JP6609247B2 - 検知のための方法及びシステム - Google Patents
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Description
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は、芳香族キノンを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、官能性部分は置換又は非置換の、キノン、ベンゾキノン、アントラキノン、及びフェナントレンキノンからなる群から選択される官能基を含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、半導体ナノ構造は、ケイ素を含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、電気特性の変化量を決定するように構成及び配置された検出器を更に含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、複数のナノ構造は、実質的に同一である。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記少なくとも2つのチャンバが互いに流体連通している。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、システムは、前記少なくとも1つのチャンバから前記検知コンパートメントへの流れを可能にする、又は防止する少なくとも1つの弁を更に含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、追加の検知装置は、光学検知装置を含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件下におくことが、前記チャンバを前記条件を提供する他のチャンバに流体連通させることを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件下におくことが、前記条件を提供する他のチャンバを前記検知コンパートメントに流体連通させることを含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件が、前記物質からの前記酸化成分又は前記還元成分の生成を触媒する酵素反応を含む。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記条件を提供する他のチャンバが、前記検知システムの一部を形成する。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、物質は、代謝産物である。
本発明の任意の実施形態のいくつかは、前記細胞を含む少なくとも1種の流体試料が、治療薬を更に含み、前記治療薬と接触した前記細胞の活性を決定又はモニタリングするための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかは、前記物質が代謝産物であり、前記細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤を同定するための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、前記流体試料が、被験体の生物学的試料である。
本発明の任意の実施形態のいくつかは、被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の治療のモニタリングのための方法である。
本発明の任意の実施形態のいくつかによれば、酸化成分は、過酸化物である。
標的分子を検出するように構成された検知コンパートメントと、
複数のチャンバであって、それぞれが対応するマイクロチャネルと、該チャネル上に装着された対応する弁とを介して、前記検知コンパートメントと制御可能に流体連通している複数のチャンバと、
少なくとも2つの前記チャンバから前記検知コンパートメントへの流体の流れを制御するように、それぞれの弁を選択的に操作するためのコントローラと、を含む。
本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、検知コンパートメントと制御可能な流体連通にある少なくとも1つのチャンバを備えたシステムが提供される。
ここで図面を参照すると、図9A、Bは、本発明のいくつかの実施形態による検知システム10の概略図である。
ナノ構造の長さは、その断面に略直交する、その伸長範囲を表す。本発明のいくつかの実施形態によれば、ナノ構造の長さは、10nm〜50マイクロメートルの範囲である。
「ワイヤー」は伝導性を有する、即ちそれ自体に電荷を通過させる能力を有する任意の材料を指す。
本発明のいくつかの実施形態において、ナノ構造は、中空チューブとして成形されており、中空チューブは、長手方向軸線に沿って完全に中空である、本明細書で「ナノチューブ」又は「ナノチューブ構造」と称されるものであることが好ましい。
