JP6597118B2 - 細胞挙動評価用基板、細胞挙動評価用容器及び細胞挙動評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の挙動を評価するために用いられる細胞挙動評価用基板及び細胞挙動評価用容器、並びに細胞の挙動を評価する方法に関する。

近年、創薬開発、再生医療等のバイオテクノロジー関連分野において、生体組織から単離した細胞や、細胞を構成する細胞構成要素（例えば、培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム等）を用いた試験・研究が盛んに行われている。一般に、培養細胞を用いた試験・研究は、動物を用いた試験・研究に比べて安価であり、評価する試薬量が少なくて済む、均質な実験データが得られやすいといった利点がある。このような試験・研究において、生体組織から単離した細胞の細胞死を抑制し、当該細胞を安定的に培養し、増殖させることが重要となる。

細胞を安定的に培養し、増殖させるために、細胞を培養するための細胞培養器具に関する開発が進められている。従来、マルチウェルプレートタイプの細胞培養容器であって、各ウェルの底面に、ピラー状の凹凸構造を有する培養シートが取り付けられている細胞培養容器が提案されている（特許文献１参照）。

国際公開２０１３／０３０９４０号公報

上記特許文献１に記載の細胞培養容器において、培養シートが有するピラー状の凹凸構造上に、培養対象である細胞を播種すると、当該細胞がピラー状の凹凸構造上にて凝集してスフェロイドが形成される。

ところで、上記特許文献１に記載の細胞培養容器を用いて細胞を安定的に培養するためには、ピラー状の凹凸構造が、培養対象である細胞種等に適した寸法等を有することが必要となる。細胞種等によって、好適な接着性を示す凹凸構造の寸法等は異なるためである。そのため、凹凸構造の寸法等に応じて、培養対象である細胞種等の挙動を評価し、細胞培養容器の凹凸構造の寸法等を決定しなければならないが、そのような細胞種等の挙動を評価する器材は提案されていない現状である。

このような課題に鑑みて、本発明は、微細凹凸パターン上における細胞の挙動を的確に評価可能な細胞挙動評価用基板、細胞挙動評価用容器及び細胞挙動評価方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は、微細凹凸パターン上における細胞の挙動を評価するための細胞挙動評価用基板であって、第１面及び当該第１面に対向する第２面を有する基部を備え、前記基部の前記第１面の一部に設定された、所定の一方向に沿って順に並列する第１〜第Ｎ（Ｎは２以上の整数である。）評価領域のそれぞれに、前記微細凹凸パターンとしての第１〜第Ｎ凹凸パターンが形成されてなり、第Ｍ（Ｍは１以上Ｎ−１以下の整数である。）評価領域に形成されている第Ｍ凹凸パターンと、第Ｍ＋１評価領域に形成されている第Ｍ＋１凹凸パターンとは、１００〜５００ｎｍの範囲内の寸法であって前記細胞の挙動を評価可能な程度に互いに異なる寸法を有することを特徴とする細胞挙動評価用基板を提供する（発明１）。

上記発明（発明１）によれば、細胞挙動評価用基板の第１面の一部に、所定の一方向に沿って順に並列する複数の評価領域（第１〜第Ｎ（Ｎ≧２）評価領域）が設定され、各評価領域に形成される凹凸パターン（第１〜第Ｎ凹凸パターン）の内の第Ｍ（１≦Ｍ≦Ｎ−１）凹凸パターンとそれに隣接する第Ｍ＋１凹凸パターンとが、細胞の挙動を評価可能な程度に異なる寸法（１００〜５００ｎｍの範囲内）を有することで、播種された細胞の挙動を的確に評価することができる。

上記発明（発明１）において、前記第１面における前記第１〜第Ｎ評価領域のそれぞれの近傍に、前記第１〜第Ｎ凹凸パターンの寸法に関する情報を含む識別マークが設けられているのが好ましい（発明２）。

細胞挙動評価用基板上に形成されている第１〜第Ｎ凹凸パターンは、１００〜５００ｎｍの範囲内の寸法を有するものであるため、当該微細凹凸パターン上の細胞を光学顕微鏡で観察する場合、当該細胞が良好な接着性を示す微細凹凸パターンの寸法を把握することが困難である。しかしながら、上記発明（発明２）によれば、各評価領域内に形成されている凹凸パターンの寸法に関する情報を含む識別マークが、各評価領域の近傍に設けられていることで、光学顕微鏡で細胞を観察する場合であっても、当該細胞が良好な接着性を示している微細凹凸パターンの寸法を容易に把握することができる。

上記発明（発明１，２）において、前記第１〜第Ｎ凹凸パターンの寸法は、前記第１〜第Ｎ評価領域の並列順に段階的に変化するのが好ましい（発明３）。かかる発明（発明３）によれば、寸法が段階的に変化（増減）するように各凹凸パターンが形成されているため、細胞が良好な接着性を示す（又は細胞が接着性を示し難い）微細凹凸パターンの寸法の範囲を容易に決定することができる。

上記発明（発明１〜３）において、前記第Ｍ評価領域に形成されている前記第Ｍ凹凸パターンと、前記第Ｍ＋１評価領域に形成されている前記第Ｍ＋１凹凸パターンとが連続しているのが好ましい（発明４）。

隣接する評価領域の間に、微細凹凸パターンとは異なる構造が存在すると、当該構造が細胞の挙動に与える影響を無視し難くなるが、上記発明（発明４）によれば、隣接する評価領域のそれぞれに形成されている微細凹凸パターンが互いに連続していることで、細胞の挙動に影響を与える可能性のある構造が存在しないため、微細凹凸パターンの寸法が細胞の挙動に与える影響を的確に評価することができる。

上記発明（発明１〜４）において、前記第１面における前記第Ｍ評価領域と前記第Ｍ＋１評価領域との境界を示すマークが、当該境界の近傍に設けられているのが好ましい（発明５）。

第１〜第Ｎ凹凸パターンが１００〜５００ｎｍの寸法を有することで、光学顕微鏡を用いた観察では、隣接する微細凹凸パターンの境界を判別することが困難であるが、上記発明（発明５）によれば、隣接する評価領域の境界を示すマークが設けられていることで、隣接する評価領域の境界近傍に位置する細胞が良好な接着性を示す微細凹凸パターンの寸法を的確に評価することができる。

上記発明（発明１〜５）において、前記第１〜第Ｎ凹凸パターンの頂部は、前記第１面における前記第１〜第Ｎ評価領域以外の領域と同一平面上に位置するのが好ましい（発明６）。

