JP6592751B2 - Ｈｉｖ／ａｉｄｓ補助療法としてのビスホスホネートの使用 - Google Patents

Description

［発明の分野］
本発明は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療または管理用に設計された組成物の使用に関する。本発明の方法は、単球および／またはマクロファージの作用を阻害するため、および／または炎症を抑えるため、および／またはＨＩＶリザーバー（reservoirs）を減らすために有効量のビスホスホネートを含む製剤を投与することを含む。この組成物の使用により高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）のような抗ウイルス療法を補完できるだろう。

［発明の背景］
ヒト免疫不全ウイルス感染症／後天性免疫不全症候群（human immunodeficiency virus infection: HIV / acquired immunodeficiency syndrome: AIDS）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染により引き起こされるヒトの免疫系の疾患である。１９８０年代初頭に発見されてから、ＡＩＤＳは、世界的に流行し、死者は２５００万人以上に達した。世界中で約３５００万人が現在ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者として生活しており、この疾患の有効かつ費用的にも無理のない長期にわたる治療と管理が喫緊の課題となっている。

ＨＩＶは、ＣＤ４^＋Ｔ細胞および単球／マクロファージを主要な標的として、多種多様な免疫細胞に感染可能である。ＨＩＶは、まず、ウイルスエンベロープを細胞膜と融合させ、ＨＩＶカプシドを細胞内に放出することによって、標的細胞を攻撃する。感染細胞内部では、ＨＩＶの一本鎖ＲＮＡゲノムが二本鎖ウイルスＤＮＡに逆転写され、ウイルスＤＮＡが感染細胞のゲノムに組み込まれる。すると、感染細胞の細胞機構が乗っ取られてＲＮＡゲノムを生成するとともにウイルスのタンパク質成分を生成し、これらが組み立てられて感染細胞内で未成熟ＨＩＶビリオンになる。細胞表面で最終的に組み立てられた後、この未成熟ＨＩＶビリオンは、感染細胞の細胞膜から発芽し、プロテアーゼ切断という最終段階を経て、生成した成熟ビリオンが放出され、自己複製サイクルが完了する。ＨＩＶは、感染後最初の２〜４週間で急速に自己複製し、その結果、循環しているＣＤ４^＋Ｔ細胞の数が著しく減少する。まだ大部分が無傷の免疫機構がＨＩＶの自己複製に抵抗するために動員されると、ウイルスレベルが規制されて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の個数は安定し、ＨＩＶ感染は臨床的潜伏期に入るが、この潜伏期は、約３年から２０年超継続する可能性がある。ＨＩＶは免疫機構を徐々に破壊するので、結果的に、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のレベルが低下して警戒レベルに達し、ＨＩＶ感染が進行してＡＩＤＳを発症する。ＡＩＤＳ患者は、しばしば、自身の免疫機構崩壊の結果、日和見感染症で死に至る。また、ＨＩＶは、神経系統を損傷することもあり、感染初期に、感染免疫細胞を通じて脳に入り、さらに小膠細胞や星状膠細胞のような中枢神経系（ＣＮＳ）常在免疫細胞にまで蔓延する。このような感染によって、脳や脊髄を損傷し、錯乱および健忘症、行動変化、頭痛、進行性衰弱、腕部や脚部の感覚喪失といった諸症状を生じることがある。

ＡＩＶ／ＡＩＤＳ治療の主流となっているのは、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）であり、これは、多種類の抗ウイルス薬を含む化合物の組み合わせ（いわば「カクテル」）を使用するものである。個々の感染者におけるウイルス産生は、ほとんどが、遊離ウイルスとウイルス産生細胞とをともに高速でターンオーバーさせつつ活性化ＣＤ４^＋Ｔ細胞の新たな感染と自己複製を連続的に繰り返すことを含む動態過程の結果である。こういった抗ウイルスカクテルは、侵入・逆転写・組み込み・組み立て・放出を含むＨＩＶの自己複製サイクルのステップを抑制する。その結果、ＨＡＡＲＴは、ＨＩＶ自己複製サイクルを中断させ、未成熟ＨＩＶビリオンおよび宿主細胞を枯渇（deplete）させ、ＨＩＶ感染の封じ込めが実現する。

しかし、ＨＩＶ感染は、休止メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞および単球／マクロファージを含む他のＨＩＶ感染細胞がその半減期が長いことでウイルスリザーバーとして機能してしまうため、現在の抗ウイルス療法によっては根絶されない。また、ＨＡＡＲＴには、コストが高く、有毒副作用や、薬物相互作用や、薬物抵抗性があるといった難点もある。これらの弊害は、ときには、計画的治療中断（「ＴＩ（therapy interruptions）」、すなわち、休薬期間）の導入や治療の全面的な中止を余儀なくさせることもある。薬物抵抗性は、ＨＡＡＲＴにおいては、深刻な問題である。ＨＩＶ・ＲＮＡの逆転写には誤り（mistakes）が起こりやすく、結果としてウイルスゲノムに突然変異を引き起こすことになる。継続的な抗ウイルス薬の投与は、薬物抵抗性突然変異種が自然選択されることにつながる。ＴＩによって、適応性の低い（less “fit”）薬物抵抗性突然変異種より、適応性の高い（more “fit”）野生型薬物感受性ウイルスの方が増殖しやすくなるかもしれないとする理論がある。このことからも、計画的に抗ウイルス療法を中断することがしばしば推奨されている。しかし、ＴＩ期間中には一般に血漿ウイルス量（viral load: ＶＬ）のリバウンドとＣＤ４^＋Ｔ細胞の個数減少が起こり、それによりＨＡＡＲＴ療法の効果が打ち消されてしまう。ＨＩＶリザーバー内に隔離されたビリオン（特に、薬物抵抗性ビリオン）は、もはやＴＩ期間中に抑制されることはないので、成熟し、放出されるかもしれない。このことが、ＴＩ期間中の治療の後退と、ＨＡＡＲＴがその後再導入されたときに提供される抑制効果がしばしば低下することの原因であると考えられている。

感染した休止メモリーＣＤ４^＋Ｔ細胞と単球とマクロファージとが、薬物抵抗種を含むＨＩＶのリザーバーである。また、単球はサイトカイン（たとえばＴＮＦα）を産出し、これが他の感染細胞（たとえばＣＤ４^＋Ｔ細胞）におけるＨＩＶの自己複製を誘発する。感染した活性マクロファージは、未感染Ｔ細胞のアポトーシスを起こし、ＨＩＶ感染したＴ細胞をアポトーシスから守る。したがって、単球およびマクロファージがＴＩ期間中に自己複製できるウイルスのプールを提供し、それらの生理学的作用が免疫機構へのＨＩＶ感染ダメージをさらに増幅する。ＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療として単球およびマクロファージを標的とする研究がいくつかあるが、それらの方法による治療効果は限定的である。

選択的アフェレーシスによる循環単球の除去の効果を試験する臨床研究は種々の結果をもたらした。選択的アフェレーシスでは、ＨＩＶ感染しＨＡＡＲＴ治療中の患者の血液を、体外の装置に通して、循環している単球と顆粒球を除去する。ある研究では、ＨＡＡＲＴ治療中のアフェレーシスが、対照標準と比べて、血漿ＨＩＶ−１ ＲＮＡ量に影響することはなかったが、３〜４セッションのアフェレーシス後にはＴＮＦαレベルの減少とＣＤ４^＋Ｔ細胞個数の増加があった。（Beretta, A. et al., J. Biol. Regulators and Homeostatic Agents 14, 27-31 (2000).）別の研究では、ＴＩの最初の５週間の間、単球と顆粒球の選択的アフェレーシスが行われている。ＨＡＡＲＴの再開時には、アフェレーシス群は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の個数に増加がみられた。ＨＡＡＲＴ再開は、対照標準群のウイルスのリバウンドをほとんど抑制しなかったが、全く抑制しなかったわけではなく、アフェレーシス群のほとんどは、ウイルス学的抑制を発現した。アフェレーシス群は、その一部で、最大５２％までの単球ＨＩＶウイルス量の減少が見られたが、それ以外では、対照標準に匹敵する改善がみられた。（Hasson, H. et al., J. Med. Virol. 79, 1640-49 (2007).）これらの不十分な結果は、アフェレーシスによる循環単球の減少が平均してわずか３０％にすぎず、循環している単球は、全身の単球／マクロファージのプールのうちのほんの一部を代表しているにすぎないという事実によって説明できるかもしれない。また、このアプローチのもう一つ別の制約として、アフェレーシスが侵襲性で時間のかかる入院患者用処置であり、患者にとって大きな負担となる可能性があることが挙げられる。

ほかに、ＨＩＶ動物モデルにマクロファージ阻害剤を試験した研究者もあり、ＨＡＡＲＴの中断後のウイルス量の抑制とＣＤ４^＋Ｔ細胞のリバウンドにおいてポジティブな効果がみられている。マクロファージの特定的で効果的なターゲティングを達成するため、赤血球ゴースト（噴出赤血球）に薬物が投与された。（Cervasi, B. et al., J. Viol. 80, 10335-45 (2006); Serafini, S. et al., Antrivial Res. 81, 93-102 (2009).参照。）しかし、赤血球ゴーストは調製と保存が難しいので、需要の大きい薬剤の送達用としては理想的な選択肢とは言えない。また、赤血球ゴーストは、固有の漏出と、赤血球を除去する通常の生理学的過程とがあるため、その内容物が急速に放出される。結果として生ずる血漿薬剤濃度の上昇は毒性の問題を引き起こす。（Lanao, J. M. et al., J. Drug Targeting 15(1), 21-36 (2007).参照。）

信頼性の高い治療または効果のあるＨＩＶワクチンがいまだ科学者たちの手中にはない以上、できるだけ、ＨＩＶ感染の進行を遅らせて臨床的潜伏期を継続させることが肝要である。したがって、本技術分野において、ＨＡＡＲＴを、特にそのＴＩ期間に、補完するウイルス自己複製抑制のための安全で効果的な方法に対するニーズが存在する。また、そのような方法は、大勢いるＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の需要を満足させるため、投与が容易で、大量生産が可能であることが望まれる。

本発明は、単球およびマクロファージを、ＨＩＶ潜在リザーバーとして、特定的に標的とし、ＨＩＶウイルス量のリバウンドを防止または遅延させるという利点を提供する。その配合により、ＴＩ期間の安全性向上とＴＩ期間の延長が期待される。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者および公衆衛生システムに対する肉体的・経済的な負担を考えれば、ＴＩ期間の安全性向上と延長は疾患の長期にわたる管理にとって非常に望ましい。先行技術と比べれば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ抗ウイルス療法に対する補助療法として、本発明の製剤は、投与が容易で、非侵襲性で、貯蔵と流通が容易で、大量生産可能である。

