JP6595247B2 - 凝固時間の測定方法およびその装置、凝固時間測定用試薬ならびに試薬キット - Google Patents

Description

本発明は、凝固時間の測定方法およびその装置、凝固時間測定用試薬ならびに試薬キットに関する。

活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）は、抗凝固薬剤であるヘパリンの濃度のモニタリングに用いられている（特許文献１）。特許文献１には、銅塩または亜鉛塩を含むＡＰＴＴ測定用試薬によれば、ＡＰＴＴ測定の際にヘパリンの活性が低減することが記載されている。

特開平８−６８７９４号公報

しかしながら、ヘパリン含有検体を用いた場合であっても感度よく凝固時間を測定することが望まれている。

本発明の１つの側面は、（Ａ）血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とを混合して試料を得る工程、および
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた試料とカルシウム塩とを混合して測定試料を調製し、測定試料の凝固時間を測定する工程
を含む、凝固時間の測定方法を含む。

本発明の他の側面は、血液検体と、活性化剤と、リン脂質と、ニッケルイオン形成化合物と、カルシウム塩とを混合して測定試料を調製する試料調製部と、試料調製部で得られた測定試料から凝固反応に伴う変化を示す凝固情報を取得する検出部と、検出部によって取得された光学的情報に基づいて、測定試料の凝固時間を算出する算出部と、活性化剤と、リン脂質と、ニッケルイオン形成化合物と、カルシウム塩とを収容する試薬収容部とを備え、試料調製部が、試薬収容部から活性化剤、リン脂質およびニッケルイオン形成化合物を取得し、活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物と血液検体とを混合して試料を調製し、試薬収容部からカルシウム塩を取得し、カルシウム塩と試料とを混合して測定試料を得る、凝固時間の測定装置を含む。

本発明のさらに他の側面は、ニッケルイオン形成化合物を含有する、前述した凝固時間の測定方法に用いるための凝固時間測定用試薬を含む。

本発明の別の側面は、第１試薬容器に収容された活性化剤とリン脂質とを含む第１試薬と、第２試薬容器に収容されたニッケルイオン形成化合物を含む第２試薬と、第３試薬容器に収容されたカルシウム塩を含む第３試薬とを含む試薬キットを含む。

本発明によれば、ヘパリン含有検体を用いた場合であっても感度よく凝固時間を測定することができる、凝固時間の測定方法およびその装置、凝固時間測定用試薬ならびに試薬キットを提供することができる。

凝固時間の測定装置の構成図である。 測定装置による凝固時間の測定の処理手順を示すフローチャートである。 試料の調製工程の処理手順を示すフローチャートである。 試料の調製工程の処理手順を示すフローチャートである。 試料へのカルシウム塩の添加工程および光学的情報の取得工程の処理手順を示すフローチャートである。 試薬キットの構成図である。 実施例１の測定方法による凝固時間と、比較例１の測定方法による凝固時間とを対比した結果を示すグラフである。 実施例２および比較例２〜５において、ヘパリン濃度とＡＰＴＴ比との関係を調べた結果を示すグラフである。

１．凝固時間の測定方法
本実施形態に係る凝固時間の測定方法（以下、単に「測定方法」という）は、（Ａ）血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とを混合して試料を得る工程、および
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた試料とカルシウム塩とを混合して測定試料を調製し、測定試料の凝固時間を測定する工程
を含むことを特徴とする。本実施形態に係る測定方法は、工程（Ａ）において、試料を得る際に、血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とを混合する。したがって、本実施形態に係る測定方法によれば、ヘパリン含有検体を用いた場合であっても感度よく凝固時間を測定することができる。

なお、本明細書において、「試料」とは、血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物との混合物をいう。また、「測定試料」とは、血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とカルシウム塩との混合物をいう。

血液検体としては、例えば、血漿などが挙げられるが、特に限定されない。本明細書において、「正常血漿」とは、健常者の血液から得られた血漿をいう。正常血漿は、市販の正常血漿であってもよい。被検血漿としては、例えば、被検者から得られた血漿、被検者から得られ、かつヘパリンを含む血漿などが挙げられるが、特に限定されない。

活性化剤は、内因系凝固経路に関与する接触因子を活性化する作用を有する物質であればよい。接触因子としては、例えば、プレカリクレイン、高分子キニノゲン、第ＸＩＩ因子、第ＸＩ因子などが挙げられるが、特に限定されない。活性化剤としては、例えば、エラグ酸化合物、シリカ、カオリン、珪藻土（例えば、セライトコーポレーション製、商品名：セライト（登録商標）など）などが挙げられるが、特に限定されない。これらの活性化剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。エラグ酸化合物とは、エラグ酸、エラグ酸の塩およびエラグ酸の金属錯体を含む概念をいう。

リン脂質は、血液の凝固反応を促進する。リン脂質は、分子構造中にリン酸エステル部位を有する脂質である。リン脂質は、天然由来リン脂質であってもよく、合成リン脂質であってもよい。天然由来リン脂質としては、例えば、ウサギ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒトなどの動物、大豆などの植物に由来するリン脂質などが挙げられるが、特に限定されない。動物に由来するリン脂質としては、例えば、ウサギ脳、ウシ脳、卵黄、ヒト胎盤などに由来するリン脂質などが挙げられるが、特に限定されない。リン脂質としては、具体的には、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンなどのグリセロリン脂質などが挙げられるが、特に限定されない。これらのリン脂質のなかでは、血液の凝固反応が効率的に進むことから、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリンが好ましい。これらのリン脂質は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。リン脂質が有する脂肪酸側鎖としては、例えば、パルミトイル基、オレオイル基、ステアロイル基などが挙げられるが、特に限定されない。これらの脂肪酸側鎖は、血液の凝固反応を妨げない範囲で適宜選択することができる。