第１〜第Ｎ評価領域上に細胞を播種する際、当該細胞自体が評価領域以外の領域上に存在することがある。評価領域以外の領域状に存在する細胞が、評価領域内に移動することで、細胞が良好な接着性を示す微細凹凸パターンの寸法を的確に評価可能となるが、評価領域内の微細凹凸パターンの頂部と、評価領域以外の領域との高さが異なると、細胞の移動を阻害するおそれがある。しかしながら、上記発明（発明６）によれば、微細凹凸パターンの頂部と、評価領域以外の領域とが同一平面上に位置することで、評価領域以外の領域から評価領域内に細胞が移動しやすくなるため、細胞が良好な接着性を示す微細凹凸パターンの寸法を的確に評価することができる。

上記発明（発明１〜６）において、前記第１〜第Ｎ凹凸パターンを、ピラー状又はラインアンドスペース状とすることができる（発明７）。

上記発明（発明１〜７）において、前記第１〜第Ｎ評価領域は、いずれも前記第１〜第Ｎ凹凸パターン上における前記細胞の挙動を観察するための光学顕微鏡の視野に収まる程度の大きさであるのが好ましい（発明８）。

上記発明（発明８）によれば、第１〜第Ｎ評価領域の大きさが、細胞の挙動を観察するための光学顕微鏡の視野に収まる程度であることで、光学顕微鏡の視野を移動させることなく細胞の挙動を観察し、評価することができる。

また、本発明は、貫通孔が形成されてなる底部及び前記底部の外周縁に連続する周壁部を有する容器本体と、前記底部に取り付けられてなる上記発明（発明１〜８）に係る細胞挙動評価用基板とを備え、前記容器本体の平面視において前記第１〜第Ｎ凹凸パターンが前記貫通孔に重なるように、かつ前記容器本体内に位置するようにして、前記細胞挙動評価用基板が前記底部に取り付けられており、前記貫通孔は、前記細胞挙動評価用基板により塞がれていることを特徴とする細胞挙動評価用容器を提供する（発明９）。

上記発明（発明９）において、前記細胞挙動評価用基板は、前記容器本体の平面視において前記第１〜第Ｎ凹凸パターンが前記貫通孔に物理的に包含されるようにして、前記底部に取り付けられてなるのが好ましい（発明１０）。

上記発明（発明９，１０）において、前記細胞挙動評価用基板が、前記貫通孔から前記第１〜第Ｎ凹凸パターンを露出させるようにして、前記容器本体の前記底部の外面に取り付けられているのが好ましい（発明１１）。

上記発明（発明９〜１１）において、前記細胞挙動評価用基板が、接着剤を介して前記底部に取り付けられているのが好ましい（発明１２）。

さらに、本発明は、上記発明（発明９〜１２）に係る細胞挙動評価用容器内に評価対象細胞を播種し、前記第１〜第Ｎ凹凸パターン上の前記評価対象細胞を、前記細胞挙動評価用基板の前記第２面側から観察し、当該細胞の挙動を評価することを特徴とする細胞挙動評価方法を提供する（発明１３）。

上記発明（発明１３）において、倒立顕微鏡を用いて前記評価対象細胞を観察するのが好ましい（発明１４）。

本発明によれば、微細凹凸パターン上における細胞の挙動を的確に評価可能な細胞挙動評価用基板、細胞挙動評価用容器及び細胞挙動評価方法を提供することができる。

図１（Ａ）は、本発明の一実施形態に係る細胞挙動評価用基板の概略構成を示す平面図であり、図１（Ｂ）は、本発明の一実施形態における各評価領域の概略構成を示す平面図である。 図２は、本発明の一実施形態に係る細胞挙動評価用基板の概略構成を示す、図１（Ｂ）におけるＩ−Ｉ線切断端面図である。 図３は、本発明の一実施形態における識別マーク及び境界マークの概略構成を示す平面図である。 図４は、本発明の一実施形態に係る細胞挙動評価用基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図である。 図５は、本発明の一実施形態に係る細胞挙動評価用基板の製造工程であって、図４に示す工程に連続する各工程（透明基材の研磨方法の各工程）を切断端面図にて示す工程フロー図である。 図６は、本発明の一実施形態における評価用容器の概略構成を示す平面図である。 図７は、本発明の一実施形態における評価用容器の概略構成を示す、図６におけるII−II線切断端面図である。 図８は、本発明の一実施形態における評価用容器を用いた評価方法を示す概略図である。 図９は、本発明の一実施形態における評価領域の他の態様を概略的に示す斜視図である。 図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、試験例１における細胞培養後の細胞挙動評価用基板上の顕微鏡写真である。 図１１は、試験例２における細胞培養後の細胞挙動評価用基板上の顕微鏡写真である。

本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
［細胞挙動評価用基板］
図１（Ａ）は、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板の概略構成を示す平面図であり、図１（Ｂ）は、本実施形態における各評価領域の概略構成を示す平面図であり、図２は、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板の概略構成を示す、図１（Ｂ）におけるＩ−Ｉ線切断端面図である。

図１及び図２に示すように、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０は、第１面１１ａ及び第１面１１ａに対向する第２面１１ｂを有する基部１１を備える。基部１１の第１面１１ａ側には、第１〜第Ｎ（Ｎは２以上の整数である。図１（Ｂ）に示す例においてはＮ＝１２）評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N（ＥＲ₁₂）を含む評価領域群ＧＲが設けられており、評価領域群ＧＲ内の各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに微細凹凸パターン１２が形成されている。

本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０は、微細凹凸パターン１２上に存在する評価対象物としての細胞を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察するために用いられるものであるが、評価対象物は細胞に限定されるものではなく、例えば、培養細胞から分泌される膜小胞（エクソソーム）、細胞小器官（オルガネラ）、小胞（リソソーム、エンドソーム、ファゴソーム、液胞等）、顆粒（メラノソーム、微小体、グリオキシソーム、バイベル・パラーデ小体等）、細胞骨格、中心小体、鞭毛、繊毛、リボソーム等の細胞を構成する細胞構成要素等も含まれる。以下、本実施形態においては、評価対象物としての細胞の挙動を評価するための基板を例に挙げて説明する。

基部１１を構成する材料としては、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料等を用いることができる。

なお、本実施形態において「透明」とは、波長１９０〜８００ｎｍの光を対象物（本実施形態においては細胞挙動評価用基板１０）の片側（第１面１１ａ側又は第２面１１ｂ側）から照射した際、照射された側とは反対側（第２面１１ｂ側又は第１面１１ａ側）へ光が到達することを意味する。好適な基準を透過率で示すならば２０％以上、好ましくは５０％以上、特に好ましくは８０％以上である。

基部１１の形状（平面視形状）は、特に限定されるものではなく、例えば、平面視略矩形状、平面視略円形状等を挙げることができる。また、平面視における基部１１の大きさは特に限定されるものではないが、後述するように、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０は、好適には、貫通孔２ｃを有する容器本体２の底部２ａに、貫通孔２ｃを塞ぐようにして取り付けられて用いられる（図６，７参照）。そのため、基部１１の大きさは、当該容器本体２の貫通孔２ｃの大きさに応じ、貫通孔２ｃを塞ぐことのできる程度に設定されるのが好ましい。

