JP6596442B2 - Ｄｎａ増幅を増強および／または予測するための組成物および方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１４年４月２２日出願の米国仮出願第６１／９８２，７８４号に基づく優先権および利益を主張する。

核酸増幅の方法は一般的で十分周知であるが、核酸増幅反応は主にプライマー設計に伴う困難のためにまだ性能の予測不可能性および／または乏しさに悩まされている。

核酸増幅反応の予測不可能性は、主に、標的特異的なプライマーとプローブのハイブリダイゼーションを、オフターゲット結合、自己／自己および自己／非自己二量体化と対比して定量的に評価することを可能にするプライマーおよびプローブについての配列予測可能な設計パラメーターの欠如のためである。実際、可能なプライマー配列の選択および標的核酸配列によって課される配列的制約における可変性のため、プライマー組合せおよびそれらの結果の全容を経験的かつ系統的に調べることは困難である。

ＰＣＲアッセイに基づく設計パラメーターは、プライマーおよびプローブの融解温度、ＧＣ（グアニンおよびシトシン）含有量、プライマー長、および標的核酸以外とのプライマーの相互作用を最小化することに注目してきた（例えば、ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ＿ｎｏｔｅｓ／ＰＣＲ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿Ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。具体的には、自身との分子間相互作用（例えばプライマー二量体）を伴うプライマーの使用は、そのようなプライマーがプライマーと標的核酸分子との相互作用に望ましくない影響を与えると考えられることから、全く勧められない。さらに、核酸プライマーの最適な長さは、１８〜２２ヌクレオチドであると提案されており、これは適切な特異性のために十分長く、アニーリング温度にてプライマーが鋳型に容易に結合するために十分短いと考えられている。ＧＣ含有量に関しては、４０〜６０％のＧＣ含有量が推奨されている。誤ったことに、一般的なアッセイ設計の慣行は、上に述べた全てのパラメーターが増幅アッセイのフォワードおよびリバースプライマーについて同様に設計される場合、これら２つのプライマーのハイブリダイゼーション動態も同様の結果になるであろうと推定する。これらの一般的に使用される設計パラメーターはいずれも、一本鎖形態から二本鎖ハイブリッド段階への移行におけるエンタルピー、エントロピー、溶媒和、最近傍作用（ｎｅａｒｅｓｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ）および水素結合における変化が関わる２段階オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの複合的熱力学を、適切に関連付けていない。さらに、熱力学的アルゴリズムの基礎としてのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの２段階モデルの使用さえ過度に簡略化され、実際の状況を正確に反映していない。したがって、推奨される基準すべてを満たすプライマーであっても性能が予測不可能なままである。

本質的に等温条件下で標的核酸を予測通りに増幅するためのプライマーセットの有効性を決定することにおける進歩は、非常に多数のプライマーセットを合成して実験的に試験すること（例えば多数のプライマーを設計して多数のプライマー組合せの対ごとのスクリーニングをすること）の労力、時間および費用を含む資源の消費を低減させる可能性を有する。核酸増幅反応の性能および収量を、増強し、よりよく予測するために、新規パラメーターおよび方法が必要とされている。

本明細書に記載のとおり本発明は、標的核酸分子を予測通りに増幅することができるプライマーを設計するための改善された方法、および、標的核酸分子の増幅を増強することおよび／またはバックグラウンド産物の生成を低減もしくは削減することを含む、核酸増幅のためにこれらのプライマーを使用する方法を提供する。さらに本発明は、試料標的オリゴヌクレオチドの増幅および検出のための組成物および方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明の組成物および方法は、等温核酸増幅反応に適合する。

一態様では本発明は、５’から３’に、
自己相補的配列を有する第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第１領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第２領域が関与または相互作用する代替的構造のΔＧよりも少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低いΔＧを有する、第２領域と
を含み、
前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有する、
単離されたプライマーオリゴヌクレオチドを提供する。

別の態様では本発明は、２つのオリゴヌクレオチド単量体を有する単離されたプライマー二量体を提供し、前記オリゴヌクレオチド単量体は、５’から３’に、
自己相補的配列を有する第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第１領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第２領域が関与または相互作用する代替的構造のΔＧよりも少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低いΔＧを有する、第２領域と
を含み、
前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有する。

別の態様では本発明は、標的核酸分子を検出するための単離されたオリゴヌクレオチドプローブであって、オリゴヌクレオチド、蛍光レポーター、および前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光（クエンチング）分子を含有し、前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの、相対する５’および３’末端に共有結合されており、前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第１領域と、前記第１領域の５’上流にある第２領域と、前記第１領域の３’下流にあり前記第２領域と相補的な核酸配列を有する第３領域とを含有し、前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第２領域および第３領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成でき、標的配列と前記オリゴヌクレオチドプローブの第１配列との間の二本鎖ハイブリッドのΔＧが、前記オリゴヌクレオチドプローブが関与または相互作用する代替的構造のΔＧより少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低い、オリゴヌクレオチドプローブを提供する。

別の態様では本発明は、ニッキングおよび伸長増幅反応において特異的産物を増幅する方法であって、
実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも１つのプライマーは、５’から３’に、
自己相補的配列を有する第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第１領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第２領域が関与または相互作用する代替的構造のΔＧよりも少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低いΔＧを有する、第２領域と
を含み、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有する、工程、
ならびに、
前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含有する増幅産物を生成する工程
を含む方法を提供する。

別の態様では本発明は、ニッキングおよび伸長増幅反応において特異的産物を検出する方法であって、
実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも１つのプライマーは、５’から３’に、
自己相補的配列を有する第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第１領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第２領域が関与または相互作用する代替的構造のΔＧよりも少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低いΔＧを有する、第２領域と
を含み、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有する、工程、
前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含有する増幅産物を生成する工程、ならびに、
前記標的核酸分子またはその増幅産物へのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションについて特異的なシグナルを検出し、前記シグナルが、試料中に存在する前記標的核酸分子またはその増幅産物の存在を示す工程
を含む方法を提供する。

別の態様では本発明は、ニッキング増幅反応において標的配列を増幅するためのキットを提供し、このキットは、１つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチドと、本発明の方法における前記プライマーオリゴヌクレオチドの使用のための指示書とを含有し、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、５’から３’に、
自己相補的配列を有する第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含有する、第１領域と、
標的核酸分子上の相補的領域に特異的に結合して二本鎖ハイブリッドを形成する少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記二本鎖ハイブリッドは、前記第２領域が関与または相互作用する代替的構造のΔＧよりも少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低いΔＧを有する、第２領域と
を含み、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有する。

関連する態様において本発明は、本明細書で説明する本発明のいずれかの態様によるプライマーオリゴヌクレオチドを選択する方法を提供し、この方法は、プライマーオリゴヌクレオチドを選択するそのような方法を実施するための有形、非一過性コンピュータ可読媒体上のコンピュータプログラム指令を提供することを含む。

上記態様の種々の実施形態では、第１領域は、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチドである。種々の実施形態では、第１領域は、完全に自己相補的である。上記態様の種々の実施形態では、第１領域中のパリンドローム配列は、２、４または６ヌクレオチド長である。上記態様の種々の実施形態では、第２領域は、長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドである。

上記態様の種々の実施形態では、代替的構造は、第２領域がそれ自身と（例えば、自己自己二量体）、第１領域の部分配列と（例えばヘテロ二量体）、増幅反応における他のオリゴヌクレオチド、プライマーもしくはプローブと、または標的配列領域の外側の部分的に相補的な核酸配列と（例えば、オフターゲットハイブリッド）形成し得る、１つまたは複数の部分的に二本鎖となったハイブリッドである。

上記態様の種々の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド単量体）は、２個のプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第１領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体（例えば、プライマー二量体）の形態にある。種々の実施形態では、ホモ二量体は、プライマーオリゴヌクレオチドが関与または相互作用する任意の代替的構造（そのプライマーオリゴヌクレオチドを含んだ最も安定な代替的構造を含む）のΔＧより少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低いΔＧを有する。上記態様の種々の実施形態では、自由エネルギー（ΔＧ）は、２５℃（ΔＧ_２５℃）にて、および／または１気圧（ａｔｍ）の圧力（約１０１．３ｋＰａ）にて、核酸について決定または算出される。上記態様の種々の実施形態では、自由エネルギー（ΔＧ）は、ｍＦｏｌｄアルゴリズムによって決定または算出される。

上記態様の種々の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド単量体）の第２領域は、その２’修飾が、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）、または塩基類似体を含有するものからなる群から選択される、１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含む。具体的な実施形態では、１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドは、第２領域の３’末端に位置している。他の実施形態では２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが連続している。さらに他の実施形態では連続２’修飾ヌクレオチドの数は２、３、４、５または６個である。本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、ニッキング酵素は、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６ＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩのうちの１つまたは複数である。本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、第１領域内のニッキング酵素認識配列は、５’−ＧＡＧＴＣ−３’である（およびニッキング酵素認識配列の逆相補鎖は５’−ＧＡＣＴＣ−３’である）。本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド単量体）は、ニッキング剤の認識配列を、第１領域と第２領域との間のリン酸ジエステル結合を切断する位置に有する。上記態様の種々の実施形態では、ポリメラーゼは、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）もしくはバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼＩ、またはその活性断片および誘導体である。特定の実施形態では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、またはＧｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩのうちの１つまたは複数である。

本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えばプライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド単量体）は、下記に示す核酸配列を含む第１領域を有し、

ここで「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有し）、Ｎ_１はＮ_１’に、Ｎ_２はＮ_２’に、Ｎ_３はＮ_３’に、Ｎ_４はＮ_４’に、Ｎ_５はＮ_５’に、Ｎ_６はＮ_６’に、およびＮ_７はＮ_７’と相補的である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマーオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド単量体）は、本明細書と共に提出される配列表に記載の配列を含む、５’尾部領域を含む。

本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、標的核酸分子を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブは：オリゴヌクレオチド、蛍光レポーター、および前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子を含有し、前記蛍光レポーターおよび消光分子は、オリゴヌクレオチドの相対する５’および３’末端に共有結合されており、前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第１領域と、前記第１領域の５’上流にある第２領域と、前記第１領域の３’下流にあり前記第２領域と相補的な核酸配列を有する第３領域とを含有し、前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第２領域および第３領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成できる。本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、標的配列と前記オリゴヌクレオチドプローブの第１配列との間の二本鎖ハイブリッドの前記ΔＧが、前記オリゴヌクレオチドプローブが関与または相互作用する代替的構造のΔＧより少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ低い。種々の態様ではオリゴヌクレオチドプローブの第２および第３領域は、長さ４〜８ヌクレオチドである。

本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドプローブの使用について指示書が提供される。本明細書で説明する任意の態様の種々の実施形態では、反応におけるプライマーおよびプローブは、増幅および検出の反応を共に実施するために設計および／または選択される。

本発明の他の特徴および優位性は、詳細な説明から、そして特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。

（定義）
「増幅産物」とは、目的のポリヌクレオチドの増幅の際に生成されるポリヌクレオチドを意味する。一例では、増幅産物はポリメラーゼ連鎖反応の際に生成される。

「増幅速度変更因子」とは、ポリメラーゼ伸長の速度に影響を与えることができる薬剤を意味する。

「塩基置換」とは、相補的ヌクレオチド鎖間のハイブリダイゼーションに著しい破壊を生じない核酸塩基ポリマーの置換を意味する。

本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」および「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに割り当てられる意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等を意味し得る。「本質的にからなっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」や「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法においてそれらに割り当てられる意味を有し、この用語はオープンエンドであり、記載されたものの基本的または新規の特徴が、記載されたもの以外のものの存在によって変更されない限りにおいて、記載されたもの以外のものの存在を許容するが、ただし先行技術実施形態を除く。

「相補的」または「相補性」とは、核酸が伝統的Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合によって別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成できることを意味する。相補的塩基対合は、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｔ塩基対合だけでなく、イノシンなどのユニバーサル塩基を含む塩基対合も含む。相補性百分率は、核酸分子のうち、第２の核酸配列と水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）を形成することができる連続的残基の百分率を示す（例えば第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドの内５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、１０ヌクレオチドを有する第２の核酸配列に塩基対合することは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％の相補性を表す）。相補性百分率が、少なくともあるパーセンテージであることを決定するためには、核酸分子のうち第２の核酸配列と水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）を形成できる連続的残基の百分率を算出し、最も近い整数に四捨五入される（例えば第１のオリゴヌクレオチド中の合計２３ヌクレオチドの内１２、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドが、２３ヌクレオチドを有する第２の核酸配列に塩基対合することは、それぞれ５２％、５７％、６１％、６５％、７０％および７４％を表し、それぞれ少なくとも５０％、５０％、６０％、６０％、７０％および７０％の相補性を有する）。本明細書において使用される「実質的に相補的」は、生物学的条件下でハイブリダイズできるような、鎖の間の相補性を指す。実質的に相補的な配列は、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはさらに１００％の相補性を有する。さらに、２本の鎖が生物学的条件下でハイブリダイズできるかどうかを、それらのヌクレオチド配列を検討することによって決定するための技術は、当技術分野において十分周知である。

本明細書において使用される「二重鎖」は、２本の一本鎖核酸の相互作用によって形成される二重らせん構造を指す。二重鎖は、互いに対して逆平行に方向付けられた２本の一本鎖核酸間の塩基の対ごとでの水素結合形成、すなわち、「塩基対合」によって典型的には形成される。二重鎖中の塩基対合は、一般にＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によって生じ、例えばグアニン（Ｇ）はＤＮＡおよびＲＮＡにおいてシトシン（Ｃ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＤＮＡにおいてチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、アデニン（Ａ）はＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）と塩基対を形成する。塩基対が形成され得る条件は、生理学的または生物学的に適切な条件（例えば細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン；細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）を含む。さらに二重鎖は、隣接ヌクレオチド間のスタッキング相互作用によって安定化される。本明細書において使用される場合、二重鎖は、塩基対合によってまたはスタッキング相互作用によって、確立または維持され得る。二重鎖は、実質的に相補的または完全に相補的であってよい２本の相補的核酸鎖によって形成される。多数の塩基にわたって塩基対合する一本鎖核酸は、「ハイブリダイズ」すると称される。