ニッケルイオン形成化合物は、血液検体中において、ニッケルイオンを形成する化合物であればよい。ニッケルイオン形成化合物は、２価カチオンを形成する化合物であることが好ましい。ニッケルイオン形成化合物としては、例えば、酢酸ニッケル、リン化ニッケル、硫化ニッケル、塩化ニッケル、硫酸ニッケルなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのニッケルイオン形成化合物のなかでは、酢酸ニッケルが好ましい。これらのニッケルイオン形成化合物は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。

カルシウム塩は、測定試料中でカルシウムイオンを形成する塩であればよい。カルシウム塩としては、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、酒石酸カルシウムなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのカルシウム塩は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。

工程（Ａ）では、血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とを混合して試料を得る。工程（Ａ）に先立ち、血液検体を、凝固反応を行なうのに適した温度に加温してもよい。血液検体の加温温度は、通常、好ましくは３０〜４５℃、より好ましくは３６〜３８℃である。

工程（Ａ）において、血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物との混合の順番は、特に限定されない。工程（Ａ）は、例えば、以下の態様にわけられる。
（態様１）
血液検体と活性化剤とリン脂質とを混合した後、ニッケルイオン形成化合物を添加する工程
（態様２）
血液検体とニッケルイオン形成化合物とを混合した後、活性化剤およびリン脂質を添加する工程
（態様３）
血液検体に活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とを同時に添加する工程

態様１では、工程（Ａ）は、例えば、以下の工程（Ａ１−１）および（Ａ１−２）を含む。
（Ａ１−１）血液検体と活性化剤とリン脂質とを混合する工程、および
（Ａ１−２）工程（Ａ１−１）で得られた混合物とニッケルイオン形成化合物とを混合する工程。

以下、態様１を例として挙げて説明するが、本実施形態に係る測定方法は、特に限定されない。工程（Ａ１−１）において、血液検体と活性化剤とリン脂質とを混合して混合物を得る。血液検体と活性化剤とリン脂質との混合の順は、特に限定されない。活性化剤およびリン脂質を同時に血液検体と混合してもよい。また、活性化剤およびリン脂質を異なるタイミングで血液検体と混合してもよい。この場合、血液検体への活性化剤の添加後にリン脂質を添加してもよく、血液検体への活性化剤の添加後に、リン脂質を添加してもよい。

工程（Ａ１−１）において、血液検体と混合される活性化剤の量は、測定試料における活性化剤の濃度が所定濃度となる量であればよい。測定試料における活性化剤の濃度は、活性化剤の種類に応じて適宜設定することができる。活性化剤がエラグ酸化合物である場合、測定試料における活性化剤の濃度は、通常、好ましくは３．５〜１５０μＭ、より好ましくは１０〜５０μＭである。活性化剤がシリカである場合、測定試料における活性化剤の濃度は、通常、好ましくは０．０４〜０．４ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０７〜０．２ｍｇ／ｍＬである。

工程（Ａ１−１）において、血液検体と混合されるリン脂質の量は、測定試料におけるリン脂質の濃度が所定濃度となる量であればよい。測定試料におけるリン脂質の濃度は、リン脂質の種類に応じて適宜設定することができる。リン脂質がホスファチジルエタノールアミンである場合、測定試料におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは１〜１５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜５０μｇ／ｍＬである。リン脂質がホスファチジルコリンである場合、測定試料におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜８０μｇ／ｍＬである。リン脂質がホスファチジルセリンである場合、測定試料におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは０．１〜５０μｇ／ｍＬ、より好ましくは１〜１０μｇ／ｍＬである。リン脂質が２種類以上のリン脂質の混合物である場合、測定試料における各リン脂質の濃度の合計は、通常、好ましくは５〜４００μｇ／ｍＬ、より好ましくは２０〜１００μｇ／ｍＬである。

血液検体と活性化剤および／またはリン脂質との混合の際の加温温度は、血液の凝固反応を行なうのに適した温度であればよい。加温温度は、通常、好ましくは３０〜４５℃、より好ましくは３６〜３８℃である。また、加温時間は、通常、好ましくは１０〜１５０秒間、より好ましくは３０〜９０秒間である。

工程（Ａ１−２）において、工程（Ａ１−１）で得られた混合物とニッケルイオン形成化合物とを混合して試料を得る。

工程（Ａ１−２）において、工程（Ａ１−１）で得られた混合物と混合されるニッケルイオン形成化合物の量は、測定試料におけるニッケルイオン形成化合物の終濃度が所定濃度となる量であればよい。測定試料におけるニッケルイオン形成化合物の終濃度は、好ましくは０．１μＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、好ましく１０ｍＭ未満、より好ましくは５ｍＭ以下である。

工程（Ａ１−１）で得られた混合物とニッケルイオン形成化合物との混合の際の加温温度は、血液の凝固反応を行なうのに適した温度であればよい。温度は、通常、好ましくは３０〜４５℃、より好ましくは３６〜３８℃である。また、加温時間は、通常、好ましくは３０〜４２０秒間、より好ましくは１００〜３５０秒間である。