［発明の概要］
本発明は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療または管理のための、特にＴＩ期間中あるいは抗ウイルス療法中断後に抗ウイルス療法の効果を補助し持続させるための、薬物組成物の使用に関する。本発明の方法は、食細胞の作用の抑制および／または数の減少を実現すべく設計された製剤として一種または多種の治療剤を有効量投与することを含む。この食細胞には、マクロファージおよび単球を含むが、これらに限定されない。治療剤は、好ましくは、ビスホスホネートを含む。本発明による前記投与は、抗ウイルス療法とＴＩの期間中にＨＩＶリザーバー（潜在リザーバーを含む）を抑制ないし枯渇させること、および、末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞レベルの向上を助けることで、ウイルスのリバウンドを（特にＴＩが指示されたときに）防止または遅らせることを目的とするものである。

特に、本発明は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療または管理するために、それを必要とする個人に、ビスホスホネートを含む製剤を、任意選択的に他の治療剤と組み合わせて、有効量投与することにより、ＨＩＶリザーバー（すなわち単球／マクロファージ）数を激減（deplete枯渇・消耗）させ、その効果を抑制する方法に関する。

ビスホスホネート（かつては、ジホスホネートと呼称されていた）は、２つの炭素−リン酸（Ｃ−Ｐ）結合により特徴づけられた化合物であり、骨形成および骨吸収の規制に関与する内在性無機ピロホスフェートの類似体である。２つの結合は、同じ炭素原子にくっついて配置されている場合（Ｐ−Ｃ−Ｐ）、ジェミナルビスホスホネートと呼称され、ビスホスホネートという術語は、一般に、ジェミナルビスホスホネートと非ジェミナルビスホスホネートに対して用いられる。ビスホスホネートおよびピロホスフェートは、時として、いっしょにポリマー鎖を形成することがある。臨床の場において、ビスホスホネートは、主として、効力のある骨吸収／異所性石灰化阻害剤として用いられ、最近では、それらの他の領域での臨床的適応が検査されており、リポソームカプセル封入されたビスホスホネートが再狭窄を含む心臓血管症状を治療するものであることが示されている。たとえば、米国特許第６７１９９９８号参照。

前記方法において使用される製剤は、カプセル封入されたビスホスホネート、または包埋されたビスホスホネート、または粒子状のビスホスホネートを含んでいてもよい。製剤は、主として、あるいは、排他的に、食作用によって、細胞に侵入することができる性質を備えた粒子を含んでいるので、製剤は、食細胞を特定的に標的とすることが期待される。理論に縛られず、ひとたび、標的とされた食細胞とマクロファージと単球とによって貪食されると、ビスホスホネートは、食細胞内に放たれ、それらの機能を阻害し、および／または、それらの数を激減させる。

一実施形態において、前記方法において使用される製剤は、適切な寸法のリポソーム内にカプセル封入されたビスホスホネートを含んでいる。リポソームカプセル封入されたビスホスホネートは、その大きさ（size）や電荷（charge）や伝導性（conductivity）やリポソーム脂質成分等の特性により単球および／またはマクロファージを特定的に標的とするものなので、製剤を、主として、あるいは、排他的に、食作用によって取り込ませることが可能となっている。ひとたび、食細胞に取り込まれると、リポソームカプセル封入されたビスホスホネートは、細胞内部に放たれて、単球および／またはマクロファージの作用を抑制し、および／または、単球および／またはマクロファージを殺す。

別の実施形態において、前記方法は、食細胞による取り込みに適した粒径をもつ担体の中に包埋されたビスホスホネートを含む製剤を使用する。包埋する担体も、自身をマクロファージおよび／または単球の食細胞標的にさせるような電荷または表面特性を備えるものであってもよい。

さらに別の実施形態において、前記方法は、食細胞の取り込みに適した大きさの粒子状のビスホスホネートを含む製剤を使用する。

一実施形態において、製剤は、抗ウイルス療法の期間中に投与される。他の実施形態において、製剤は、ＴＩ期間中に投与される。さらに別の実施形態においては、製剤は、抗ウイルス療法期間中およびＴＩ期間中の両方で投与される。さらに別の実施形態において、製剤は、抗ウイルス療法の中断直前に投与される。抗ウイルス療法は、ＨＡＡＲＴであってもよい。

本発明の優位性としては、単球およびマクロファージをＨＩＶリザーバーとして特定的に標的とし、ＨＩＶウイルス量のリバウンドを防止または遅延させることが挙げられる。その配合により、ＴＩ期間の安全性向上とＴＩ期間の延長が期待される。ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者および公衆衛生システムに対する肉体的経済的な負担を考えれば、ＴＩ期間の安全性向上と延長は疾患の長期にわたる管理にとって非常に望ましい。先行技術と比べて、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ抗ウイルス療法に対する補助療法として、本発明の製剤は、投与が容易で、非侵襲性で、貯蔵と流通が容易で、大量生産可能である。

図１Ａ〜１Ｂに、リポソームアレンドロネート投与量一単位分０．１ｍｇ／ｋｇを、カニクイザル（cynomolgus macaques）に投与した場合の、７日間にわたる末梢ＣＤ４＋の数に対する効果を、賦形剤を対照標準とした場合（vehicle control）と比較して示す。図１Ａは、単球の絶対度数を示し、図１Ｂは、単球の相対度数を示す。 図２Ａ〜２Ｄに、アカゲザル（rhesus macaques）の血清の化学的性質を、リポソームアレンドロネートの異なる投薬計画実施後の時間毎に示す。図２Ａは、血清アルブミンの濃度を示し、図２Ｂは、アラニントランスアミナーゼの濃度を示し、図２Ｃは、アルカリホスファターゼの濃度を示し、図２Ｄは、総ビリルビンを示す。 図３Ａ〜３Ｂは、リポソームアレンドロネート投与量一単位分１ｍｇ／ｋｇを投与した場合の、フローサイトメトリー染色パネルを用いて計測したアカゲザルの単球の度数（図３Ａ）および単球サブセットの度数（図３Ｂ）に対する効果を、賦形剤を対照標準とした場合と比較して示す。 図４Ａ〜４Ｄに、リポソームアレンドロネート投与量一単位分１ｍｇ／ｋｇを投与した場合の、７日間にわたるアカゲザルの全血における単球および３種の単球サブセットの絶対数および絶対度数に対する効果を、賦形剤を対照標準とした場合と比較して示す。図４Ａは全血、図４ＢはＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻、図４ＣはＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋、図４ＤはＣＤ１４⁻ＣＤ１６^＋である。 図５Ａ〜５Ｅに、組織中および骨髄中のマクロファージを特定するためのゲーティング法を示す。 図６Ａ〜６Ｃに、アカゲザルのさまざまな組織から採取した代表的な組織常在マクロファージおよび骨髄系前駆細胞の染色を示す。 図７Ａ〜７Ｃに、アカゲザルの組織中および骨髄中の、リポソームアレンドロネート治療前後のマクロファージおよび骨髄系前駆細胞の度数を示す。図７Ａは骨髄、図７Ｂは肝臓、図７Ｃは結腸である。 図８Ａ〜８Ｃに、ヒト以外の霊長類モデルにおける単球に対するリポソームアレンドロネート治療の効果を示す。図８ＡはＣＤ４５染色の側方散乱に対する分布によって評価した全血中の単球の度数を示し、図８Ｂは単球の絶対数を示し、図８ＣはＢｒｄＵ使用後の単球のターンオーバーを示す。 リポソームビスホスホネート、アレンドロネート１ｍｇ／ｋｇを投与した場合の、ＳＨＩＶ−感染したアカゲザルのウイルス量に対する効果を、賦形剤を対照標準とした場合と比較して示す。 リポソームアレンドロネート１ｍｇ／ｋｇを投与した場合の、ＳＨＩＶ−感染したアカゲザルの末梢ＣＤ４＋数に対する効果を、賦形剤を対照標準とした場合と比較して示す。

図面は、本発明の典型的な理解として、本発明の特定の実施形態を模式的に例示するために提供されているものであることに留意されたい。当業者であれば、他の同様の例が本発明の範囲内に属するものであることを容易に理解するであろう。図面は、本明細書に付属する特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

［発明の詳細な説明］
単球およびマクロファージは、ＨＩＶに感染しやすく、感染した単球およびマクロファージは、そのゲノムにウイルスのＤＮＡが組み込まれている。単球およびマクロファージは、長寿命で、サイクルを頻繁に繰り返すことはないので、抗ウイルス療法期間中にＨＩＶのリザーバーとしての役割を担い、未成熟ＨＩＶビリオンを潜伏させるので、未成熟ＨＩＶビリオンが抗ウイルス療法の中断時に放出される可能性がある。また、単球およびマクロファージは、ＨＩＶ感染のさらなる拡散を助長するさまざまなケモカインを分泌する。

本発明は、抗ウイルス療法中および／または抗ウイルス療法後のある期間にわたり、単球／マクロファージの作用を減少させまたは阻害し、および／または、単球／マクロファージを除去しまたはその量を減少させることによって、ＨＩＶ感染を治療する際に使用される医薬製剤を提供する。本発明の方法は、単球および／またはマクロファージによって選択的に取り込まれる製剤に入れて有効量のビスホスホネートを投与することを含む。このような投与は、ＨＡＡＲＴ等の抗ウイルス療法を補完し、抗ウイルス療法の中断中にウイルス量のリバウンドを防止ないし遅延させてＣＤ４^＋Ｔ細胞の個数を増加させると考えられている。これにより、ＴＩ期間の延長が可能となり、ひいては抗ウイルス療法の再開が必要となるタイミングを遅らせることができることが期待されている。

一実施形態において、製剤は、単球／マクロファージ阻害効果を開始させるため、抗ウイルス療法期間中に投与され、この単球／マクロファージ阻害効果は、療法の中断まで、そしてＴＩ期間中、持続することになる。製剤のＨＩＶ阻害効果はＴＩ期間を通じて持続するのが望ましいので、製剤は、抗ウイルス療法の中断前の短期間の内に、たとえば、抗ウイルス療法の中断まで約３日、または約５日、または約７日、または約１０日というタイミングで投与してもよい。他の実施形態において、製剤は、ＴＩ期間中に投与される。さらに別の実施形態において、製剤は、抗ウイルス療法中とＴＩ期間中の両方で投与される。抗ウイルス療法中および／またはＴＩ期間中に製剤を複数回投与することで、有効量に達するようにして所望の期間ＨＩＶ阻害効果を持続させることは、本発明の範囲に属する。