基部１１の厚みＴ₁₁は、０．５ｍｍ以下であり、好ましくは０．０３〜０．５ｍｍであり、特に好ましくは０．１〜０．２ｍｍで ある。本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０は、微細凹凸パターン１２上に存在する評価対象物としての細胞を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察し、当該細胞の挙動を評価するために用いられる。微細凹凸パターン１２上の細胞を観察する場合、極めて高倍率（２０倍以上、好ましくは５０倍以上程度）で観察可能であることが望ましいが、基部１１の厚みＴ₁₁が０．５ｍｍを超えると、微細凹凸パターン１２上の細胞と、基部１１を挟むようにして対向して第２面１１ｂ側に位置する倒立顕微鏡の対物レンズとの距離が遠くなってしまい、高倍率（２０倍以上程度）での観察が困難となる。なお、本実施形態において基部１１の厚みＴ₁₁は、マイクロメーター等を用いて測定され得る。

本実施形態において、評価領域群ＧＲ内には、一方向に並列するＮ個の評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nが設けられており、当該評価領域群ＧＲは、微細凹凸パターン１２が基部１１と一体的な構造物として形成されている第１評価領域群ＧＲ₁と、当該微細凹凸パターン１２とは異なる種類の形状の微細凹凸パターン１２が基部１１と一体的な構造物として形成されている第２評価領域群ＧＲ₂とに区分される。

本実施形態において、第１評価領域群ＧＲ₁の各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆に形成されている微細凹凸パターン１２は、ピラー形状を有し、第２評価領域群ＧＲ₂の各評価領域ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂に形成されている微細凹凸パターン１２は、ラインアンドスペース形状を有する。なお、第１評価領域群ＧＲ₁と第２評価領域群ＧＲ₂とのそれぞれの各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆，ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂に形成されている微細凹凸パターン１２は、互いに異なる種類の形状を有するものであればよく、これらの微細凹凸パターンの形状は、上記態様に限定されるものではない。

第１評価領域群ＧＲ₁及び第２評価領域群ＧＲ₂のそれぞれに含まれる評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆，ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂には、互いに異なる寸法の微細凹凸パターン１２が形成されている。本実施形態においては、寸法１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ及び５００ｎｍの微細凹凸パターン１２が、その順に並列するように各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆，ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂に形成されている。すなわち、各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆，ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂に形成されている微細凹凸パターン１２の寸法は、当該評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆，ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂の並列順に段階的に変化する。なお、寸法１００ｎｍの微細凹凸パターン１２の形成されている評価領域ＥＲ₂，ＥＲ₈の隣り（図１（Ｂ）において左側）の評価領域ＥＲ₁，ＥＲ₇は、微細凹凸パターン１２の存在しない領域であるが、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０はこの評価領域ＥＲ₁，ＥＲ₇を有していなくてもよい。

各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆，ＥＲ₈〜ＥＲ₁₂に形成されている微細凹凸パターン１２の寸法は、１００〜５００ｎｍの範囲内である。微細凹凸パターン１２の寸法が上記範囲内であることで、微細凹凸パターン１２の寸法に応じた、評価対象である細胞の接着性の的確な評価が可能となる。

なお、微細凹凸パターン１２の寸法とは、例えば、微細凹凸パターン１２が平面視略正方形のピラー状であれば当該正方形の一辺の長さ、平面視略円形のピラー状であれば当該円の直径、ラインアンドスペース状であればライン状パターンの短手方向の幅を意味する。また、微細凹凸パターン１２の平面視形状が略正方形や略円形でない場合（不定形である場合）、当該微細凹凸パターン１２の高さ（ピラーの高さ）の１／２の高さを通る切断面であって、基部１１の第１面１１ａと平行な切断面の面積と同一面積を有する円の直径を、微細凹凸パターン１２の寸法とする。

さらに、微細凹凸パターン１２が平面視略円形のホール（穴）状パターンであれば、当該円の直径を微細凹凸パターン１２の寸法とし、微細凹凸パターン１２が平面視不定形のホール状パターンであれば、当該微細凹凸パターン１２の深さ（ホールの深さ）の１／２の深さを通る切断面であって、基部１１の第１面１１ａと平行な切断面の面積と同一面積を有する円の直径を、微細凹凸パターン１２の寸法とする。

第Ｍ（Ｍは１以上Ｎ−１以下の整数である。）評価領域ＥＲ_Mに形成されている微細凹凸パターン１２とそれに隣接する第Ｍ＋１評価領域ＥＲ_M+1に形成されている微細凹凸パターン１２とは、それぞれ、細胞の挙動を評価可能な程度に異なる寸法を有する。具体的には、隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1に形成されている微細凹凸パターン１２の寸法差（絶対値）は、１０ｎｍ以上であるのが好ましく、５０ｎｍ以上であるのが特に好ましい。当該寸法差が１０ｎｍ未満であると、評価対象である細胞の、微細凹凸パターン１２の寸法に依存した接着性を的確に評価するのが困難となるおそれがある。

微細凹凸パターン１２の形状としては、平面視略円形、略矩形又は略多角形のピラー状、ラインアンドスペース状等が好適であるが、これらの形状に限定されるものではなく、例えば、平面視略円形、略矩形又は略多角形のホール状等であってもよい。また、微細凹凸パターン１２は、テーパー状又は逆テーパー状の側壁形状を有していてもよい。

各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの大きさは、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nが倒立顕微鏡の視野内に収まる程度の大きさであるのが好ましい。各評価領域ＥＲの大きさが倒立顕微鏡の視野からはみ出す大きさであると、評価対象物としての細胞を観察しているときに、倒立顕微鏡の視野外に当該細胞が移動してしまうおそれがあり、経時的な細胞の観察が困難となるおそれがある。一方で、当該評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの大きさが小さすぎると、評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N内に細胞が収まりきらず、微細凹凸パターン１２の寸法に依存した接着性を的確に評価するのが困難となるおそれがある。このような観点から、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの大きさは、例えば、１．５ｍｍ×０．５ｍｍ程度であるのが好ましい。

また、後述するように、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０は、好適には、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成された容器本体２の当該底部２ａの外面（容器本体２外）に、貫通孔２ｃからナノ凹凸パターン１２が露出するようにして取り付けられて用いられる（図６，７参照）。そのため、評価領域群ＧＲの大きさは、当該容器本体２の貫通孔２ｃの大きさに応じ、評価領域群ＧＲが貫通孔２ｃから露出され得る程度に、すなわち、細胞挙動評価用基板１０を取り付けた容器本体２の平面視において評価領域群ＧＲが貫通孔２ｃに物理的に包含され得る程度に適宜設定される（図６参照）。

