JP6124051B2 - 細胞培養シート、およびその製造方法、並びにこれを用いた細胞培養容器 - Google Patents
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Description
本発明に係る細胞培養シートは、透明な無機材料を含む第1の無機層を有する。この際、前記第1の無機層は、少なくとも1つの微小孔を有する。また、本発明に係る細胞培養シートは、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有する。なお、本明細書において、「平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状」とは、膜厚を有する板状の形状であって、上面および/または下面が平面視において少なくとも一部の曲線を含む形状を意味する。具体例としては、円板形状、卵形状、長円板形状、楕円板形状、角部にアール部を設けた多角形の板形状等を例示できる。これらのうち、前記「平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状」は、円板形状であることが好ましい。
第1の無機層は、細胞を培養する際に細胞の足場となる機能を有する。当該第1の無機層は、透明な無機材料を含む。
用いられうる透明な無機材料としては、透明な無機の材料であれば特に制限されない。例えば、ケイ素、チタン、亜鉛、スズ、アルミニウムの窒化物、酸化物、酸化窒化物等のうち、透明なものが挙げられる。具体的には、窒化ケイ素(SiN)、酸化ケイ素(SiO2)、酸化チタン(TiO2)、酸化亜鉛(ZnO)、酸化スズ(SnO2)、酸化窒化ケイ素(SiON)、酸化窒化チタン(TiON)等が挙げられる。なお、透明でないという観点から、例えば、酸化アルミニウム等については透明な無機材料には含まれない。これらのうち、透明な無機材料は、窒化ケイ素、二酸化ケイ素であることが好ましく、窒化ケイ素であることがより好ましい。上述の透明な無機材料は単独で用いても、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
第1の無機層は少なくとも1つの微小孔を有する。微小孔は、細胞培養シートが担持する細胞に培地の栄養素を供給する等により、細胞の好適な培養環境を実現する機能を有する。なお、本明細書において「微小孔」とは、孔を構成する任意の2点のうち、最大となる部分の長さ(直径)が20μm以下、好ましくは0.1〜10μm、さらに好ましくは0.5〜5μmである孔を意味する。
前記第1の無機層は、培養の目的等に応じて、その表面が機能性分子で修飾(表面修飾)されていてもよい。第1の無機層の表面が機能性分子で修飾されることにより、例えば、細胞培養シート上に配置される細胞を細胞培養シートに高い接着性で固定させること、細胞の増殖を促進させること等が可能となる。
細胞培養シートは、第1の無機層の外周上に外周層をさらに有していてもよい。外周層は、基材層を含む。前記外周層は、必要に応じて、透明な無機材料を含む第2の無機層やその他の任意の層をさらに有してもよい。
基材層は、外周層の必須の構成要素である。
第2の無機層は、外周層の任意の構成要素である。前記第2の無機層は、透明な無機材料を含む。
細胞培養シートは、第1の無機層上に仕切り層をさらに有していてもよい。仕切り層は、基材層を含む。前記仕切り層は、必要に応じて、透明な無機材料を含む第2の無機層やその他の任意の層をさらに有してもよい。なお、本明細書において「仕切り層」とは、第1の無機層を少なくとも2つの領域に分離する層を意味する。
基材層は、仕切り層の必須の構成要素である。
第2の無機層は、仕切り層の任意の構成要素である。
本発明に係る細胞培養シートは、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。例えば、ガラス上に微小孔を形成するためのマスクを形成した後、透明な無機材料を蒸着して無機層を形成し、次いで、形成された無機層を剥離させることにより細胞培養シートを製造する方法;シリコンウエハ上に透明な無機材料を蒸着して無機層を形成し、パターニングしたレジストを用いて無機層をドライエッチングすることにより微小孔を形成し、次いで、形成された無機層を剥離することにより細胞培養シートを製造する方法等が挙げられる。この際、少なくとも一部に曲線を含む表面を有するガラス、シリコンウエハを使用する方法;形成された無機層を加工する方法等を適宜行うことにより、細胞培養シートが、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有することとなりうる。
工程(1)は、シリコンウエハの一方の面上に透明な無機材料を含む第1の層を形成する工程である。
シリコンウエハとしては、特に制限されないが、本形態においては、単結晶構造を有するシリコンウエハを用いる。この際、シリコンウエハが(100)面を表面に有することが好ましい。
透明な無機材料としては、上述したものと同様のものが用いられうることからここでは説明を省略する。
第1の層は、通常、シリコンウエハの面上に配置される。この際、第1の層は透明な無機材料を含む。前記第1の層が形成される面は、シリコンウエハの(100)面であることが好ましい。
第1の層の形成方法としては、特に制限されず、公知の手法が適用されうる。具体例としては、蒸着法、イオンプレーティング法、スパッタ法等の物理的気相成長法;熱CVD法、触媒化学気相成長法、光CVD法、プラズマCVD法等の化学気相成長法が挙げられる。これらのうち、プラズマCVD法により第1の層を形成することが好ましい。