本発明の製剤（たとえば、カプセル封入されたビスホスホネート、包埋されたビスホスホネート、粒子形態のビスホスホネート）の使用は、重要なＨＩＶリザーバーである単球および／またはマクロファージを、選択的に不活性化し、および／または、その数を激減させる。製剤は、その特定の大きさ、および／または、他の生理化学的特性のおかげで、主として、あるいは、排他的に、食作用によって、細胞に侵入する。したがって、本発明の製剤は、特に、単球やマクロファージといった食細胞を標的とするものである。ひとたび食細胞内でビスホスホネートが放たれると、単球および／またはマクロファージを抑制、不活性化、無力化、殺生および／または枯渇させる。

本明細書において用いている「食作用（phagocytosis）」という用語は、食細胞への侵入の好ましい手段をいい、当該技術分野においては周知である。しかし、この用語は、同様の効果を同様に達成するかもしれない他の形態の飲食作用（endocytosis）をも包含すると理解されるべきである。特に、飲作用や、レセプター媒介エンドサイトーシスや、細胞の外側から物質を吸収／内在化する（absorbing/internalizing）ための他の細胞手段も、本発明の方法および組成物に含まれると理解される。

［ビスホスホネート］
製剤に使用される治療剤は、ビスホスホネートまたはその類似体である。本明細書において用いているビスホスホネート（bisphosphonates）という用語は、ジェミナル（germinal）ビスホスホネートおよび非ジェミナル（non-germinal）ビスホスホネートの両方を指す。また、この治療剤は、その範囲に、ビスホスホネートまたはピロホスフェートのポリマー鎖、特に、４０単位以下のビスホスホネートモノマーからなるポリマー鎖を含むものである。一実施形態において、ビスホスホネートは、下記の式（Ｉ）となる：

ここで、Ｒ_１はＨ、ＯＨまたはハロゲン原子でり、Ｒ_２はハロゲンであるか、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルＣ_１−Ｃ_１０アルキルアミノまたはＣ_３−Ｃ_８シクロアルキルアミノ（ここでアミノは第１級、第２級または第３級である）によって任意選択的に置換されうる直鎖または側鎖のＣ_１−Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２−Ｃ_１０アルケニルであるか、−ＮＨＹ（ここでＹは水素、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである）であるか、あるいはＲ_２は、−ＳＺ（ここでＺはクロロ置換フェニルまたはピリジニルである）である。

本発明にしたがって使用可能な他のビスホスホネートとしては、クロドロネート、チルドロネート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸、すなわちジメチル−ＡＰＤ、１−ヒドロキシ−エチリデン−１，１−ビスホスホン酸、すなわちエチドロネート、１−ヒドロキシ−３（メチルペンチルアミノ）−プロピリデン−ビスホスホン酸（イバンドロン酸）、すなわちイバンドロネート、６−アミノ−１−ヒドロキシヘキサン−１，１−ジホスホン酸、すなわちアミノ−ヘキシル−ＢＰ、３−（Ｎ−メチル−Ｎ−ペンチルアミノ）−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ジホスホン酸、すなわちメチル−ペンチル−ＡＰＤ、１−ヒドロキシ−２−（イミダゾール−１−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸、すなわちゾレドロン酸、１−ヒドロキシ−２−（３−ピリジル）エタン−１，１−ジホスホン酸（リセドロン酸）、すなわちリセドロネート、３−［Ｎ−（２−フェニルチオエチル）−Ｎ−メチルアミノ］−１−ヒドロキシプロパン−１，１−ビスホスホン酸、１−ヒドロキシ−３−（ピロリジン−１−イル）プロパン−１，１−ビスホスホン酸，１−（Ｎ−フェニルアミノチオカルボニル）メタン−１，１−ジホスホン酸、すなわちＦＲ７８８４４（フジサワ）、５−ベンゾイル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラゾール−３，３−ジホスホン酸テトラエチルエステル、すなわちＵ８１５８１（アップジョン）、１−ヒドロキシ−２−（イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン−３−イル）エタン−１，１−ジホスホン酸、すなわちＹＭ５２９、もしくは、それらの類似体が挙げられるが、その限りではない。上記ビスホスホネートのいくつかは、米国特許第６，７１９，９９８号公報（引用により本明細書に組み込むものとする）に式が記載されている。

特定の実施形態において、ビスホスホネートは、アレンドロネートまたはその類似体である。そのような実施形態では、式Ｉは、Ｒ１＝ＯＨかつＲ２＝（ＣＨ_２）_３−ＮＨ_３である。

アレンドロネートは、良好な治療域を提供する第２世代の窒素含有ビスホスホネートである［１７，２１，２２］。一般に、窒素含有ビスホスホネートには、本発明にとって特に有用なビスホスホネートの好適なサブクラスがある。そのようなビスホスホネートは、その、アレンドロネートの生物学的作用を模倣する能力に基づいて選択することができる。それは、たとえば、マクロファージや繊維芽細胞などの食細胞の内部に入るとその作用を阻害する生体外の作用や、マクロファージからのＩＬ−１および／またはＩＬ−６および／またはＴＮＦ−αの分泌の阻害や、試験製剤の、動物モデルまたはヒトの血液の単球を枯渇または無能化させる能力あるいはＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療する能力といった生体内の作用などである。

［製剤、医薬品組成、投与経路］
本発明の製剤は、専らあるいは主として食作用による細胞の内在化に適した粒径を有するように、調製することで、マクロファージおよび単球等の食細胞に対する特異性を付与することができる。本発明のビスホスホネートを含有する製剤は、好ましくは、専らあるいは主として食作用によって内在化される粒径、すなわち、好ましくは０．０３ミクロンより大きい粒径を有するように、調製される。たとえば、そのような製剤としては、粒径を、たとえば平均粒径で、約０．０３〜１．０ミクロン、または約０．１〜０．３ミクロン、または約０．１〜０．１８ミクロン、または約０．０７〜０．５ミクロン、または約０．０７〜０．１５ミクロンとすることができる。必要な患者への投与前の製剤粒径測定には、当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。たとえば、レーザー光の散乱を利用したＮｉｃｏｍｐ Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒ （ｍｏｄｅｌ ３７０， Ｎｉｃｏｍｐ、カリフォルニア州サンタバーバラ）を用いることができる。

専らあるいは主として食作用によって細胞内へ取り込まれることが可能な製剤にビスホスホネートを組み入れるためには、当該技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。製剤は、標的部位へのデリバリーを強化するため充分な時間ビスホスホネートを隔離しておくことができる。製剤は、食作用に影響を与える、または、食作用を強化する帯電特性や表面特性を有するものであってもよい。さらに、製剤は、標的部位で標的細胞（たとえば、単球および／またはマクロファージ）内にあるときにビスホスホネートを放出するものであってもよい。

一実施形態において、ビスホスホネートは、カプセル封入されている。カプセル封入された形態とは、たとえば、ポリマーまたはリポイドのデリバリーシステムのような、治療剤に対するバリアとして機能する構造を有するエンクロージャーを意味することを意図することばである。一実施形態において、カプセル封入剤は、リポソームである。リポソームは、ビスホスホネートをカプセル封入する脂質材料を含み、単一の脂質層であってもよく、多層構造であってもよい。リポソームは、正に帯電していても、電気的に中性であっても、負に帯電していてもよい。好ましい実施形態において、リポソームは、負に帯電している。本発明による好適なリポソームとしては、たとえば、ホスファチジルコリンやホスホグリセロールやコレステロールから調製されるもののような、非毒性リポソームが好ましい。一実施形態において、脂質材料には、たとえば、ジアステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）や、ジアステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）や、コレステロール（ｃｈｏｌ）を含むものであってよい。たとえば、リポソームは、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：ｃｈｏｌのモル比が３：１：２であってもよい。ビスホスホネートの脂質材料に対する質量比は、薬剤：脂質比と呼ばれ、重量比約１：５〜１：８、または重量比約１：６〜１：７とすることができる。特定の実施形態において、たとえば、ＤＳＰＣ、ＤＳＰＧおよびコレステロールにカプセル封入されたアレンドロン酸ナトリウムでは、１：５．７の薬剤：脂質質量比−アレンドロン酸ナトリウムに対して約１：３のモル比に等しい−が採用可能である。他の例としては、同じ脂質材料へのクロドロン酸二ナトリウムのカプセル封入に、約１：５．４の質量比を採用可能であるが、これは、１：３モル比に相当する。他のビスホスホネートおよび他の脂質の組み合わせに対するモル比の決定は、当該技術分野における技能の範囲にある。

製剤のリポソームは、サイズ、電荷、ｐＨ、伝導性、オスモル濃度を含む、主として食作用による取り込みを可能にする固有の特徴を有する。使用されるリポソームの直径は、単球またはマクロファージによる食作用に適した範囲のサイズ、たとえば、０．０３〜１．０ミクロンの範囲とすることができるが、直径は、本明細書に記載したようなサイズもしくはサイズの範囲を有するものであってもよい。たとえば、一実施形態において、リポソームは、約０．０８±０．００５ミクロンの直径を有するものであってもよい。リポソームの伝導性は、たとえば、１３．５〜１７．５ｍｓ／ｃｍとしてもよい。リポソームの外部オスモル濃度は、ヒトの体のオスモル濃度と一致させることができ、内部オスモル濃度は、低くすることができる。オスモル濃度を低くすると製剤の安定性を高めることができるからである。したがって、たとえば、内部オスモル濃度を、約３４０〜４４０ｍＯ／ｋｇとすることができる。リポソームおよび／またはリポソーム製剤の内部ｐＨは、約６．９とすることができる。

リポソームは、当該技術分野において公知の方法（たとえば、Moenkkoenen, J., et al., J. Drug Target, 2:299-308 (1994); Moenkkoenen, J., et al., Calcif. Tissue Int., 53:139-145 (1993); Lasic, D. ., Liposomes Technology Inc., Elsevier, Chapter 3, pp. 63-105 (1993); Winterhalter, M, Lasic, D.D., Chem. Phys. Lipids, 54(1-3):35-43 (September 1993); Epstein-Barash, H., et al., J. Controlled Release, 146:182-195 (2010); Epstein, H. et al., AAPS J, 10:505-515 (2008); U.S. Patent No. 7,008,645; U.S. Patent Publication No. 2010/0015213; U.S. Patent Publication No. 2004/0266734; U.S. Patent Application Ser. No. 13/804,707)参照；これらすべての文献は、その全体を引用により本明細書に組み込むものとする）のいずれかにより調製することができる。その方法の一つは、リポソームを液晶二分子層の積層体として形成し、水和して水和脂質シートとし、これらが撹拌中に分離し自己閉鎖（self-close）して、大きな多重膜ベシクル（multilamellar vesicles: ＭＬＶ）を形成するものであり、脂質薄膜水和技法として知られている。これらの粒子が形成されると、粒子のサイズを、音波エネルギー（超音波処理）または力学的エネルギー（押し出し処理）を用いて縮小することができる。超音波処理は、通常、小さな単層ベシクル（small, unilamellar vesicles: ＳＵＶ）を生成し、脂質押し出し処理は、脂質懸濁液を一連のポリカーボネートフィルター（通常、０．８、０．４、０．２、０．１ミクロンのメンブレン）を通して、高圧（５００ｐｓｉ以下）で押し出すものであり、使用するフィルターの細孔径に近い直径の粒子を生成する。