略長方形の各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの一の短辺の近傍であって、評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの外側（図１に示す例においては各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの下側）には、当該評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成されている微細凹凸パターン１２の種類（形状）及び寸法を示す識別マークＩＭが形成されている。図１（Ｂ）に示す例において、「Ｄ１００」は、寸法１００ｎｍのピラー状微細凹凸パターン１２が当該評価領域ＥＲ₂に形成されていることを意味し、「Ｌ１００」は、寸法１００ｎｍのラインアンドスペース状微細凹凸パターン１２が当該評価領域ＥＲ₈に形成されていることを意味する。

また、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの外側（図１（Ｂ）に示す例においては各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ₁₂の上側及び下側）には、隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1の境界を示す境界マークＢＭが形成されている。本実施形態において、評価領域ＥＲに形成されている微細凹凸パターン１２の種類（形状）及び寸法を、細胞の観察と同時に倒立顕微鏡にて判別することは略不可能である。しかし、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０によれば、細胞が良好な接着性を示す微細凹凸パターン１２の種類（形状）及び寸法に関する情報を、細胞の観察と同時に識別マークＩＭや境界マークＢＭから取得することができる。よって、評価対象である細胞の挙動を観察しながら、細胞の接着性に寄与する微細凹凸パターン１２の種類（形状）や寸法を把握することができる。

本実施形態において、識別マークＩＭ及び境界マークＢＭは、図３に示すように、全体として文字や三角形状を表すラインアンドスペース形状の凹凸構造により構成され、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの外側に設けられる。

本実施形態において、各識別マークＩＭ及び各境界マークＢＭの全体の大きさは、細胞の観察に用いられる倒立顕微鏡にて判別可能な大きさであり、例えば、識別マークＩＭの大きさは１００μｍ程度、境界マークＢＭの大きさは５０μｍ程度に設定され得る。

また、各識別マークＩＭ及び各境界マークＢＭを構成する、ラインアンドスペース形状の凹凸構造の寸法は、１〜１０μｍ程度であるのが好ましい。このような寸法範囲の凹凸構造により識別マークＩＭ及び境界マークＢＭが構成されていることで、それらのマークＩＭ，ＢＭが、評価対象である細胞の接着性に対して影響を与え難く、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成されている微細凹凸パターン１２の寸法に依存した細胞の挙動を的確に評価することができる。

識別マークＩＭから評価領域ＥＲまでの距離Ｌ_IMは、評価領域ＥＲ外から評価領域ＥＲ内に向かう細胞の移動に対して障壁とならない程度であればよく、例えば、１００μｍ以上程度に設定され得る。また、境界マークＢＭから評価領域ＥＲまでの距離Ｌ_BMは、例えば、３０μｍ程度に設定され得る。なお、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０において、隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1の一部と、各評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1に対応する識別マークＩＭ及び境界マークＢＭとが、倒立顕微鏡の高倍率での視野内に収まるように、識別マークＩＭ及び境界マークＢＭが設けられているのが好ましい。倒立顕微鏡の高倍率での視野内に隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1の一部と、識別マークＩＭ及び境界マークＢＭとが収まることで、互いに異なる寸法及び間隔の微細凹凸パターン１２が形成されている評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1における細胞の挙動を同時に、かつ詳細に観察することができる。具体的には、高倍率（対物Ｘ１０倍）での倒立顕微鏡の視野の大きさが０．５ｍｍ×０．５ｍｍであり、その視野内に２つの評価領域の一部と、２つの識別マークＩＭと、１つの境界マークＢＭとが少なくとも含まれるように、識別マークＩＭ及び境界マークＢＭが設けられているのが好ましい。

図２に示すように、微細凹凸パターン１２の頂部１２ａは、評価領域群ＧＲの外側における基部１１の第１面１１ａと同一平面上に位置するのが好ましい。基部１１の第１面１１ａと異なる平面上に微細凹凸パターン１２の頂部１２ａが位置すると、細胞が、評価領域群ＧＲの外側に存在する場合に、評価領域群ＧＲ（評価領域ＥＲ内）まで移動するのが困難となり、細胞の挙動の評価が困難となるおそれがある。

微細凹凸パターン１２の高さ（アスペクト比）は、特に限定されるものではなく、微細凹凸パターン１２の寸法に応じて、適宜設定され得る。通常、微細凹凸パターン１２のアスペクト比が０．１〜５、好ましくは０．３〜３程度になるように、微細凹凸パターン１２の高さが設定され得る。

なお、基部１１の第１面１１ａにおける評価領域ＥＲの外側の領域は、後述する底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成された容器本体２の当該底部２ａの外面に取り付けられる際に接着剤が塗布される領域として構成される。

上述した構成を有する本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０によれば、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに、寸法の異なる微細凹凸パターン１２が形成されていることで、微細凹凸パターン１２の寸法に応じた細胞の挙動、すなわち細胞が良好な接着性を示す微細凹凸パターン１２の寸法を的確に評価することができる。

［細胞挙動評価用基板の製造方法］
上述した構成を有する細胞挙動評価用基板１０は、以下のようにして製造することができる。図４は、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板の製造工程を切断端面図にて示す工程フロー図であり、図５は、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板の製造工程であって、図４に示す工程に連続する各工程（透明基材の研磨方法の各工程）を切断端面図にて示す工程フロー図である。

まず、第１面３１ａ及び第１面３１ａに対向する第２面３１ｂを有し、第１面３１ａ上にハードマスク層４１及びレジスト膜４２がその順に形成されてなる透明基材３１を準備する（図４（Ａ）参照）。

透明基材３１としては、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０の構成材料（例えば、石英ガラス、合成石英ガラス、ソーダガラス、蛍石、フッ化カルシウム、フッ化マグネシウム、アクリルガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス材料；ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、その他ポリオレフィン等の樹脂材料等の透明材料）からなる基材等を用いることができる。かかる透明基材３１は、０．５ｍｍを超える厚みを有するものであり、通常、１．０〜６．３５ｍｍ程度の厚みを有するものである。
本実施形態において、透明基材３１は、第１面３１ａ側に複数の細胞挙動評価用基板１０に相当する領域が割り付けられてなる多面付け透明基材であって、後述する工程（図５（Ｄ）参照）において切断されることによって、各細胞挙動評価用基板１０が製造される。

ハードマスク層４１を構成する材料としては、例えば、金属クロム、酸化クロム、窒化クロム、酸窒化クロム等を用いることができる。ハードマスク層４１は、後述する工程（図４（Ｃ）参照）により透明基材３１をエッチングするために用いられるハードマスクパターン４４を形成するための層である。そのため、透明基材３１を構成する材料とのエッチング選択比や、細胞挙動評価用基板１０におけるナノ凹凸パターン１２のアスペクト比を考慮した材料により構成される。例えば、透明基材３１が石英ガラスにより構成される場合、ハードマスク層４１は金属クロム等により構成されるのが望ましい。

レジスト膜４２を構成するレジスト材料としては、特に限定されるものではなく、従来公知のエネルギー線感応型レジスト材料（例えば、電子線感応型レジスト材料、紫外線感応型レジスト材料等）等を用いることができる。

