JP6596442B2 - Dna増幅を増強および/または予測するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2014年4月22日出願の米国仮出願第61/982,784号に基づく優先権および利益を主張する。
自己相補的配列を有する第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第1領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第2領域が関与または相互作用する代替的構造のΔGよりも少なくとも15kcal/mol低いΔGを有する、第2領域と
を含み、
前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを有する、
単離されたプライマーオリゴヌクレオチドを提供する。
自己相補的配列を有する第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第1領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第2領域が関与または相互作用する代替的構造のΔGよりも少なくとも15kcal/mol低いΔGを有する、第2領域と
を含み、
前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを有する。
実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する2つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも1つのプライマーは、5’から3’に、
自己相補的配列を有する第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第1領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第2領域が関与または相互作用する代替的構造のΔGよりも少なくとも15kcal/mol低いΔGを有する、第2領域と
を含み、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを有する、工程、
ならびに、
前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含有する増幅産物を生成する工程
を含む方法を提供する。
実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する2つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも1つのプライマーは、5’から3’に、
自己相補的配列を有する第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第1領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第2領域が関与または相互作用する代替的構造のΔGよりも少なくとも15kcal/mol低いΔGを有する、第2領域と
を含み、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを有する、工程、
前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含有する増幅産物を生成する工程、ならびに、
前記標的核酸分子またはその増幅産物へのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションについて特異的なシグナルを検出し、前記シグナルが、試料中に存在する前記標的核酸分子またはその増幅産物の存在を示す工程
を含む方法を提供する。
自己相補的配列を有する第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第1領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第2領域が関与または相互作用する代替的構造のΔGよりも少なくとも15kcal/mol低いΔGを有する、第2領域と
を含み、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを有する。
ここで「N」は任意のヌクレオチドであり(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有し)、N1はN1’に、N2はN2’に、N3はN3’に、N4はN4’に、N5はN5’に、N6はN6’に、およびN7はN7’と相補的である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド(例えば、プライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド単量体)は、本明細書と共に提出される配列表に記載の配列を含む、5’尾部領域を含む。
「増幅産物」とは、目的のポリヌクレオチドの増幅の際に生成されるポリヌクレオチドを意味する。一例では、増幅産物はポリメラーゼ連鎖反応の際に生成される。
本発明の方法は、プライマーの予測可能な設計のために有用であり、核酸増幅反応において標的核酸分子の増幅のためにそのようなプライマーを使用する方法である。組成物および方法はまた、核酸増幅反応(ニッキング増幅反応を含む)における標的核酸分子の増幅および検出のために有用である。
プライマー設計のための従来の方法は、プライマー融解温度、プライマーアニーリング温度、GC(グアニンおよびシトシン)含有量、プライマー長、および、プライマーが標的核酸以外と相互作用することを最小化することに焦点を合わせてきた(例えばwww.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.htmlを参照されたい)。これらの方法とは対照的に、形成の自由エネルギー(ΔG)の観点から表される安定プライマー/二量体を形成するプライマーが、核酸増幅反応において予測可能に機能することが見出された。自由エネルギー(ΔG)と融解温度(Tm)は、主な構成要素エンタルピー(ΔH)およびエントロピー(ΔS)を共有するが、ΔGとTm値は異なって導かれ相関関係を有さず、所与のΔGを所与のTm値と関連付ける唯一の方法は、それらが由来するΔHおよびΔSの値を正確に知ることだけである(Manthey,“mFold,Delta G,and Melting Temperature”著作権2005 and 2011 Integrated DNA Technologies)。図1〜11は、最適なプライマーの設計に関する。