工程(2)は、シリコンウエハの他方の面(第1の層が形成された面とは反対側の面)上に透明な無機材料を含む第2の層を形成する工程である。
工程(3)は、前記第1の層に微小孔を形成する工程である。
工程(a)は第1の層の表面にレジスト層を形成する工程である。
工程(b)は、工程(a)で形成されたレジストをパターニングする工程である。
工程(c)は第1の層をエッチングする工程である。
工程(4)は、前記第2の層にエッチング窓を形成する工程である。
工程(5)は、第2の層の方向から結晶異方性エッチングを行う工程である。この際、前記第2の層がエッチングマスク層として機能する。
本発明の一実施形態において、本形態に係る製造方法は、培養面を表面処理する工程(6)をさらに含んでいてもよい。当該工程(6)は、プラズマ処理により培養面に官能基を導入する工程と、前記官能基に機能性分子を導入する工程と、を含む。
本発明に係る細胞培養シートは、細胞培養容器に好適に使用される。
筒状部材は、細胞培養シートを保持するとともに、ウェルを提供する機能を有する。
細胞培養シートは、筒状部材の筒部に配置される。
細胞培養シートや、これを構成する筒状部材は適宜改変を施してもよいし、その他の部材を適宜使用してもよい。例えば、筒状部材を有底筒状に形成してもよい。また、筒状部材の内壁面に取り付けられ、細胞培養シートを筒状部材に対してより好適に固定するための支持部材を設けてもよい。この支持部材は、細胞培養シートの周囲が載置される形態、細胞培養シートの周縁を挟持して支持する形態等、種々の形態が採用されうる。さらに、培養した細胞を細胞培養シートの裏面(培養面とは反対の面)から観察するための観察部材を設けてもよい。これらのその他の部材等については、公知の技術が適宜採用されうる。
外周層を有する細胞培養シートを製造した。
はじめに円板状のシリコンウエハ(直径約50mm)を準備した。
シリコンウエハの第1の層と対向する面上に、工程(1)と同様の方法で、第2の層としての窒化ケイ素の層を形成した。形成した窒化ケイ素の層の膜厚は、1μmであった。
工程(a)
第1の層の表面に、ポジ型レジストであるOFPR−800LB 23CP(東京応化工業株式会社製)をスピンコート法により塗布し、90℃で90秒乾燥させることによりレジスト層を形成した。
予め、微小孔の孔径が9μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が56%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを、工程(a)で形成したレジスト層上に配置した。ガラスマスクを圧着させてレジスト層に密着させ、紫外線(波長:436nm)によりレジスト層を露光した。次に、現像液であるNMD−3(水酸化テトラメチルアンモニウムの2.38%水溶液、東京応化工業株式会社製)に、上記露光後のシリコンウエハ積層体を浸漬し、レジスト層を現像することで、レジストをパターニングした。
残存したレジスト層をマスクとして、ドライエッチングを行うことにより第1の層に微小孔を形成した。より詳細には、反応性ガスとして四フッ化炭素(CF4)ガスのプラズマにより、第1の層をエッチングした。この際、エッチングガスの流量は、50mL/min、圧力は50Pa、エッチング時間は360秒であった。次いで、アセトンに浸漬することにより、ポジ型レジストをすべて除去した。なお、形成された微小孔は孔径が9μm、微小孔間のピッチが12μmであった。また、微小孔の角度は90度であった。
工程(5)における結晶異方性エッチングにより培養面の直径が7.1mm、面積が39.6mm2となるようにパターニングしたガラスマスクを用いたことを除いては、上記工程(3)と同様の方法で、第2の層に円形のエッチング窓を形成した。
工程(4)において形成したエッチング窓から結晶異方性エッチングを行うことにより、外周層を有する細胞培養シートを形成した。
微小孔の孔径が5μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が17%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
微小孔の孔径が6μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が1%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
微小孔の孔径が6μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が13%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
微小孔の孔径が6μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が66%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
微小孔の孔径が3μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が2%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
微小孔の孔径が3μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が14%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