「検出」は、検出される分析物の存在、欠如または量を同定することを指す。

「検出可能成分」とは、目的の分子に連結されるとその分子を分光学、光化学、生化学、免疫化学または化学的手段を介して検出可能とする組成物を意味する。例えば、有用な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるようなもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンを含む。

「断片」とは、核酸分子の一部分を意味する。この一部分は、基準核酸分子またはポリペプチドの全長の好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含有する。断片は、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ヌクレオチドを含有してよい。

「自由エネルギー（ΔＧ）」とは、式：ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳによって記述される、一定温度および圧力での系とその環境との間のエネルギーの正味の交換を意味する。自由エネルギーは、構造の形成がどの程度有利であるかを表し、構造の形成のΔＧ（例えばｋｃａｌ／ｍｏｌで表される）が、より負であればあるほど、複数の代替的構造の動的平衡において熱力学的により有利となる。したがってΔΔＧは、２つの異なるΔＧを有する２つの異なる構造の形成間での有利さにおける差異を測定する。一態様では、ΔΔＧは、動的平衡における他の望ましくない構造の形成可能性に対する、望ましいオリゴヌクレオチド構造の形成の有利さを測定する数値スコアを提供する。一実施形態では、第１の構造が、１つのオリゴヌクレオチドの第１領域（５’尾部領域）と、その第１のオリゴヌクレオチドと同じ核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドの第１領域（５’尾部領域）との間に形成される二重鎖ハイブリッドであり、第２の構造は、そのオリゴヌクレオチドを含む任意の他の代替的構造である。

「ハイブリダイズ」とは、様々なストリンジェンシーの条件下で相補的ポリヌクレオチド配列（例えば本明細書に記載の遺伝子）またはその部分の間で二本鎖分子を形成することを意味する（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９、Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。ハイブリダイゼーションは、相補的核酸塩基間の、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合形成であってよい水素結合形成によって生じる。例えばアデニンとチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的核酸塩基である。

「核酸ハイブリッド」とは、相補的核酸分子の結合によって形成される実質的な二本鎖分子を意味する。一実施形態では、二本鎖分子は、部分的にまたは完全に二本鎖である。

「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノムではその遺伝子に隣接する遺伝子を、伴わない核酸（例えばＤＮＡ）を意味する。したがってこの用語は、例えばベクターに、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている組換えＤＮＡ、あるいは、他の配列から独立して別個の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたゲノムもしくはｃＤＮＡの断片）を包含する。それに加えて、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されるＲＮＡ分子、および追加的ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを包含する。

用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、天然状態で見出される場合に通常それに伴っている構成成分が、様々な程度において除去されている物質を指す。「単離」は、原材料または周囲からの分離の程度を示す。「精製」は、単離より高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物もそのタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えたり他の有害な結果を生じたりしないように、十分に他の物質が除かれている。すなわち本発明の核酸またはペプチドは、それが組換えＤＮＡ技術によって産生された場合には細胞物質、ウイルス性物質もしくは培養培地を、あるいは化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学薬品を実質的に含まない場合に、精製されていることになる。純度および均質性は、典型的には、分析的化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じることを示し得る。例えばリン酸化またはグリコシル化のような修飾に供され得るタンパク質については、異なる修飾が異なる単離タンパク質を生じ得、これらは別々に精製することができる。

「融解温度（Ｔｍ）」とは、分子集団の５０％が１つの状態であってその集団の５０％が別の状態であるという平衡にある系の温度を意味する。本発明の核酸に関しては、Ｔｍは、集団の５０％が一本鎖であり、５０％が二本鎖（例えば、分子内または分子間で）である温度である。

「反応をモニタリング（監視）する」とは、反応の進行を検出することを意味する。一実施形態では、反応進行をモニタリングすることは、ポリメラーゼ伸長を検出することおよび／または増幅反応の完了を検出することを含む。

本明細書において使用される、「薬剤を得ること」などにおける「得ること」は、その薬剤を合成する、購入する、またはその他のやり方で取得することを含む。

本明細書において使用される用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、および一本鎖または二本鎖形態でのそれらのポリマーを指す。この用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと類似の様式で代謝される、合成、天然、および非天然の、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは連結を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例は、非限定的に、２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−Ｆヌクレオチド）を含む。

本明細書において使用される「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環またはリン酸基への１つまたは複数の修飾を有するヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸およびシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、ならびにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸およびデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを除く。修飾は、メチル基転移酵素などの、ヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる、天然に存在するものを含む。修飾ヌクレオチドは、合成または非天然ヌクレオチドも含む。ヌクレオチド中の合成または非天然修飾は、２’修飾、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）または塩基類似体を含むものを有するものを含む。

「ヌクレオチド付加物」とは、標準的ヌクレオチド塩基に共有結合している、またはその他のやり方で固定されている成分を意味する。

「ニッキング剤」とは、二本鎖核酸分子中の特異的構造を認識しそれに結合でき、その認識される特異的構造への結合の際に、一本鎖上で隣接しているヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を切断し、それによりニック部位に先行する末端ヌクレオチドに遊離３’−ヒドロキシル基を生ずることができる化学物質を意味する。好ましい実施形態では、３’末端は、エクソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによって伸長され得る。例示的ニッキング剤は、ニッキング酵素、ＲＮＡザイム、ＤＮＡザイム、および遷移金属キレーターを含む。

「パリンドローム」とは、１つの鎖上で５’から３’に読んでも或いはその相補鎖上で５’から３’に読んでも同一である核酸配列を意味する。完全なパリンドロームとは、２つの隣接サブ配列を有する配列であって、１つのサブ配列が５’から３’方向に読まれた場合に、他方のサブ配列が３’から５’方向に読まれたものと同一になっているものを指す。

「ポリメラーゼ停止分子」とは、ポリヌクレオチド鋳型上のポリメラーゼの進行を抑制または顕著に低減する、ポリヌクレオチド鋳型またはプライマーに付随する成分を意味する。好ましくは、この成分は、ポリヌクレオチドに組み込まれる。好ましい一実施形態では、この成分は、鋳型上でのポリメラーゼの進行を抑制する。

「ポリメラーゼ伸長」とは、次に来る単量体を鋳型ポリヌクレオチド上のそれらの結合パートナーに合致させる、ポリメラーゼの前方進行を意味する。

本明細書において使用される「プライマー二量体」は、２個の単量体オリゴヌクレオチドプライマーの二量体を意味する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーでは、単量体プライマーの５’尾部領域が二量体化する。

「特異的産物」とは、プライマーオリゴヌクレオチドの相補的標的配列へのハイブリダイゼーションと、それに続くポリメラーゼ媒介による標的配列の伸長とから生じる、ポリヌクレオチド産物を意味する。

「実質的に等温条件」とは、単一の温度または著しくは変動しない狭い温度範囲内であることを意味する。一実施形態では、実質的に等温条件下で実行される反応は、約１〜５℃だけ変動する（例えば、１、２、３、４または５度まで変動する）温度で実行される。別の実施形態では、その反応は、利用される装置の操作パラメーター内の単一の温度で実行される。

「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」とは、標準的状態または対照状態を意味する。当業者には明らかであるように、適切な基準は、要素の影響を判定するためにその要素が変更されるものである。

「対象」とは、これだけに限らないが、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ若しくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含む、哺乳動物を意味する。

「標的核酸分子」とは、分析されるポリヌクレオチドを意味する。そのようなポリヌクレオチドは、標的配列のセンスまたはアンチセンス鎖であってよい。用語「標的核酸分子」は、元の標的配列の増幅産物をも指す。

本明細書で提供される範囲は、範囲内の全ての値についての省略表現であると理解される。例えば１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からのあらゆる数、数の組合せまたは部分範囲を含むと理解される。

具体的に述べられ、または文脈から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される用語「または」は、包括的であると理解される。具体的に述べられ、または文脈から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は単数形または複数形であると理解される。

具体的に述べられ、または文脈から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の２標準偏差内として理解される。約は、言及された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内として理解され得る。文脈から明らかである場合を除いて、本明細書で提供されるすべての数値は用語「約」によって修飾される。

本明細書における可変部の定義における化学基の列挙の記載は、列挙された基のいずれかの単一基または組合せとしてのその可変部の定義を包含する。本明細書における可変部または態様についての実施形態の記載は、いずれかの単一の実施形態またはいずれかの他の実施形態もしくはその部分との組合せとしてのその実施形態を包含する。

本明細書で提供されるあらゆる組成物または方法は、本明細書で提供される他の組成物および方法のいずれか１つまたは複数と組み合わされ得る。

図１は、効率的な指数関数的増幅を有する標的核酸分子の鎖置換核酸増幅反応を説明する機序を示す図である。標的核酸分子（灰色）の３’末端と、対応する、３’認識領域（赤）および二量体化することができる「５’尾部」領域（黒）を有する配列特異的プライマーとの相互作用が示されている。標的特異的増幅のために、３’認識領域（赤）は、標的核酸に対して配列に関して相補的であり、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。活性立体配置にあるプライマーは、２個の単量体プライマーの５’尾部領域の二量体化によって形成される安定なホモ二量体（「プライマー二量体」と呼ばれる）である。具体的な一実施形態では、プライマーは、自己相補的な、対称的に逆位にある配列を有する。生じたプライマー二量体は、一本鎖認識領域（赤）に対して５’にある二本鎖または実質的に二本鎖の二量体化領域（黒）を有する。すなわち、プライマーの標的特異的部分（標的核酸分子にアニーリングすることができる）は、プライマー二量体において３’一本鎖領域として露出している。反応の開始時に、プライマー二量体の３’一本鎖部分が標的核酸分子にアニールし、標的核酸分子の複製を開始する。反応経過の際に、相補鎖の合成からのポリメラーゼ鎖置換作用によって、伸長されたプライマー二量体から単量体プライマーが放出される。増幅反応の特異性および／または効率を増強するために、単量体プライマーは、（１）自己相補的、対称または実質的に対称であり、それ自身に塩基対合することができる配列を有する５’尾部領域と、（２）標的核酸分子に対して配列に関して完全にまたは実質的に相補的であり、標的核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる３’認識領域とを有するように設計される。プライマー二量体形成に関するΔＧが低い場合、プライマーがオープン立体配置を有する単量体として存在する時間は最少化される。単量体プライマーは、非標的特異的プライマー伸長反応における鋳型またはプライマーのいずれとしても作用し得、それによりバックグラウンドを生成および／または増幅することから、単量体プライマーは望ましくない。好ましくは、単量体から二量体への移行は、「実質的に即時的」であるか、または動態学的に可能な限り短い。熱力学的因子（例えば、プライマー二量体形成の非常に低いΔＧ、高プライマー濃度、高い二量体Ｔｍ）を用いて、プライマー二量体形成が有利になるようにする。

図２は、非効率的な増幅を有する標的核酸の鎖置換核酸増幅反応を説明する機序を示す図である。標的核酸分子（灰色）の３’末端と、対応する、配列特異的プライマー（赤および黒）との相互作用が示されている。オープン立体配置にある単量体プライマーが反応全体を通じて持続する等温反応は、直線状の非特異的バックグラウンド増幅を生じる。プライマー二量体形成を好まないプライマー単量体は、例えば、単量体プライマーの５’部分（黒）において自己相補的配列が最小限であるかまたは存在せず、プライマー二量体形成について高いΔＧをもたらす。プライマー二量体が標的核酸分子と相互作用することがアニーリングおよび伸長反応を駆動することから、プライマー二量体の形成は標的核酸の合成および／または増幅の効率に影響を与える。完全にまたは部分的なオープン立体配置において、プライマー単量体は、非標的特異的プライマー伸長反応において鋳型またはプライマーのいずれかとしても作用し得（挿入図参照）、これがさらなる反応非効率性につながる。単量体プライマーのオープン立体配置が（例えば配列設計によって）最少化されない場合、単量体から二量体への移行は遅いが、それはその移行が熱力学的因子（例えば、複数の二量体立体配置および部分的二量体立体配置が共に同様のΔＧおよび低い二量体Ｔｍを有すること）によって有利とならないからである。

図３は、プライマー二量体形成を阻害するプライマー構造を示す図であり、そのようなプライマー構造は、例えば、非特異的副産物（構造（Ｈ）〜（Ｊ））の増幅をもたらす構造（Ａ）〜（Ｃ）、または標的ハイブリダイゼーションをすることができない構造（Ｄ）および（Ｋ）を含む。プライマー（赤および黒）核酸断片（灰色）間の相互作用が示されている。構造（Ａ）は、標的特異的領域中に「ループして」戻って「自己複製」のために伸長可能な３’末端を生ずることができる不連続逆位配列を有するプライマー単量体を示す。構造（Ａ）は、ヘアピン構造を形成するようにそれ自体にループして戻る５’領域も有する。構造（Ｂ）は、プライマーの標的特異的領域中に「ループして」戻って「自己複製」のために伸長可能な３’末端を生ずることができる不連続逆位配列を有するプライマー二量体を示す。構造（Ｃ）は、「オープン」立体配置にあるプライマー単量体と、近くに位置する鋳型ＤＮＡ中のランダムなおよび／または配列特異的なニックからのＤＮＡポリメラーゼニック伸長反応によって剥がされた一本鎖ＤＮＡ断片（灰色）との間の偽ハイブリッド構造を示す。構造（Ｄ）は、部分的二本鎖二量体構造を示し、そこでは、標的特異的領域の大部分が標的ハイブリダイゼーションに利用できない。構造（Ｄ）は、プライマー単量体中の逆位配列反復によって形成され得る。構造（Ｅ）は、構造（Ａ）から生成される、中間体の、偽プライマー伸長／鎖置換反応産物を示す。構造（Ｇ）は、構造（Ｂ）から生成される、中間体の、偽プライマー伸長／鎖置換反応産物を示す。構造（Ｈ）は、「ニックアンドキック」様式での成熟した偽反応産物を示し、これは一本鎖副産物の連続的再循環および増幅を生じる。構造（Ｊ）は、「ニックアンドキック」様式での成熟した偽反応産物を示し、これは一本鎖副産物の連続的再循環および増幅を生じる。構造（Ｋ）は、反応における構造（Ｄ）の部分二本鎖二量体の持続を示す。標的特異的領域の大部分が標的ハイブリダイゼーションに利用できないことから、標的核酸複製および／または増幅は阻害され、または開始されない。本発明によるプライマー設計は、望ましくないプライマー構造の形成およびそれらの標的特異的核酸増幅における阻害効果を最少化する、最適なプライマー二量体形成を促進する。