凝固時間の測定時に凝固時間が長くなりすぎるのを効果的に抑制する観点から、工程（Ａ１−１）における血液検体と活性化剤とリン脂質との混合終了時から１５０秒間以内、好ましくは６０秒間以内に、工程（Ａ１−２）において、工程（Ａ１−１）で得られた混合物とニッケルイオン形成化合物とを混合することが好ましい。

工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で得られた試料とカルシウム塩とを混合して測定試料を調製し、測定試料の凝固時間を測定する。

試料と混合されるカルシウム塩の量は、測定試料におけるカルシウム塩の濃度が所定濃度となる量であればよい。測定試料におけるカルシウム塩の濃度は、好ましくは２〜２０ｍＭ、より好ましくは４〜１０ｍＭである。

工程（Ｂ）においては、試料にカルシウム塩を添加するのに先立ち、試料を、凝固反応を行なうのに適した温度に加温してもよい。試料の加温温度は、凝固反応の反応性の観点から、好ましくは３０℃以上、より好ましくは３６℃以上であり、タンパク質の安定性の観点から、好ましくは４５℃以下、より好ましくは３８℃以下である。この場合、加温時間は、凝固反応の反応性の観点から、好ましくは１分間以上、より好ましくは２分間以上であり、タンパク質の安定性の観点から、好ましくは６分間以下、より好ましくは５分間以下である。

測定試料の凝固時間は、凝固情報に基づいて調べることができる。凝固情報としては、例えば、測定試料に光を照射したときの透過光または散乱光の変化、測定試料の粘度の変化などが挙げられるが、特に限定されない。この場合、測定試料の凝固時間は、測定試料に光を照射し、測定試料を透過した透過光または測定試料からの散乱光の変化をモニターすること、測定試料の粘度の変化をモニターすることなどによって調べることができる。ここで、本明細書において、「凝固時間」とは、活性化部分トロンボプラスチン時間を意味する。凝固時間は、試料へのカルシウム塩の添加開始時から血漿が凝固するまでの時間である。

血漿の凝固は、例えば、光が照射された測定試料からの光の変化がなくなったこと、測定試料の粘度の変化がなくなったことなどを指標として判断することができる。

２．凝固時間の測定装置
［測定装置の全体構成］
前述した測定方法に用いられる凝固時間の測定装置（以下、単に「測定装置」という）の一例を、添付の図面に基づき説明する。図１に示されるように、測定装置１０は、測定ユニット２０と、処理装置３０とを含む。測定ユニット２０と処理装置３０とは、通信可能に接続されている。

［測定ユニットの構成］
図１に示されるように、測定ユニット２０は、試料調製部１００と、検出部２００と、試薬収容部３００と、血液検体が収容された検体収容部４００と、制御部５００とを含む。

試料調製部１００は、試薬収容部３００から試薬を取得するとともに、検体収容部４００から血液検体を取得する。また、試料調製部１００は、取得された試薬と血液検体とを所定の処理手順で混合することによって測定試料を調製する。試料調製部１００は、検体搬送部１１１と、第１試薬搬送部１１２と、第２試薬搬送部１１３と、第３試薬搬送部１１４と、第４試薬搬送部１１５と、キュベット搬送部１３１とを含む。検体搬送部１１１は、第１ノズル１０１を有している。検体搬送部１１１は、検体収容部４００に収容された血液検体を取得する。また、検体搬送部１１１は、取得された血液検体をキュベット９０内に吐出する。第１試薬搬送部１１２は、第２ノズル１０２を有している。第１試薬搬送部１１２は、第２ノズル１０２により、試薬収容部３００の第１容器３０１内に収容された試薬を取得する。また、第１試薬搬送部１１２は、取得された試薬をキュベット９０内に吐出する。第２試薬搬送部１１３は、第３ノズル１０３を有している。第２試薬搬送部１１３は、第３ノズル１０３により、試薬収容部３００の第２容器３０２内に収容された試薬を取得する。また、第２試薬搬送部１１３は、取得された試薬をキュベット９０内に吐出する。第３試薬搬送部１１４は、第４ノズル１０４により、試薬収容部３００の第３容器３０３内に収容された試薬を取得する。また、第３試薬搬送部１１４は、取得された試薬をキュベット９０内に吐出する。第４試薬搬送部１１５は、第５ノズル１０５により、試薬収容部３００の第４容器３０４内に収容された試薬を取得する。また、第４試薬搬送部１１５は、取得された試薬をキュベット９０内に吐出する。キュベット搬送部１３１は、調製された測定試料が収容されたキュベット９０を検出部２００へ搬送する。

検出部２００は、光照射部２０１と、受光部２０２と、第２キュベット載置部２０３とを含む。光照射部２０１は、測定試料に対する照射光の光源を有している。照射光の波長は、血液の凝固反応の進行に伴う変化をモニターするのに適した波長であればよい。受光部２０２は、測定試料からの光を受光する。また、測定試料からの光は、透過光であってもよく、散乱光であってもよい。受光部２０２は、受光した光の量に応じた電気信号を処理装置の算出部３１に出力する。第２キュベット載置部２０３は、光照射部２０１と受光部２０２との間に設けられている。第２キュベット載置部２０３には、試料調製部１００から搬送されたキュベット９０が載置される。