実質的に均一なリポソームが、米国特許出願公開第２００４／０２６６７３４号公報および同時係属米国特許出願第１３／８０４，７０７号（両文献は、引用により本明細書中に組み込むものとする）に記載されているような低圧法により調製することができる。簡単に説明すると、たとえば、治療剤をあらかじめ選択しておいた脂質と混合してベシクルを形成し、そのベシクルを単一のあらかじめ選択しておいたサイズのフィルターを通して単段式押し出し処理にかけた後、限外濾過を行うものとすることができる。この方法によれば、約０．０３〜０．５ミクロン、約０．０７〜０．１２ミクロン、約０．０７〜０．１５ミクロン、約０．１〜０．１８ミクロン、約０．１〜０．３ミクロンの粒径を有するリポソームを産生することができる。

一実施形態において、リポソームは、次のように調製することができる。（１）ビスホスホネートとあらかじめ選択しておいた脂質とを混合して多重膜ベシクル（ＭＬＶ）を形成し、（２）最終サイズのベシクルを生成し、（３）ビスホスホネート封入リポソームの精製および選択を行う。ステップ（１）においては、ビスホスホネートを、通常、水に溶かし、正確に計量した脂質材料を、クロロホルム：メタノール（９：１）、またはエタノール：ｔ−ブタノール（１：１）、またはエタノール：ｔ−ブタノール：水（７７：７７：６ ｖ／ｖ／ｖ）等の溶媒に溶かす。そして、ビスホスホネート溶液を、脂質溶液に混合するが、混合促進のため軽い加熱を適用してもよい。このプロセスによって、ＭＬＶへのビスホスホネートへの効率的なカプセル封入が実現するが、このＭＬＶは、サイズが均一でなく所望最終サイズよりも大きい。ステップ（２）においては、ベシクルのサイズを縮小してベシクルを均一なサイズと形状にそろえるために力学的な方法を使用する。当該技術分野において公知の方法としては、超音波処理と押し出し処理が挙げられる。リポソームは、脂質・薬剤混合物に、圧力を加えて、漸減する細孔径をもつ一連のフィルターを通過させることにより押し出し処理することができる。代替的に、リポソームは、同時係属米国特許出願第１３／８０４，７０７号に記載されている低圧下で単一細孔径のフィルターを使用した単段式濾過法による方法によって押し出し処理するのでもよい。この方法によれば、運転コストと運転時間を抑制することが可能であり、多段式高圧押し出し処理よりも収率を向上させることが可能である。ステップ（３）においては、適切にカプセル封入されたビスホスホネートが、カプセル封入されていないビスホスホネートと溶媒と脂質から分離される。このステップの代表的な方法としては、ゲル・カラムを通すゲル濾過や、メンブレンを通す限外濾過が挙げられる。

他の実施形態において、ビスホスホネートは、担体に、すなわち所望の属性（たとえば０．０３〜１．０ミクロンの範囲の粒径）をもつ包埋剤に、包埋される。包埋されたビスホスホネートには、担体内に包埋、封入および／または吸着された形態、担体マトリックスに分散された形態、担体表面に吸着もしくは結合された形態、あるいはこれらの形態のいずれかを組み合わせた形態がある。特定の実施形態において、包埋剤（すなわち担体）は、微粒子（microparticle）、またはナノ粒子（nanoparticle）、またはナノスフェア（nanosphere）、またはミクロスフェア（microsphere）、またはマイクロカプセル（microcapsule）、またはナノカプセル（nanocapsule）である（たとえば、M. Donbrow in: Microencapsulation and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy, CRC Press, Boca Raton, Fla., 347, 1991参照）。「担体（carrier）」という用語は、ポリマー製剤と非ポリマー製剤の両方を含む。特定の実施形態において、包埋剤は、ナノ粒子である。ナノ粒子は、球形であっても、非球形であっても、ポリマー粒子であってもよい。治療剤は、ナノ粒子に包埋されたものであってもよく、ポリマーマトリックスに均一または不均一に分散されたものであってもよく、その表面に吸着されたものであってもよく、あるいはこれらの形態のいずれかを組み合わせたものであってもよい。好ましい実施形態において、ナノ粒子を作成するために用いられるポリマーは、生体適合性と生分解性をもつ、たとえば、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）ポリマー（ＰＬＧＡ）等である。もっとも、ナノ粒子を作成するために用いることができるその他のポリマーとして、ＰＬＡ（ポリ乳酸）およびそのコポリマー、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート（ポリイソブチルシアノアクリレート等）、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドおよびそれらの誘導体、キトサン、アルブミン、ゼラチン等が挙げられるが、これらに限定されない。包埋されたビスホスホネートは、粒径サイズの範囲を、たとえば０．０３〜１．０ミクロンとすることができるが、粒径サイズまたはその範囲を、本明細書に記載されているように、単球またはマクロファージによる食作用に適した範囲内、たとえば、平均粒径を、約０．０３〜１．０ミクロン、または約０．１〜０．３ミクロン、または約０．１〜０．１８ミクロン、または約０．０７〜０．５ミクロン、または約０．０７〜０．１５ミクロンといった範囲内としてもよい。

他の実施形態において、ビスホスホネートは、各粒子が所望の属性を有する粒子形態である。粒子形態には、カプセル封入もしくは包埋されていない不溶性の懸濁もしくは分散した粒子形態を含む。粒子形態のビスホスホネートは、懸濁もしくは分散した、コロイド（colloids）、集合体（aggregates）、凝集体（flocculates）、不溶性塩（insoluble salts）、不溶性錯体（insoluble complexes）、ポリマー鎖（polymer chains）といった形態をとるものとすることができる。このような粒子は、保存／投与の際にそれを入れる流体（たとえば、生理的食塩水や水）およびその治療効果を発揮する際にそれが入る流体（血液や血清）に溶けない。通常、「不溶性である／溶けない（insoluble）」とは、溶媒１００００部超に対し粒子形態化合物１部の溶解度を意味する。粒子または集合体を作成するための当該技術分野において公知の方法がいずれも利用可能である。粒子形態ビスホスホネートは、粒径サイズの範囲を、たとえば０．０３〜１．０ミクロンとすることができるが、粒径サイズまたはその範囲を、本明細書に記載されているように、単球またはマクロファージによる食作用に適した範囲内、たとえば、平均粒径を、約０．０３〜１．０ミクロン、または約０．１〜０．３ミクロン、または約０．１〜０．１８ミクロン、または約０．０７〜０．５ミクロン、または約０．０７〜０．１５ミクロンといった範囲内としてもよい。

本発明の製剤は、それぞれ、食作用の標的となるよう設計されているが、ビスホスホネートが比較的単球およびマクロファージに限定的に作用するため、単球およびマクロファージ以外の食細胞（たとえば、好中球）は、粒子を取り込むかもしれないけれど、影響を受けないか影響は比較的小さい。非食細胞は、リポソーム製剤の特殊な生理化学特性ゆえに、比較的、製剤を取り込むことができにくくなっている。

単球／マクロファージによって取り込まれた後、ビスホスホネートは、単球／マクロファージに対する持続的阻害作用を有することが期待される。このように持続的に作用することで、単球／マクロファージの炎症作用を充分に和らげてくれる。それゆえ、阻害を持続させるために薬剤の放出を延長する必要がない。したがって、単球／マクロファージを阻害することによって（たとえば、カプセル封入された薬剤を使用することによって）、特定の疾患を治療する方法は、好ましくは、製剤が循環単球と組織常在マクロファージの両方を標的とするものであるという意味で、全身性治療である。製剤中の具体的なビスホスホネートによっては、食作用を有する単球およびマクロファージは、異なる反応を示すかもしれない。たとえば、アレンドロネート−カプセル封入されたリポソームは、アポトーシスを引き起こす可能性があり、クロドロネートカプセル封入されたリポソームは、ネクローシスを引き起こす可能性がある。

本発明の方法において用いられる製剤は、個々の患者固有の多様な因子（たとえば、障害の重篤度と種類、患者の年齢、体重、応答、過去の病歴）、製剤中の治療剤の数と種類、製剤の種類（たとえば、カプセル封入形態、包埋形態、粒子形態、等）、組成物の形態（たとえば、液体、または半流動体、または固体）および／または投与経路（たとえば、経口投与、経静脈投与、筋肉内投与、経動脈投与、髄内投与、髄腔内投与、脳室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、経鼻投与、経腸投与、局所投与、舌下投与、経膣投与、経直腸投与）に基づいて、投与のための様々な医薬品形態で提供される。本発明の組成物に含ませてもよい医薬品の担体、賦形剤、補形薬、希釈剤には、水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、油、（たとえば、石油、動物油、植物油、合成油）、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、エタノール、デキストロース等があるが、これらに限定されない。組成物は、必要に応じて、湿潤剤や、乳化剤やｐＨ緩衝剤を少量含有するものとすることもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、タブレット、ピル、カプセル、散剤、徐放性製剤等の形態をとるものとすることができる。

非経口腸管外投与に適した製剤は、水溶液として、好ましくは、ハンクス液や、リンゲル液や、緩衝生理食塩水のような生理学的に適合性のある緩衝液として調製することができる。水性懸濁注射液には、カルボキシルメチルセルロースナトリウムや、ソルビトールや、デキストランといった懸濁液の粘性を向上させる物質を含んでいてもよい。また、活性化合物の懸濁液は、適切な油性懸濁注射液として調製することができる。適切な親油性溶剤または賦形剤としては、ゴマ油等の脂肪油や、オレイン酸エチルやトリグリセリド等の合成脂肪酸エステルや、リポソームが挙げられる。任意選択的に、懸濁液には、適切な安定剤や、高濃度溶液の調製を考慮した化合物の溶解度を向上させる薬剤を含むものであってもよい。

ビスホスホネートは、たとえば、塩、塩溶媒和化合物、およびそれらの水和物を含む、任意の形態で提供することができる。したがって、たとえば、カプセル封入される場合、ビスホスホネートは、固体であってもよく、溶液の状態であってもよく、固体は、溶媒和化合物であってもよく、水和物であってもよい。