次に、レジスト膜４２をパターニングして、細胞挙動評価用基板１０の各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成される微細凹凸パターン１２に対応するレジストパターン４３を、透明基材３１の第１面３１ａ側における、細胞挙動評価用基板１０の各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N（図１及び図２参照）に相当する領域内に形成する（図４（Ｂ）参照）。

レジストパターン４３を形成する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、電子線リソグラフィー法、フォトリソグラフィー法、ナノインプリントリソグラフィー法等によりレジストパターン４３を形成することができる。

続いて、レジストパターン４３をマスクとして用いてハードマスク層４１をドライエッチング法によりエッチングし、ハードマスクパターン４４を形成する（図４（Ｃ）参照）。そして、当該ハードマスクパターン４４をマスクとして用いて透明基材３１の第１面３１ａをエッチングして微細凹凸パターン１２を形成した後、ハードマスクパターン４４を除去する（図４（Ｄ）参照）。

このようにして第１面３１ａ側に微細凹凸パターン１２が形成された透明基材３１を第２面３１ｂ側から研磨して、透明基材３１の厚みを０．５ｍｍ以下にする。かかる透明基材３１を研磨する方法は、以下のようにして実施され得る。図５は、本実施形態における透明基材３１（第１面３１ａ側に微細凹凸パターン１２が形成された透明基材３１）を研磨する方法の工程を概略的に切断端面図にて示す工程フロー図である。

まず、第１面３１ａに微細凹凸パターン１２が形成された透明基材３１の当該第１面３１ａの全面を覆うように、当該第１面３１ａ上に金属含有膜５１を形成する（図５（Ａ）参照）。

金属含有膜５１を構成する材料としては、例えば、クロム、銅等の金属材料、当該金属の酸化物、窒化物等が挙げられる。後述の研磨工程（図５（Ｃ）参照）後に、金属含有膜５１をエッチング処理により剥離する（図５（Ｄ）参照）ことを考慮すると、透明基材３１として石英ガラスを用いる場合には、選択比等の観点から剥離の容易なクロム、酸化クロム等を、金属含有膜５１を構成する材料として用いるのが好ましい。

金属含有膜５１の厚み（微細凹凸パターン１２の頂部１２ａ上の厚み）は、５０ｎｍ以上であるのが好ましく、５０〜２００ｎｍであるのが好ましい。本実施形態において、透明基材３１の厚みが０．５ｍｍ以下になるまで、透明基材３１の第２面３１ｂ側から研磨するため（図５（Ｃ）参照）、研磨処理の過程で透明基材３１の厚みが薄くなるに従い、透明基材３１の強度が低下する。また、後述するように、厚みが０．５ｍｍ以下にまで研磨された透明基材３１が切断され個片化されることで、細胞挙動評価用基板１０が製造される（図５（Ｄ），（Ｅ）参照）。そのため、金属含有膜５１の厚みが５０ｎｍ未満であると、透明基材３１の補強効果が不十分となり、研磨処理や切断工程において透明基材３１が破損してしまうおそれがある。

第１面３１ａに金属含有膜５１を形成する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、ＰＶＤ法、真空蒸着法等の公知の成膜法を採用することができる。

次に、金属含有膜５１上に有機膜５２を形成する（図５（Ｂ）参照）。後述する研磨工程（図５（Ｃ）参照）において、微細なパーティクル等が生じるが、金属含有膜５１上に有機膜５２を形成しておくことで、有機膜５２を除去する過程で当該パーティクル等も同時に除去することができるため、当該パーティクル等が微細凹凸パターン１２に付着してしまうのを防止することができる。

有機膜５２を構成する材料としては、特に限定されるものではなく、例えば、上述したレジスト膜４２（図４（Ａ）参照）を構成する材料と同様の材料を用いることができる。

金属含有膜５１上に有機膜５２を形成する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スピンコート法等の公知の塗布方法により有機膜５２を構成する材料を塗布した後、当該材料を硬化させる方法等を採用することができる。

有機膜５２の厚みは、特に限定されるものではなく、後述する研磨工程（図５（Ｃ）参照）において生じ得る微細なパーティクル等が微細凹凸パターン１２内に付着してしまうのを防止し得る程度の厚みであればよい。例えば、有機膜５２の厚みは、２００〜５００ｎｍ程度である。

続いて、有機膜５２が形成された透明基材３１を、厚みが０．５ｍｍ以下になるまで第２面３１ｂ側から研磨する（図５（Ｃ）参照）。第１面３１ａ側に金属含有膜５１が形成されていることで、透明基材３１を破損させることなく、厚みが０．５ｍｍ以下になるまで研磨することができる。また、金属含有膜５１上に有機膜５２が形成されていることで、研磨の過程で生じるパーティクル等が微細凹凸パターン１２に付着してしまうのを防止することができる。

透明基材３１を研磨する方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、化学機械研磨処理（Chemical Mechanical Polishing，ＣＭＰ）、回転研磨盤等を用いた機械研磨処理等が挙げられる。好ましくは、機械研磨処理により厚み０．５ｍｍ超１ｍｍ以下程度まで研磨（１次研磨）した後、ＣＭＰにより厚み０．５ｍｍ以下になるまで研磨（２次研磨）する。

このようにして研磨され、０．５ｍｍ以下の厚みを有する透明基材３１の第１面３１ａ側から有機膜５２及び金属含有膜５１を剥離する。これにより、本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０を製造することができる（図５（Ｄ）参照）。

有機膜５２及び金属含有膜５１を剥離する方法は、特に限定されるものではなく、例えば、硫酸等を含む洗浄液にて有機膜５２を溶解して除去する方法、金属含有膜５１を構成する金属材料等をエッチング可能なエッチング液を用いて金属含有膜５１を除去する方法等が挙げられる。

本実施形態における研磨方法やそれを含む細胞挙動評価用基板１０の製造方法によれば、第１面３１ａ側にナノ凹凸パターン１２が形成されてなる透明基材３１を破損させることなく、厚み０．５ｍｍ以下にまで研磨することができ、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察可能な細胞挙動評価用基板１０を容易に製造することができる。

［評価用容器］
上述した構成を有する細胞挙動評価用基板１０は、第１面１１ａ側における微細凹凸パターン１２上に存在する、評価対象である細胞を、倒立顕微鏡を用いて第２面１１ｂ側から観察し、当該細胞の挙動を評価するために用いられるものであるが、後述する評価用容器の態様で用いられるのが好適である。図６は、本実施形態における評価用容器の概略構成を示す平面図（上面図）であり、図７は、本実施形態における評価用容器の概略構成を示す、図６におけるII−II線切断端面図である。

図６及び図７に示すように、本実施形態における評価用容器１は、底部２ａ及び当該底部２ａの外周縁に連続する周壁部２ｂを有し、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２と、容器本体２の底部２ａに取り付けられている本実施形態に係る細胞挙動評価用基板１０とを備える。