ナノチューブは、単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、又はそれらの組み合わせであってもよい。
多層ナノチューブの場合、いくつかの実施形態では、壁間距離は、0.5ナノメートル〜200ナノメートル、又は1nm〜100nm、又は1nm〜50nmの範囲であってもよい。
本明細書で使用する「族」は、当業者が理解するその通常の定義が付与される。例えば、III族元素は、B、Al、Ga、In及びTlを含み;IV族元素は、C、Si、Ge、Sn及びPbを含み;V族元素は、N、P、As、Sb及びBiを含み;VI族元素は、O、S、Se、Te及びPoを含む。
本発明者らが行った実験では、Siナノワイヤーと、ジボランドーパントを有するp型Siナノワイヤーとを使用した。
例示的なナノチューブ、及びこれを調製する方法は、その全体が本明細書に示される、参照により組み込まれる特許文献6に開示されている。
検知コンパートメント12は、好ましくは、ナノ構造14に共有結合した官能性部分16を含んでもよい。官能性部分16は、検出可能な標的種(例えば、部分又は化合物)18との接触によってナノ構造14の電気特性に検出可能な変化を生じるように選択される。
例えば、検出器32は、電気特性の変化に対応する電気的な量を測定するように構成されてもよい。電気的な量は、例えば電圧、電流、伝導率、抵抗、インピーダンス、インダクタンス、電荷等であってもよい。
システム10はまた、チャネル22と、チャネル22上に装着された弁24とを介して、検知コンパートメント12と制御可能に流体連通している1つ以上のチャンバ20も備え得る。複数のチャンバが使用される場合、各チャンバは対応するチャネル22と、対応するチャネル22上に装着された対応する弁24とを介して、同じ検知コンパートメント12と制御可能に流体連通していてもよい。本発明のいくつかの実施形態では、2つ以上の検知コンパートメント12などの検知コンパートメントが使用され、この少なくとも2つのチャンバは、異なる検知コンパートメントと制御可能に流体連通している。本発明のいくつかの実施形態では、異なるチャンバにより供給される検知コンパートメント間に流体連通は存在せず、本発明のいくつかの実施形態では、異なるチャンバにより供給される検知コンパートメント間に流体連通が存在する。システムが2つ以上の検知コンパートメントを備える実施形態の代表的な例を後に提供する。
いくつかの実施形態において、チャンバはウェルの形態である。
本明細書で使用する「マイクロチャネル」という用語は、断面寸法が最大でも1mm未満、より好ましくは500μm未満、より好ましくは400μm未満、より好ましくは300μm未満、より好ましくは200μm未満、例えば100μm以下である、流体チャネルを指す。
そのようなシステムは、下記に更に詳細に記載するように、複数の試料をシステムに導入することにより多重モニタリングを行うことを可能にする。
図11A〜Cは、本発明のいくつかの実施形態による、2つ以上の検知コンパートメント12を備えたシステム200の概略図である。本発明のいくつかの実施形態では検知コンパートメントは同じ基板の異なる領域上に形成され、本発明のいくつかの実施形態では検知コンパートメントは異なる基板上に形成されている。
本明細書に記載される検知システムとして、1つ以上の検知コンパートメント内にSiNW(シリコンナノワイヤー)FETアレイを使用する例を示した。本検知システムでは、シリコンナノワイヤーの少なくともいくつかが、その表面に官能基を導入することにより修飾され、官能基と酸化成分又は還元成分を含む試料との接触により、複数のナノワイヤーが電気特性における検出可能な変化を示す。この変化は、例えば代謝産物等の還元成分生成又は酸化成分生成物質の存在及び/又は量の指標となる。官能基は、例えば、酸化・還元反応を、好ましくは可逆的にできることが可能な基であってもよく、その酸化又は還元の結果、ナノワイヤー上の電子密度が変化する。
この態様による検知システムは、検知コンパートメントと制御可能な流体連通にある少なくとも1つのチャンバを含む。
いくつかの実施形態によれば、検知システムは、本明細書に記載され、かつそれぞれ独立に図9A、B、図1A又は図1Bに示されたようなものである。
ケト−エノール互変異性化を経ることが可能な1つ以上の官能基を含む部分としては、例えばキノン部分が挙げられ、以下のスキーム1により集合的に表すことができる:
還元成分の検出のために、右の部分が使用される。
Xは、水素、又は、好ましくは金属原子若しくはイオンであり、追加の1つ以上の同じ又は異なってもよいフェロセン部分で更に置換されていてもよい。なお、複数のフェロセン部分が存在する場合、酸化・還元反応でフェロセン部分の数に対応する電子移動が行われる。
本明細書に記載した検知システムの任意の1つ、及び検知システムの実施形態の任意の1つに関して、検知システムは、本明細書に記載されるナノ構造を含む複数の、同じ又は異なってもよい検知コンパートメントを備えてもよい。
本明細書に記載される任意の実施形態のうちのいくつかの態様によれば、標的分子の検出方法が提供される。