［製剤の投与］
本発明は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療または管理するために、１回または複数回の投与計画で１種類ないし複数種類のビスホスホネートを有効量含有する製剤を投与することを含むことが意図されている。採用される投与回数は、所望の効果を達成するために必要なだけ、たとえば、１回、３回、５回、８回、１０回、または、１日１回、１日２回（b.i.d.）、１日４回（q.i.d.）、あるいは、一定期間継続して注入を行う場合のような連続投与とすることができる。本発明の製剤は、他の医薬品と組み合わせて投与してもよい。「組み合わせて（in combination）」という用語は、正確に同じタイミングで医薬品を投与する方法に限らず、むしろ、本発明の製剤と他の医薬品とを、一定期間内に患者に順次投与することで、そうしなかった場合よりもメリットが大きくなるように協調して作用することが可能となるような場合が意図されている。たとえば、本発明の製剤および他の医薬品を同時に投与してもよいし、任意の順序で異なる時点で順次投与してもよいが、同時に投与されない場合には、それらが所望の治療効果をもたらすよう充分時間的に近接したタイミングで投与しなければならない。本発明の製剤の投与は、他の医薬品と組み合わせるか否かを問わず、それぞれ個別に、適切もしくは所望の作用部位に効果的に治療剤が搬送されるよう任意の適切な形態かつ任意の適切な投与経路で実施される。本発明の製剤の投与の好ましい方式としては、経静脈投与（i.v.）および経動脈投与（i.a.）が挙げられる。他の適切な投与方式としては、筋肉内投与（i.m.）、皮下投与（s.c.）、腹腔内投与（i.p.）、経口投与（per os）が挙げられる。このような投与は、大量瞬時投与（ボーラス）または注入によるものとすることができる。他の投与方式としては、経血管周囲デリバリーによるものもある。上記した投与経路のいずれかの組み合わせを、本発明にしたがって採用することができる。

投与時には、その後続くＴＩ期間の全体を通して単球／マクロファージ阻害効果が持続するような投与量と投与タイミングで製剤を投与するのが望ましい。一実施形態において、製剤は、ＴＩ期間前の短期間（たとえば、抗ウイルス治療終了前の約３日〜約１０日）に少なくとも１回投与される。他の実施形態において、製剤は、抗ウイルス治療中に複数回、投与してもよい。さらに他の実施形態において、製剤は、ＴＩ期間中に、ＴＩ前投与に加えて、あるいは、直前の抗ウイルス治療の間には投与せず、投与してもよい。ＨＩＶ／ＡＩＤＳの管理は長期にわたる努力であり、ＴＩ期間をはさんで複数回の抗ウイルス治療を行うものとしてもよいので、抗ウイルス療法レジームおよびＴＩとの関連において、適切な時点に、本発明による単球／マクロファージ阻害治療を複数ラウンド行うことを含むことは、本発明に調和する。

「有効量（effective amount）」という用語は、製剤中のビスホスホネートの量であって、活性ビリオンの再出現を遅延させるために単球／マクロファージの作用を阻害もしくは減少させる効果がある、および／または、循環している単球／マクロファージをなくすもしくはその数を減らす効果がある量のことをいう。製剤中のビスホスホネートの有効量は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの管理における抗ウイルス療法を補完するための長期治療を提供するものとなるよう検討される。製剤中のビスホスホネートの有効量は、単球／マクロファージを一定期間の間、阻害および／または枯渇させるものであることが好ましく、その期間は、約１週間、約２週間、好ましくは１ヶ月以上、より好ましくは、２ヶ月以上、さらに好ましくは３ヶ月以上、最も好ましくは、６ヶ月以下もしくはそれ以上である。熟練技術者であれば、製剤を必要としている個人（またはそのような個人の動物モデル）に投与し、異なる時点で阻害／枯渇のレベルを監視することによって、実験的に、有効性を有する期間を決定することができるであろう。また、阻害の時間を適切な望ましい臨床効果（たとえば、ＨＩＶウイルス量の阻害、および／または、ＣＤ４^＋Ｔ細胞のレベルの上昇）と相関させてもよい。

製剤中のビスホスホネートの有効量は、いくつかの要因に依存して変わってくるかもしれない。その要因には、患者の性別や年齢や体重、製剤投与の方式、ビスホスホネートをカプセル封入または包埋するのに用いる担体の種類（たとえば、ビスホスホネートを急速に放出する担体、または、それをある期間にわたって放出する担体）、治療計画（たとえば、製剤の投与を、数日おきに１回、数週間おきに１回、抗ウイルス療法ごとに１回行う）、ウイルス種や、製剤の投与前後の治療対象個体のウイルス量およびＣＤ４＋Ｔ細胞数を含むＨＩＶ／ＡＩＤＳの状態、抗ウイルスカクテルに使用される薬剤の種類および量、患者の薬物抵抗性、ＨＩＶ／ＡＩＤＳへの感染しやすさに関連する患者の遺伝子型、抗ウイルス療法の継続時間、ＴＩの継続時間が含まれるが、その限りではない。熟練技術者であれば、通常実施している実験方法によって、前記要因あるいは他の関連する要因および本明細書の説明に基づき、有効量を決定することができる。

ヒトに使用する本発明の製剤用のビスホスホネートの例示的・非限定的な投与量は、たとえば、約１．５ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（体重比）、または約１５ｎｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ（体重比）、または約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１５μｇ／ｋｇ（体重比）、または約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ（体重比）μｇ／ｋｇ（体重比）であると考えられる。したがって、たとえば、患者は、約０．１μｇ〜約１ｍｇの範囲の量、たとえば、０．１μｇ、または約１μｇ、または約１０μｇ、または約１００μｇ、または約１ｍｇの量を投与されることになるだろう。他の投与量も、特定のビスホスホネートが使用され、特定の製剤および投薬計画による場合には、採用可能であり、熟練技術者により容易に決定可能である。

細胞培養検定および動物調査から得られたデータを用いてヒトに使用する製剤の投与量範囲を決定することができる。製剤中のビスホスホネートの投与１回分の量は、好ましくは、結果として、ほとんど、または、まったく毒性のないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲となる。特定の患者に対する投与量は、使用する特定の製剤と採用する投与経路と患者の状態（症状）または特性とに依存することになる。本発明の方法において使用する製剤に対して、最初に、有効な投与量を細胞培養検定から推定することができる。投与量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されたＩＣ_５０（すなわち、最大半減の症状阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲に当てはまるように処方することができる。このような情報は、ヒトの有効投与量をより正確に決定するために利用することができる。血漿レベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。ヒトの有効投与量は、さらに、臨床試験によって決定してもよい。

［治療有用性の特性評価］
一実施形態において、単球／マクロファージの作用を阻害しまたは減少させ、および／または、単球／マクロファージを除去しまたはその数を減少させることがもたらす望ましい治療効果は、充分長い期間にわたる、ＨＩＶウイルス量の抑制、および／または、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の増加である。充分長い期間は、ＴＩ期間全体であってもよい。特定の場合、充分長い期間は、ＴＩ期間全体よりも長くてもよく、短くてもよい。

本発明の治療方法の毒性および有効性は、細胞培養または実験動物において、たとえば、ＬＤ_５０（母集団の５０％に対し致死的な量）、観測可能な副作用のないレベル（No Observable Adverse Effect Level：ＮＯＡＥＬ）、ＥＤ_５０（母集団の５０％において治療効果のある投与量）と判定するための標準的な薬学的処置により判定することができる。有毒作用と治療効果との間の投与量比率は、治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０またはＮＯＡＥＬ／ＥＤ_５０の比率で表すことができる。大きい治療指数を示す製剤が好ましい。毒性副作用を示す製剤を使うこともありうるが、患部以外の細胞が潜在的に受ける可能性のあるダメージを最小限にとどめて副作用を減らすために、その製剤の薬剤が標的細胞の部位をターゲットとして効力を生じるようデリバリーシステムを設計することに留意すべきである。また、そのような製剤の薬剤担体は、放出される薬剤のレベルが何らかの毒性限界値を超えてしまうことのないよう、薬剤放出を規制するよう設計されていなければならない。

本発明の方法のプロトコルおよび構成は、ヒトに使用する前に、所望の治療効果について、生体外で、それから生体内で、試験しておくのが好ましい。一例として、そのような生体外検定には、単球／マクロファージにおける生体外細胞培養検定がある。単球／マクロファージを培養液で生長させて細胞に接触させるなどの方法で細胞に投与してその検定の細胞への効果（たとえば、活性の阻害または減少、および／または細胞の完全または部分的な死）を観察するものである。単球／マクロファージは、株化細胞系から取得してもよく、あるいは、個体から初代細胞系として最近分離したものであってもよい。当該技術分野における標準的な多くの検定が、単球／マクロファージへの製剤の作用を測定するために利用可能であり、たとえば、マクロファージ化学走性誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インターロイキン１β（ＩＬ−１Ｂ）、組織壊死因子α（ＴＮＦ−α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）といった化学走性因子のレベルを定量化することによるものがある。当該技術分野における標準的な多くの検定が、単球／マクロファージの生存および／または生長を評価するために利用可能であり、たとえば、^３Ｈ−チミジン取り込みの測定により、直接細胞数カウントにより、プロトオンコジーン（たとえば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）や細胞周期マーカーのような公知の遺伝子の転写活性変化の検出により、細胞の増殖を検定することが可能であり、トリパンブルー染色によって細胞の生存能力を評価することが可能である。

本明細書中に引用するすべての刊行された記事、書籍、リファレンスマニュアル、摘要の内容は、本発明の属する技術分野の技術水準をより十全に説明するため、ここに、その全体を、引用により組み込むものとする。

本明細書中に記載する以下の実施例は、本発明の実施態様の多様な側面を例示し説明することを意図するものであり、決して本発明を限定することを意図するものではない。

リポソームアレンドロネート（ＬＡ）は、たとえば、Epstein-Barash, H., et al., J. Controlled Release, 146:182-195 (2010); Epstein, H. et al., AAPS J, 10:505-515 (2008)、および、米国特許出願第１３／８０４，７０７号に記載されているプロトコルにしたがって、調製することができる。より詳しくは、実施例２〜７のために、ＬＡは、米国特許出願第１３／８０４，７０７号（実施例１としてここに転載）にしたがって調製した。