試薬収容部３００は、凝固時間の測定に用いられる試薬を収容する。本実施形態においては、試薬収容部３００は、活性化剤を収容する第１容器３０１と、リン脂質を収容する第２容器３０２と、ニッケルイオン形成化合物を収容する第３容器３０３と、カルシウム塩を収容する第４容器３０４とを含む。第１〜第４容器のそれぞれには、各容器に収容された試薬の種類を識別するための識別子が設けられている。識別子としては、例えば、バーコードなどが挙げられるが、特に限定されない。なお、本実施形態では、第１容器３０１と第２容器３０２とが別々の容器として試薬収容部３００に設けられている。しかし、活性化剤とリン脂質とは、同時に血液検体と混合してもよいことから、第１容器および第２容器の代わりに、共通の１つの容器に活性化剤およびリン脂質を収容されていてもよい。この場合、第１試薬搬送部１１２と第２試薬搬送部１１３とは、共通の搬送部である。

検体収容部４００は、血液検体を収容する。本実施形態においては、検体収容部４００は、複数の検体容器４０１を備えている。また、検体収容部４００は、所望の血液検体を収容した検体容器４０１を所定の検体吸引位置へ搬送する。複数の検体容器４０１それぞれには、各容器に収容された血液検体の種類を識別するための識別子が設けられている。識別子としては、例えば、バーコードなどが挙げられるが、特に限定されない。

制御部５００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）５０１と、記憶部５０２とを含む。制御部５００は、コンピュータによって構成されている。ＣＰＵ５０１は、記憶部５０２に記憶されたコンピュータプログラムを実行する。これにより、ＣＰＵ５０１は、試料調製部１００における試料調製の処理ならびに検出部２００における測定試料に関する光学的情報の取得の処理を行なう。コンピュータプログラムとしては、例えば、測定試料の調製のためのコンピュータプログラム、測定試料に関する光学的情報の取得のためのコンピュータプログラムなどが挙げられるが、特に限定されない。また、記憶部５０２は、試薬収容部３００に収容された試薬を識別するための試薬識別情報、測定試料を調製する際の処理手順に関する試料調製情報、および検体収容部４００に収容された血液検体を識別するための検体識別情報をさらに記憶している。試料識別情報としては、例えば、試薬の種類と収容容器の位置と識別子との関連付けの情報などが挙げられるが、特に限定されない。また、検体識別情報としては、例えば、血液検体の種類と収容容器の位置と識別子との関連付けの情報などが挙げられるが、特に限定されない。ＣＰＵ５０１は、記憶部５０２に記憶された試薬識別情報および試料調製情報を用い、測定試料の調製のためのコンピュータプログラムを実行する。これにより、ＣＰＵ５０１は、測定ユニット２０の試料調製部１０に測定試料の調製を行なわせる。

［処理装置の構成］
処理装置３０は、図１に示されるように、算出部３１と、表示部３２と、入力部３３とを含む。本実施形態において、処理装置３０は、コンピュータシステムによって構成されている。算出部３１は、ＣＰＵ６０１と、記憶部６０２とを含む。ＣＰＵ６０１は、記憶部６０２に記憶されたコンピュータプログラムを実行する。これにより、ＣＰＵ６０１は、凝固時間の算出の処理を行なう。表示部３２としては、例えば、スクリーンディスプレイなどが挙げられるが、特に限定されない。表示部３２は、例えば、算出された凝固時間の情報などを表示する。入力部３３としては、例えば、キーボード、マウスなどが挙げられるが、特に限定されない。

記憶部６０２は、ＣＰＵ６０１に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラムなどのコンピュータプログラムおよびコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。アプリケーションプログラムとしては、例えば、凝固時間の測定のためのコンピュータプログラムなどが挙げられるが、特に限定されない。ＣＰＵ６０１は、記憶部６０２に記憶された凝固時間の測定のためのコンピュータプログラムを実行する。これにより、ＣＰＵ６０１は、測定装置１０に、凝固時間の測定を行なわせる。

［測定装置の変形例］
検体搬送部１１１、第１試薬搬送部１１２、第２試薬搬送部１１３、第３試薬搬送部１１４および第４試薬搬送部１１５は、検体または試薬を流すための流路であってもよい。流路としては、チューブなどが挙げられるが、特に限定されない。

また、凝固時間は、血液の凝固による粘度の増加その他の凝固情報に基づいて測定されてもよい。凝固時間を血液の凝固による粘度の増加に基づいて測定する場合、検出部２００は、高周波発信コイルと、高周波受信コイルと、高周波発信コイルと高周波受信コイルとの間にある、スチールボールを収容したキュベットを載置するキュベット載置部と、キュベット載置部の両端に設けられた電磁石とを備える。キュベット内のスチールボールは、電磁石が発生する磁力によって左右に振幅運動する。この振幅運動は、粘度が増加するほど減少する。測定試料の凝固が始まると、測定試料の粘度が増加するため、スチールボールの振幅が減少する。したがって、検出部２００は、高周波発信コイルが発信する高周波を高周波受信コイルが受信することによって、振幅の変化を検知する。また、処理装置３０の算出部３１は、検知された振幅の変化に基づき、凝固時間を算出する。