いくつかの実施形態において、試料コンパートメントは、以降更に詳細に記載されるように、洗浄流体(例えば洗浄溶液)を収容するチャンバを更に含む。
他の条件としては、例えば試料をpH調整剤と接触させることにより、試料のpHを変更することが挙げられる。
ほぼいずれの生物学的代謝産物も、例えば、酵素反応又は化学的試薬等の生物学的代謝産物からROSを生成し、続いてH2O2を生成する条件に供され得る。
ラクテートオキシダーゼの触媒する反応においてH2O2を生成する乳酸塩;
グルコースオキシダーゼの触媒する反応においてH2O2を生成するグルコース;
無機リン酸塩及び酸素の存在下でH2O2を生成するピルビン酸塩;
キサンチンオキシダーゼの触媒する反応においてH2O2を生成するヒポキサンチン;
NAD(P)Hオキシダーゼの触媒する反応において超酸化物を生成するNAD(P)H;
スーパーオキシドジスムターゼの触媒する反応においてH2O2を生成する超酸化物(O2 −)、
対応するアルデヒドオキシダーゼの触媒する反応においてH2O2を生成するアルデヒドが挙げられる。
本明細書に記載される検知システムの任意の1つに導入される試料は、例えば、本明細書に記載するように、標的部分や、標的部分を生成する物質を含有する溶液であってもよい。
一実施形態によれば、細胞は、免疫系の細胞、即ち白血球(white blood cell)(即ち、白血球細胞(leukocyte))である。例としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球(T細胞又はB細胞)、単球、マクロファージ及び樹状細胞が挙げられる。
細胞は、付着細胞、又は懸濁液中の細胞であってもよい。
同じ試料は異なる条件に供されてもよく、検知はそれぞれ供された後に行われる。
例示的な細胞生物学的試料としては、血液(例えば、末梢血白血球、末梢血単核細胞、全血、臍帯血)、固形組織生検材料、脳脊髄液、尿、リンパ液、並びに呼吸器、腸管及び泌尿生殖器管のさまざまな外分泌物、滑液、羊水、並びに絨毛膜絨毛が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載される検知方法は、多様な診断及び療法の用途に使用することができる。
このような方法は、細胞に対する治療薬の有効性を決定するのに使用することができる。
あるいは、そのような方法は、改変された代謝活性に関連した被験体の疾病の治療のモニタリングに使用されてもよい。
癌疾患としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。癌疾患の特定の例としては、これらに限定されるものではないが、以下のものがあげられる:慢性骨髄性白血病、成熟を伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球の増大を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血病、好酸球増加症を有する急性骨髄単球性白血病等の骨髄性白血病;バーキット型非ホジキン悪性リンパ腫等の悪性リンパ腫;急性リンパ性(lumphoblastic)白血病、慢性リンパ性白血病等のリンパ性(Lymphoctyic)白血病;固形腫瘍良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、結腸腺腫等の骨髄増殖性疾患;小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液性肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫(alveolar)、骨外性粘液型軟骨肉腫(chonodrosarcoma)、ユーイング腫瘍等の腺癌。その他には、精巣及び卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽腫、悪性黒色腫、中皮腫、***、皮膚、膵臓、子宮頸部、前立腺、及び卵巣の腫瘍が挙げられる。
(a)上述した方法に従って、被験者における疾病の存在を診断し;
(b)該診断に基づいて被験者を治療する。
被験体から得た、少なくとも1種の医薬と共に細胞を含む生物学的試料について、本明細書に記載されるいずれかの関連方法(その態様も含む)から選ばれた任意の1種を用いて、試料中の代謝産物の存在及び/又は量を決定することを含み、
(本明細書に記載されるように、1種以上の代謝産物のレベルを測定して得られた)細胞の代謝活性における、同一条件下で試験された正常かつ健康な細胞試料の代謝活性に近づくようなシフトは、疾病に効果的な医薬であるという指標となる。
(a)疾病に対する少なくとも1種の医薬を被験体に投与し;
(b)投与後、被験体の細胞を含む生物学的試料を回収し;
(c)該生物学的試料を、本明細書に記載される実施形態の任意の1種による検知システムに導入し;
試料中の1種以上の代謝産物のレベルを決定する。
(a)細胞を薬剤に暴露し;
(b)薬剤に暴露する前と後の細胞の代謝活性を測定し、1種以上の代謝産物のレベルのシフトは、薬剤が代謝活性を変更することが可能であることの指標となる。