本発明は、そのプライマー・標的形成が安定(ΔG≦約−20kcal/molあるいはそれを超える)であって核酸増幅反応性能を増強する可能性を有する3’認識配列を有する、プライマーを提供する。3’認識領域は、標的核酸に、例えば標的核酸の相補的配列に、特異的に結合する。特定の実施形態では、3’認識領域は、標的核酸配列の12、13、14、15、16、17、18、19または20塩基以上と相補的である配列を有する。種々の実施形態では、プライマー・標的融解温度は、アッセイの反応または伸長温度の8または6℃下の温度以上である(Tm≧アッセイ温度−8℃)。具体的な実施形態では、3’認識配列は、12〜20、12〜17、または12〜14ヌクレオチドを含む。具体的な実施形態では、プライマー・標的形成は、自己二量体形成よりも安定である(例えばΔΔG≦約−15、−16、−17、−18、−19、−20kcal/molあるいはそれを超える)。実際、有効アッセイと非有効アッセイとの間の差異は、ΔΔG<約−15kcal/molの場合であることが見出された(例えば図11を参照されたい)。好ましくは、3’認識配列は、自己相補的配列、短い逆位反復(例えば>4塩基/反復)、または他に分子内相互作用を促進する配列を含有しない(それらはプライマー・標的アニーリングに干渉する可能性を有する。
本発明は、核酸増幅反応性能を増強する、自己二量体化することができる5’尾部領域を有するプライマーを提供する。理論に束縛されることなく、核酸増幅反応において、このプライマーはプライマー二量体として標的核酸にアニールする(例えば図1を参照されたい)。例えば、ニッキング増幅プライマーは、標的認識配列についてのプライマーの結合特異性とは関係しない5’末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的プライマー相互作用由来の非特異的バックグラウンド産物は、それがなければ特異的産物の増幅のために利用されるはずである反応構成成分を捕捉する可能性を有する。種々の実施形態ではホモ二量体形成が安定である(例えば、ΔG≦約−30、−35、−40、−45、−50、−55、−60kcal/mol、あるいはそれを超える)。種々の実施形態では、ホモ二量体は、伸長反応温度より高い融解温度を有する。具体的な実施形態では、5’尾部領域は、パリンドロームである配列を有する。さらなる実施形態では、5’尾部領域は、長さ少なくとも12塩基である(例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24塩基)。付加的な実施形態では、5’尾部領域は、80〜90%のGC含有量を有する。特定の実施形態では、ホモ二量体形成は、他のより安定性が低いプライマー二量体コンホメーションの形成よりも安定である(例えば、ΔΔG≦約−12、−13、−14、−15、−16、−17、−18、−19、−20、−25、−30、−35、−40kcal/mol、あるいはそれを超える)。
の核酸配列を含み、式中「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と相補的である。
の核酸配列を含み、式中、「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と、N2はN2’ と、N3はN3’ と、N4はN4’と、N5はN5’と相補的である、等々である。
による核酸配列を含むものを除外し、式中、「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と、N2はN2’と、N3はN3’と相補的である、等々である。
による核酸配列を含み、式中、「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と相補的であり、N2はN2’と相補的である。
による核酸配列を含み、式中「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と、N2はN2’と、N3はN3’と、N4はN4’と、N5はN5’と、N6はN6’と相補的である、等々である。
による核酸配列を含むものを除外し、式中「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と、N2はN2’と、N3はN3’と相補的である、等々である。
による核酸配列を含み、式中「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と相補的であり、N2はN2’と相補的であり、N3はN3’と相補的である。
による核酸配列を例えば含み、式中「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と、N2はN2’と、N3はN3’と、N4はN4’と、N5はN5’と、N6はN6’と、N7はN7’と相補的である、等々である。
による核酸配列を有するものを除外し、式中「N」は任意のヌクレオチド(例えばアデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)またはグアニン(G)核酸塩基を有する)であり、N1はN1’と、N2はN2’と、N3はN3’と、N4はN4’と、N5はN5’と相補的である、等々である。
核酸増幅技術は、複雑な生物学的プロセスの理解、病原性および非病原性生物の検出および同定、法医学的犯罪学分析、疾患関連研究、ならびに遺伝的に改変された生物における事象の検出などの手段を提供してきた。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAを増幅するために使用される一般的な熱サイクル依存核酸増幅技術であり、DNA融解とDNAポリメラーゼを使用したDNAの酵素的複製とのための反応物の反復的加熱および冷却のサイクルからなる。リアルタイム定量的PCR(qPCR)は、生物学的試料中の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用される技術である。現在、qPCRは、反応を通じたリアルタイムでの反応産物の検出を利用し、増幅プロファイルを、各反応の開始時に既知量の核酸(または未知の検査核酸に対する既知の比率の核酸)を含有する対照の増幅と比較する。典型的には標準反応増幅曲線の対数部分に基づいて、対照の結果を使用して標準曲線を構築する。これらの値は、それらの増幅曲線がどこで標準対照量と匹敵するかに基づいて未知物の量を内挿するために使用される。