本実施形態において、容器本体２は、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成され、上方に開口するシャーレ状容器であるが、底部に貫通孔が形成されている限りにおいて、このような態様に限定されるものではない。例えば、底部に貫通孔が形成されているフラスコ状容器等であってもよい。

平面視における容器本体２の大きさは、特に限定されるものではなく、細胞培養等において一般的に用いられているシャーレと同等の直径、例えば、直径３０〜６０ｍｍ程度であるのが好ましい。また、容器本体２の底部２ａの厚みは、０．８〜１．５ｍｍ程度である。

容器本体２は、合成樹脂製のものであってもよいし、ガラス製のものであってもよい。また、周壁部２ｂと底部２ａとが異なる材質（例えば、周壁部２ｂが合成樹脂製であって、底部２ａがガラス製等）により構成されるものであってもよい。

貫通孔２ｃの大きさは、特に限定されるものではないが、細胞挙動評価用基板１０の第１面１１ａの評価領域群ＧＲを物理的に包含し得る大きさであるのが好ましく、例えば、直径１０〜３０ｍｍ程度である。

本実施形態において、細胞挙動評価用基板１０は、容器本体２内に評価領域群ＧＲが位置するように、すなわちすべての評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nの微細凹凸パターン１２が貫通孔２ｃから露出するようにして、容器本体２の底部２ｂの外面に取り付けられている。そして、評価用容器１（容器本体２）の平面視（上面視）において、細胞挙動評価用基板１０は、評価領域群ＧＲ（すべての評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N）が貫通孔２ｃに重なるように、すなわち評価領域群ＧＲ（すべての評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N）が貫通孔２に物理的に包含されるようにして、容器本体２の底部２ａの外面に取り付けられている。

細胞挙動評価用基板１０は、貫通孔２ｃを塞ぐようにして容器本体２の底部２ａの外面に取り付けられている。すなわち、貫通孔２ｃが形成されている底部２ａと、当該貫通孔２ｃを塞ぐ細胞挙動評価用基板１０とにより、容器本体２の底面が構成されている。

細胞挙動評価用基板１０は、接着剤（図示せず）を介して容器本体２の底部２ａの外面における貫通孔２ｃの周縁近傍に接着することで取り付けられているのが好ましい。かかる接着剤としては、特に限定されるものではないが、細胞挙動評価用基板１０及び容器本体２の底部２ａの構成材料に応じてそれらに対する接着力が高く、評価用容器１内に収容される培養液等に対するシール性（液密性）を有し、細胞に対して悪影響を与えない（毒性等を有しない）ものであるのが好まし。当該接着剤としては、例えば、脱オキシム型シリコーン系接着剤等が用いられ得る。

上述した構成を有する本実施形態における評価用容器１によれば、０．５ｍｍ以下の厚みＴ₁₁を有する細胞挙動評価用基板１０が容器本体２の底部２ａの外面に、すべての評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nが容器本体２の貫通孔２ｃに物理的に包含されるようにして取り付けられていることで、微細凹凸パターン１２上に存在する細胞を、倒立顕微鏡を用いて高倍率で観察することができる。また、細胞は、いずれかの評価領域ＥＲに形成されている、いずれかの寸法の微細凹凸パターン１２に対して良好な接着性を示すため、微細凹凸パターン１２の寸法に依存した接着性を評価することができる。

［評価用容器の製造方法］
上述した評価用容器１は、底部２ａ及び当該底部２ａの外周縁に連続する周壁部２ｂを有し、底部２ａの略中央に貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２を準備し、当該容器本体２の底部２ａの外面に、細胞挙動評価用基板１０の第１面１１ａの評価領域群ＧＲの外周の領域に塗布された接着剤を介して当該細胞挙動評価用基板１０を取り付けることにより製造され得る。

このとき、容器本体２の貫通孔２ｃを塞ぐように、かつ細胞挙動評価用基板１０における評価領域群ＧＲ（すべての評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N）が、貫通孔２ｃから露出するようにして、当該細胞挙動評価用基板１０を容器本体２の底部２ａに取り付ける。これにより、すべての評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成されている微細凹凸パターン１２を容器本体２内に位置させることができる。

本実施形態によれば、容器本体２の底部２ａの略中央に形成されている貫通孔２ｃを塞ぐように細胞挙動評価用基板１０を接着させるだけで評価用容器１を製造することができるため、評価用容器１を容易に製造することができる。

［評価方法］
上述した評価用容器１は、評価対象である細胞を観察し、当該細胞の挙動を評価するために用いられるものである。以下、当該評価用容器１を用いて細胞を観察し、当該細胞の挙動を評価する方法について説明する。図８は、本実施形態における評価方法を示す概略図である。

図８に示すように、本実施形態においては、評価用容器１内に細胞７１を播種し、当該評価用容器１を倒立顕微鏡（図示せず）のステージ６１上に載置する。倒立顕微鏡のステージ６１には、所定の大きさの開口６２が形成されているため、この開口６２内に評価用容器１の評価領域群ＧＲが位置するように、評価用容器１をステージ６１上に載置する。

そして、倒立顕微鏡の対物レンズ６３を、評価用容器１の底部２ａに接着されている細胞挙動評価用基板１０の第２面１１ｂ側に近接させて、所望とする倍率で細胞７１を第２面１１ｂ側から観察する。

このとき、評価用容器１内の細胞７１は、評価領域群ＧＲの各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成されている、互いに異なる寸法の微細凹凸パターン１２のうち、所定の寸法の微細凹凸パターン１２に対して良好な接着性を示す。そのため、本実施形態のように、倒立顕微鏡を用いて細胞７１を第２面１１ｂ側から観察することで、微細凹凸パターン１２の寸法に応じた当該細胞７１の接着性を容易に評価することができる。

また、本実施形態における評価方法によれば、評価用容器１の底部２ａに取り付けられている細胞挙動評価用基板１０の厚みＴ₁₁が０．５ｍｍ以下であることで、微細凹凸パターン１２上に存在する細胞７１と対物レンズ６３との間の距離を極めて短くして観察することができる。そのため、極めて高い倍率で細胞７１を観察することができる。

以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等物をも含む趣旨である。

上記実施形態において、細胞挙動評価用基板１０の各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nが、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成されている微細凹凸パターン１２の寸法順に並列しているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。

上記実施形態において、細胞挙動評価用基板１０の隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1の境界が、境界マークＢＭにより示されているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、図９に示すように、隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1を区分する壁部１３が存在していてもよい。この場合において、壁部１３の短手方向の寸法Ｗ₁₃は、細胞の観察時に用いられる倒立顕微鏡にて当該壁部１３を認識（判別）可能な寸法（例えば、１０μｍ程度）に設定され得る。