(a)疾病に対する少なくとも1種の医薬を被験体に投与し;
(b)前記投与後に、被験体の細胞を含む生物学的試料を回収し;
(c)前記細胞の細胞外環境において酸化成分又は還元成分を生成する代謝産物の存在及び/又は量を、本明細書に記載される実施形態の任意の1種に記載される任意の検知方法及びシステムを使用して、モニタリングする。
「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(include)」「含んでいる(including)」、「有している(having)」及びそれらの活用形は、「含むが、限定されない」ことを意味する。
「から本質的になる」は、組成物、方法又は構造が追加の成分、工程及び/又は部分を含み得ると定義する。しかし、追加の成分、工程及び/又は部分は、特許請求される組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
「結合基」は、結合基の2つ以上の原子を介して化合物中の2つ以上の部分に結合している基(置換基)を示す。
例えば、アミン基がナノ構造の表面上に生成される場合、このアミン基は末端基であり、官能性部分に共有結合した後のアミン基は、結合基である。
「チオスルフェート」は、上記で定義したような−O−S(=S)(=O)−OR’末端基又は−O−S(=S)(=O)−O−結合基を示し、R’は、上記に定義した通りである。
「チオスルファイト」は、上記で定義したような−O−S(=S)−O−R’末端基又は−O−S(=S)−O−基結合基を示し、R’は、上記に定義した通りである。
「スルフィネート」は、上記で定義したような−S(=O)−OR’末端基又は−S(=O)−O−基結合基を示し、R’は、上記に定義した通りである。
「スルホネート」は、上記で定義したような−S(=O)2−R’末端基又は−S(=O)2−結合基を示し、R’は、本明細書に定義した通りである。
「N−スルホンアミド」は、上記で定義したようなR’S(=O)2−NR”−末端基又は−S(=O)2−NR’−結合基を示し、R’及びR”は、本明細書に定義した通りである。
「チオカルボニル」は、本明細書で使用する場合、上記で定義したような−C(=S)−R’末端基又は−C(=S)−結合基を示し、R’は、本明細書に定義した通りである。
「ヒドロキシル」は、−OH基を示す。
「アリールオキシ」は、本明細書に定義した−O−アリール及び−O−ヘテロアリール基の両方を示す。
「チオアルコキシ」は、本明細書に定義した−S−アルキル基、及び−S−シクロアルキル基の両方を示す。
「チオアリールオキシ」は、本明細書に定義した−S−アリール及び−S−ヘテロアリール基の両方を示す。
「イソシアネート」は、−N=C=O基を示す。
「ニトロ」は、−NO2基を示す。
「アシルハロゲン化物」は、−(C=O)R””基を示し、R””は、上記で定義したハロゲン化物である。
「アゾ」又は「ジアゾ」は、上記で定義したN=NR’末端基又は−N=N−結合基を示し、R’は、上記に定義した通りである。
「O−カルボキシレート」は、上記で定義したOC(=O)R’末端基又は−OC(=O)−結合基を示し、R’は、本明細書に定義した通りである。
「O−チオカルボキシレート」は、上記で定義したOC(=S)R’末端基又は−OC(=S)−結合基を示し、R’は、本明細書に定義した通りである。
「O−カルバメート」は、上記で定義したOC(=O)−NR’R”末端基又は−OC(=O)−NR’−結合基を示し、R’及びR”は、本明細書に定義した通りである。
「N−チオカルバメート」は、上記で定義したR”OC(=S)NR’−末端基又は−OC(=S)NR’−結合基を示し、R’及びR”は、本明細書に定義した通りである。
「N−ジチオカルバメート」は、上記で定義したR”SC(=S)NR’−末端基又は−SC(=S)NR’−結合基を示し、R’及びR”は、本明細書に定義した通りである。
「チオ尿素」は、本明細書で「チオウレイド」とも称され、−NR’−C(=S)−NR”R”’末端基又は−NR’−C(=S)−NR”−結合基を示し、R’、R”及びR”’は、本明細書に定義した通りである。
「N−アミド」は、上記で定義したR’C(=O)−NR”−末端基又はR’C(=O)−N−結合基を示し、R’及びR”は、本明細書に定義した通りである。
「グアニジン」は、上記で定義したR’NC(=N)−NR”R”’末端基又は−R’NC(=N)−NR”−結合基を示し、R’、R”及びR”’は、本明細書に定義した通りである。
「ヒドラジン」は、上記で定義したNR’−NR”R”’末端基又は−NR’−NR”−結合基を示し、R’、R”、及びR”’は、本明細書に定義した通りである。
「シロキシ」は、上記で定義したSi(OR’)R”R”’末端基又は−Si(OR’)R”−結合基を示し、R’、R”及びR”’のそれぞれは、本明細書に定義した通りである。
「テトラオルトシリケート」は、上記で定義したO−Si(OR’)(OR”)(OR”’)末端基又は−O−Si(OR’)(OR”)−結合基を示し、R’、R”及びR”’は、本明細書に定義した通りである。