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイにおいて増幅された標的核酸分子の検出を提供する。本明細書に記載の方法において有用なポリメラーゼは、標的核酸分子に結合されたオリゴヌクレオチド(例えばプライマー)の3’ヒドロキシル末端、および/または二本鎖DNA分子中のニック部位における3’ヒドロキシル末端を伸長するためのヌクレオチドの組み込みを触媒する能力を有すると共に、鎖置換活性の能力を有する。そのようなポリメラーゼはまた、5’−3’エクソヌクレアーゼ活性が欠けているかまたは実質的に低減されており、好熱性であるものを含み得る。3’−末端の6ヌクレオチドを含むプライマー領域中に2’−修飾ヌクレオチドを有するプライマーが関わる方法において有用であるDNAポリメラーゼは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)としても分類されるバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)、ならびにゲオバチルス(Geobacillus)属を含む密接に関連する細菌の系統、単離株、および種から単離された、DNAポリメラーゼIの誘導体およびバリアントを含み、5’−3’エクソヌクレアーゼ活性は欠けているまたは実質的に低減しており、鎖置換活性を有する。例示的ポリメラーゼは、これだけに限らないが、Bst DNAポリメラーゼI、Gst DNAポリメラーゼI、Gka DNAポリメラーゼIのラージフラグメントを含む。
本発明の方法および組成物は、検査試料中の標的核酸分子の増幅および/または同定のために有用である。標的配列は、これだけに限らないが、真菌、胞子、ウイルス、または細胞(例えば原核生物、真核生物)を含む試料を含む、標的核酸分子を含む実質的にいかなる試料からも増幅される。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、クラビバクター・ミシガネンシス亜種ミシガネンシス(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)、クラビバクター・ミシガネンシス亜種セペドニカス(Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus)、シリンゲ菌トマト病原型(Pseudomonas syringae pv Tomato)、斑点細菌病原菌(Xanthomonas campestris pv Vesicatoria)、アルテルナリア属(Alternaria spp)、クラドスポリウム属(Cladosporium spp)、フサリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、バーティシリウム・ダーリア(Verticilium dahlia)、シュードモナス・クルガタ(Pseudomonas currugata)、エルウィニア・カロトボラ(Erwina carotovora)および青枯病菌(Ralstonia solanacearum)を検出する。例示的検査試料は、体液(例えば血液、血清、血漿、羊水、痰、尿、脳脊髄液、リンパ液、涙液、便または胃液)、組織抽出物、培養培地(例えば病原菌細胞などの細胞が増殖された液体)、環境試料、農産物またはその他の食品、およびそれらの抽出物ならびにDNA同定タグを含む。所望により、試料は、生物学的試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される任意の標準的方法を使用して、ニッキング増幅反応の前に精製される。
本発明のプライマーを使用する標的核酸増幅は、標的核酸の迅速な検出のための有用な特徴を有する(図10)。そのような反応は、高い信号対雑音比([RFUMAX−RFUBL])、急な勾配(高値の[RFUMAX−RFUBL]/[TOSEA−TRFUmax])、指数関数的増幅相の早期出現(TOSEA<10分間)、および同じ試料の反復アッセイ反応間における低いシグナル変動によって特徴付けられる。特定の実施形態では、TOSEA−TRFUmax≒3分間である。
本発明は、少なくとも1つのポリメラーゼ停止分子(例えば、オリゴヌクレオチドが標的核酸分子に結合はできるが、検出可能オリゴヌクレオチドプローブを標的として利用するポリメラーゼ伸長は支持することができないようにする、ヌクレオチド修飾または他の成分)を含む、増幅不能な検出可能ポリヌクレオチドプローブを使用して、ニッキング増幅反応物中の標的核酸分子またはその増幅産物の検出を提供する。理論に束縛されることなく、ポリメラーゼ進行を許容しない1つまたは複数の成分の存在は、オリゴヌクレオチドへの非核酸骨格付加においてまたは複製ポリメラーゼの失速を通じて、ポリメラーゼ停止を引き起こす(すなわちC3−スペーサー、損傷されたDNA塩基、その他のスペーサー成分、O−2−Me塩基)。したがってこれらの構築物は、ニッキング増幅反応の経過の際に、プローブの不当な増幅を抑制または低減する。このことは、増幅を抑制するためにニッキング増幅反応の終了時に添加されなければならない従来の検出プローブからそれらを区別する。
増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは、ニッキング増幅反応で標的核酸分子を増幅および検出するための方法において有用である。この方法は、標的核酸分子を、実質的に等温条件下、適切な緩衝液およびdNTPの存在下で、ポリメラーゼ、それぞれが標的ヌクレオチド分子上の相補的配列に特異的に結合する2つのプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含む増幅産物を生成する工程と;標的核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを、反応物中のプローブ分子からの蛍光強度に基づいて、反応のあいだリアルタイムで検出することによって、反応物中に存在する標的核酸分子を検出する工程と、を含む。有利なことに、そのような方法は、ニッキング増幅反応をリアルタイムでモニタリングするために有用である。
本明細書に記載の方法は、一般的目的のまたは特別にプログラムされたハードウエアもしくはソフトウェアで実装されてよい。例えば本方法は、コンピュータ可読媒体によって実装され得る。したがって本発明は、本発明のいずれかの実施形態によるアルゴリズムおよび/または方法を実施するように構成されたソフトウェアおよび/またはコンピュータプログラム製品も提供する。本発明において提供されるアルゴリズムおよび/または方法を実施できるソフトウェアをどのように構成するかは当業者に周知である。コンピュータ可読媒体は、非一過性および/または有形であってよい。例えば、コンピュータ可読媒体は、揮発性メモリー(例えばランダムアクセスメモリーなど)または非揮発性メモリー(例えば読み出し専用メモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、光学ディスク、紙表、パンチカードなど)であってよい。コンピュータ実行可能指令は、適切なコンピュータ言語またはいくつかの言語の組合せで書かれてよい。基本的な計算生物学的方法は、例えばSetubal and Meidanis et al.,Introduction to Computational Biology Methods(PWS Publishing Company,Boston,1997)、Salzberg,Searles,Kasif,(Ed.),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998)、Rashidi and Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRC Press,London,2000)およびOuelette and Bzevanis Bioinformatics:A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley & Sons,Inc.,2nded.,2001)に記載されている。