図４は、良い（右）および悪い（左）プライマー構造を示す図である。本発明のプライマーは、自己相補的配列の存在により、プライマー二量体および／またはヘアピンを含む、増幅反応に好ましい構造を取ることができる。理論に束縛されることなく、プライマー二量体はより安定であって、プライマーが高濃度で反応物中に存在する場合に（例えば反応の開始時に）形成され、ヘアピンは、プライマー濃度が低減された場合に（例えば反応の経過時に）形成される。

図５は、望ましくないプライマー立体配置を示す図であり、非最適プライマーの立体配置間に動的平衡が存在している。各構造の形成に対応するΔＧがおよそ同じである場合（すなわち、ΔＧ_１≒ΔＧ_２≒ΔＧ_３≒ΔＧ_４）、有利となるプライマー立体配置または構造はない。プライマーがそのような複数の立体配置で存在する場合、それは核酸増幅反応を促進するように最適に形成されてはいない。

図６は、最適なプライマーとは、二量体立体配置が非常に有利となるもの（すなわち、ΔＧ_１＞＞ΔＧ_２）、特に、その次に好まれる立体配置（例えばプライマーが分子内でそれ自身と相互作用する場合）よりも有利となるものであることを示す図である。この立体配置は、立体配置間に動的平衡が存在する図５とは対照的である。プライマーは、望ましくないプライマー立体配置および構造の形成を低減または排除しながら、核酸増幅反応のために好ましい安定な立体配置および構造を有するように設計され得る。５’尾部二量体化領域を有するプライマーについては、５’尾部配列は、それが有利となり他の構造より安定であるように選択される（ΔＧ_１≦−３０〜−６２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。ニッキング増幅反応におけるプライマーについては、５’尾部配列は、実質的に自己相補的かつ対称的に逆位である。そのようなプライマーは、分子内相互作用（例えばヘアピンループ）を形成する可能性を有し得る。しかしそのような立体配置は、対称的な逆位配列が完全に自己相補的である場合には最少化され、そのことはプライマー二量体の安定性がヘアピンループ構造を超えること（ΔＧ_２と比較して非常に低いΔＧ_１）により示されている。したがって、プライマーが十分高濃度である場合には、ヘアピンは事実上形成されない。

図７は、ニッキング増幅反応において有用なプライマーの、安定なプライマー二量体構造の配列を示す図である。図７は、上部鎖ニッキング酵素（Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）のためのニッキング酵素認識配列を含む５’尾部領域を有するプライマー二量体の、ホモ二量体を示す。ニック部位は、５’尾部領域の３’末端のヌクレオチドと３’認識領域の５’末端のヌクレオチドとの間に位置するように設計される。理論に束縛されることなく、ニッキング酵素は、３’認識が一本鎖である場合にはニック部位での切断をしない。しかしながら、３’認識領域が二本鎖である場合（例えば核酸増幅反応の経過の際にプライマーが二本鎖標的核酸分子に組み込まれる場合）には、ニック部位での切断が起こる。

図８Ａ〜８Ｃは、例示的５’尾部領域配列を示す図である。図８Ａは、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有し、次の式：５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’に基づく、長さ２４ヌクレオチドの例示的５’尾部領域配列を示す。この式に基づいて、次の特性：ΔＧ＝−３４．２Ｋｃａｌ／モル〜−６５ｋｃａｌ／モル、ΔΔＧ＜−４０ｋｃａｌ／モル、かつＧＣ含有量６８％〜８４％を有する、５３７、８２４通りの５’尾部配列が存在する。これらの内の、１０５０の選択配列が提供され、これは配列スペース全体（２４８、８３２）の０．２％を表す。図８Ｂは、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有し、次の式：５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣＮＮＮＮＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’に基づく、長さ２２ヌクレオチドの例示的５’尾部領域配列を示す。この式に基づいて次の特性：ΔＧ＝−４７Ｋｃａｌ／モル〜−５５ｋｃａｌ／モル、ΔΔＧ＜−４０ｋｃａｌ／モル、かつＧＣ含有量７２％〜８２％を有する、２４８、８３２通りの５’尾部配列が存在する。これらの内、２００の選択配列が提供され、これは配列スペース全体（２４８、８３２）の０．０８％を表す。図８Ｃは、６ヌクレオチドスペーサー領域を有する例示的５’尾部領域配列を示す。

図９は、ＤＮＡ増幅の２チャネル検出によって検出される、５’尾部および３’認識領域を有する本発明のプライマーを使用した標的特異的核酸増幅を示すグラフである。標的特異的産物は、分子ビーコンプローブによって検出される（上パネル）。非特異的核酸増幅はＳＹＢＲＧｒｅｅｎによって検出される。両グラフにおいて見られるとおり、指数関数的増幅がおよそ６分間で始まり、増幅が標的特異的であることを示している。入力を有さない対照反応は実質的にバックグラウンドを生じなかった。

図１０は、５’尾部および３’認識領域を有する本発明のプライマーを使用する核酸増幅が、標的核酸の迅速な検出のために有用な特徴を有することを示すグラフである。そのような反応は、高い信号雑音比（［ＲＦＵ_ＭＡＸ−ＲＦＵ_ＢＬ］）、急な勾配（高値の［ＲＦＵ_ＭＡＸ−ＲＦＵ_ＢＬ］／［Ｔ_ＯＳＥＡ−Ｔ_{ＲＦＵｍａｘ}］）、指数関数的増幅相の早い出現（Ｔ_ＯＳＥＡ＜１０分間）、および、同じ試料の反復アッセイ反応間における低いシグナル変動によって特徴付けられる。

図１１は、うまく働くアッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーを、それらの相対的安定性によりプロットしたグラフである。ΔΔＧ≦約−１６ｋｃａｌ／モルを有する３’認識領域を有するプライマーは、ニッキング増幅アッセイにおいて有効である（うまく働く）ことが観察された一方、ΔΔＧ＞約−１６を有するプライマーは不良である場合が多かった。ΔΔＧ≦約−１６ｋｃａｌ／モルを有する３’認識領域とΔΔＧ≦約−３０ｋｃａｌ／モルを有する５’尾部とを有するプライマーはすべて有効であることが観察された。

図１２は、性能が不明の多数の候補プライマー組合せをスクリーニングすることをせずに、一対の予測された最適プライマー構造と単一の予測された最適プローブとから行う、ダイズレクチンについての等温ＤＮＡ増幅アッセイの設計を示す図である。

図１３は、ダイズレクチンについての等温ＤＮＡ増幅アッセイの最初の実験試行の結果を示すグラフであり、これはアッセイ性能予測を実験的に確証している。ダイズゲノムＤＮＡを含有する反応において標的特異的増幅が観察された。標的を含まない対照反応では増幅は観察されなかった。

図１４は、性能が不明の多数の候補プライマー組合せをスクリーニングすることをせずに、一対の予測された最適なプライマー構造と単一の予測された最適プローブから行う、病原性サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ｉｎｖＡ遺伝子についての等温ＤＮＡ増幅アッセイの設計を示す図である。

図１５は、病原性サルモネラ・エンテリカｉｎｖＡ遺伝子についての等温ＤＮＡ増幅アッセイの最初の実験試行の結果を示すグラフであり、これはアッセイ性能予測を実験的に確証している。ダイズゲノムＤＮＡを含有する反応において標的特異的増幅が観察された。標的を含まない対照反応では増幅は観察されなかった。

図１６は、サルモネラ・エンテリカｉｎｖＡ遺伝子についての等温ＤＮＡ増幅アッセイが容易に最適化されることを示す２個のグラフである。

図１７Ａ〜１７Ｉは、プライマー構造パラメーター（Ｔ_Ｍ、％ＧＣ、ｂｐ長、ΔＧ_２５℃、ΔΔＧ_２５℃）クラスター分析を示す図である。図１７Ａは、有効（ｗｏｒｋｉｎｇ）アッセイプライマーおよび不良（ｆａｉｌｅｄ）アッセイプライマーの第１プライマー領域（５’尾部）自己・自己二量体のΔΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を、第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のΔΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーのクラスター化は、機能性／非機能性との相関を示した。図１７Ｂは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの第２プライマー標的相補的領域の塩基長を、第２プライマー標的相補的領域の％ＧＣ含有量に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。図１７Ｃは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの第２プライマー標的相補的領域の塩基長を、第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。図１７Ｄは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のＴ_Ｍ（℃）を、第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーは、機能性／非機能性との相関を示さなかった。図１７Ｅは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの最も好まれた第２プライマー領域／オフターゲットハイブリッド二重鎖のΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を、プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。図１７Ｆは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの第２プライマー領域の％ＧＣ含有量を、第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のＴ_Ｍ（℃）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。図１７Ｇは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの第２プライマー領域の％ＧＣ含有量を、第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のΔＧ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。図１７Ｈは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーの第２プライマー領域の％ＧＣ含有量を、第２プライマー領域／標的ハイブリッド二重鎖のＴ_Ｍ（℃）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。図１７Ｉは、有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーのプライマー（３’標的認識領域）の塩基長を、プライマー・標的ハイブリッド二重鎖のＴ_Ｍ（℃）に対してプロットしたグラフである。有効アッセイプライマーおよび不良アッセイプライマーはランダム分布を示した。

（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、プライマーの予測可能な設計のために有用であり、核酸増幅反応において標的核酸分子の増幅のためにそのようなプライマーを使用する方法である。組成物および方法はまた、核酸増幅反応（ニッキング増幅反応を含む）における標的核酸分子の増幅および検出のために有用である。

本発明は、核増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチド（プライマーおよびプローブを含む）に関するいくつかの発見、および核酸増幅反応を増強または実現することに対するそれらの効果に関するいくつかの発見に、少なくとも部分的に基づいている。出願人らは、これらの発見の１つまたは複数の組合せが、核酸増幅反応および／または検出アッセイのためのプライマーおよびプローブを設計するために適用され得ることを最初に認識した。

本発明は、ある種の立体配置にあるオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーおよびプローブ）が核酸増幅反応性能を増強する可能性を有すること、および、好ましい立体配置をとるオリゴヌクレオチドの能力は、望ましい特異的オリゴヌクレオチド・標的配列ハイブリッドと、そのオリゴヌクレオチドの種々の非特異的な分子内（部分的二本鎖単量体）および分子間複合体（プライマー・プライマーおよびプライマー・プローブ二量体、オフターゲットハイブリッド）との間の自由エネルギー変化（ΔＧ）における差異を検討することによって決定され得るという発見に、少なくとも基づいている。今日まで、プライマーおよびプローブの設計は、標的特異的および非特異的なプライマーおよびプローブの構造間の自由エネルギーにおける差異を、標的配列増幅アッセイのための最も好適なプライマー／プローブセットを同定するためのスコア順位付けツールとして用いてこなかった。前述の事柄をプライマー設計に適用することは、予測可能的に機能するプライマーの設計をもたらし、実験的検査の必要を最少化または排除する。したがって本発明は、実用可能な核酸増幅および検出反応を促進するプライマー配列選択、プライマー修飾、および／またはプローブ設計のための方法を提供する。

出願人らは、プライマー・標的形成が安定である（例えば、ΔＧ_２５℃≦約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌあるいはそれを超える）３’認識配列を有するプライマーが、核酸増幅反応性能を増強する可能性を有することを発見した。具体的な実施形態では、３’標的認識配列は、１２〜２４、１２〜１７または１２〜１４塩基を含む。具体的な実施形態では、プライマー・標的形成は、自己二量体形成より安定である（例えば、ΔΔＧ≦約−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌあるいはそれを超える）。実際、有効アッセイと非有効アッセイとの間の差異は、ΔΔＧ＜約−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合であることが見出された（例えば図１１を参照されたい）。

さらに、出願人らは、自己二量体化できる５’尾部領域を有するプライマーが核酸増幅反応性能を増強することを発見した。理論に束縛されることなく、核酸増幅反応においてこのプライマーは、プライマー二量体として標的核酸にアニールする（例えば図１を参照されたい）。驚くべきことに、かつ予測外なことに、このプライマー二量体立体配置は、検出可能なかたちでポリメラーゼ活性に干渉せず、プライマーの５’部分がそれ自身または他の核酸分子と非特異的相互作用することを低減または抑制する。５’尾部領域は、完全なパリンドローム配列を含み、それを通じて単量体プライマーが二量体化できる。例えば、プライマーは、標的認識配列についてのプライマーの結合特異性と関係しない５’末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的プライマー相互作用由来の非特異的バックグラウンド産物は、それがなければ特異的産物の増幅のために利用されるはずの反応構成成分を捕捉する可能性を有する。種々の実施形態では、ホモ二量体形成が安定である（例えば、ΔＧ_２５℃≦約−３０、−３５、−４０、−４５、−５０、−５５、−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、あるいはそれを超える）。種々の実施形態では、ホモ二量体は、伸長反応温度より高い融解温度を有する。具体的な実施形態では、５’尾部領域は、パリンドロームである配列を有する。さらなる実施形態では、５’尾部領域は、長さ少なくとも２０塩基（例えば、２０、２１、２２、２３、２４塩基）である。付加的な実施形態では、５’尾部領域は、８０〜９０％のＧＣ含有量を有する。特定の実施形態では、ホモ二量体形成は、安定性がより低い他のプライマー二量体コンホメーションの形成より安定である（例えば、ΔΔＧ≦約−１５、−２０、−２５、−３０、−３５、−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、あるいはそれを超える）。