［実施例１−リポソームアレンドロネート製剤］
コレステロールとＤＳＰＣとＤＳＰＧとを含有するリポソームにカプセル封入され、リン酸緩衝生理食塩水の溶液に分散させたリポソームアレンドロネートを１リットルバッチ分製造した。リポソームアレンドロネートは、臨床上の便宜を見込んで、無菌白色リポソーム分散系として５ｍｇ／ｍｌおよび０．５ｍｇ／ｍｌという２種類の濃度で、用意してもよい。これらの濃度は、さらに、特定の体積中に所望の量の治療剤が得られるように配合してもよい。脂質材料は、コレステロールとＤＳＰＣとＤＳＰＧとから構成した。分散系は、ｐＨ調整と注入適合性確保のため、および、等張性維持のために、リン酸緩衝生理食塩水を含有するものともした。最終生産物中の薬剤の少なくとも９６％がリポソームにカプセル封入された。投与に供するために、バイアルの中身（または、必要に応じその一部）を生理食塩水賦形剤で希釈し、注入液として投与した。特定の前臨床実施例の一つにおいて、適切な質量のＬＡ（体重で測定）を、室温の１Ｘ ＰＢＳで、最終体積２０ｍｌになるまで希釈し、経静脈（伏在静脈）注射または腹腔内注射によって４ｍｌ／分で投与した。

前記製造方法に用いる成分の量と質と、それらの１リットルバッチ毎の量とを含むバッチ配合を、下表１に示す。

表１の１リットルバッチで製造した経静脈注入（ＩＶ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）用リポソームアレンドロネートの内容と量的組成を下表２にまとめてある。このバッチにおいて、ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロールのモル比は３：１：２としたことに留意されたい。また、薬剤：脂質の比率は計算により約１：５．７±１．５（ｗ：ｗ）であることがわかった。

本明細書に記載した製造方法により実際に製造した経静脈注入用リポソームアレンドロネート製剤を下表３に示す。

０．５ｍｇ／ｍｌ有効性成分含量を、上述の５ｍｇ／ｍｌ有効成分含量の場合と同様のプロセスで製造してもよい。投与に供する最終製剤濃度を異なる濃度にするという点で、最終標準化ステップ（後述）だけが異なっている。下記実施例では０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を採用した。当該技術分野における熟練技術者であれば、このプロセスにしたがって、他の投与量で製造し得ることが理解される。

治療薬液（アレンドロネート溶液）および脂質溶液を次のように調製した。

［アレンドロネート溶液］ＮａＯＨ（６．８〜８．０ｇ）を計量し、８５０ｍｌの注射用蒸留水（ＷＦＩ）に７０±３℃の温度で６００±１５０ＲＰＭで溶かした。目視により完全に溶解したことを確認した。アレンドロン酸ナトリウム（６８〜８０．７５ｇ）をＮａＯＨ溶液に入れて７０±３℃の温度下で６００±１５０ＲＰＭで撹拌して溶かした。目視により完全に溶解したこと（すなわち、透明な溶液）を確認し、伝導性およびｐＨ測定値を確認した（ｐＨ＝６．８±０．３。伝導性＝１８．０±１ｍｓ／ｃｍ）。

［脂質溶液］３０ｇのＤＳＰＣ（３７．９ｍｍｏｌ）、１０ｇのＤＳＰＧ（１２．５ｍｍｏｌ）、１０ｇのコレステロール（２５．８ｍｍｏｌ）（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／コレステロール；３／１／２ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）を計量し、２５０ｍｌビーカーの中で、１６０ｍｌのｔ−ブタノール／ＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（７７／７７／６、ｖ／ｖ／ｖ）に入れて、加熱したマグネチックスターラーで７０±３℃の温度で溶かして、３１２ｍｇ／ｍｌの濃度の脂質溶液を形成した。温度が範囲内となったとき透明黄色の溶液が形成された。

［ＭＬＶ製剤］温度を７０±３℃に維持しつつ６００＋１５０ＲＰＭで混合しながら、アレンドロネート溶液に脂質溶液を加えた（１部薬剤；５．３部脂質）。少なくとも５分経過後、１００ｍｌのＷＦＩ（総体積の１０％）を加えて、押し出し処理前に溶媒濃度を低減した。さらに１０分間製剤を混合した。

［押し出し処理］製剤は、ベシクルのサイズを小さくし、ベシクルの均一性を向上させるために、圧力＝９０±１５ｐｓｉ、温度６８±５℃で、１枚の０．１４μｍセラミック製メンブレンまたは２枚のポリカーボネート製メンブレン（たとえば、０．２プレフィルターおよび０．１μｍメンブレン）を装着した１．２Ｌの加熱されたステンレススチール押し出し機によって、押し出し処理にかけた。８０〜１００ｎｍのベシクルを得るために、プロセスを１２〜１８回繰り返すことが必要であった。繰り返し実行される押し出し処理は、リアルタイムでサンプリングして、限外濾過前のベシクルのサイズを確認した。リポソーム製剤のサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ ＺＳアナライザー（許容限度：９５±２０ｎｍ）を用いて分析した。押し出しサンプルに対しては、好気性細菌の数を調べるための解析も行った（バイオバーデン管理）。許容限度は１００ＣＦＵ／ｍｌ未満とした。

［限外濾過および透析濾過］まず、限外濾過にかける前に、製剤を４５℃未満になるまで冷ました。限外濾過は、５００Ｋの中空繊維膜を備えたＡｍｅｒｓｈａｍ ＱｕｉｘＳｔａｎｄ ｓｙｓｔｅｍで実行した。製剤は、２５ｐｓｉ以下の入口圧力で濃縮した。最小体積に到達すると、製剤をホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液の１０初期体積（約７Ｌ）で透析にかけた。ＰＢＳ溶液は、１０ＬのＷＦＩ中に１４５ｍＭのＮａＣｌ、１３ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、７ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４を溶かすことで調製した。ＰＢＳは、ｐＨが約６．９で、伝導性は約１６．９ｍｓ／ｃｍであった。ＰＢＳは、０．２μｍのフィルターで濾過した。透析濾過は、透析された製剤のｐＨおよび伝導性を測定することによって終了とした。製剤は、初期体積（約１．２リットル）の１２０％を超えないように、限外濾過システムから排出した。一般的な分析と好気性細菌の計数（バイオバーデン管理）を行うためサンプルを採取した。許容限度は１０００ＣＦＵ／ｍｌ未満とした。

透析終了時に、製剤は、バイオバーデン管理を維持するため０．２μｍのフィルターを通して濾過した。製剤を収容した圧力容器を０．２μｍの無菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ）に接続した。フィルターは、無菌受容槽にあらかじめ組み付けておいた。圧力容器に５〜３０ｐｓｉの圧力を加えることで濾過を実施した。一般的な分析と好気性細菌の計数（バイオバーデン管理）を行うためサンプルを採取した。許容限度は１００ＣＦＵ／ｍｌ未満とした。

［最終標準化］製剤を、サイズと、リポソーム・薬剤・自由治療剤成分中の脂質／治療剤組成とについてＨＰＬＣで解析した。この実施例における予想収量は、約６ｍｇ／ｍｌのカプセル封入されたアレンドロネートと３５ｍｇ／ｍｌの脂質とを含有する１リットルの製剤であった。アレンドロネート濃度の結果に基づいて、最終製剤濃度５ｍｇ／ｍｌまたは０．５ｍｇ／ｍｌの製剤約１リットル分を得るために必要な希釈を算出した。５ｍｇ／ｍｌ製剤を生産するために、限外濾過後のリポソームアレンドロネート約９００ｍｌを上述のように調製した約１００ｍｌのＰＢＳで希釈した。さらに、０．５ｍｇ／ｍｌの製剤を生産するために、限外濾過後のリポソームアレンドロネート約１００ｍｌを約９００ｍｌのＰＢＳで希釈して０．５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。得られたアレンドロネート濃度を測定するためにサンプルを採取した。

標準製剤濃度溶液を作成した後、製剤を収容したボトルを、クラス１００のクリーンルームもしくは生物学的無菌フード内に設置した２枚の連続した０．２μｍの無菌フィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｂｒａｎ Ｐ）に接続した。フィルターは、あらかじめ無菌化されたディスポーザブル受容バッグまたはボトルにあらかじめ組み付けておいた。蠕動ポンプまたは加圧窒素により、濾過を実行した。圧力は、１０ｐｓｉを超えてはならない。濾過終了時に、フィルターの完全性を検査した。

前記実施例において製造したＩＶ（経静脈）注入用リポソームアレンドロネートは、いくつかの望ましい特性を持っていた。たとえば、（ｉ）少なくともアレンドロネートおよび脂質の、５°（２〜８℃の範囲）における３年間の安定性、（ｉｉ）粒子状物質のない平均ベシクル粒径８０±５、（ｉｉｉ）アレンドロン酸ナトリウム濃度５ｍｇ／ｍｌ以下（０．１〜５．０ｍｇ／ｍｌの範囲）、（ｉｖ）アレンドロネートカプセル封入９６％以上、（ｖ）ジステアロイルフォスファチジルコリン／ジステアロイルフォスファチジルグリセロール／コレステロール（ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＣＨＯＬ）の脂質組成３／１／２ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ、（ｖｉ）生理的オスモル濃度２７０〜３４０ｍＯ／ｋｇ、（ｖｉｉ）水とほぼ同等の粘性、すなわち２０℃で約１．０ｍＰａ・ｓの動粘性係数、（ｖｉｉｉ）ｐＨ６．８（６．８〜７．０の範囲）、（ｉｘ）米国または欧州の薬局方に準拠した賦形剤品質の世界的容認性、（ｘ）ＵＳＰ２４−ＮＦ １９において刊行されている無菌状態と発熱物質に対するＵＳＰガイドラインに適合、（ｘｉ）生理的食塩水、注入キット、注射器との適合性（用途）、（ｘｉｉ）フィルター、ステンレススチール管材、ガラス管材との適合性（プロセス）といった特性である。

［リポソームアレンドロネートはヒト以外の霊長類動物において単球を激減させた］単球を激減（deplete枯渇／消耗）させるＬＡの能力をカニクイザルで試験した。特に、２匹のカニクイザルに対して経静脈によるＬＡ０．１ｍｇ／ｋｇの１回投与をもって治療した（ＬＡ１，ＬＡ２）。そこで、全血中のＣＤ１４＋単球の絶対度数および相対度数を、フローサイトメトリーによって、注射後７日間（７ｄ．ｐ．ｉ．）評価した。その結果を図１Ａ〜１Ｂに示す。ＬＡ０．１ｍｇ／ｋｇの経静脈投与を受けたカニクイザルは、注射後１日（１ｄ．ｐ．ｉ．）でＣＤ１４＋単球度数が約５０％の減少を示した。もっとも、図１Ａ〜１Ｂに示すように、ＣＤ１４＋単球度数は２ｄ．ｐ．ｉ．でベースラインレベルまで復帰しているので、この消耗は、一過性のものではある。このように、ＬＡは、ヒト以外の霊長類動物において単球の消耗に効果があることが確認された。

［血液処理］ＥＤＴＡ処置された管（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）内に全血を捕集した。５００μｌのアリコートを用いて、Ｈｏｒｉｂａ／ＡＢＸ Ｐｅｎｔｒａ ６０Ｃ＋（Ｈｏｒｉｂａ、カリフォルニア州アーヴィン）を使用した全血計数（ＣＢＣ）を行った。