本発明は、標的核酸分子の増幅のためのキットも提供する。そのようなキットは、対象から得られた生物学的試料中の標的核酸の増幅および検出のために有用である。本発明のキットは、例えば、本明細書に記載されているように、1つまたは複数のポリメラーゼ、フォワードおよびリバースプライマー、ならびに1つまたは複数のニッキング酵素を含んでよい。1つの標的が増幅される場合には、1つまたは2つのニッキング酵素がキットに含まれていてよい。複数の標的配列が増幅され、これらの標的配列に対して設計されたプライマーが同じニッキング酵素についてのニッキング酵素部位を含む場合には、1つまたは2つのニッキング酵素が含まれていてよい。これらのプライマーが異なるニッキング酵素によって認識される場合には、例えば3個以上などのように、より多くのニッキング酵素がキットに含まれていてよい。
プライマーを実験的に試験することによる補助無しで、本発明による設計原理だけを使用して、ダイズレクチンの検出のための良好に働く等温DNA増幅アッセイを創出した(図12)。
太字で示すのは、それぞれフォワードおよびリバースプライマーの設計のために選択された配列領域である。
フォワードプライマー・標的ハイブリッド(PrTH)のΔG25℃=−25.99kcal/モル;
プライマー・標的結合領域自己二量体(PrTBRHD)のΔG25℃=−3.14kcal/モル;
ΔΔG25℃=ΔGPTH−ΔGPTBRHD=−22.85kcal/モル
低ΔΔG(≦約−16kcal/モル)は、フォワードプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始することができることを示している。
revプライマー・標的ハイブリッド(PrTH)のΔG25℃=−25.35kcal/モル;
プライマー・標的結合領域自己二量体(PrTBRHD)のΔG25℃=−3.14 kcal/モル;
ΔΔG25℃=ΔGPTH−ΔGPTBRHD=−22.21kcal/モル。
低ΔΔG(≦約−16kcal/モル)は、リバースプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始できることを示している。
フォワードプライマー(「m」=2’−メトキシヌクレオチド)
5’−ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTATTACCTATGAmUmGmCmC−3’
リバースプライマー(「m」=2’−メトキシヌクレオチド)
5’−ACGCGACTCGTCGACGAGTCGCGTACCAAAGAAmGmCmAmAmC−3’
分子ビーコンプローブ(「I」はユニバーサルイノシンヌクレオチドを表す)
5’−CalRed610−CGCGCTCCACCAICCTCTTGCGCG−BHQ2−3’
プライマーをさらに実験的に試験することによる補助無しで、本発明による設計原理だけを使用して、サルモネラ・エンテリカinvAの検出のための容易に実用可能な等温DNA増幅アッセイを創出した。
太字で示すのは、それぞれフォワードおよびリバースプライマーの設計のために選択された配列領域である。
fwdプライマー・標的ハイブリッド(PTH)のΔG25℃=−26.11kcal/モル;
プライマー・標的結合領域自己二量体(PTBRHD)のΔG25℃=−1.95kcal/モル;
ΔΔG25℃=DGPTH−ΔGPTBRHD=−24.16kcal/モル
低ΔΔG(≦約−16kcal/モル)は、フォワードプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始することができることを示している。
revプライマー・標的ハイブリッド(PTH)のΔG25℃=−25.28kcal/モル;
プライマー・標的結合領域自己二量体(PTBRHD)のΔG25℃=−1.57kcal/モル;
ΔΔG25℃=ΔGPTH−ΔGPTBRHD=−23.71kcal/モル。
低ΔΔG(≦約−16kcal/モル)は、リバースプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始することができることを示している。
フォワードプライマー1(「m」=2’−メトキシヌクレオチド)
5’−GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCATACTCATCTGmUmUmUmAmCmC−3’
フォワードプライマー2(「m」=2’−メトキシヌクレオチド)
5’−GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCATACTCATCTGTmUmUmAmCmC−3’
リバースプライマー(「m」=2’−メトキシヌクレオチド)
5’−GGCTGACTCCTGCAGGAGTCAGCCTTTTCTCTGmGmAmUmGmG−3’
分子ビーコンプローブ(「I」はユニバーサルイノシンヌクレオチドを表す)
5’−CalRed610−ACCTGTTTACCGGGCATACAAACAGGT−BHQ2−3’
5’−3’方向に、自己相補的第1領域(ニッキング酵素認識配列を有する5’尾部)と、標的配列相補的第2領域とを含む、34個のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを、ハイブリッド二重鎖の融解温度(TM)、%GC含有量、配列長、およびΔGなどの、プライマー設計アルゴリズムにおいて一般的に使用される複数のパラメーターについて分析した。すべてのパラメーターを、第1および第2プライマー領域それぞれについて別々に決定した。25個のプライマーのサブセットは、確認された機能的等温DNAble(登録商標)アッセイに属していた。9個のプライマーのサブセットは、アッセイスクリーニング実験においてプローブ検出可能な増幅産物を産生できなかった候補プライマー/プローブセットに属していた。
前述の記載から、種々の用途および条件に適合させるために本明細書に記載の発明に変更および改変がなされ得ることは明らかであろう。そのような実施形態も下記特許請求の範囲内である。
Claims (52)
- 単離されたプライマーオリゴヌクレオチドであって、
5’から3’に、
i)自己相補的配列を含む第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第1領域と、
ii)標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを含み、前記第2領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第2領域を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、第2領域と