さらに出願人らは、３’認識領域の３’末端に２’修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アルキル）を含むプライマーが、非特異的バックグラウンド産物を低減または排除することを発見した。これは、核酸増幅反応において、バックグラウンド産物の生成を伴わずに特異的産物の生成を増加させる。種々の実施形態では、３’認識領域中のヌクレオチドの１つまたは複数が、ミスマッチ塩基対を不安定化させる修飾核酸塩基を含む。具体的な実施形態では、修飾核酸塩基は、３’末端から１、２、３、４、５または６位で開始する２つ以上の連続ヌクレオチドにおけるものであり、ここで１位は３’末端のヌクレオチドである。特定の実施形態では、３’認識領域の最初の５’ヌクレオチドと最も近い３’修飾ヌクレオチドとの間に、８個以上１０個以下の未修飾ヌクレオチドが配置される。

特定の実施形態では、プライマーは、３’認識領域および５’尾部二量体化領域を含む。反応条件下で、単量体プライマーは、それらの５’尾部二量体化領域の結合によって、プライマー二量体を形成するように二量体化する。理論に束縛されることなく、プライマー二量体の一本鎖３’認識領域は、標的核酸分子にアニールし、相補的標的鎖を合成する。相補鎖の合成からのポリメラーゼ鎖置換作用によって、伸長された鎖から単量体プライマーが放出される。放出された単量体プライマーは、５’尾部領域結合によって別の遊離単量体と二量体化する。複数サイクルが指数関数的標的核酸増幅をもたらす。

［プライマー設計］
プライマー設計のための従来の方法は、プライマー融解温度、プライマーアニーリング温度、ＧＣ（グアニンおよびシトシン）含有量、プライマー長、および、プライマーが標的核酸以外と相互作用することを最小化することに焦点を合わせてきた（例えばｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈ＿ｎｏｔｅｓ／ＰＣＲ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿Ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍｌを参照されたい）。これらの方法とは対照的に、形成の自由エネルギー（ΔＧ）の観点から表される安定プライマー／二量体を形成するプライマーが、核酸増幅反応において予測可能に機能することが見出された。自由エネルギー（ΔＧ）と融解温度（Ｔｍ）は、主な構成要素エンタルピー（ΔＨ）およびエントロピー（ΔＳ）を共有するが、ΔＧとＴｍ値は異なって導かれ相関関係を有さず、所与のΔＧを所与のＴｍ値と関連付ける唯一の方法は、それらが由来するΔＨおよびΔＳの値を正確に知ることだけである（Ｍａｎｔｈｅｙ，“ｍＦｏｌｄ，Ｄｅｌｔａ Ｇ，ａｎｄ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ”著作権２００５ ａｎｄ ２０１１ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。図１〜１１は、最適なプライマーの設計に関する。

分子間プライマー構造についての形成の自由エネルギー（ΔＧ）は、当技術分野において周知の式を使用して算出され得る。例えば、ｍｆｏｌｄおよびＵＮＡｆｏｌｄ予測アルゴリズムを含む多数のプログラムが、種々の分子内および分子間プライマー構造の形成を決定しそれらのΔＧを算出するために利用可能である（例えば、Ｍａｒｋｈａｍ ａｎｄ Ｚｕｋｅｒ．ＵＮＡＦｏｌｄ：Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｐｐ３〜３１，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，２００８、Ｚｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｉｎ ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１〜４３，ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９、Ｍ．Ｚｕｋｅｒ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ Ｅｎｅｒｇｙ Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６７〜２９４，１９９４、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ Ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｄ Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ＲＮＡ．Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８３，２８１〜３０６，１９９０、Ｚｕｋｅｒ．Ｏｎ Ｆｉｎｄｉｎｇ Ａｌｌ Ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ Ｆｏｌｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ＲＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４，４８〜５２，１９８９を参照されたい）。ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１は、プライマー設計のためのｍｆｏｌｄのそのような一実施形態である（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／）。例えばＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ ３．１に関して、ΔＧ算出は、次のパラメーターを使用して実施され得る：標的種類：ＤＮＡ、オリゴ濃度０．２５μＭ、Ｎａ^＋濃度：６０ｍＭ、Ｍｇ^＋＋濃度：１５ｍＭおよびｄＮＴＰ濃度：０．３ｍＭ。

［３’認識領域］
本発明は、そのプライマー・標的形成が安定（ΔＧ≦約−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌあるいはそれを超える）であって核酸増幅反応性能を増強する可能性を有する３’認識配列を有する、プライマーを提供する。３’認識領域は、標的核酸に、例えば標的核酸の相補的配列に、特異的に結合する。特定の実施形態では、３’認識領域は、標的核酸配列の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０塩基以上と相補的である配列を有する。種々の実施形態では、プライマー・標的融解温度は、アッセイの反応または伸長温度の８または６℃下の温度以上である（Ｔｍ≧アッセイ温度−８℃）。具体的な実施形態では、３’認識配列は、１２〜２０、１２〜１７、または１２〜１４ヌクレオチドを含む。具体的な実施形態では、プライマー・標的形成は、自己二量体形成よりも安定である（例えばΔΔＧ≦約−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０ｋｃａｌ／ｍｏｌあるいはそれを超える）。実際、有効アッセイと非有効アッセイとの間の差異は、ΔΔＧ＜約−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合であることが見出された（例えば図１１を参照されたい）。好ましくは、３’認識配列は、自己相補的配列、短い逆位反復（例えば＞４塩基／反復）、または他に分子内相互作用を促進する配列を含有しない（それらはプライマー・標的アニーリングに干渉する可能性を有する。

特に、３’認識配列を有する本発明のプライマーはニッキング増幅アッセイにおいて有用である。さらに、標的特異的３’認識領域は、１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、２’−ヒドロキシル（ＲＮＡ）、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート））を含む。理論に束縛されることなく、認識領域中に１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを組み込むことがプライマーの分子間および／または分子内相互作用（例えば、プライマー二量体形成）を低減または排除し、それにより等温増幅においてバックグラウンドシグナルを低減または排除することが仮定される。２’修飾ヌクレオチドは、好ましくは、標的配列と塩基対合する塩基を有する。具体的な実施形態では、標的特異的認識領域中の２個以上の２’修飾ヌクレオチド（例えば、２、３、４、５個以上の２’修飾ヌクレオチド）が連続している（例えば、修飾ヌクレオチドのブロック）。いくつかの実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、標的特異的認識領域の３’末端に位置している。他の実施形態では、２’修飾ヌクレオチドのブロックは、標的特異的認識領域の５’末端に位置している。２’修飾ヌクレオチドのブロックが標的特異的認識領域の５’末端に位置している場合、２’修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチド（例えば、２、３、４、５個以上の２’未修飾ヌクレオチド）によってニック部位から隔てられていてよい。出願人は、１つ以上の２’修飾ヌクレオチドの位置または２’修飾ヌクレオチドのブロックの位置が、増幅の動態を改変することを見出した。１つ以上の２’修飾ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチドのブロックが、認識領域の５’末端またはその近くに、あるいはニック部位の近位に位置する場合、リアルタイム増幅反応は検出までの時間の減少を示した。さらに、シグナル曲線が縮約され、曲線の勾配がシフトする。

関連実施形態では、１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーの比率を使用して、検出までの時間および／または反応の効率を変更して反応の「チューニング（調整）」を行うことができ、これは反応動態について予測可能な制御をもたらす。認識配列の３’末端に１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーの比率を、認識配列の５’末端に１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを有するプライマーに対して増加させることは、シグナル曲線を縮約させ、曲線の勾配をシフトさせた。検出までの時間および反応の効率の両方を操作する手段を提供して反応を「チューニング」できることは有利である。反応をチューニングすることは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において、標的核酸増幅の効率と基準核増幅（例えば内部標準）との効率を合致させるために使用され得る。さらに、標的核酸増幅と内部標準増幅とについて同じ効率を提供しながら、それらの増幅産物の検出の時間が分離するように、標的核酸の増幅曲線と内部標準の増幅曲線を変化させることができる。反応内でのオリゴヌクレオチド構造の特定の組合せおよび比率の使用を通じて、チューニングされた反応性能を可能にする条件を創出することが可能になる。

［５’尾部二量体化領域］
本発明は、核酸増幅反応性能を増強する、自己二量体化することができる５’尾部領域を有するプライマーを提供する。理論に束縛されることなく、核酸増幅反応において、このプライマーはプライマー二量体として標的核酸にアニールする（例えば図１を参照されたい）。例えば、ニッキング増幅プライマーは、標的認識配列についてのプライマーの結合特異性とは関係しない５’末端に存在するニッキング剤認識部位を有する。非特異的プライマー相互作用由来の非特異的バックグラウンド産物は、それがなければ特異的産物の増幅のために利用されるはずである反応構成成分を捕捉する可能性を有する。種々の実施形態ではホモ二量体形成が安定である（例えば、ΔＧ≦約−３０、−３５、−４０、−４５、−５０、−５５、−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、あるいはそれを超える）。種々の実施形態では、ホモ二量体は、伸長反応温度より高い融解温度を有する。具体的な実施形態では、５’尾部領域は、パリンドロームである配列を有する。さらなる実施形態では、５’尾部領域は、長さ少なくとも１２塩基である（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４塩基）。付加的な実施形態では、５’尾部領域は、８０〜９０％のＧＣ含有量を有する。特定の実施形態では、ホモ二量体形成は、他のより安定性が低いプライマー二量体コンホメーションの形成よりも安定である（例えば、ΔΔＧ≦約−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２５、−３０、−３５、−４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、あるいはそれを超える）。

特に、５’尾部配列を有する本発明のプライマーは、ニッキング増幅反応において有用である。ニッキング増幅反応における使用のために、５’尾部領域は１つまたは複数のニッキング剤認識部位を有し、５’尾部領域は対称的な逆位配列を有する。いくつかの実施形態では、ニック部位は、５’尾部領域の３’末端のヌクレオチドと３’認識領域の５’末端のヌクレオチドとの間に位置するように設計されている。理論に束縛されることなく、ニッキング酵素は、３’認識が一本鎖である場合にはニック部位での切断を行わない。しかしながら、３’認識領域が二本鎖である場合（例えばプライマーが核酸増幅反応の経過の際に二本鎖標的核酸分子に組み込まれる場合）にはニック部位での切断が起こる。

種々の実施形態では、５’尾部配列は、５’から３’に、逆位ニッキング酵素認識配列、それに作動可能に連結されたパリンドローム配列（または自己相補的配列）、それに作動可能に連結されたニッキング酵素認識配列を含む。特定の実施形態では、スペーサー領域は偶数個のヌクレオチド（例えば２、４、６など）である。

２ヌクレオチドのスペーサーを有するＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素認識配列（５’−ＧＡＧＴＣ−３’）に基づく例示的５’尾部は、下記式：

の核酸配列を含み、式中「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と相補的である。

そのような２塩基スペーサー尾部配列についての例示的配列は、例えば下記式：

の核酸配列を含み、式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’ と、Ｎ_３はＮ_３’ と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と相補的である、等々である。

いくつかの実施形態では、２塩基スペーサー尾部は、下記式：

による核酸配列を含むものを除外し、式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と相補的である、等々である。

４ヌクレオチドスペーサーを有しＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素認識配列（５’−ＧＡＧＴＣ−３’）に基づく例示的５’尾部は、下記式：

による核酸配列を含み、式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と相補的であり、Ｎ_２はＮ_２’と相補的である。

そのような４塩基スペーサー尾部配列についての例示的配列は、例えば、下記式：

による核酸配列を含み、式中「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と、Ｎ_６はＮ_６’と相補的である、等々である。

いくつかの実施形態では４塩基スペーサー尾部は、下記式：

による核酸配列を含むものを除外し、式中「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と相補的である、等々である。

６ヌクレオチドスペーサーを有しＮｔ．ＢｓｔＮＢＩニッキング酵素認識配列（５’−ＧＡＧＴＣ−３’）に基づく例示的５’尾部は、下記式：

による核酸配列を含み、式中「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と相補的であり、Ｎ_２はＮ_２’と相補的であり、Ｎ_３はＮ_３’と相補的である。

そのような６塩基スペーサー尾部配列についての例示的配列は、例えば下記式：

による核酸配列を例えば含み、式中「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と、Ｎ_６はＮ_６’と、Ｎ_７はＮ_７’と相補的である、等々である。

いくつかの実施形態では、６塩基スペーサー尾部は、下記式：

による核酸配列を有するものを除外し、式中「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と相補的である、等々である。