上記実施形態において、評価領域群ＧＲの各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nにピラー状及びラインアンドスペース状の微細凹凸パターン１２が形成されている態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、評価領域群ＧＲの各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに互いに寸法の異なるピラー状の微細凹凸パターン１２又はラインアンドスペース状の微細凹凸パターン１２が形成されている態様であってもよい。

上記実施形態において、隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1の境界を示す境界マークＢＭが全体として三角形状を有し、各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_Nに形成されている微細凹凸パターン１２の寸法等を示す識別マークＩＭが文字（英数字）形状を有するが、本発明はこのような態様に限定されるものではなく、境界マークＢＭ及び識別マークＩＭのそれぞれの機能が奏され得る限りにおいて、いかなる形状であってもよい。

上記実施形態において、評価用容器１は、細胞挙動評価用基板１０が容器本体２の底部２ａの外面に取り付けられてなるが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、細胞挙動評価用基板１０の第２面１１ｂ側に接着剤を塗布し、容器本体２における底部２ａの貫通孔２ｃの外周縁の領域に当該細胞挙動評価用基板１０を接着し、細胞挙動評価用基板１０が容器本体２内に取り付けられてなるものであってもよい。

上記実施形態においては、細胞挙動評価用基板１０を、底部２ａに貫通孔２ｃが形成されてなる容器本体２の当該底部２ａに取り付けて用いる態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。上記細胞挙動評価用基板１０は、そのまま評価対象である細胞の観察・評価用途に用いられてもよい。

上記実施形態においては、透明基材３１の第１面３１ａ側に微細凹凸パターン１２を形成した後、ハードマスクパターン４４を除去してから金属含有膜５１を形成しているが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、ハードマスクパターン４４を除去することなく、金属含有膜５１を形成してもよい。この場合、金属含有膜５１を剥離する工程（図５（Ｄ）参照）において、金属含有膜５１とともにハードマスクパターン４４を除去可能であるのが好ましいため、ハードマスクパターン４４と金属含有膜５１とは、同一のエッチング液にてエッチング可能な材料により構成されているのが好ましい。

上記実施形態においては、一の細胞挙動評価用基板１０に相当する大きさの透明基材を用いて、一の細胞挙動評価用基板１０を製造する態様を例に挙げて説明したが、本発明はこのような態様に限定されるものではない。例えば、第１面３１ａ側に複数の細胞挙動評価用基板１０に相当する領域が割り付けられてなる多面付け透明基材３１を用いて細胞挙動評価用基板１０を製造してもよい。この態様においては、研磨後の透明基材３１を切断して個片化した後に、金属含有膜５１を剥離すればよい（図５（Ｄ）参照）。

以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例等により何ら限定されるものではない。

〔細胞挙動評価用基板の製造例〕
厚さ６ｎｍのＣｒからなるハードマスク層４１が第１面３１ａに設けられている透明基材３１としての石英ガラス基板（１５２ｍｍ×１５２ｍｍ，厚さ：６．３５ｍｍ）を用意し、電子線感応型レジスト（製品名：ＳＥＢＰ−９０１２，信越化学工業社製）をハードマスク層４１上に塗布してレジスト膜４２を形成した。当該レジスト膜４２上に電子線描画装置を用いてピラー状のレジストパターン４３を形成した。また、石英ガラス基板３１の第１面３１ａ上の１４ｍｍφの領域内に５個の評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆（各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆の大きさ：５００μｍ×１５００μｍ）を設定し、各領域に間隔及び寸法の異なるピラー状のレジストパターン４３（レジストパターン４３の間隔及び寸法：評価領域ＥＲ₂＝１００ｎｍ，評価領域ＥＲ₃＝１５０ｎｍ，評価領域ＥＲ₄＝２００ｎｍ，評価領域ＥＲ₅＝３００ｎｍ，評価領域ＥＲ₆＝５００ｎｍ）、各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆に対応する識別マークＩＭのレジストパターン（各識別マークＩＭの文字列：１００，１５０，２００，３００，５００）及び各境界マークＢＭのレジストパターンを形成した（図４（Ｂ）参照）。識別マークＩＭの大きさは１００μｍ、境界マークＢＭの大きさは５０μｍであり、また、各識別マークＩＭ及び各境界マークＢＭを構成する、ラインアンドスペース形状の凹凸構造の寸法は、２μｍである。

次に、レジストパターン４３をマスクとして用いてハードマスク層４１をドライエッチング（エッチングガス：Ｃｌ₂＋Ｏ₂）し、残存するレジストパターン４３を除去して、ハードマスクパターン４４を形成した。

上述のようにして形成されたハードマスクパターン４４をマスクとして用いて石英ガラス基板３１をエッチングし、石英ガラス基板３１の第１面３１ａの各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆に、所定の間隔及び寸法のピラー状の微細凹凸パターン１２（微細凹凸パターン１２の間隔及び寸法（走査型電子顕微鏡（Ｖｉｓｔｅｃ社製，製品名：ＬＷＭ９０００）を用いて測定）：評価領域ＥＲ₂＝１００ｎｍ，評価領域ＥＲ₃＝１５０ｎｍ，評価領域ＥＲ₄＝２００ｎｍ，評価領域ＥＲ₅＝３００ｎｍ，評価領域ＥＲ₆＝５００ｎｍ）を形成するとともに、各識別マークＩＭ及び各境界マークＢＭを形成した。ピラー状の微細凹凸パターン１２高さは測定誤差が見込まれるものの、１００〜２００ｎｍであった。最後に、ハードマスクパターン４４を剥離して、細胞挙動評価用基板１０を製造した。

〔試験例１〕
底面に１４ｍｍφの穴が形成されている穴あきディッシュ（３５ｍｍφ）を準備し、微細凹凸パターン１２が形成されている各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆が当該底面の穴から露出するように、細胞挙動評価用基板１０を穴あきディッシュの底面の外側に取り付けた。
次に、上記穴あきディッシュ内に２×１０⁵個のヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Normal Human Dermal Fibroblast）を播種し、当該細胞と細胞挙動評価用基板１０の微細凹凸パターン１２とを接触させた状態で、３７℃のインキュベータ内で２４時間培養した。培養液として、カナマイシン添加のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を用いた。

培養後、各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆近傍を撮像した画像に基づき、微細凹凸パターン１２の間隔及び寸法と、細胞接着の状態との関係を評価する評価試験を行った。結果を図１０に示す。

図１０（Ａ）は、ピラー状の微細凹凸パターン１２の間隔及び寸法が異なる評価領域ａ及び評価領域ｂの境界近傍の顕微鏡写真である。図１０（Ａ）に示すように、評価領域ｂの細胞密度が評価領域ａの細胞密度よりも大きいことが明白であった。また、図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）における評価領域ａ及び評価領域ｂとは別の評価領域ｃ及び評価領域ｄの境界近傍の顕微鏡写真である。図１０（Ｂ）に示すように、別の評価領域の境界においても、評価領域ｃの細胞密度は、評価領域ｄの細胞密度よりも大きいことが明白であった。