［凝固時間の測定装置の処理手順］
つぎに、図２に基づき、測定装置１０による凝固時間の測定の処理手順の概要を説明する。以下の処理手順においては、測定ユニット２０の制御部５００は、記憶部５０２から取得した試薬識別情報および試料調製情報を用い、記憶部５０２に記憶された測定試料の調製のためのコンピュータプログラムを実行する。また、制御部５００は、記憶部５０２に記憶された測定試料に関する光学的情報の取得のためのコンピュータプログラムを実行する。処理装置３０の算出部３１は、取得された光学的情報を用い、記憶部６０２に記憶された凝固時間の測定のためのコンピュータプログラムを実行する。

まず、ステップＳ１において、測定ユニット２０の制御部５００は、試料調製部１００に試料の調製を実行させる。ステップＳ１の試料の調製は、後述する図３および図４に示される処理手順にしたがって実行される。

その後、ステップＳ２において、制御部５００は、試料調製部１００に、試料へのカルシウム塩の添加を実行させる。また、ステップＳ３において、制御部５００は、検出部２００に、測定試料に関する光学的情報の取得を実行させる。ステップＳ２の試料へのカルシウム塩の添加と、ステップＳ３の光学的情報の取得とは、図５に示される処理手順に従って実行される。

その後、ステップＳ４において、処理装置３０の算出部３１は、凝固時間の算出のためのコンピュータプログラムを実行することにより、凝固時間を算出する。

［試料の調製の処理手順］
つぎに、図３および図４に基づき、測定装置１０による試料の調製の処理手順の概要を説明する。

まず、ステップＳ１０１において、制御部５００は、試料調製部１００に、図１における試料調製位置６２へのキュベット９０の配置を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、キュベット９０を図１における第１キュベット載置部６１に位置するように載置させる。これにより、試料調製位置６２へのキュベット９０の配置が行われる。

つぎに、ステップＳ１０２において、制御部５００は、検体収容部４００に、図１における検体吸引位置８１への検体容器４０１の搬送を実行させる。このとき、制御部５００は、記憶部５０２に記憶された検体識別情報に基づき、検体収容部４００に、所望の血液検体が収容された検体容器４０１を選択させる。そして、制御部は、検体収容部４００に、選択された検体容器４０１を検体吸引位置８１に位置するように搬送させる。

つぎに、ステップＳ１０３において、制御部５００は、試料調製部１００に、検体吸引位置８１への第１ノズル１０１の移動を実行させる。その後、ステップＳ１０４において、制御部５００は、試料調製部１００に、検体容器４０１からの血液検体の吸引を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、第１ノズル１０１を介して検体容器４０１に収容された血液検体を吸引させる。

つぎに、ステップＳ１０５において、制御部５００は、試料調製部１００に、試料調製位置６２への第１ノズル１０１の移動を実行させる。その後、ステップＳ１０６において、制御部５００は、試料調製部１００に、キュベット９０への血液検体の吐出を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、第１ノズル１０１で吸引された血液検体をキュベット９０に吐出させる。

つぎに、ステップＳ１０７において、制御部５００は、試料調製部１００に、活性化剤吸引位置７１への第２ノズル１０２の移動を実行させる。その後、ステップＳ１０８において、制御部５００は、試料調製部１００に、第１容器３０１からの活性化剤の吸引を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、第２ノズル１０２を介して第１容器３０１に収容された活性化剤を吸引させる。

つぎに、ステップＳ１０９において、制御部５００は、試料調製部１００に、試料調製位置６２への第２ノズル１０２の移動を実行させる。その後、ステップＳ１１０において、制御部５００は、試料調製部１００に、キュベット９０への活性化剤の吐出を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、第２ノズル１０２で吸引された活性化剤をキュベット９０に吐出させる。

つぎに、図４のステップＳ１１１からステップＳ１１４までの各ステップにおいて、制御部５００は、試料調製部１００に、リン脂質吸引位置７２への第３ノズル１０３の移動、第２容器３０２からのリン脂質の吸引、試料調製位置６２への第３ノズル１０３の移動およびキュベット９０へのリン脂質の吐出を実行させる。ステップＳ１１１からステップＳ１１４までの各ステップは、第３ノズル１０３によってリン脂質の吸引および吐出の一連の処理を行なうことを除き、図３のステップＳ１０７からステップＳ１１０までの各ステップと同様である。

つぎに、ステップＳ１１５からステップＳ１１８の各ステップにおいて、制御部５００は、試料調製部１００に、ニッケルイオン形成化合物吸引位置７３への第４ノズル１０４の移動、第３容器３０３からのニッケルイオン形成化合物の吸引、試料調製位置６２への第４ノズル１０４の移動およびキュベット９０へのニッケルイオン形成化合物の吐出を実行させる。ステップＳ１１５からステップＳ１１８の各ステップは、第４ノズル１０４によってニッケルイオン形成化合物の吸引および吐出の一連の動作を行なうことを除き、図３のステップＳ１０７からステップＳ１１０と同様である。これにより、試料が得られる。

なお、本実施形態においては、血液検体への活性化剤およびリン脂質の添加を、活性化剤の添加およびリン脂質の添加の順で行なっている。しかし、活性化剤およびリン脂質の添加は、同時に行なってもよい。

［試料へのカルシウム塩の添加および光学的情報の取得の処理手順］
つぎに、図５に基づき、測定装置１０による試料へのカルシウム塩の添加および光学的情報の取得の処理手順の概要を説明する。