本明細書で使用されるように、「チオヒドラジド」は、上記で定義したC(=S)−NR’ −NR”R”’末端基又は−C(=S)−NR’−NR”−結合基を表し、R’、R”及びR’”は、本明細書に定義した通りである。
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する
代謝産物の多重リアルタイムモニタリング用のナノワイヤーバイオセンサとして使用され得る、本発明のいくつかの実施形態に係る例示的なマイクロ流体バイオ検知システム(本明細書でマイクロ流体アレイ又はチップとも称される)を、図1A及び1Bに示す。
検知コンパートメント内で、SiNW FETアレイは、ROSの検知、及びROSを生成する他の小分子代謝産物の検知のために、例えば9,10−アントラキノン−2−スルホン酸クロリド等の酸化・還元反応性官能基で修飾されている。図1C及び1Dに例示するように、ROS生成代謝産物を、FETアレイと接触させる前に、例えばオキシダーゼ酵素の存在下で反応させて、H2O2(例えば過酸化物、H2O2)を生成する。
次いで、ROS又はそれによって得られるH2O2は、FET表面上の9,10−ジヒドロキシアントラセンを酸化して9,10−アントラキノンを形成する(図1D)。この酸化反応は表面電子密度を低下させ、一方、N,N−ジエチルヒドロキシルアミン(DEHA)等の還元成分は、9,10−アントラキノンを9,10−ジヒドロキシアントラセンに還元して表面電子密度を増大させる。
検知コンパートメントの主要部であるSiNW−FETアレイをフォトリソグラフィーにより製作した。FETのソース電極及びドレイン電極を、LOR5A(Microchem)及びS1805(Shipley)からなる多層フォトレジスト構造により作成した。FETのソース電極とドレイン電極との間の間隙は、2μmであった。フォトレジストの暴露及び現像後、パターンをTi/Pd/Ti(それぞれ、5/60/10nm)の電子ビーム蒸着により金属化した。その後、80℃でのプラズマ増強化学蒸着(ICP−PECVD,Axic Inc.)により、蒸着したSi3N4の60nmの層と、原子層堆積(ALD)により作製した20nmのアルミナ層(Savannah 200システム、Cambridge Nanotech)とにより電極を絶縁した。
SiNW FETアレイの製作後、細胞代謝産物を検知するために(例えば図1Dおよび図2A〜Dに示すように)チップを化学的に修飾した。
図2の差し込み図に示すように、9,10−アントラキノン−2−スルホン酸ナトリウムのスルホネート基を、トルエン中で塩化オキサリル及びDMFを使用してスルホン酸クロリドに変換した。
作成したSiNW FETアレイチップをアセトン、イソプロピルアルコール(IPA)、及び脱イオン水(DIW)の順で洗浄し、その後、窒素乾燥した。酸素プラズマ(100W、0.2トル)で15分間処理した。その直後、チップをおよそ100μlの(3−アミノプロピル)−ジメチル−エトキシシラン(APDMES;SIA0603.0,Gelest Inc.)で10分間覆った。次いで、チップを65℃のホットプレート上に2時間静置した。その後、チップ表面を再度IPAで洗浄し、その後窒素乾燥した。
以下のパラメータを使用する質量分析法(Autospec M250Q,Waters)を用いて、表面修飾に使用した9,10−アントラキノン−2−スルホン酸クロリドの元素組成を確認した: 電子衝突の測定モード、70eVで正イオン化、溶媒はCH2Cl2。
XPS測定は、超高真空(2.5×10−10トル基準圧力)中で行った(Multi−Technique Systen 5600,PHI)。試料にAlKα単色化線源(1486.6eV)を照射し、0.8mmのスリット開口部を使用した球状キャパシタアナライザにより、放出された電子を分析した。
図2A〜Cの示す修飾表面のXPSスペクトル及び原子組成の結果は、各修飾ステップ後の炭素(C)、窒素(N)及び硫黄(S)の増大を示す。
図1A及び1Bに示すような、細胞の培養及び複数の溶液の制御のためにソレノイド作動弁を有するPDMS(ポリジメチルシロキサン)培養コンパートメントを、ソフトリソグラフィーを用いて製作した。ソレノイド作動PDMS弁の製作は、非特許文献33に従った。その後、この弁をPDMS培養コンパートメントに組み込んだ。
実験方法:
一般的な検知設定:
検体溶液中の検体の酸化中に検出されるROS又はH2O2、又は検体溶液中の検体の還元中に検出される還元成分のいずれかの表面電荷により誘導されるSiNW FET(Ids)の電流を、データ収集システムを使用して測定した。
時間に対する電流の信号を1秒間隔で記録した。
さまざまな濃度のH2O2を含む溶液に関して、データ収集システムを使用して、H2O2による表面電荷により誘導されたSiNW FETの電流を測定した。
乳酸塩の検知のためには、乳酸塩がFETアレイに到達する前に、0.1単位/mlのラクテートオキシダーゼ(LOX;L0638,SIGMA)をフェノールレッド不含有培地に加えて、(図1Dに示すように)乳酸塩をピルビン酸塩及びH2O2に変換した。
検知は、血清添加培地中、pH7.0で行ってもよい。