例示的５’尾部領域配列が図８Ａ〜８Ｅに提供されている。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有する、長さ２４ヌクレオチドの例示的５’尾部領域配列は、次のテンプレート５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’に基づいて生成され得る（図８Ａ）。このテンプレートに基づいて、次の特性：ΔＧ＝−４８Ｋｃａｌ／モル〜−６２ｋｃａｌ／モル；ΔΔＧ＜−４０ｋｃａｌ／モル；およびＧＣ含有量６８％〜８４％を有する５３７、８２４個の５’尾部配列が存在する。それらの内、１０５０の選択配列が提供され、これは配列スペース全体（２４８、８３２）の０．２％を表す。長さ２２ヌクレオチドの例示的５’尾部領域配列は、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ認識配列を有し、次のテンプレート：５’−ＮＮＮＮＧＡＣＴＣＮＮＮＮＧＡＧＴＣＮＮＮＮ−３’に基づく（図８Ｂ）。この鋳型に基づいて、次の特性：ΔＧ＝−４７Ｋｃａｌ／モル〜−５５ｋｃａｌ／モル、ΔΔＧ＜−４０ｋｃａｌ／モル、およびＧＣ含有量７２％〜８２％を有する２４８、８３２個の５’尾部配列が存在する。これらの内、２００の選択配列が提供され、これは配列スペース全体（２４８、８３２）の０．０８％を表す。

［核増幅方法］
核酸増幅技術は、複雑な生物学的プロセスの理解、病原性および非病原性生物の検出および同定、法医学的犯罪学分析、疾患関連研究、ならびに遺伝的に改変された生物における事象の検出などの手段を提供してきた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡを増幅するために使用される一般的な熱サイクル依存核酸増幅技術であり、ＤＮＡ融解とＤＮＡポリメラーゼを使用したＤＮＡの酵素的複製とのための反応物の反復的加熱および冷却のサイクルからなる。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、生物学的試料中の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用される技術である。現在、ｑＰＣＲは、反応を通じたリアルタイムでの反応産物の検出を利用し、増幅プロファイルを、各反応の開始時に既知量の核酸（または未知の検査核酸に対する既知の比率の核酸）を含有する対照の増幅と比較する。典型的には標準反応増幅曲線の対数部分に基づいて、対照の結果を使用して標準曲線を構築する。これらの値は、それらの増幅曲線がどこで標準対照量と匹敵するかに基づいて未知物の量を内挿するために使用される。

ＰＣＲに加えて、非限定的に：ニッキング増幅反応、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ＬＡＭＰ法（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写増幅法（ＴＭＡ）、自己持続配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、Ｑ−β複製酵素系、およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む、非熱サイクル依存増幅系または等温核酸増幅技術が存在する。

等温ニッキング増幅反応は、ＰＣＲ熱サイクルと類似性を有する。ＰＣＲと同様にニッキング増幅反応は、プライマーと称される、標的配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列を用いる。それに加えて、標的配列のニッキング増幅反応は、標準的ＰＣＲと全く同じ様に、標的配列の対数的増加をもたらす。標準的ＰＣＲとは異なり、ニッキング増幅反応は等温で進行する。標準的ＰＣＲでは、ＤＮＡの２本の鎖が分離できるように温度が上昇される。ニッキング増幅反応では、標的核酸配列は、検査試料中に存在する特異的ニッキング部位においてニックを入れられる。ポリメラーゼはニック部位に進入し、既存の相補的ＤＮＡ鎖を剥がしつつ、ニックが入れられた標的ヌクレオチド配列（付加された外来性ＤＮＡ）の相補鎖合成を開始する。この鎖置換複製工程は、熱的鎖分離の必要性を排除する。この時点で、プライマー分子は、追加された外来性ＤＮＡから剥がされた相補的配列にアニールする。このときポリメラーゼは、プライマーの３’末端から伸長を行い、既に剥がされた鎖に対する相補鎖を生成する。次いで第２のプライマーオリゴヌクレオチドが、新たに合成された相補鎖にアニールし、伸長されて、ニッキング剤認識配列を含むＤＮＡの二重鎖を作る。次いでこの鎖がニックを受け、ポリメラーゼによる続く鎖置換伸長で、元の標的ＤＮＡの両側にニック部位を有するＤＮＡの二重鎖の中間的増幅産物の産生をもたらす。いったんこの中間的増幅産物が合成されると、その分子は、新たなプライマー分子による剥がされた鎖の複製を通じて、指数関数的に増幅され続けられる。それに加えて、ニック部位が挿入された鋳型でのニック翻訳合成の反復作用を通じて、各産物分子から直線的な増幅も進行する。その帰結は、標的シグナル増幅の非常に急速な増加である。１０分間未満で増幅がもたらされ、それは、ＰＣＲ熱サイクルによって生じるものよりもはるかに速い。

［ニッキング剤依存性等温核酸増幅アッセイ］
本発明は、等温ニッキング増幅アッセイにおいて増幅された標的核酸分子の検出を提供する。本明細書に記載の方法において有用なポリメラーゼは、標的核酸分子に結合されたオリゴヌクレオチド（例えばプライマー）の３’ヒドロキシル末端、および／または二本鎖ＤＮＡ分子中のニック部位における３’ヒドロキシル末端を伸長するためのヌクレオチドの組み込みを触媒する能力を有すると共に、鎖置換活性の能力を有する。そのようなポリメラーゼはまた、５’−３’エクソヌクレアーゼ活性が欠けているかまたは実質的に低減されており、好熱性であるものを含み得る。３’−末端の６ヌクレオチドを含むプライマー領域中に２’−修飾ヌクレオチドを有するプライマーが関わる方法において有用であるＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）としても分類されるバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ならびにゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属を含む密接に関連する細菌の系統、単離株、および種から単離された、ＤＮＡポリメラーゼＩの誘導体およびバリアントを含み、５’−３’エクソヌクレアーゼ活性は欠けているまたは実質的に低減しており、鎖置換活性を有する。例示的ポリメラーゼは、これだけに限らないが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメントを含む。

本明細書に記載の方法において有用なニッキング剤は、二本鎖核酸分子中の特異的構造を認識しかつそれに結合でき、その認識された特異的構造に結合した際に、上部鎖上の隣接したヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を、下部鎖上の隣接したヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を切断するよりも実質的に高い率で切断することができ、それによって、ニック部位に先行する末端ヌクレオチド上に、５’−３’エクソヌクレアーゼ欠損鎖置換ポリメラーゼによって伸長され得る遊離３’−ヒドロキシル基を生成することができる化学物質である。本明細書に開示の方法の好ましい実施形態では、「ニッキング剤」の上部鎖リン酸ジエステル結合切断率は１００％にほぼ等しい一方で、下部鎖リン酸ジエステル結合の切断率は０％にほぼ等しい。本明細書に記載の方法において有用なニッキング剤は、酵素、すなわち複数の基質分子を対象とする自己再生触媒、または１つだけの基質分子を等モル比で対象とする非再生触媒のいずれであってもよい。

ニッキング酵素は、二本鎖ＤＮＡに結合し、二重鎖の二本鎖の内の一本の鎖を切断する。本発明の方法では、ニッキング酵素は、上部鎖（ニッキング剤認識部位の５’−３’配列を含む鎖）を切断する。ニッキング酵素は、結合部位またはニッキング酵素認識部位の上流または下流のいずれかを切断し得る。本明細書で開示される本発明の具体的な実施形態では、ニッキング酵素は、上部鎖だけを切断し、認識部位の３’下流を切断する。例示的実施形態では、この反応は、産物配列がニッキング部位を含有しないように、結合部位の下流を切断またはニック化するニッキング酵素の使用を含む。結合部位の下流を切断する酵素を使用することは、ポリメラーゼがニッキング酵素を押しのける必要なくより容易に伸長できるようにする。理想的には、ニッキング酵素は、ポリメラーゼと同じ反応条件下で機能性を有する。例示的ニッキング酵素は、これだけに限らないが、Ｎ．Ｂｓｔ９Ｉ、Ｎ．ＢｓｔＳＥＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．Ｂｐｕ１０Ｉ（Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）、Ｎｂ．ＢｓｍＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ（ＮＥＢ）、Ｎｂ．ＢｔｓＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＡｌｗＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．Ｂｐｕ１０Ｉ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６Ｉ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ（ＮＥＢ）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（ＮＥＢ）およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩ（ＮＥＢ）を含む。ニッキング酵素認識部位の配列を表１に提供する。

ニッキング酵素は、制限エンドヌクレアーゼの切断活性を改変することによって作製された、操作されたニッキング酵素も含む（ＮＥＢ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ Ｊｕｌｙ ２００６、ｖｏｌ１．２）む。制限エンドヌクレアーゼがＤＮＡ中のそれらの認識配列に結合する場合、各々の鎖を加水分解するための各酵素内の２つの触媒部位が、平行して進行する２つの独立した加水分解反応を駆動する。二重鎖の１つの鎖だけを加水分解し、切断されるのではなく「ニックを入れられた」（３’−ヒドロキシル、５’−リン酸）ＤＮＡ分子を産生するように改変された制限酵素を作出することができる。ニッキング酵素は、修飾ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびニッカーゼ活性を有する亜鉛フィンガーヌクレアーゼも含み得る。

ニッキング増幅反応は、典型的には、例えばジデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）などのヌクレオチドを含む。この反応は、放射標識（例えば、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテンまたは蛍光色素を含むがこれらに限定されない、検出可能成分を含むｄＮＴＰの存在下でも実行され得る。この反応は、ニッキング酵素およびポリメラーゼの活性をもたらすある種の塩および緩衝剤をさらに含む。

有利なことに、ニッキング増幅反応は、実質的に等温条件下で実行され、増幅反応の経過の際に反応の温度が事実上一定である。より高い温度とより低い温度との間で温度が循環される必要がないことから、ニッキング増幅反応は、従来のＰＣＲを実行するのは困難である条件下で実行され得る。典型的には、その反応は、３５℃から９０℃の間（例えば約３５、３７、４２、５５、６０、６５、７０、７５、８０、または８５℃）で実行される。有利なことに、温度が高い正確性で維持されることは必須ではない。温度におけるいくらかの可変性は許容される。

増幅反応のためのプライマーのセットは、ΔΔＧ≦−１５、−１６、１７、−１８、−１９、−２０、−２５、−３０ｋｃａｌ／モルあるいはそれを超えるものを有して選択される。増幅反応の性能特徴は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、１つまたは複数のプライマーおよび／またはプローブ）の濃度および／またはそれらの比を増加させることによって変更され得る。高濃度のプライマーもプライマー二量体形成を好む。種々の実施形態では、プライマーの濃度は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎＭ、あるいはそれを超える。融解温度（Ｔｍ）および反応速度変更因子（例えばエチレングリコールおよびグリセロールであるがこれらに限定されない）も、オリゴヌクレオチドの融解温度を低下させるために使用され得る。加えて、ＤＮＡポリメラーゼ反応速度変更因子（ｄＮＴＰおよびマグネシウムの濃度など）を用いて反応速度を改変させ得る。具体的な実施形態では、フォワードおよびリバースプライマーの５’尾部配列は、同じ核酸配列を有する。

本発明は、候補フォワードプライマーおよび／または候補リバースプライマーの多数の組合せを実験的にスクリーニングすることを伴わずに、ニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイを設計する方法も提供する。Ｔｍ≧アッセイ温度（例えば約５５℃）を有する１２〜２０ｂｐ配列を中央部分に有する、３５〜７０ｂｐ長の領域を、標的配列内に同定する。上記１５〜２０ｂｐ長の中央領域のすぐ下流および上流の１２ｂｐ〜２０ｂｐ長の隣接配列が、上記基準により同定される。上記で選ばれた、二本鎖の下流および上流の隣接配列のＴｍは、互いから±３℃以上は外れない。安定な二量体形成プライマーのための５’尾部領域を、１２〜２０塩基の上流隣接配列の５’末端に、および１２〜２０塩基の下流隣接配列の相補鎖の５’末端に、取り付けることによって、フォワードおよびリバースプライマーの標的特異的対が創出される。フォワードプライマー、リバースプライマー、およびプローブを組み合わせる場合には、プローブと相補的な鎖の合成を駆動するプライマーは、モル比約１．１：１〜１０：１において、他方のプライマーより過剰にある。アッセイ中のプライマーの合計濃度は、１０００ｎＭ以下である。このアッセイ設計方法は、増幅産物≦７０ｂｐに関する予め検証されたＰＣＲアッセイを、ニッキング剤依存性等温鎖置換増幅アッセイに転換するためにも使用され得る。

［標的核酸分子］
本発明の方法および組成物は、検査試料中の標的核酸分子の増幅および／または同定のために有用である。標的配列は、これだけに限らないが、真菌、胞子、ウイルス、または細胞（例えば原核生物、真核生物）を含む試料を含む、標的核酸分子を含む実質的にいかなる試料からも増幅される。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、クラビバクター・ミシガネンシス亜種ミシガネンシス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ）、クラビバクター・ミシガネンシス亜種セペドニカス（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ． Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）、シリンゲ菌トマト病原型（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ Ｔｏｍａｔｏ）、斑点細菌病原菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ）、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、バーティシリウム・ダーリア（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａ）、シュードモナス・クルガタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｕｒｒｕｇａｔａ）、エルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）および青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）を検出する。例示的検査試料は、体液（例えば血液、血清、血漿、羊水、痰、尿、脳脊髄液、リンパ液、涙液、便または胃液）、組織抽出物、培養培地（例えば病原菌細胞などの細胞が増殖された液体）、環境試料、農産物またはその他の食品、およびそれらの抽出物ならびにＤＮＡ同定タグを含む。所望により、試料は、生物学的試料から核酸分子を単離するために典型的に使用される任意の標準的方法を使用して、ニッキング増幅反応の前に精製される。