図５のステップＳ２０１からステップＳ２０４までの各ステップにおいて、制御部５００は、試料調製部１００に、カルシウム塩吸引位置７４への第５ノズル１０５の移動、第２容器３０２からのカルシウム塩の吸引、試料調製位置６２への第５ノズル１０５の移動およびキュベット９０へのカルシウム塩の吐出を実行させる。これにより、測定試料が得られる。ステップＳ２０１からステップＳ２０４までの各ステップは、第５ノズル１０５によってカルシウム塩の吸引および吐出の一連の処理を行なうことを除き、図３のステップＳ１０７からステップＳ１１０までの各ステップと同様である。

ステップＳ２０４と同時に、ステップＳ３０１において、制御部５００は、試料調製部１００に、キュベット搬送部１３１を介してキュベット９０を検出部２００の第２キュベット載置部２０３へ搬送させる。また、ステップＳ３０１においては、制御部５００は、検出部２００に、測定試料への光照射を実行させる。具体的には、制御部５００は、検出部２００の光照射部２０１に、第２キュベット載置部２０３に載置されたキュベット９０に対し、光を照射する。これにより、キュベット９０内の測定試料に光が照射される。

つぎに、ステップ３０２において、制御部５００は、検出部２００に、測定試料からの光の測定を実行させる。具体的には、制御部５００は、検出部２００の受光部２０２に、受光された透過光の量に応じた電気信号を処理装置の算出部３１に出力させる。

その後、図２のステップＳ４における凝固時間の算出に処理が進行する。

［処理手順の変形例］
ステップＳ１０７からステップＳ１１０までの一連のステップと、ステップＳ１１１からステップＳ１１４までの一連のステップは、並行して行なってもよい。また、ステップＳ１１５からステップＳ１１８までの一連のステップは、ステップＳ１０７からステップＳ１１０までの一連のステップおよびステップＳ１１１からステップＳ１１４までの一連のステップの両者よりも先に行なってもよい。

また、血液の凝固による粘度の増加に基づいて凝固時間を測定する場合、検出部２００として、高周波発信コイルと、高周波受信コイルと、スチールボールを収容したキュベットを載置するキュベット載置部と、電磁石とを備える検出部を用いることができる。ここでは、制御部５００は、検出部２００の高周波発信コイルが発信する高周波を高周波受信コイルによって受信させることによって振幅の変化を検知させる。つぎに、制御部５００は、検出部２００に、振幅の変化に関する情報を処理装置３０に出力させる。その後、処理装置３０の算出部３１は、取得された振幅の変化に関する情報を用い、記憶部６０２に記憶された凝固時間の測定のためのコンピュータプログラムを実行することにより、凝固時間を算出する。

３．凝固時間測定用試薬
本実施形態に係る凝固時間測定用試薬は、ニッケルイオン形成化合物を含有する、前述の凝固時間の測定方法に用いるための凝固時間測定用試薬である。ニッケルイオン形成化合物は、前述の測定方法におけるニッケルイオン形成化合物と同様である。

本実施形態に係る凝固時間測定用試薬は、実質的にニッケルイオン形成化合物からなる試薬であってもよく、ニッケルイオン形成化合物と適切な溶媒、助剤などとをさらに含有する試薬であってもよい。なお、本実施形態に係る凝固時間測定用試薬は、実質的にリン脂質と活性化剤とを含有していない。

凝固時間測定用試薬は、固体の状態で提供することができる。この場合、凝固時間測定用試薬の剤型としては、例えば、粒剤、粉剤などが挙げられるが、特に限定されない。

凝固時間測定用試薬は、ニッケルイオン形成化合物を適切な溶媒に溶解させた状態であってもよい。この場合、溶媒としては、例えば、脱塩精製水、生理食塩水などが挙げられるが、特に限定されない。

凝固時間測定用試薬が、ニッケルイオン形成化合物を適切な溶媒に溶解させた状態の試薬である場合、凝固時間測定用試薬におけるニッケルイオン形成化合物の含有量は、好ましくは１μＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ以下である。

凝固時間測定用試薬がさらに助剤を含有する場合、助剤としては、例えば、ニッケルイオン形成化合物の安定化剤、保存剤などが挙げられるが、特に限定されない。

４．試薬キット
本実施形態に係る試薬キットは、第１試薬容器に収容された活性化剤とリン脂質とを含む第１試薬と、第２試薬容器に収容されたニッケルイオン形成化合物を含む第２試薬と、第３試薬容器に収容されたカルシウム塩を含む第３試薬とを含む試薬キットである。本実施形態に係る試薬キットの一例としては、図６に示される試薬キット８００などが挙げられるが、特に限定されない。図６に示される試薬キット８００は、第１試薬容器８０１と、第２試薬容器８０２と、第３試薬容器８０３とを含む。第１試薬容器８０１は、活性化剤とリン脂質とを含む第１試薬を収容する。第２試薬容器８０２は、ニッケルイオン形成化合物を含む第２試薬を収容する。第３試薬容器８０３は、カルシウム塩を含む第３試薬を収容する。試薬キットは、添付文書をさらに含んでもよい。添付文書は、本実施形態に係る試薬キットを用いて上述した凝固時間の測定方法を行なう操作手順などの記載を含んでもよい。