〔試験例２〕
底面に１４ｍｍφの穴が形成されている穴あきディッシュ（３５ｍｍφ）を準備し、微細凹凸パターン１２が形成されている各評価領域ＥＲ₂〜ＥＲ₆が当該底面の穴から露出するように、細胞挙動評価用基板１０を穴あきディッシュの底面の外側に取り付けた。

次に、上記穴あきディッシュ内に１×１０⁴個のヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Normal Human Dermal Fibroblast）を播種し、当該細胞と細胞挙動評価用基板１０の微細凹凸パターン１２とを接触させた状態で、３７℃のインキュベータ内で２４時間培養した。培養液として、カナマイシン添加のＤＭＥＭ培地を用いた。結果を図１１に示す。

図１１は、倒立顕微鏡を用いて評価領域ＥＲ₃〜ＥＲ₅を撮像した写真である。
図１１に示すように、隣接する評価領域ＥＲ_M，ＥＲ_M+1の境界を示す境界マークＢＭと、各評価領域ＥＲ₃〜ＥＲ₅に形成されている微細凹凸パターン１２の寸法を示す識別マークＩＭ₃〜ＩＭ₅が識別できることを確認された。

上記試験例１及び２から、細胞挙動評価用基板１０の各評価領域ＥＲ₁〜ＥＲ_N内に形成されている微細凹凸パターン１２の間隔及び寸法が適切な範囲で設定され、異なる間隔及び寸法の微細凹凸パターン１２が隣接して形成されていることで、細胞の挙動を的確に評価可能であることが確認された。

本発明は、創薬開発、再生医療等のバイオテクノロジー関連分野における細胞の挙動評価等において有用である。

１…評価用容器
２…容器本体
２ａ…底部
２ｂ…周壁部
２ｃ…貫通孔
１０…細胞挙動評価用基板
１１…基部
１１ａ…第１面
１１ｂ…第２面
１２…微細凹凸パターン
ＥＲ…評価領域

Claims (14)

1. 微細凹凸パターン上における細胞の挙動を評価するための細胞挙動評価用基板であって、
   第１面及び当該第１面に対向する第２面を有する基部と、
   前記基部の前記第１面に形成されている前記微細凹凸パターンと
   を備え、
   前記基部の前記第１面には、所定の一方向に沿って順に並列する複数の評価領域を含む評価領域群が設定されており、
   前記評価領域群は、前記複数の評価領域のうちの一部の評価領域を含む第１評価領域群と、前記第１評価領域群に含まれない評価領域を含む第２評価領域群とを有し、
   前記第１評価領域群に含まれる評価領域には、第１の形状の前記微細凹凸パターンが形成されており、
   前記第２評価領域群に含まれる評価領域には、前記第１の形状とは異なる種類の第２の形状の前記微細凹凸パターンが形成されており、
   前記複数の評価領域のうちの互いに隣接する評価領域のそれぞれに形成されている前記微細凹凸パターンは、１００〜５００ｎｍの範囲内の寸法であって前記細胞の挙動を評価可能な程度に互いに異なる寸法を有することを特徴とする細胞挙動評価用基板。
2. 前記第１の形状が、ピラー形状であり、前記第２の形状が、ラインアンドスペース形状であることを特徴とする請求項１に記載の細胞挙動評価用基板。
3. 前記第１面における前記複数の評価領域のそれぞれの近傍に、前記複数の評価領域のそれぞれに形成されている前記微細凹凸パターンの寸法に関する情報を含む識別マークが設けられていることを特徴とする請求項１又は２に記載の細胞挙動評価用基板。
4. 前記第１評価領域群及び前記第２評価領域群は、それぞれ複数の前記評価領域を含み、
   前記第１評価領域群に含まれる前記複数の評価領域のそれぞれに形成されている前記微細凹凸パターンの寸法は、前記評価領域の並列順に段階的に変化し、
   前記第２評価領域群に含まれる前記複数の評価領域のそれぞれに形成されている前記微細凹凸パターンの寸法は、前記評価領域の並列順に段階的に変化することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞挙動評価用基板。
5. 前記第１評価領域群に含まれる前記複数の評価領域のうちの一の評価領域に形成されている前記微細凹凸パターンと、前記一の評価領域に隣接する評価領域に形成されている前記微細凹凸パターンとが連続しており、
   前記第２評価領域群に含まれる前記複数の評価領域のうちの一の評価領域に形成されている前記微細凹凸パターンと、前記一の評価領域に隣接する評価領域に形成されている前記微細凹凸パターンとが連続していることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞挙動評価用基板。
6. 前記第１面における隣接する２つの前記評価領域の間の境界を示すマークが、当該境界の近傍に設けられていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の細胞挙動評価用基板。
7. 前記微細凹凸パターンの頂部は、前記第１面における前記評価領域以外の領域と同一平面上に位置することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞挙動評価用基板。
8. 前記評価領域群に含まれる前記複数の評価領域は、いずれも前記微細凹凸パターン上における前記細胞の挙動を観察するための光学顕微鏡の視野に収まる程度の大きさであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の細胞挙動評価用基板。
9. 貫通孔が形成されてなる底部及び前記底部の外周縁に連続する周壁部を有する容器本体と、
   前記底部に取り付けられてなる請求項１〜８のいずれかに記載の細胞挙動評価用基板と
   を備え、
   前記容器本体の平面視において前記微細凹凸パターンが前記貫通孔に重なるように、かつ前記容器本体内に位置するようにして、前記細胞挙動評価用基板が前記底部に取り付けられており、
   前記貫通孔は、前記細胞挙動評価用基板により塞がれていることを特徴とする細胞挙動評価用容器。
10. 前記細胞挙動評価用基板は、前記容器本体の平面視において前記微細凹凸パターンが前記貫通孔に物理的に包含されるようにして、前記底部に取り付けられてなることを特徴とする請求項９に記載の細胞挙動評価用容器。
11. 前記細胞挙動評価用基板が、前記貫通孔から前記微細凹凸パターンを露出させるようにして、前記容器本体の前記底部の外面に取り付けられていることを特徴とする請求項９又は１０に記載の細胞挙動評価用容器。
12. 前記細胞挙動評価用基板が、接着剤を介して前記底部に取り付けられていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の細胞挙動評価用容器。
13. 請求項９〜１２のいずれかに記載の細胞挙動評価用容器内に評価対象細胞を播種し、
    前記微細凹凸パターン上の前記評価対象細胞を、前記細胞挙動評価用基板の前記第２面側から観察し、当該細胞の挙動を評価することを特徴とする細胞挙動評価方法。
14. 倒立顕微鏡を用いて前記評価対象細胞を観察することを特徴とする請求項１３に記載の細胞挙動評価方法。