一実施形態では、プライマーは、試料中の病原体の存在を検出するために、病原体の標的核酸を増幅する。例示的病原体は、真菌、細菌、ウイルスおよび酵母を含む。そのような病原体は、検査試料において、毒素などの病原体タンパク質をコードしている核酸分子を同定することによって、検出され得る。例示的毒素は、これだけに限らないがアフラトキシン、コレラ毒素、ジフテリア毒素、サルモネラ毒素、シガ毒素、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｉｌｉｎｕｍ）毒素、エンドトキシンおよびマイコトキシンを含む。環境的応用については、検査試料は、水、エアフィルター抽出液、土壌試料、建築材料（例えば乾式壁、天井タイル、壁板、建材、壁紙および床仕上げ材）、環境スワブまたは任意の他の試料を含み得る。一実施形態では、プライマーオリゴヌクレオチドは、例えば干ばつに対する植物の耐性、除草剤に対する植物の耐性、または有害昆虫による捕食に対する植物の耐性を改善することを意図した分子育種実験における内部標準として使用される、植物の標的核酸を増幅する。

標的核酸分子は、二本鎖および一本鎖の核酸分子（例えばＤＮＡ、および本明細書に記載の核酸分子とハイブリダイズすることができる、当技術分野において知られる他の核酸塩基ポリマー）を含む。本発明の検出可能オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いた検出に好適なＤＮＡ分子は、これだけに限らないが、二本鎖ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアのＤＮＡ、ウイルス性ＤＮＡおよび合成二本鎖ＤＮＡ）を含む。一本鎖ＤＮＡ標的核酸分子は、例えばウイルス性ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび合成一本鎖ＤＮＡ、または当技術分野において知られる他の種類のＤＮＡを含む。

一般に、検出のための標的配列は、長さ１０から１００ヌクレオチドの間（例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ヌクレオチド）である。標的核酸分子のＧＣ含有量は、約４５、５０、５５または６０％未満であるように選択される。望ましくは、標的配列が、反応混合物中に含まれるいかなるニッキング酵素のためのニッキング部位も含有しないように、標的配列およびニッキング酵素が選択される。

［適用］
本発明のプライマーを使用する標的核酸増幅は、標的核酸の迅速な検出のための有用な特徴を有する（図１０）。そのような反応は、高い信号対雑音比（［ＲＦＵ_ＭＡＸ−ＲＦＵ_ＢＬ］）、急な勾配（高値の［ＲＦＵ_ＭＡＸ−ＲＦＵ_ＢＬ］／［Ｔ_ＯＳＥＡ−Ｔ_{ＲＦＵｍａｘ}］）、指数関数的増幅相の早期出現（Ｔ_ＯＳＥＡ＜１０分間）、および同じ試料の反復アッセイ反応間における低いシグナル変動によって特徴付けられる。特定の実施形態では、Ｔ_ＯＳＥＡ−Ｔ_{ＲＦＵｍａｘ}≒３分間である。

本発明は、等温増幅反応のリアルタイムモニタリングを提供する。本発明の組成物および方法は、迅速な検出が望まれる（例えば２０、１５、１０、９、８、７、６、５分間以下での検出可能な増幅）ヒトの診断において有用である。具体的な実施形態では、本発明は、ヒト診断および臨床設定におけるニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。他の実施形態では、本発明は、熱サイクル装置へのアクセスが利用できないかまたは極めて高価となる診断現場作業において、ニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。さらに他の実施形態では、本発明は、迅速な核酸増幅および検出が望まれる学術的設定でのニッキング増幅反応アッセイの使用を提供する。

［検出可能なオリゴヌクレオチドプローブ］
本発明は、少なくとも１つのポリメラーゼ停止分子（例えば、オリゴヌクレオチドが標的核酸分子に結合はできるが、検出可能オリゴヌクレオチドプローブを標的として利用するポリメラーゼ伸長は支持することができないようにする、ヌクレオチド修飾または他の成分）を含む、増幅不能な検出可能ポリヌクレオチドプローブを使用して、ニッキング増幅反応物中の標的核酸分子またはその増幅産物の検出を提供する。理論に束縛されることなく、ポリメラーゼ進行を許容しない１つまたは複数の成分の存在は、オリゴヌクレオチドへの非核酸骨格付加においてまたは複製ポリメラーゼの失速を通じて、ポリメラーゼ停止を引き起こす（すなわちＣ３−スペーサー、損傷されたＤＮＡ塩基、その他のスペーサー成分、Ｏ−２−Ｍｅ塩基）。したがってこれらの構築物は、ニッキング増幅反応の経過の際に、プローブの不当な増幅を抑制または低減する。このことは、増幅を抑制するためにニッキング増幅反応の終了時に添加されなければならない従来の検出プローブからそれらを区別する。

従来の検出プローブは、リアルタイムでニッキング増幅反応を検出するためには非実用的であることが示されている。従来の検出プローブがニッキング増幅反応に組み込まれると、これらの従来の検出プローブは標的と同時に増幅されてしまう。これらの検出分子の増幅は、反応開始時の検出プローブの開始分子数のために、正当な標的増幅産物の検出を覆い隠してしまう。

本発明は、少なくとも１個のポリメラーゼ停止分子を含む、増幅できない検出可能ポリヌクレオチドプローブを提供する。本発明のポリメラーゼ停止分子は、複製ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断し、それにより検出分子の増幅は抑制するが、標的分子もしくはその増幅されたコピーに対する適正なハイブリダイゼーションまたはヌクレオチド間隔は許容することができる、ヌクレオチド修飾または他の成分を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、検出分子の非正当的増幅を抑制または低減する３炭素スペーサー（Ｃ３スペーサー）を含む。

一実施形態では、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、相補的ヌクレオチドへの増強された結合親和性を有する１つまたは複数の修飾ヌクレオチド塩基を含む。修飾塩基の例は、これだけに限らないが２’フルオロアミダイトおよび２’ＯＭｅ ＲＮＡアミダイト（ポリメラーゼ停止分子としても機能する）を含む。本発明の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブは、さまざまな色のフルオロフォアを伴って合成されてもよく、実質的にいかなる標的配列にもハイブリダイズするように設計され得る。それらの顕著な特異性の観点から、本発明の増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは、試料中の単一の標的核酸分子を検出するために使用され、または、それぞれ異なる標的核酸分子に結合する検出可能なオリゴヌクレオチドプローブの組合せで使用される。したがって、本発明の増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは、同じ反応物中の１つまたは複数の標的核酸分子を検出するために使用でき、それらの標的を同時に検出できるようにする。本発明は、本明細書に記載の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと併せたそのようなフルオロフォアの使用を包含する。

［増幅不可能な検出可能ポリヌクレオチドプローブの使用］
増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは、ニッキング増幅反応で標的核酸分子を増幅および検出するための方法において有用である。この方法は、標的核酸分子を、実質的に等温条件下、適切な緩衝液およびｄＮＴＰの存在下で、ポリメラーゼ、それぞれが標的ヌクレオチド分子上の相補的配列に特異的に結合する２つのプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含む増幅産物を生成する工程と；標的核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを、反応物中のプローブ分子からの蛍光強度に基づいて、反応のあいだリアルタイムで検出することによって、反応物中に存在する標的核酸分子を検出する工程と、を含む。有利なことに、そのような方法は、ニッキング増幅反応をリアルタイムでモニタリングするために有用である。

一般に、本発明の増幅できない検出可能なポリヌクレオチドプローブは、（１）標的核酸分子；（２）標的核酸分子と相補的であるいくつかの数のオリゴヌクレオチドおよびニッキング酵素によって切断され得る部位を含む、２つのプライマー；（３）ｄＮＴＰ；（４）鎖置換ポリメラーゼ；ならびに（５）ニッキング酵素を含む、ニッキング増幅反応物に含有される。したがって本発明は、標的核酸分子を検出するためにこれらの構成成分を使用する方法を提供する。

［ハードウエアおよび／またはソフトウェアでの実装］
本明細書に記載の方法は、一般的目的のまたは特別にプログラムされたハードウエアもしくはソフトウェアで実装されてよい。例えば本方法は、コンピュータ可読媒体によって実装され得る。したがって本発明は、本発明のいずれかの実施形態によるアルゴリズムおよび／または方法を実施するように構成されたソフトウェアおよび／またはコンピュータプログラム製品も提供する。本発明において提供されるアルゴリズムおよび／または方法を実施できるソフトウェアをどのように構成するかは当業者に周知である。コンピュータ可読媒体は、非一過性および／または有形であってよい。例えば、コンピュータ可読媒体は、揮発性メモリー（例えばランダムアクセスメモリーなど）または非揮発性メモリー（例えば読み出し専用メモリー、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、光学ディスク、紙表、パンチカードなど）であってよい。コンピュータ実行可能指令は、適切なコンピュータ言語またはいくつかの言語の組合せで書かれてよい。基本的な計算生物学的方法は、例えばＳｅｔｕｂａｌ ａｎｄ Ｍｅｉｄａｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）、Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ，（Ｅｄ．），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）、Ｒａｓｈｉｄｉ ａｎｄ Ｂｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）およびＯｕｅｌｅｔｔｅ ａｎｄ Ｂｚｅｖａｎｉｓ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２^ｎｄｅｄ．，２００１）に記載されている。

本発明は、プローブ設計、データの管理、分析、および装置操作などのさまざまな目的のために、種々のコンピュータプログラム製品およびソフトウェアも活用し得る（米国特許第５，５９３，８３９号、第５，７９５，７１６号、第５，７３３，７２９号、第５，９７４，１６４号、第６，０６６，４５４号、第６，０９０，５５５号、第６，１８５，５６１号、第６，１８８，７８３号、第６，２２３，１２７号、第６，２２９，９１１号および第６，３０８，１７０号を参照されたい）。さらに本発明は、米国特許出願第１０／１９７，６２１号、第１０／０６３，５５９号（米国特許出願公開第２００２０１８３９３６号）、第１０／０６５，８５６号、第１０／０６５，８６８号、第１０／３２８，８１８号、第１０／３２８，８７２号、第１０／４２３，４０３号および第６０／４８２，３８９号に示されているように、インターネットなどのネットワーク上で遺伝情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有し得る。

［キット］
本発明は、標的核酸分子の増幅のためのキットも提供する。そのようなキットは、対象から得られた生物学的試料中の標的核酸の増幅および検出のために有用である。本発明のキットは、例えば、本明細書に記載されているように、１つまたは複数のポリメラーゼ、フォワードおよびリバースプライマー、ならびに１つまたは複数のニッキング酵素を含んでよい。１つの標的が増幅される場合には、１つまたは２つのニッキング酵素がキットに含まれていてよい。複数の標的配列が増幅され、これらの標的配列に対して設計されたプライマーが同じニッキング酵素についてのニッキング酵素部位を含む場合には、１つまたは２つのニッキング酵素が含まれていてよい。これらのプライマーが異なるニッキング酵素によって認識される場合には、例えば３個以上などのように、より多くのニッキング酵素がキットに含まれていてよい。

一態様では本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ；一次プライマー、二次プライマー、前記プライマー内のニッキング酵素結合部位に対する特異性を有するニッキング酵素、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）を（例えば増幅のために十分な構成成分を含有する緩衝液中に）含む、核酸増幅のためのキットを提供する。種々の実施形態では、一次プライマーおよび二次プライマーは、標的配列と相補的または実質的に相補的な３’末端特異的認識領域配列をそれぞれ有し、この末端特異的認識領域は、１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチド；それ自身と二量体化することができ（例えば自己相補的であり）、前記３’末端特異的認識領域配列の上流のニッキング酵素結合部位を含有する、５’末端尾部領域を含む。具体的な実施形態では、１つまたは複数のプライマーは、（例えば、およそＴｍで加熱し徐冷することによって産生される）プライマー二量体立体配置にある。

本発明のキットは、１つまたは複数の構成成分を、任意の数の別々の容器、包み、チューブ（例えば＜０．２ｍｌ、０．２ｍｌ、０．６ｍｌ、１．５ｍｌ、５．０ｍｌ、＞５．０ｍｌ）、バイアル、マイクロタイタープレート（例えば、＜９６ウエル、９６ウエル、３８４ウエル、１５３６ウエル、＞１５３６ウエル）、ＡｒｒａｙＴａｐｅなどに含んでもよく、あるいは、構成成分はそのような容器に様々な組合せで組み合わされていてもよい。種々の実施形態では、キットは、基準配列に結合しそれを増幅できるプライマー対をさらに含む。具体的な実施形態では、キットは、（例えば、およそＴｍへの加熱および徐冷によって産生される）プライマー二量体立体配置にある、１つまたは複数のプライマーを含む。さらに他の実施形態では、キットは、プライマーを含有する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、ビン、バイアル、チューブ、袋、ポーチ、ブリスター包装、または当技術分野において知られる他の好適な容器形態であってよい。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または核酸を保持するために好適な他の材料で作られていてよい。

キットの構成成分は、例えば１つまたは複数の容器内に存在してよく、例えばすべての構成成分が１個の容器中にあってよく、または、例えば酵素がプライマーとは別の容器中にあってよい。構成成分は、例えば乾燥され（例えば粉末）、または安定緩衝液中（例えば、化学的に安定化された、熱的に安定化された）にあってもよい。乾燥構成成分は、例えば凍結乾燥、真空遠心分離補助乾燥、および／または常圧乾燥によって調製されてよい。種々の実施形態では、ポリメラーゼおよびニッキング酵素が、単一の容器中で凍結乾燥形態にあり、プライマーは、異なる容器中で、凍結乾燥状態（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）、凍結乾燥状態（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｉｅｄ）、または緩衝液中にある。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、ニッキング酵素およびプライマーは、単一容器中で凍結乾燥形態にある。他の実施形態では、ポリメラーゼおよびニッキング酵素が異なる容器に分けられていてよい。

キットは、例えば、反応において使用されるｄＮＴＰ、もしくは修飾ヌクレオチド、反応のために使用されるキュベットその他の容器、または、凍結乾燥された構成成分を再水和するための水もしくは緩衝液のバイアルをさらに含んでよい。使用される緩衝液は、例えば、ポリメラーゼおよびニッキング酵素活性の両方に適切であるものであってよい。