還元成分添加溶液を使用することによって、修飾FETをpHセンサに変換した。培地に0.1%v/v DEHAを添加して修飾FET表面を還元した後、プロトン化又は脱プロトン化により変動する表面プロトン密度は、測定電流を顕著に変化させる。観察によると、培地への0.1%v/v DEHAの添加によってpHの有意な変化は生じなかった。
SDは、試験したナノワイヤー装置の平均値における変動性の指数と見なされるため、検知特性のデータは平均±SDで表した。
血清添加培地中のH2O2に反応した9,10−ジヒドロキシアントラセン修飾SiNW FETによる検知を、図3A、Bに示す。
図3Aは、異なる濃度のH2O2中の修飾FETの酸化動力学と、還元成分を流した後の対応還元動力学とを示す。
小分子代謝産物の検知には、代謝産物をH2O2に変換するオキシダーゼ酵素を使用した。
図4Aは、血清含有培地中の乳酸塩の濃度依存性の検知特性を示す。この図に示すように、乳酸塩を含まない溶液の場合、LOX添加試料(左から一番目の赤色の曲線)の信号は、LOX無添加の対応試料(黒色の曲線)よりも高かった。これもまた2つの信号の間の差が、血清添加培地の複雑な組成による可能性がある。従って、2つの信号の間の差は、バックグラウンド信号と定義した。
図5Aに概略的に示されるように、上記の修飾FETは、単に還元成分を加えることにより、pHセンサへと変換された。培地にDEHAを添加し、修飾単層を9,10−ジヒドロキシアントラセン及びH2O2含有物に還元した後は、プロトン化又は脱プロトン化により変化する表面プロトン密度が、測定電流を顕著に変化させる。
実験方法:
細胞培養、薬物処理及び生存率評価:
ヒトTリンパ球、Jurkat(TIB−152,ATCC)を、5% CO2雰囲気下にて37℃で培養及びインキュベートした。培地は、10%ウシ胎児血清(FBS;04−001−1A,Biological Industry)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(15140,GIBCO)を含むRPMI 1640培地(52400,GIBCO)を使用した。
血球計数器を使用してトリパンブルー染色細胞を計数することにより、細胞生存率を評価した。
健康なドナーと、慢性リンパ性白血病(CLL)の患者とから末梢血(PB)細胞を得た。
低密度細胞を単離するために、Ficoll−Paque(GE Healthcare)を使用してPB細胞を分別した。検知のために、単離された細胞をフェノールレッド不含有血清添加培地中に再懸濁した。
フローサイトメトリー分析により、分析上、93%を超える正常な細胞又はCLL分別細胞がCD19+であることが確認された。
細胞のナノワイヤー検知との比較のために、ジクロロジヒドロフルオレセイン(DCFH)を使用した対照実験を行った。理論的には、ROSによってDCFHは酸化されて蛍光ジクロロフルオレセイン(DCF)となる。
10% FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むフェノールレッド不含有RPMI 1640培地中、1×106生細胞/mlの密度でJurkat細胞を培養した。
細胞代謝産物に関するデータを、平均±標準誤差(SEM)又は標準偏差(SD)にて示す。加えて、両側2標本t検定を行って、細胞代謝産物に関するデータの有意性を統計的に分析した。
T細胞株を使用した検知:
活性酸素種(ROS)は、酸素の正常な代謝の天然副産物として形成され、多様な生物学的プロセスの調節におけるシグナリング分子としての重要な役割を有する。シグナリング分子として、ROSの1つの重要な特徴は、例えば細胞膜を横切るなど異なるコンパートメント間を移動する能力である。従って、段階的に増大する細胞内ROSは、細胞膜を通って細胞外空間に拡散し、代謝活性を表す指標となりうる。
測定したROSレベルを、生細胞の数に対して正規化した。
図6B及び6E、6Fに示した相対的な細胞数は、t=24時間における細胞数の、初期細胞数に対する割合である。
慢性リンパ性白血病(CLL)細胞及び正常なB細胞の代謝レベルを24時間モニタリングし、代謝有意性を決定した。
データから更に、酸化・還元反応性ナノワイヤーバイオセンサによって、治療中の癌細胞の代謝変化が評価でき、オーダーメード医療が可能となるであろう。
下記の表1は、CLL細胞の生物学的パラメータを示す。
Claims (17)
- 少なくとも1種の流体試料中の、酸化・還元成分を生成する物質の存在及び/又は量を決定する方法であって、前記酸化・還元成分は、酸化成分又は還元成分であり、前記少なくとも1種の試料を、検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも一つのチャンバを含む検知システムに導入することを含み、前記少なくとも1つのチャンバが流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、