を含む、
単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。 - 前記第1領域中の前記パリンドローム配列が、2、4、または6ヌクレオチド長である、請求項1に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記第1領域が、長さ12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドである、請求項1または2に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記第2領域が、長さ16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記第1領域が完全に自己相補的である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 2つのプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第1領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体の形態にある、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記ホモ二量体が、前記プライマーオリゴヌクレオチドを含む自己二量体のΔGより少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、請求項6に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドが、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−ヒドロキシル、2’−アルキル、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、および2’−O−(N−メチルカルバメート)、または塩基類似体を含むそれらのものからなる群から選択される2’修飾を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 2つ以上の2’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項8に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 連続する2’修飾ヌクレオチドの数が4、5、または6である、請求項9に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記ニッキング酵素がNt.BspD6IおよびNt.BstNBIのうちの1つまたは複数である、請求項1〜10のいずれかに記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 前記第1領域内の前記ニッキング酵素認識配列が5’−GAGTC−3’である、請求項11に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- ニッキング剤の認識配列が、前記第1領域と第2領域との間のリン酸ジエステル結合を切断するように位置されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
- 2つのオリゴヌクレオチド単量体を含む単離されたプライマー二量体であって、前記オリゴヌクレオチド単量体は、5’から3’に、
i)自己相補的配列を含む第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第1領域と、
ii)標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを含み、前記第2領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第2領域を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、第2領域と
を含む、
単離されたプライマー二量体。 - 前記第1領域中の前記パリンドローム配列が、2、4、または6ヌクレオチド長である、請求項15に記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記第1領域が、長さ12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドである、請求項15または16に記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記第2領域が、長さ16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドである、請求項15〜17のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記第1領域が完全に自己相補的である、請求項15〜18にいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
- 2つのオリゴヌクレオチド単量体の自己相補的第1領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体の形態にある、請求項15〜19のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記ホモ二量体が、前記オリゴヌクレオチド単量体を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、請求項20に記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドが、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−ヒドロキシル、2’−アルキル、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、および2’−O−(N−メチルカルバメート)、または塩基類似体を含むそれらのものからなる群から選択される2’修飾を有する、請求項15〜21のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
- 2つ以上の2’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項22に記載の単離されたプライマー二量体。
- 連続する2’修飾ヌクレオチドの数が4、5、または6である、請求項23に記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記ニッキング酵素がNt.BspD6IおよびNt.BstNBIのうちの1つまたは複数である、請求項15〜24のいずれかに記載の単離されたプライマー二量体。