本発明のキットは、本明細書に記載の１つもしくは複数の方法を実施するための説明書、および／または本明細書に記載の１つまたは複数の組成物もしくは試薬の記述を含んでいてもよい。説明書および／または記述は、印刷された形態であってよく、キット挿入物に含まれていてよい。キットは、そのような説明書または記述を提供するインターネット指定区域の記載を含んでいてもよい。

キットは、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはＤＮＡ結合色素などの検出方法（例えば、リアルタイムまたはエンドポイント）のために使用される試薬をさらに含んでよい。キットは、例えば、ＦＲＥＴのための試薬、側方流動デバイス、ディップスティック、蛍光色素、コロイド金粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、またはポリスチレンビーズなどの、検出方法のために使用される試薬をさらに含んでよい。検出構成要素は、側方流動デバイスに組み込まれてよい。側方流動デバイスは臨床現場（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅ）で使用されてよい。

本発明の実施は、特に示す場合を除いて、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来的技術を用い、それらは十分に当業者の技量範囲内である。そのような技術は“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）、“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献に完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生のために適用可能であり、従って本発明を構成し、実施することにおいて検討され得る。具体的な実施形態のために特に有用な技術は、以下のセクションにおいて考察される。

以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法をどのように構築および使用するかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために記載されるものであり、本発明者らが自らの発明として見なすものの範囲を限定することは意図しない。

［実施例１：プライマー標的結合の安定性を決定することによる、ダイズレクチンの等温ＤＮＡ増幅のための系の設計］
プライマーを実験的に試験することによる補助無しで、本発明による設計原理だけを使用して、ダイズレクチンの検出のための良好に働く等温ＤＮＡ増幅アッセイを創出した（図１２）。

ダイズレクチン遺伝子中のアッセイ標的配列は、３０〜６０ｂｐ配列ウインドウ中の一塩基多型（ＳＮＰ）の欠如に基づいて選択した：

太字で示すのは、それぞれフォワードおよびリバースプライマーの設計のために選択された配列領域である。

フォワードプライマー（５’−ＡＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣ−３’）の標的結合配列を選択するために、以下のようにして、標的に対するフォワードプライマー結合の安定性を、フォワードプライマー自己二量体化の安定性と比較した：

フォワードプライマー・標的ハイブリッド（ＰｒＴＨ）のΔＧ_２５℃＝−２５．９９ｋｃａｌ／モル；
プライマー・標的結合領域自己二量体（ＰｒＴＢＲＨＤ）のΔＧ_２５℃＝−３．１４ｋｃａｌ／モル；
ΔΔＧ_２５℃＝ΔＧ_ＰＴＨ−ΔＧ_{ＰＴＢＲＨＤ}＝−２２．８５ｋｃａｌ／モル

低ΔΔＧ（≦約−１６ｋｃａｌ／モル）は、フォワードプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始することができることを示している。

リバースプライマー（５’−ＡＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣ−３’）の標的結合配列を選択するために、以下のようにして、標的に対するリバースプライマー結合の安定性を、リバースプライマー自己二量体化の安定性と比較した。

リバースプライマー５’−ＡＣＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＣ−３’の標的結合領域の安定性（ΔＧ）と、最も近いものに対する相対的安定性（ΔΔＧ）とを、次のとおり決定した：

ｒｅｖプライマー・標的ハイブリッド（ＰｒＴＨ）のΔＧ_２５℃＝−２５．３５ｋｃａｌ／モル；
プライマー・標的結合領域自己二量体（ＰｒＴＢＲＨＤ）のΔＧ_２５℃＝−３．１４ ｋｃａｌ／モル；
ΔΔＧ_２５℃＝ΔＧ_ＰＴＨ−ΔＧ_{ＰＴＢＲＨＤ}＝−２２．２１ｋｃａｌ／モル。

低ΔΔＧ（≦約−１６ｋｃａｌ／モル）は、リバースプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始できることを示している。

ニッキング増幅反応物（５０μｌ）は、０．３ｍＭ ｄＮＴＰ、０．３８Ｕ／ｍｌ Ｂｓｔ ２．０ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）０．１５単位、２５０ｎＭフォワードプライマー、２５０ｎＭリバースプライマー、５’末端でＣａｌＲｅｄ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）によっておよび３’末端でＢＨＱ２（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）によって標識された２００ｎＭ分子ビーコンプローブ、ならびにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ゲノムＤＮＡ（１０，０００コピー）を含有した。プライマーおよびプローブの配列（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡによって合成された）は次のとおりであった：
フォワードプライマー（「ｍ」＝２’−メトキシヌクレオチド）
５’−ＡＣＧＣＧＡＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＣＧＣＧＴＡＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡｍＵｍＧｍＣｍＣ−３’
リバースプライマー（「ｍ」＝２’−メトキシヌクレオチド）
５’−ＡＣＧＣＧＡＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＣＧＣＧＴＡＣＣＡＡＡＧＡＡｍＧｍＣｍＡｍＡｍＣ−３’
分子ビーコンプローブ（「Ｉ」はユニバーサルイノシンヌクレオチドを表す）
５’−ＣａｌＲｅｄ_６１０−ＣＧＣＧＣＴＣＣＡＣＣＡＩＣＣＴＣＴＴＧＣＧＣＧ−ＢＨＱ２−３’

反応物を、ＩＱ５ ｔｈｅｒｍｏ ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上で、５６℃にておよそ１０分間、インキュベートした。蛍光シグナルをＲＯＸチャネル（励起：５７５ｎｍ；発光：６０２ｎｍ）で記録した。ダイズｇＤＮＡを含有する反応物（ｎ＝３）は、シグモイド型曲線を生じた（図１３）。対照的に、標的ＤＮＡを含有していない対照反応物（ｎ＝３）はシグナルを生成しなかった。指数関数的増幅が出現するまでの時間は約３分間であり、最大相対蛍光単位の出現までの時間は約６分間であった。反応の指数関数的増幅相のφ勾配は、６６０ＲＦＵ／分であると決定された。

［実施例２：プライマー標的結合の安定性を決定することによる、サルモネラ・エンテリカｉｎｖＡの等温ＤＮＡ増幅のための系の設計］
プライマーをさらに実験的に試験することによる補助無しで、本発明による設計原理だけを使用して、サルモネラ・エンテリカｉｎｖＡの検出のための容易に実用可能な等温ＤＮＡ増幅アッセイを創出した。

サルモネラ・エンテリカｉｎｖＡ遺伝子におけるアッセイ標的配列は、３０〜６０ｂｐ配列ウインドウ中の一塩基多型（ＳＮＰ）の欠如に基づいて選択した：

太字で示すのは、それぞれフォワードおよびリバースプライマーの設計のために選択された配列領域である。

フォワードプライマー（５’−ＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＴＴＴＡＣＣ−３’）の標的結合配列を選択するために、以下のようにして、標的に対するフォワードプライマー結合の安定性を、フォワードプライマー自己二量体化の安定性と比較した：

ｆｗｄプライマー・標的ハイブリッド（ＰＴＨ）のΔＧ_２５℃＝−２６．１１ｋｃａｌ／モル；
プライマー・標的結合領域自己二量体（ＰＴＢＲＨＤ）のΔＧ_２５℃＝−１．９５ｋｃａｌ／モル；
ΔΔＧ_２５℃＝ＤＧ_ＰＴＨ−ΔＧ_{ＰＴＢＲＨＤ}＝−２４．１６ｋｃａｌ／モル

低ΔΔＧ（≦約−１６ｋｃａｌ／モル）は、フォワードプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始することができることを示している。

リバースプライマー（５’−ＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＡＴＧＧ−３’）の標的結合配列を選択するために、以下のようにして、標的に対するリバースプライマー結合の安定性を、リバースプライマー自己二量体化の安定性と比較した：

ｒｅｖプライマー・標的ハイブリッド（ＰＴＨ）のΔＧ_２５℃＝−２５．２８ｋｃａｌ／モル；
プライマー・標的結合領域自己二量体（ＰＴＢＲＨＤ）のΔＧ_２５℃＝−１．５７ｋｃａｌ／モル；
ΔΔＧ_２５℃＝ΔＧ_ＰＴＨ−ΔＧ_{ＰＴＢＲＨＤ}＝−２３．７１ｋｃａｌ／モル。

低ΔΔＧ（≦約−１６ｋｃａｌ／モル）は、リバースプライマーが標的核酸分子の相補鎖にアニーリングすることができ、その合成を開始することができることを示している。

核酸増幅反応物（２６μｌ）は、０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．３８Ｕ／ｍｌ Ｂｓｔ２．０ＷａｒｍＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）０．１５単位、２５０ｎＭフォワードプライマー、２５０ｎＭリバースプライマー、５末端でＣａｌＲｅｄ（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）によっておよび３’末端でＢＨＱ２（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）によって標識された３００ｎＭ分子ビーコンプローブ、ならびにサルモネラゲノムＤＮＡ（１０，０００コピー）を含有した。プライマーおよびプローブの配列（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡによって合成された）は次のとおりである：
フォワードプライマー１（「ｍ」＝２’−メトキシヌクレオチド）
５’−ＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧｍＵｍＵｍＵｍＡｍＣｍＣ−３’
フォワードプライマー２（「ｍ」＝２’−メトキシヌクレオチド）
５’−ＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＴＧＴｍＵｍＵｍＡｍＣｍＣ−３’
リバースプライマー（「ｍ」＝２’−メトキシヌクレオチド）
５’−ＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＧｍＧｍＡｍＵｍＧｍＧ−３’
分子ビーコンプローブ（「Ｉ」はユニバーサルイノシンヌクレオチドを表す）
５’−ＣａｌＲｅｄ_６１０−ＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＧＧＣＡＴＡＣＡＡＡＣＡＧＧＴ−ＢＨＱ２−３’

反応物を、ＩＱ５ ｔｈｅｒｍｏ ｃｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）上で、５６℃にておよそ１０分間、インキュベートした。蛍光シグナルをＲＯＸチャネル（励起：５７５ｎｍ；発光：６０２ｎｍ）で記録した。ダイズｇＤＮＡを含有する反応物（ｎ＝３）は、シグモイド型曲線を生じた（図１５）。対照的に、標的ＤＮＡを含有していない対照反応物（ｎ＝３）はシグナルを生成しなかった。指数関数的増幅が出現するまでの時間は約３分間であり、最大相対蛍光単位の出現までの時間は約６分間であった。反応の指数関数的増幅相のφ勾配は、６６０ＲＦＵ／分であると決定された。

アッセイ最適化の結果を図１６Ａおよび１６Ｂに示す。

［実施例３：等温増幅アッセイのために設計された候補プライマー／プローブセットの性能と相関する相対的熱力学パラメーターとしてのΔΔＧの同定。インシリコで設計されたプライマー／プローブセットにおけるプライマーオリゴヌクレオチドの成功または不成功を予測する閾値の決定。］
５’−３’方向に、自己相補的第１領域（ニッキング酵素認識配列を有する５’尾部）と、標的配列相補的第２領域とを含む、３４個のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを、ハイブリッド二重鎖の融解温度（Ｔ_Ｍ）、％ＧＣ含有量、配列長、およびΔＧなどの、プライマー設計アルゴリズムにおいて一般的に使用される複数のパラメーターについて分析した。すべてのパラメーターを、第１および第２プライマー領域それぞれについて別々に決定した。２５個のプライマーのサブセットは、確認された機能的等温ＤＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイに属していた。９個のプライマーのサブセットは、アッセイスクリーニング実験においてプローブ検出可能な増幅産物を産生できなかった候補プライマー／プローブセットに属していた。

不良なアッセイプライマーのデータ点が機能的アッセイプライマーのデータ点から分かれてクラスター化するパラメーター組合せを同定する意図で、ＸおよびＹ軸それぞれについて設計パラメーターの異なる組合せを使用して、多数の２次元マトリクスプロット（図１７Ａ〜１７Ｈ）を作成した。図１７Ｂ〜１７Ｈでのプロットにより実証されているとおり、プライマー設計のために先行技術において使用された標準設計パラメーターの組合せ（Ｔ_Ｍ、ΔＧ、％ＧＣ、塩基の配列長）では、２次元プロットマトリクスにおいて、非機能性プライマーからの機能性プライマーの識別可能な分離を生じたものはなかった。機能性および非機能性オリゴヌクレオチドプライマー内の標準的パラメーター値の広い重複範囲のために予測されたとおり、両方のプライマー集団のデータ点は、これらのプロットにおいて広く重複していた。

驚くべきことに、本願の本発明者らによって定義されたΔΔＧの新規相対的熱力学パラメーターだけが、機能性および非機能性プライマーのデータ点がプライマーセットスクリーニング試験の実験的結果と相関して別々にクラスター化したマトリクスを産生した。図１７Ａのプロットは、それぞれ、Ｘ軸が、自己相補的第１プライマー領域のΔΔＧ値をプロットするためのスケールを提供し、Ｙ軸が、標的相補的第２プライマー領域のΔΔＧ値をプロットするためのスケールを提供するマトリクスを示している。不良なアッセイプライマーのすべては、第２領域／標的二重鎖（大部分の場合）または第１領域自己相補的二重鎖（１例において）のいずれかについて、−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌに満たないΔΔＧ値を有していた。したがって、約−１５ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔΔＧ値が、非機能性プライマーから機能性プライマーを分ける、このオリゴヌクレオチドプライマーデータセットについての実験的閾値となった。