［単球／マクロファージのフローサイトメトリー分析］１１色のフローサイトメトリー染色パネルを、表４に示すように、アカゲザルの血液および組織中の単球／マクロファージの分析用に設計し最適化した。

１００μｌの全血または１×１０６の全組織細胞を１×ＰＢＳで２回洗浄し、室温で３０分間表面染色した。そして、全血および脾臓を１ｍｌのＦＡＣＳＬｙｓｅ内で１０分間培養し、８３０×ｇで４分間回転させ、１０％のウシ胎児血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を補充した１×ＰＢＳに入れて３回洗浄した。他の組織細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄して２％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞内染色のために、固定細胞をサポニン１ｍｇ／ｍｌを含有するＦＡＣＳ緩衝液（サポニン緩衝液）で２回洗浄し、室温で１時間染色した。核内染色（ＢｒｄＵおよびＫｉ−６７）のために、固定細胞をサポニン緩衝液と２Ｘ ＢＤ ＦＡＣＳＰｅｒｍの１：１混合液で２回洗浄し、サポニン緩衝液で１回洗浄して、０．５ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉの存在下、室温で１時間染色した。染色後、サンプルをサポニン緩衝液で２回洗浄して、ＢＤ−ＬＳＲＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）にかけた。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．６．４（ＴｒｅｅＳｔａｒ、オレゴン州アシュランド）にて解析した。全ポジティブゲートをｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールチューブを用いて適切なフルオロフォアにセットした。

［リポソームアレンドロネートはヒト以外の霊長類動物において良好な耐用性を示す。］ヒト以外の霊長類モデルでＬＡ治療の安全性を確認した。肝機能の４つの基本測定値（アルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、ビリルビン）の血清中濃度を、それぞれ２種類の異なるＬＡ治療計画のうちの一つで投薬治療中の４体のアカゲザルにおいて監視した。図２Ａ〜２Ｄに、反復的に少量のＬＡ投与を受けたアカゲザル（０．１ｍｇ／ｋｇを経静脈で毎日１週間投与；Ｒｈ２２６１８、Ｒｈ２８４５０）と１回の大量ＬＡ投与を受けたアカゲザル（１０ｍｇ／ｋｇを経静脈投与；Ｒｈ２８４３８、Ｒｈ２９０５４）の血清化学分析を示す。点線は、オレゴン国立霊長類研究センター（Oregon National Primate Research Center）のアカゲザル個体群統計に基づくアルブミン、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、総ビリルビンの血清中濃度の予測される範囲を示している。少量反復注射によるＬＡ投与を受けた動物の血清化学を、０日目、３日目、７日目にサンプリングした。大量注射による１回のＬＡ投与を受けた動物の血清化学は、剖検前に２日間行った。

図２Ａ〜Ｄに示すように、ＬＡの少量反復投与は、肝機能に変化を来すことがなく、大量１回投与は、肝機能に動揺をもたらすことが明らかになった。具体的に、ベースライン測定値とＬＡ後の測定値とを比較すると、ＬＡの少量反復投与を受けた動物（Ｒｈ２２６１８、Ｒｈ２８４５０）の血清化学に有害な変化は見られなかった。Ｒｈ２８４５０においてアルカリホスファターゼがベースラインで高い値をとった（図２Ｃ）ことを例外として、すべての値は、予測範囲内に収まっていた。毎日少量ＬＡ投与を受けた動物とは対照的に、ＬＡを１回大量に投与した動物（Ｒｈ２８４３８、Ｒｈ２９０５４）は、アルブミンの血清中濃度が減少を示し（図２Ａ）、同時に、アラニントランスアミナーゼの濃度上昇が生じた（図２Ｂ）が、アラニントランスアミナーゼ濃度は、予測値の範囲内であった。アルブミンおよびアラニントランスアミナーゼの血清中濃度のこのような変化は、おそらくは肝臓クッパー細胞（Kupffer cells）の消耗（後述）を原因とする、肝臓の活動（exertion）を示している。これらの所見にかかわらず、ＬＡを大量投与した動物にも、ＬＡを量や頻度を問わず投与された動物にもなんらＬＡ治療の臨床的副作用は認められなかった。なお、ＬＡ０．１ｍｇ／ｋｇの経静脈投与が単球消耗に充分有効であったこと（図１Ａ〜Ｂ）および、この量のＬＡ投与がアカゲザルにおいて毎日反復注射した場合であっても安全であったこと（図２Ａ〜Ｄ）は、特記に値するポイントである。したがって、ＬＡは、有効量投与で良好な耐容性を有し、ヒト以外の霊長類動物において単球消耗のために実行可能な新しい技術を構成するものである。

アカゲザルはオレゴン国立霊長類研究センターで飼育されていた。オレゴン健康科学大学の機関動物管理利用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）が、すべての研究プロトコルを審査し、米国保健福祉省実験動物の管理利用指針（U.S. Department of Health and Human Services Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に準拠するものとして承認した。

［代替的な投与量と投与経路でのＬＡ治療はヒト以外の霊長類の他のモデルにおいて単球の減少をもたらす。］図３Ａ〜Ｂに示すように、ＬＡ投与の量と経路を変えることで対照標準に比べアカゲザルにおける単球消耗が多くなることが確認された。３体のアカゲザル（Ｒｈ２４９３７、Ｒｈ２８０３４、Ｒｈ２８０９９）にＬＡを１ｍｇ／ｋｇ、経静脈投与（i.v.）および腹腔内投与（i.p.）の両経路で注射し、１ｄ．ｐ．ｉ．（注射後１日）の間、上述のフローサイトメトリー染色パネルを用いて単球の度数を監視した。２体の対照標準アカゲザル（Ｒｈ２６１１８およびＲｈ２６１４４）に、ホスフェート緩衝食塩水注射で、ＬＡ治療を施した動物と同じ量（体積分）を同じ経路で投与した。単球の数は、ＣＤ４５平均蛍光強度（mean fluorescence intensities：ＭＦＩ）の側方散乱に対する特徴的な分布によって、リンパ球および顆粒球と区別可能であった（図３Ａ）。

図３Ａは、表４に記載したフローサイトメトリー染色パネルを用いて計測した、アカゲザルに１ｍｇ／ｋｇの量のＬＡを１回投与した１日後の単球の度数を、対照標準と対比して示すものである。具体的に、図３Ａは、ＣＤ４５ＭＦＩの側方散乱に対する分布のフローサイトメトリー分析により判定した、ＬＡ治療前後の全血中の単球の度数を示している。ＬＡ治療後、１ｄ．ｐ．ｉ．で単球度数の大幅な減少が、特にＲｈ２８０３４における顕著な消耗が見られた（ベースライン：８．２２％に対して、１ｄ．ｐ．ｉ．：１．７８％）。対照的に、対照標準動物の単球度数は、１ｄ．ｐ．ｉ．においてなお安定している（図３Ａ）。

ＬＡ治療を受けたアカゲザルにおいて確認された単球の消耗をさらに評価するために、単球のサブセット群の数値を求め、最も影響を受けたのがどれかを判定した。前記した３種の単球サブセット（古典的なＣＤ１４＋ＣＤ１６−、中間的なＣＤ１４＋ＣＤ１６＋、非古典的なＣＤ１４−ＣＤ１６＋）［２４］の度数を、ＬＡ治療前後に、単球プール全体の中で比較した。結果を図３Ｂに示す。具体的に、図３Ｂは、表４に記載したフローサイトメトリー染色パネルを用いて計測した、アカゲザルに１ｍｇ／ｋｇの量のＬＡを１回投与した１日後の単球サブセットの度数を、対照標準と対比して示すものである。詳しくは、図３Ｂは、ＣＤ１４＋対ＣＤ１６＋の染色のフローサイトメトリー分析により判定した、ＬＡ治療前後の全血中の単球サブセットの度数を示している。単球サブセット度数の治療前後を比較したとき、顕著な個体間の（animal-to-animal）ばらつきがみられた。重要なことは、ＬＡ治療を受けたアカゲザルが、１ｄ．ｐ．ｉ．で、ほぼすべてのＣＤ１４−ＣＤ１６＋単球の消耗を発現し、その一方で、対照標準のアカゲザルは、１ｄ．ｐ．ｉ．で、同等の単球サブセット度数を維持したことであり、全面的な単球消耗がみられなかったことを根拠づけていることである（図３Ａ〜Ｂ）。

消耗の持続を確認するために、単球の絶対数と度数とを７ｄ．ｐ．ｉ．の間、監視した。その結果を図４Ａ〜Ｄに示す。図中、白抜き記号はＬＡ治療を受けた動物を示し、塗りつぶされた記号は対照標準動物を示す。図４Ａ〜Ｄの上の並びは、ＬＡ治療前後の全血中の絶対単球数を示す。絶対単球数は、ＣＤ１４＋単球および／またはＣＤ１６＋単球の度数を評価し、この値を全白血球数（ＣＤ４５＋細胞）と比較することによって算出した。図４Ａ〜Ｄの下の並びは、フローサイトメトリーで評価した、ＬＡ治療前後の全血中の単球の度数を示す。ＬＡ治療に伴う単球度数の大幅な減少を示すデータと整合し、血液マイクロリットル当たりの単球の絶対数は、１ｄ．ｐ．ｉ．で実質的な減少を示している（図４Ａ、下）。これは、Ｒｈ２８０３４およびＲｈ２８０９９で最も顕著であり、それぞれ、絶対単球数が８７％および８４％減少している。興味深いのは、絶対単球数が、ＬＡ治療後にＣＤ１４＋ＣＤ１６＋単球が保存されたことをも示していることである。これは、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−およびＣＤ１４−ＣＤ１６＋の個体群で単球数の大幅な減少がみられたことと際立った対照をなしている（図４Ａ〜Ｄ、上の並び）。これらＬＡ治療を受けたアカゲザルにおいて見られた単球の消耗は、０．１ｍｇ／ｋｇのＬＡを１回で経静脈投与する治療を受けたカニクイザルにおいて見られた結果同様、極めて一過性の現象であった（図１Ａ〜Ｂ；図４Ａ〜Ｄ、下の並び）。したがって、ＬＡ治療は、大幅な、しかし極めて一過性の、単球消耗を、安全に、アカゲザルに発現させることができるものである。