- 前記第1領域内の前記ニッキング酵素認識配列が5’−GAGTC−3’である、請求項25に記載の単離されたプライマー二量体。
- ニッキング剤の認識配列が、前記第1領域と第2領域との間のリン酸ジエステル結合を切断するように位置されている、請求項15〜26のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
- 標的核酸分子を検出するための単離されたオリゴヌクレオチドプローブであって、
i)オリゴヌクレオチド、
ii)蛍光レポーター、および
iii)前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子
を含み、
前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの相対する5’および3’末端に共有結合されており、
前記オリゴヌクレオチドは、
a)標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第1領域と、
b)前記第1領域の5’上流にある第2領域と、
c)前記第1領域の3’下流にあり前記第2領域と相補的な核酸配列を有する第3領域と
を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第2領域および第3領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成することができ、
標的配列と前記オリゴヌクレオチドプローブの第1領域との間のプライマー・標的二本鎖ハイブリッドのΔGが、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む自己二量体のΔGより少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低い、
オリゴヌクレオチドプローブ。 - 前記第2および第3領域が、長さ4〜8ヌクレオチドである、請求項29に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプローブ。
- ニッキングおよび伸長増幅反応において特異的産物を増幅する方法であって、
(a)実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する2つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも1つのプライマーは、5’から3’に、
i)自己相補的配列を含む第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第1領域と、
ii)標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを含み、前記第2領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第2領域を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、第2領域と
を含む、工程、
ならびに、
(b)前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含む増幅産物を生成する工程
を含む、方法。 - ニッキングおよび伸長増幅反応において特異的産物を検出する方法であって、
(a)実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する2つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも1つのプライマーは、5’から3’に、
i)自己相補的配列を含む第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第1領域と、
ii)標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを含み、前記第2領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第2領域を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、第2領域と
を含む、工程、
(b)前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含む増幅産物を生成する工程、ならびに
(c)前記標的核酸分子またはその増幅産物へのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションについて特異的なシグナルを検出し、前記シグナルが、試料中に存在する前記標的核酸分子またはその増幅産物の存在を示す工程
を含む、方法。 - 前記オリゴヌクレオチドプローブが、
i)オリゴヌクレオチド、
ii)蛍光レポーター、および
iii)前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子
を含み、
前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの相対する5’および3’末端に共有結合されており、
前記オリゴヌクレオチドは、
a)標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第1領域と、
b)前記第1領域の5’上流にある第2領域と、
c)前記第1領域の3’下流にあり前記第2領域と相補的な核酸配列を有する第3領域と
を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第2領域および第3領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成することができる、
請求項32に記載の方法。 - 前記ポリメラーゼが、ゲオバチルス属(Geobacillus spp.)もしくはバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)のDNAポリメラーゼI、またはその活性断片および誘導体である、請求項31〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Bst DNAポリメラーゼI、Gst DNAポリメラーゼI、またはGka DNAポリメラーゼIのうちの1つまたは複数である、請求項34に記載の方法。
- 前記第1領域中の前記パリンドローム配列が2、4、または6ヌクレオチド長である、請求項35に記載の方法。