第１試薬における活性化剤の濃度は、測定試料における濃度を上述した測定方法における濃度の範囲に調整できる範囲であればよい。活性化剤がエラグ酸化合物である場合、第１試薬における活性化剤の濃度は、通常、好ましくは１０〜４００μＭ、より好ましくは５０〜１５０μＭである。活性化剤がシリカである場合、第１試薬における活性化剤の濃度は、通常、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．２〜０．６ｍｇ／ｍＬである。

第１試薬におけるリン脂質の濃度は、測定試料における濃度を上述した測定方法における濃度の範囲に調整できる範囲であればよい。第１試薬におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは３０〜４００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１００μｇ／ｍＬである。リン脂質がホスファチジルエタノールアミンである場合、第１試薬におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは１０〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは２０〜５０μｇ／ｍＬである。リン脂質がホスファチジルコリンである場合、測定試料におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは１０〜３００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１０〜１００μｇ／ｍＬである。リン脂質がホスファチジルセリンである場合、測定試料におけるリン脂質の濃度は、通常、好ましくは１〜７５μｇ／ｍＬ、より好ましくは２〜１５μｇ／ｍＬである。

第２試薬は、固体の状態のニッケルイオン形成化合物であってもよく、ニッケルイオン形成化合物を適切な溶媒に溶解させた状態であってもよい。溶媒は、上述した凝固時間測定用試薬における溶媒と同様である。

第２試薬が、ニッケルイオン形成化合物を適切な溶媒に溶解させた状態の試薬である場合、第２試薬におけるニッケルイオン形成化合物の濃度は、第１試薬におけるリン脂質の濃度は、測定試料における濃度を上述した測定方法における濃度の範囲に調整できる範囲であればよい。この場合、第２試薬におけるニッケルイオン形成化合物の濃度は、好ましくは１μＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ以下である。

第３試薬におけるカルシウム塩の濃度は、測定試料における濃度を上述した測定方法における濃度の範囲に調整できる範囲であればよい。第３試薬におけるカルシウム塩の濃度は、好ましくは２．５〜４０ｍＭ、より好ましくは１０〜３０ｍＭである。

本実施形態に係る試薬キットでは、第２試薬は、実質的にリン脂質と活性化剤とを含有していない。また、本実施形態に係る試薬キットでは、第１試薬は、実質的にニッケルイオン形成化合物を含有していない。

試薬キットに用いられる活性化剤、リン脂質、ニッケルイオン形成化合物およびカルシウム塩は、前述の測定方法に用いられるものと同様である。また、各試薬容器には、適宜、適切な溶媒、助剤などが収容されていてもよい。溶媒および助剤は、凝固時間測定用試薬に用いられる溶媒および試薬と同様である。なお、本実施形態に係る試薬キットでは、活性化剤およびリン脂質が、別々の容器に収容されていてもよい。

以下において、凝固時間の測定は、全自動凝固時間測定装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＣＳ−２０００ｉ〕によって行なった。

（実施例１）
本実施例において、血液検体として、正常血漿または被検血漿を用いた。正常血漿として、表１に示される正常血漿を用いた。また、被検血漿として、表１に示されるヘパリン添加血漿を用いた。

血液検体５０μＬを３７℃で６０秒間加熱した。加熱後の血液検体にＡＰＴＴ試薬〔ロシュ・ダイアゴノスティックス社製、商品名：ＰＴＴ−ＬＡ（登録商標）〕５０μＬを添加し、混合した。得られた混合物を３７℃で２０秒間加熱した。加熱後の混合物に２．５ｍＭ塩化酢酸ニッケル水溶液２０μＬを添加し、混合した。得られた混合物を３７℃で１７０秒間加熱した。加熱後の混合物に凝固反応促進剤である２５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を添加するとともに凝固時間を測定した。実施例１の測定方法による凝固時間を図７に示す。

（比較例１）
本比較例において、血液検体として、実施例１と同様の血液検体を用いた。血液検体５０μＬを３７℃で６０秒間加熱した。加熱後の血液検体にＡＰＴＴ試薬〔ロシュ・ダイアゴノスティックス社製、商品名：ＰＴＴ−ＬＡ（登録商標）〕５０μＬを添加し、混合した。得られた混合物を３７℃で１７０秒間加熱した。加熱後の混合物に２５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を添加するとともに凝固時間を測定した。比較例１の測定方法による凝固時間を図７に示す。

（結果）
図７に示された結果から、実施例１の測定方法による凝固時間は、比較例１の測定方法による凝固時間と比べて、長いことがわかった。したがって、実施例１の測定方法によれば、ヘパリン含有検体血漿を用いた場合であっても、比較例１の測定方法と比べ、感度よく凝固時間を測定することができることがわかった。

（実施例２および比較例２〜５）
血液検体として表１に示される正常血漿、表１に示される被検血漿のうちのＨＥ２、ＨＥ４、ＨＥ６、ＨＥ８およびＨＥ１０を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、凝固時間を測定した（実施例２）。実施例２の測定方法によって得られた凝固時間を用い、式（Ｉ）：
［ＡＰＴＴ比］＝［被検血漿の凝固時間／正常血漿の凝固時間］ （Ｉ）
にしたがって、ＡＰＴＴ比を求めた。

２．５ｍＭ酢酸ニッケル水溶液を用いる代わりに、２．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液（比較例２）、２．５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（比較例３）、２．５ｍＭ硫酸銅水溶液（比較例４）および２．５ｍＭ塩化亜鉛水溶液（比較例５）を用いたことならびに血液検体として表１に示される正常血漿、表１に示される被検血漿のうちのＨＥ２、ＨＥ４、ＨＥ６、ＨＥ８およびＨＥ１０を用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、凝固時間を測定した。なお、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸銅および塩化亜鉛は、２価ニッケルイオン以外の２価イオン（２価カチオン）を形成する化合物である。