ΔΔＧは、室温および大気圧で、動的平衡にある、複数の予測された代替的構造の形成の好ましさに対する、望まれるオリゴヌクレオチド構造（特異的プライマー／標的ハイブリッドおよび第１領域自己二量体）の形成の熱力学的好ましさの差異、すなわち相対的優位性を測定する、相対的パラメーターである。驚くべきことに、このΔＧ優位性（ΔΔＧ）は、候補プライマーオリゴヌクレオチドがインシリコで設計された場合に、アッセイ成功についての予測パラメーターであることがわかった。機能的等温アッセイについての順位付けスコアおよび予測因子としての、算出されたΔΔＧ値の使用は、ダイズレクチン遺伝子およびサルモネラ・エンテリカｉｎｖＡ遺伝子の検出のための等温ＤＮＡｂｌｅ（登録商標）アッセイの設計および試験を記載している次の例において実施化された。候補プライマーおよびプローブのスクリーニングが、算出されたΔΔＧ値を使用して純粋にインシリコで行われたのは、まったく初めてのことである。それぞれの場合において、単一のプライマー／プローブセットのみが選択され実験的に試験された。最初の試行において、時間および費用がかかる多数の候補プライマー／プローブセットのスクリーニングを行わずに２個の機能的アッセイが確立された。

［他の実施形態］
前述の記載から、種々の用途および条件に適合させるために本明細書に記載の発明に変更および改変がなされ得ることは明らかであろう。そのような実施形態も下記特許請求の範囲内である。

本明細書の可変部の定義における要素の列挙の記載は、列挙された要素のいずれか単一の要素または組合せ（もしくは部分的組合せ）としてその可変部の定義を含む。本明細書における実施形態の記載は、いずれか単一の実施形態またはいずれかの他の実施形態もしくはその部分との組合せとしての実施形態を含む。

本出願は、２０１２年４月９日出願の米国仮特許出願第６１／６２１，９７５号に基づく優先権および利益を主張する、２０１３年４月９日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３５７５０号に関連し得、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本出願は、２０１０年８月１３日出願の米国仮特許出願第６１／３７３，６９５号に基づく優先権および利益を主張する、２０１１年８月９日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４７０４９号に関連し得、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、それぞれ独立の特許および刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されている場合と同程度において、本明細書に参照により組み込まれる。

Claims (52)

1. 単離されたプライマーオリゴヌクレオチドであって、
   ５’から３’に、
   ｉ）自己相補的配列を含む第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第１領域と、
   ｉｉ）標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含み、前記第２領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第２領域を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、第２領域と
   を含む、
   単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
2. 前記第１領域中の前記パリンドローム配列が、２、４、または６ヌクレオチド長である、請求項１に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
3. 前記第１領域が、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドである、請求項１または２に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
4. 前記第２領域が、長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
5. 前記第１領域が完全に自己相補的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
6. ２つのプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第１領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体の形態にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
7. 前記ホモ二量体が、前記プライマーオリゴヌクレオチドを含む自己二量体のΔＧより少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、請求項６に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
8. 前記１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）、または塩基類似体を含むそれらのものからなる群から選択される２’修飾を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
9. ２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項８に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
10. 連続する２’修飾ヌクレオチドの数が４、５、または６である、請求項９に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
11. 前記ニッキング酵素がＮｔ．ＢｓｐＤ６ＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩのうちの１つまたは複数である、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
12. 前記第１領域内の前記ニッキング酵素認識配列が５’−ＧＡＧＴＣ−３’である、請求項１１に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
13. ニッキング剤の認識配列が、前記第１領域と第２領域との間のリン酸ジエステル結合を切断するように位置されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
14. 下記核酸配列：
    

    

    

    の１つを含む第１領域を有し、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と、Ｎ_６はＮ_６’と、Ｎ_７はＮ_７’と相補的である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたプライマーオリゴヌクレオチド。
15. ２つのオリゴヌクレオチド単量体を含む単離されたプライマー二量体であって、前記オリゴヌクレオチド単量体は、５’から３’に、
    ｉ）自己相補的配列を含む第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第１領域と、
    ｉｉ）標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含み、前記第２領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第２領域を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、第２領域と
    を含む、
    単離されたプライマー二量体。
16. 前記第１領域中の前記パリンドローム配列が、２、４、または６ヌクレオチド長である、請求項１５に記載の単離されたプライマー二量体。
17. 前記第１領域が、長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドである、請求項１５または１６に記載の単離されたプライマー二量体。
18. 前記第２領域が、長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
19. 前記第１領域が完全に自己相補的である、請求項１５〜１８にいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
20. ２つのオリゴヌクレオチド単量体の自己相補的第１領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体の形態にある、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
21. 前記ホモ二量体が、前記オリゴヌクレオチド単量体を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、請求項２０に記載の単離されたプライマー二量体。
22. 前記１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）、または塩基類似体を含むそれらのものからなる群から選択される２’修飾を有する、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
23. ２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項２２に記載の単離されたプライマー二量体。
24. 連続する２’修飾ヌクレオチドの数が４、５、または６である、請求項２３に記載の単離されたプライマー二量体。
25. 前記ニッキング酵素がＮｔ．ＢｓｐＤ６ＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩのうちの１つまたは複数である、請求項１５〜２４のいずれかに記載の単離されたプライマー二量体。
26. 前記第１領域内の前記ニッキング酵素認識配列が５’−ＧＡＧＴＣ−３’である、請求項２５に記載の単離されたプライマー二量体。
27. ニッキング剤の認識配列が、前記第１領域と第２領域との間のリン酸ジエステル結合を切断するように位置されている、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
28. 前記オリゴヌクレオチド単量体が、下記核酸配列：
    

    

    

    の１つを含む第１領域を有し、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と、Ｎ_６はＮ_６’と、Ｎ_７はＮ_７’と相補的である、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の単離されたプライマー二量体。
29. 標的核酸分子を検出するための単離されたオリゴヌクレオチドプローブであって、
    ｉ）オリゴヌクレオチド、
    ｉｉ）蛍光レポーター、および
    ｉｉｉ）前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子
    を含み、
    前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの相対する５’および３’末端に共有結合されており、
    前記オリゴヌクレオチドは、
    ａ）標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第１領域と、
    ｂ）前記第１領域の５’上流にある第２領域と、
    ｃ）前記第１領域の３’下流にあり前記第２領域と相補的な核酸配列を有する第３領域と
    を含み、
    前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第２領域および第３領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成することができ、
    標的配列と前記オリゴヌクレオチドプローブの第１領域との間のプライマー・標的二本鎖ハイブリッドのΔＧが、前記オリゴヌクレオチドプローブを含む自己二量体のΔＧより少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低い、
    オリゴヌクレオチドプローブ。
30. 前記第２および第３領域が、長さ４〜８ヌクレオチドである、請求項２９に記載の単離されたオリゴヌクレオチドプローブ。
31. ニッキングおよび伸長増幅反応において特異的産物を増幅する方法であって、
    （ａ）実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なポリヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも１つのプライマーは、５’から３’に、
    ｉ）自己相補的配列を含む第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第１領域と、
    ｉｉ）標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含み、前記第２領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第２領域を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、第２領域と
    を含む、工程、
    ならびに、
    （ｂ）前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含む増幅産物を生成する工程
    を含む、方法。
32. ニッキングおよび伸長増幅反応において特異的産物を検出する方法であって、
    （ａ）実質的に等温条件下で、標的核酸分子を、ポリメラーゼ、それぞれが前記標的核酸分子上の相補的配列に特異的に結合する２つ以上のプライマー、ニッキング酵素、および検出可能なオリゴヌクレオチドプローブに接触させ、ここで、少なくとも１つのプライマーは、５’から３’に、
    ｉ）自己相補的配列を含む第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第１領域と、
    ｉｉ）標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含み、前記第２領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、プライマーの前記第２領域を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、第２領域と
    を含む、工程、
    （ｂ）前記標的核酸分子の少なくとも一部分を含む増幅産物を生成する工程、ならびに
    （ｃ）前記標的核酸分子またはその増幅産物へのオリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションについて特異的なシグナルを検出し、前記シグナルが、試料中に存在する前記標的核酸分子またはその増幅産物の存在を示す工程
    を含む、方法。
33. 前記オリゴヌクレオチドプローブが、
    ｉ）オリゴヌクレオチド、
    ｉｉ）蛍光レポーター、および
    ｉｉｉ）前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子
    を含み、
    前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの相対する５’および３’末端に共有結合されており、
    前記オリゴヌクレオチドは、
    ａ）標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第１領域と、
    ｂ）前記第１領域の５’上流にある第２領域と、
    ｃ）前記第１領域の３’下流にあり前記第２領域と相補的な核酸配列を有する第３領域と
    を含み、
    前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第２領域および第３領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成することができる、
    請求項３２に記載の方法。
34. 前記ポリメラーゼが、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）もしくはバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼＩ、またはその活性断片および誘導体である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記ポリメラーゼが、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｇｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、またはＧｋａ ＤＮＡポリメラーゼＩのうちの１つまたは複数である、請求項３４に記載の方法。
36. 前記第１領域中の前記パリンドローム配列が２、４、または６ヌクレオチド長である、請求項３５に記載の方法。
37. 前記第１領域が長さ１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドである、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記第２領域が長さ１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドである、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記第１領域が完全に自己相補的である、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記少なくとも１つのプライマーは、２つのプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第１領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されたホモ二量体の形態にある、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記ホモ二量体は、前記プライマーオリゴヌクレオチドを含む自己二量体のΔＧより少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、請求項４０に記載の方法。
42. 前記１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−ヒドロキシル、２’−アルキル、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ_２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ_２）_２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、および２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）、または塩基類似体を含むそれらのものからなる群から選択される２’修飾を有する、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドが、前記第２領域の３’末端に位置している、請求項３１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. ２つ以上の２’修飾ヌクレオチドが連続している、請求項３１または４３に記載の方法。
45. 連続する２’修飾ヌクレオチドの数が４、５または６である、請求項４４に記載の方法。
46. 前記ニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｐＤ６ＩおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩのうちの１つまたは複数である、請求項３１〜４５のいずれかに記載の方法。
47. 前記第１領域中の前記ニッキング酵素認識配列が５’−ＧＡＧＴＣ−３’である、請求項４６に記載の方法。
48. ニッキング剤の認識配列が、前記第１領域と第２領域との間のリン酸ジエステル結合を切断するように位置されている、請求項３１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
49. 前記プライマーは、下記核酸配列：
    

    

    

    の１つを含む第１領域を有し、「Ｎ」は任意のヌクレオチド（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）またはグアニン（Ｇ）核酸塩基を有する）であり、Ｎ_１はＮ_１’と、Ｎ_２はＮ_２’と、Ｎ_３はＮ_３’と、Ｎ_４はＮ_４’と、Ｎ_５はＮ_５’と、Ｎ_６はＮ_６’と、Ｎ_７はＮ_７’と相補的である、請求項３１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
50. １つまたは複数のプライマーオリゴヌクレオチドと、請求項３１〜４９のいずれか一項に記載の方法における前記プライマーオリゴヌクレオチドの使用についての指示書とを含む、ニッキング増幅反応において標的配列を増幅するためのキットであって、
    前記プライマーオリゴヌクレオチドは、５’から３’に、
    ｉ）自己相補的配列を含む第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第１領域と、
    ｉｉ）標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含む少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域であって、前記第２領域は３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含み、前記第２領域が標的核酸上の相補的領域に特異的に結合して形成するプライマー・標的二本鎖ハイブリッドは、前記第２領域を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低いΔＧを有する、第２領域と
    を含む、
    キット。
51. ｉ）オリゴヌクレオチド；
    ｉｉ）蛍光レポーター；および
    ｉｉｉ）前記蛍光レポーターからの励起エネルギーを吸収することができる消光分子；
    を含むオリゴヌクレオチドプローブと、請求項３１〜４９のいずれか一項に記載の方法における前記プライマーオリゴヌクレオチドの使用についての指示書とをさらに含み、
    前記蛍光レポーターおよび消光分子は、前記オリゴヌクレオチドの相対する５’および３’末端に共有結合されており、
    前記オリゴヌクレオチドは、
    ａ）標的核酸配列と実質的に相補的である核酸配列を有する第１領域と、
    ｂ）前記第１領域の５’上流にある第２領域と、
    ｃ）前記第１領域の３’下流にあり前記第２領域と相補的な核酸配列を有する第３領域と
    を含み、
    前記オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に結合していない場合には、前記第２領域および第３領域のハイブリダイゼーションによってステムループヘアピン構造を形成することができる、
    請求項５０に記載のキット。
52. プライマーオリゴヌクレオチドを選択する方法を実施するためのコンピュータプログラム指令を含む、有形、非一過性コンピュータ可読媒体であって、
    前記プライマーオリゴヌクレオチドは、５’から３’に、
    ｉ）自己相補的配列を含む第１領域であって、５’から３’に、ニッキング酵素認識配列の逆相補鎖、パリンドローム配列、および前記ニッキング酵素認識配列を含む、第１領域と、
    ｉｉ）標的核酸分子上の領域に相補的な配列を含み３’末端において１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも１６ヌクレオチド長の第２領域と
    を含み、
    前記方法は、
    ａ）前記プライマーオリゴヌクレオチドの第２領域を選択する工程であって、前記第２領域と前記標的核酸分子とのハイブリダイゼーションによって形成されるプライマー・標的二本鎖ハイブリッドについてのΔＧが、プライマーオリゴヌクレオチドの前記第２領域を含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低い、工程、
    ｂ）前記プライマーオリゴヌクレオチドの第１領域を選択する工程であって、２つのプライマーオリゴヌクレオチド分子の自己相補的第１領域配列のハイブリダイゼーションによって形成されるホモ二量体についてのΔＧが、前記プライマーオリゴヌクレオチドを含む自己二量体のΔＧよりも少なくとも６２．７６ｋＪ／ｍｏｌ（１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）低い、工程
    を含む、
    コンピュータ可読媒体。

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