前記官能性部分は酸化・還元反応部分であって、酸化・還元成分との接触によって、前記官能性部分の有する原子の1つ以上の酸化数が変化するものであり、さらに前記酸化・還元成分との前記接触によって、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものであり、前記電気特性の検出可能な変化が、前記少なくとも1種の試料における前記物質の存在及び/又は量の指標となる、方法。 - 少なくとも1種の流体試料を、前記物質が前記酸化・還元成分を生成する反応条件下におくことを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記条件下におくことが、前記チャンバを前記条件を提供する他のチャンバに流体連通させることを含む、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1種の流体試料が細胞を含み、前記酸化成分又は前記還元成分を生成する前記物質の前記細胞における存在及び/又は量を決定するための、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記物質が代謝産物である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種の流体試料が細胞を含み、前記細胞の代謝活性の決定又はモニタリングのための、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞を含む少なくとも1種の流体試料が、治療薬を更に含み、前記治療薬と接触した前記細胞の活性の決定又はモニタリング、および前記細胞に対する前記治療薬の有効性の決定の少なくとも一方を実施するための、請求項6に記載の方法。
- 前記物質が代謝産物であり、前記細胞の代謝活性を変更することが可能な薬剤を同定するための、請求項4に記載の方法。
- 被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の診断、および被験体における改変された代謝活性に関連した疾病の治療のモニタリングの少なくとも一方を実施するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1種の流体試料中の酸化・還元成分の存在及び/又は量を決定する方法であって、前記酸化・還元成分は、酸化成分又は還元成分であり、前記少なくとも1種の試料を、検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも一つのチャンバを含む検知システムに導入することを含み、前記少なくとも1つのチャンバは流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、前記官能性部分は酸化・還元反応部分であって、酸化・還元成分との接触によって、前記官能性部分の有する原子の1つ以上の酸化数が変化するものであり、さらに前記酸化・還元成分との前記接触によって、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものであり、前記電気特性の検出可能な変化が、前記少なくとも1種の試料における酸化・還元成分の存在及び/又は量の指標となる、方法。
- 検知コンパートメントと制御可能に流体連通している少なくとも一つのチャンバを含むシステムであって、前記少なくとも1つのチャンバが流体を収容するように構成されており、前記検知コンパートメントは半導体ナノ構造と、前記ナノ構造に共有結合した官能性部分とを含み、前記官能性部分は酸化・還元反応部分であって、酸化成分又は還元成分である酸化・還元成分との接触によって、前記官能性部分の有する原子の1つ以上の酸化数の変化が生じ、前記ナノ構造の電気特性の検出可能な変化を生じるものである、システム。
- 少なくとも2つのチャンバを含み、それぞれのチャンバは流体を収容するように構成され、前記検知コンパートメントと流体連通しており、前記チャンバの少なくとも1つは、分析するべき試料を保持するように構成されており、前記チャンバの少なくとも1つは、前記酸化・還元反応部分が生成される条件を提供するように選択された流体を保持するように構成されている、請求項11に記載のシステム。
- 光学検知装置をさらに含む、請求項12に記載のシステム。
- 前記官能性部分は、酸化数が可逆的に変化しうる原子を少なくとも1つ有する官能基を少なくとも1つ含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記流体連通が、マイクロチャネルを用いて達成される、請求項1〜10および14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記官能性部分は、酸化数が可逆的に変化しうる原子を少なくとも1つ有する官能基を少なくとも1つ含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記流体連通が、マイクロチャネルを用いて達成される、請求項11〜13および16のいずれか一項に記載のシステム。
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