比較例１〜５それぞれの測定方法によって得られた凝固時間を用い、式（Ｉ）にしたがって、ＡＰＴＴ比を求めた。ヘパリン濃度とＡＰＴＴ比との関係を調べた結果を図８に示す。図中、白丸は実施例２の測定方法（ニッケルイオン形成化合物あり）によるＡＰＴＴ比、黒四角は比較例１の測定方法（２価カチオンを形成する化合物なし）によるＡＰＴＴ比、白三角は比較例２の測定方法（カルシウムイオンを形成する化合物あり）によるＡＰＴＴ比、黒三角は比較例３の測定方法（マグネシウムイオンを形成する化合物あり）によるＡＰＴＴ比、白四角は比較例４の測定方法（銅イオンを形成する化合物あり）によるＡＰＴＴ比、黒丸は比較例５の測定方法（亜鉛イオンを形成する化合物あり）によるＡＰＴＴ比を示す。

図８に示された結果から、実施例２の測定方法によるＡＰＴＴ比は、比較例１〜５の測定方法によるＡＰＴＴ比よりも大きいことがわかった。したがって、実施例２のように、ニッケルイオン形成化合物を用いることにより、他の二価イオンを形成する化合物を用いた場合（比較例２〜５）や従来の方法（比較例１）と比べ、ヘパリン含有検体に対する感度が向上していることがわかった。一方、比較例２〜５の測定方法のように、他の二価イオンを形成する化合物を用いた場合、ＡＰＴＴ比は、比較例１の測定方法によるＡＰＴＴ比と同程度以下であることがわかった。

これらの結果から、ＡＰＴＴ試薬を用いる凝固時間の測定において、凝固反応促進剤の添加前に、２価カチオンのなかでもニッケルイオンを形成する化合物を血液検体に添加することにより、感度よく凝固時間を測定することができることがわかった。

１０ 測定装置
２０ 測定ユニット
３０ 処理装置
３１ 算出部
３２ 表示部
３３ 入力部
６１ 第１キュベット載置部
６２ 試料調製位置
７１ 活性化剤吸引位置
７２ リン脂質吸引位置
７３ ニッケルイオン形成化合物吸引位置
７４ カルシウム塩吸引位置
８１ 検体吸引位置
９０ キュベット
１００ 試料調製部
１０１ 第１ノズル
１０２ 第２ノズル
１０３ 第３ノズル
１０４ 第４ノズル
１０５ 第５ノズル
１１１ 検体搬送部
１１２ 第１試薬搬送部
１１３ 第２試薬搬送部
１１４ 第３試薬搬送部
１１５ 第４試薬搬送部
１３１ キュベット搬送部
２００ 検出部
２０１ 光照射部
２０２ 受光部
２０３ 第２キュベット載置部
３００ 試薬収容部
３０１ 第１容器
３０２ 第２容器
３０３ 第３容器
３０４ 第４容器
４００ 検体収容部
４０１ 検体容器
５００ 制御部
５０１ ＣＰＵ
５０２ 記憶部
６０１ ＣＰＵ
６０２ 記憶部
８００ 試薬キット
８０１ 第１試薬容器
８０２ 第２試薬容器
８０３ 第３試薬容器

Claims (8)

1. （Ａ）血液検体と活性化剤とリン脂質とニッケルイオン形成化合物とを混合して試料を得る工程、および
   （Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料とカルシウム塩とを混合して測定試料を調製し、測定試料の凝固時間を測定する工程
   を含み、
   前記工程（Ａ）は、
   （Ａ１−１）血液検体と活性化剤とリン脂質とを混合する工程、および
   （Ａ１−２）前記工程（Ａ１−１）で得られた混合物とニッケルイオン形成化合物とを混合する工程
   を含む、凝固時間の測定方法。
2. 前記工程（Ａ）で得られた混合物における前記ニッケルイオン形成化合物の終濃度が、０．１μＭ以上１０ｍＭ未満である、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（Ｂ）において、前記工程（Ａ）で得られた混合物を所定条件に加熱した後、前記混合物にカルシウム塩を混合する、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記所定条件が、３５℃以上４０℃以下の温度で２分間以上５分間以下インキュベーションする条件である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ニッケルイオン形成化合物が、酢酸ニッケル、リン化ニッケル、硫化ニッケル、塩化ニッケル、硫酸ニッケルおよび安息香酸ニッケルからなる群より選ばれた化合物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ニッケルイオン形成化合物を含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の凝固時間の測定方法に用いるための凝固時間測定用試薬。
7. 前記ニッケルイオン形成化合物が、酢酸ニッケル、リン化ニッケル、硫化ニッケル、塩化ニッケル、硫酸ニッケルおよび安息香酸ニッケルからなる群より選ばれた化合物である、請求項６に記載の凝固時間測定用試薬。
8. 第１試薬容器に収容された活性化剤とリン脂質とを含む第１試薬と、
   第２試薬容器に収容されたニッケルイオン形成化合物を含む第２試薬と、
   第３試薬容器に収容されたカルシウム塩を含む第３試薬と
   を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の凝固時間の測定方法用の試薬キット。