微小孔の孔径が3μm、微小孔間のピッチが12μm、微小孔の面積率が38%の微小孔が形成されるようにパターニングされたガラスマスクを使用したことを除いては、実施例1と同様の方法で、外周層を有する細胞培養シートを製造した。
市販品のMillicell(登録商標)セルカルチャーインサート(孔径:8μm、微小孔間のピッチ:不規則、微小孔の面積率:不明、ポリカーボネート製、日本ミリポア株式会社性)を使用した。
市販品のMillicell(登録商標)セルカルチャーインサート(孔径:0.4μm、微小孔間のピッチ:不規則、微小孔の面積率:13%、ポリカーボネート製、日本ミリポア株式会社性)を使用した。
エッチング液に、Triton X−100を添加せず、培養面の一辺の長さが6.3mm、面積が39.7mm2となるように条件を調節したことを除いては、実施例2と同様の方法で、培養面が矩形の細胞培養シートを製造した。
実施例1〜7、参考例8および比較例1〜3の細胞培養シートを用いて透明性および培養細胞の分布に係る性能評価を行った。
細胞培養シートを、DMEM/F12培養液に浸漬させた。次いで、マルチチャンネル分光器PMA−12 C10027−01(浜松ホトニクス株式会社製)を使用し、培養液中における細胞培養シート(培養面)の波長域400〜800nmにおける光透過率を求めた。
まず、実施例1および2と、比較例1および2とを対比した。得られた結果を図7に示す。
実施例3〜5および実施例6〜8について、それぞれ孔径を6μmおよび3μmに設定し、微小孔の面積率(開孔率)を適宜変更した場合における細胞培養シートの光線透過率を対比した。得られた結果を図8に示す。
次に実施例2および比較例3の細胞培養シートを用いて、細胞培養をした場合における細胞の分布について試験した。
1 第1の無機層、
2 微小孔、
3 外周層、
4 基材層、
5 第2の無機層、
6 仕切り層、
7 シリコンウエハ、
8 第1の層、
9 第2の層、
10 エッチング窓、
400、500 細胞培養装置、
11 中空円筒部材。
Claims (15)
- 透明な無機材料を含む第1の無機層を有する、細胞培養シートであって、
前記第1の無機層が、少なくとも1つの微小孔を有し、
前記第1の無機層の培養面が、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有し、
前記微小孔を構成する任意の2点のうち、最大となる部分の長さが5〜10μmである、細胞培養シート。 - 前記第1の無機層における開孔率が、1〜70%である、請求項1に記載の細胞培養シート。
- 透明な無機材料を含む第1の無機層を有する、細胞培養シートであって、
前記第1の無機層が、少なくとも1つの微小孔を有し、
前記第1の無機層の培養面が、平面視において少なくとも一部に曲線を含む形状を有し、
前記微小孔を構成する任意の2点のうち、最大となる部分の長さが0.1〜5μmであり(ただし、前記微小孔を構成する任意の2点のうち、最大となる部分の長さが5μmである場合を除く)、
前記第1の無機層における開孔率が、20%以下である、細胞培養シート。 - 前記微小孔を構成する任意の2点のうち、最大となる部分の長さが0.5〜3μmである、請求項3に記載の細胞培養シート。
- 前記無機材料が、窒化ケイ素または酸化ケイ素である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養シート。
- 前記第1の無機層の膜厚が、0.1〜5μmである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞培養シート。
- 前記第1の無機層の表面粗さ(Ra)が、10nm以下である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の細胞培養シート。
- 前記第1の無機層の外周上に配置された外周層をさらに有する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の細胞培養シート。
- 前記第1の無機層上に仕切り層をさらに有する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞培養シート。
- シリコンウエハの一方の面上に透明な無機材料を含む第1の層を形成する工程(1)と、
前記シリコンウエハの他方の面上に透明な無機材料を含む第2の層を形成する工程(2)と、
前記第1の層に、微小孔を形成する工程(3)と、
前記第2の層にエッチング窓を形成する工程(4)と、
前記第2の層の方向から結晶異方性エッチングを行う工程(5)と、
を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞培養シートの製造方法。 - 前記第2の層が、前記シリコンウエハの(100)面に形成される、請求項10に記載の製造方法。
- 前記結晶異方性エッチングが、水酸化テトラメチルアンモニウムおよび界面活性剤を含むエッチング液を用いて行われる、請求項10または11に記載の製造方法。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載の細胞培養シートと、
前記細胞培養シートの外周縁に接触する、または隙間を隔てて向かい合う内壁面を備える筒状部材と、
を含む、細胞培養容器。 - 前記細胞培養シートが、前記筒状部材の底面に配置される、請求項13に記載の細胞培養容器。
- 前記細胞培養シートが、前記筒状部材の中央部に配置される、請求項13に記載の細胞培養容器。
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