- 前記第1領域が長さ12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドである、請求項31〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2領域が長さ16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチドである、請求項31〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1領域が完全に自己相補的である、請求項31〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのプライマーは、2つのプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第1領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体の形態にある、請求項31〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ホモ二量体は、前記プライマーオリゴヌクレオチドを含む自己二量体のΔGより少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、請求項40に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドが、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−ヒドロキシル、2’−アルキル、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、および2’−O−(N−メチルカルバメート)、または塩基類似体を含むそれらのものからなる群から選択される2’修飾を有する、請求項31〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドが、前記第2領域の3’末端に位置している、請求項31〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 2つ以上の2’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項31または43に記載の方法。
- 連続する2’修飾ヌクレオチドの数が4、5または6である、請求項44に記載の方法。
- 前記ニッキング酵素が、Nt.BspD6IおよびNt.BstNBIのうちの1つまたは複数である、請求項31〜45のいずれかに記載の方法。
- 前記第1領域中の前記ニッキング酵素認識配列が5’−GAGTC−3’である、請求項46に記載の方法。
- ニッキング剤の認識配列が、前記第1領域と第2領域との間のリン酸ジエステル結合を切断するように位置されている、請求項31〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチドと、請求項31〜49のいずれか一項に記載の方法における前記プライマーオリゴヌクレオチドの使用についての指示書とを含む、ニッキング増幅反応において標的配列を増幅するためのキットであって、
前記プライマーオリゴヌクレオチドは、5’から3’に、
i)自己相補的配列を含む第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第1領域と、
ii)標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域であって、前記第2領域は3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを含み、前記第2領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、前記第2領域を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低いΔGを有する、第2領域と
を含む、
キット。 - i)オリゴヌクレオチド;
ii)蛍光レポーター;および
iii)前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子;
を含むオリゴヌクレオチドプローブと、請求項31〜49のいずれか一項に記載の方法における前記プライマーオリゴヌクレオチドの使用についての指示書とをさらに含み、
前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの相対する5’および3’末端に共有結合されており、
前記オリゴヌクレオチドは、
a)標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第1領域と、
b)前記第1領域の5’上流にある第2領域と、
c)前記第1領域の3’下流にあり前記第2領域と相補的な核酸配列を有する第3領域と
を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第2領域および第3領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成することができる、
請求項50に記載のキット。 - プライマーオリゴヌクレオチドを選択する方法を実施するためのコンピュータプログラム指令を含む、有形、非一過性コンピュータ可読媒体であって、
前記プライマーオリゴヌクレオチドは、5’から3’に、
i)自己相補的配列を含む第1領域であって、5’から3’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第1領域と、
ii)標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含み3’末端において1つまたは複数の2’修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも16ヌクレオチド長の第2領域と
を含み、
前記方法は、
a)前記プライマーオリゴヌクレオチドの第2領域を選択する工程であって、前記第2領域と前記標的核酸分子とのハイブリダイゼーションによって形成されるプライマー・標的二本鎖ハイブリッドについてのΔGが、プライマーオリゴヌクレオチドの前記第2領域を含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低い、工程、
b)前記プライマーオリゴヌクレオチドの第1領域を選択する工程であって、2つのプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第1領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されるホモ二量体についてのΔGが、前記プライマーオリゴヌクレオチドを含む自己二量体のΔGよりも少なくとも62.76kJ/mol(15kcal/mol)低い、工程
を含む、
コンピュータ可読媒体。
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