［ＬＡ治療は組織常在マクロファージの度数を減少させ骨髄単球の度数を増加させる。］上述のように、リポソームアレンドロネートは、ヒト以外の霊長類モデルにおいて、一貫して組織常在マクロファージを消耗させ、骨髄単球発生を誘導する。ヒト以外の霊長類コホートにおけるＬＡ投与後に見られる一貫した単球消耗（図１Ａ〜Ｂ、図４Ａ〜Ｄ）と同時に、組織常在マクロファージおよび骨髄単球の度数の減少が進行するか否かを判定するため、多様な組織を収集し、マクロファージ／単球度数を、１１色フローサイトメトリー染色パネルを用いて（実施例２、表４）、ゲーティング手法により評価した。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、結腸生検組織、肝臓生検組織、骨髄吸引物を、ＬＡ治療前後に、６体のアカゲザルから、後述の組織処置法によって採集した。図５Ａ〜Ｅに、結腸組織に対して表示した、組織（ＭＡＣ３８７＋および／またはＣＤ１６３＋として規定）および骨髄（ＣＤ１６３＋として規定）中のマクロファージの特定のためのゲーティング方法を示す。

ＬＡ治療後のＢＡＬにおいて肺胞マクロファージの度数に変化は見られなかった（データは省略）。図６Ａ〜Ｃに、Ｒｈ２８４５０およびＲｈ２９７２４から採取した代表的な組織常在マクロファージおよび骨髄の骨髄系前駆細胞染色を示す。より特定的に、図６Ａ〜Ｃ（図４Ｂ）は、骨髄吸引液、肝臓、結腸から採取した、ＬＡ治療前後のＣＤ１６３に対するＭＡＣ３８７の染色の比較例を示すものである。ＭＡＣ３８７は、組織常在マクロファージにおいて発現するカルシウム結合骨髄関連タンパク質ＭＲＰ１４を認識する抗体である［２５〜２７］。この染色パネルは、これらの組織中の３つの異なるマクロファージ個体群、すなわちＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３−、ＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３＋、ＭＡＣ３８７−ＣＤ１６３＋を特定している。一般に、図６Ａ〜Ｂに示すように、ＭＡＣ３８７−ＣＤ１６３＋マクロファージは、ＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３−およびＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３＋マクロファージより低い度数で発見された。これら３つの組織マクロファージ個体群をさらに評価するために、それらのＣＤ６８の発現を、すなわち、（組織常在マクロファージにおいても発現する［２６、２８、２９］）糖タンパク質を検査した。具体的に、ＬＡ治療前後のＲｈ２９７２４の結腸から採取したＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３−個体群およびＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３＋個体群におけるＣＤ６８発現を、ＭＡＣ３８７−ＣＤ１６３＋（網掛け部分）と比較した。図６Ｃは、ＬＡ治療前後の、Ｒｈ２９７２４の結腸から採取した３つの個体群のＣＤ６８の発現が、両時点において類似した染色分布をもつものとなったことを示している。また、図６Ｃは、ＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３−マクロファージおよびＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３＋マクロファージがともにＣＤ６８を発現し、後者の個体群が最も高い発現を示したことを示しており、我々のフローサイトメトリーパネルが組織マクロファージを特定することができるものであったことが確認された。このように、前記３つのマクロファージマーカーを用いた、ヒト以外の霊長類動物のＬＡ治療後の組織常在マクロファージの消耗が、ここに、初めて示されている。

骨髄における単球消耗に対するＬＡ治療の有効性を判定するために、分析を敷衍して実施した。血液単球は、骨髄から遊出した後、ＭＡＣ３８７およびＣＤ１６３の両方を発現するので、骨髄においてこれらのマーカーを発現する細胞の度数を、６体のアカゲザルにおいてＬＡ治療前後に、検査した。同様に、肝臓および結腸において組織マクロファージの消耗を評価した。図７Ａに、ＬＡ治療前後の骨髄中のＣＤ１６３＋細胞の度数を示す。図７Ｂに、ＬＡ治療前後の肝臓中の組織常在マクロファージ度数（ベースラインからの百分率変化）を示す。図７Ｃに、ＬＡ治療前後の結腸内の組織常在マクロファージの度数を示す。

骨髄吸引液の染色において、ＭＡＣ３８７＋および／またはＣＤ１６３＋として規定したときの単球の全度数にほとんど変化は現れなかった（データは省略）。しかしながら、骨髄中の顆粒球もＭＡＣ３８７を発現するかもしれないことを想定して、骨髄単球をＣＤ１６３＋として規定する別の分析が実施された［２５］。図７Ａに示すように、骨髄中の単球前駆細胞の生成に顕著な増加がみられた。特に、この分析によって、ＬＡの投与後骨髄単球度数に顕著な増加がみられることが明らかとなった（ｐ＝０．０３１）（図７Ａ）。ＬＡ治療が骨髄単球を消耗させるという初期の仮定にかかわらず、この発見は、全く驚くべきということでもない。というのも、組織マクロファージのＳＩＶに伴う消耗が骨髄からの単球放出を契機として骨髄のターンオーバーを増加させることが示されているからである［３０］。しかし、単球消耗が骨髄で検査の最も早い時点（１ｄ．ｐ．ｉ．）よりも前に起こる可能性を退けることはできない。

図７Ｂ〜Ｃに示すように、組織常在マクロファージ度数は、ＬＡ治療により減少した。図７Ｂは、肝臓における顕著な減少を示している。図７Ｃは、５体中４体のアカゲザルで結腸マクロファージの減少があったことを示しているが、１体が結腸マクロファージ度数の増加を示しているので、それは、有意とはいえない。特に、肝臓のマクロファージ度数は、６体中５体の被験動物においてＬＡ治療後に４５％を超える減少を示した（ｐ＝０．０３１、図４Ｄ、左側パネル）。図７Ａ〜Ｃのための有意検定は、すべて、ウィルコクソン符号付検定によった。クッパー細胞が人体中の組織マクロファージの８０〜９０％を占めると仮定すると、この結果は、組織マクロファージ消耗におけるＬＡの有効性を強調するものである［３１］。肝臓における消耗したマクロファージの大部分がＭＡＣ３８７＋ＣＤ１６３−であったことに留意することは重要である（図７Ｂ、データ省略）。この同じ趨勢は、結腸においても見られ、全マクロファージ度数が、５体の動物中４体（Ｒｈ２２６１８はＬＡ前のマクロファージ度数が検出できなかったため分析から除外した）で４５％を超える減少となった（ｐ＝０．６２５）。結腸においては、しかしながら、消耗は、３つのマクロファージ個体群により均等に分布した（図７Ｃ、データ省略）。驚くべきことに、動物のうちの１体（Ｒｈ２７５０８）は、結腸のマクロファージ度数が大幅な上昇を示した。しかし、この動物は、同時に、骨髄のＣＤ１６３＋単球の前記した増大と、絶対単球数の８０％を超える減少と、肝臓のマクロファージ度数の５０％を超える減少を示しており、ＬＡ治療の直接的効果を示す多くの証拠を提供するものであった（図７Ｂ〜Ｃ）。したがって、結腸マクロファージ度数の増加が、この動物のＬＡに伴う消耗後の異なる骨髄細胞ターンオーバー動態の結果であるという可能性を除外することはできない。

［組織処理］気管支肺胞洗浄液を７０μｍストレーナーで濾過した。骨髄を８３０×ｇで４分間の遠心法でペレット化してから、再懸濁させ、２ｍＭのＥＤＴＡを含む１×ＰＢＳに入れて激しく振盪して大きな細胞塊を分離した。細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｒ１０）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ユタ州ローガン）に入れて２度洗浄した。リンパ節および脾臓を小刀で刻み、７０μｍ細胞ストレーナーですりつぶした。ストレーナーをＲ１０で繰り返しすすぎ、単細胞懸濁液を得た。結腸および肝臓を５ｍｍ^３の小片に切断し、その小片を、約２５〜３０個、３％ウシ胎児血清を追加したＲＰＭＩ−１６４０（Ｒ３）２５ｍｌが入った５０ｍｌの円錐容器中に配置した。ジチオスレイトールを加え、２００μＭの最終濃度とし、組織を室温で１５分間、２２５ｒｐｍで振盪した。組織を沈降させ、ＤＴＴを添加したＲ３を吸引して、５ｍＭのＥＤＴＡを含むＲ３に置換した。組織は、３７℃で３０分間、２２５ｒｐｍで振盪し、上澄み液を含む細胞を回収して細胞ストレーナーを通した。ＥＤＴＡを含むＲ３を再び追加して、組織を振盪し、細胞を回収した。組織を１×ハンクス液の中で２度洗浄し、過剰ＥＤＴＡを除去してから、０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）および０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス）を含むＲ３の中に懸濁させた。組織は、３７℃で４５分間、２２５ｒｐｍで振盪し、上澄み液を含む細胞を回収して、７０μｍ細胞ストレーナーに通した。コラゲナーゼおよびＤＮアーゼＩを含むＲ３を再び追加し、組織を振盪し、細胞を回収した。ＥＤＴＡから回収した細胞分画とコラゲナーゼ温浸を合わせ（全組織）、３０％の等張パーコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国バッキンガムシャー）中に再懸濁させた。そして、細胞は、６０％／４０％パーコール勾配で積層させ、ブレーキオフ（brake off）で、５００ｘｇで回転させた。下界面（lower interface）からの単核細胞を回収し、Ｒ１０に入れて洗浄した。

［５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）でＬＡ治療後の単球ターンオーバーを示す］前記データにより示したように、単球は、ＬＡ治療後一貫して検出されたが、その単球が、骨髄からの新たな遊走細胞なのか、それとも単に元の細胞プールにあった残部にすぎないのかは、データからはわからない。ＣＤ１６３^＋骨髄単球の度数上昇は、血液単球ターンオーバーがＬＡ治療後に悪化されることを示唆していた。単球ターンオーバーのより詳細な特徴づけを提供し、消耗という結果を根拠づけ、総血液単球消耗のよりよい算出を可能にするため、ＬＡ治療は、ＢｒｄＵ投与と同時に行うよう設計および実行することで、ヒト以外のこの霊長類モデルにおける単球ターンオーバーのレベルを確認した。

ＢｒｄＵは、Ｓフェーズ中に***細胞のＤＮＡに組み込まれる合成チミジン類似体であり、細胞内抗体染色によって検出することができる［３２、３３］。骨髄中の***単球前駆細胞は、単球として血液中に放出される前にＢｒｄＵを取り込む。骨髄からの放出後、単球および組織常在マクロファージはほとんど***することがないことが、ＢｒｄＵを骨髄細胞ターンオーバーの信頼できるマーカーたらしめている［３０］。

単球ターンオーバーを評価するために、２体のアカゲザルＲｈ２８４３８およびＲｈ２９０５４にＬＡ１０ｍｇ／ｋｇを経静脈投与するとともに、ＢｒｄＵ６０ｍｇ／ｋｇを経静脈投与した。対照標準動物Ｒｈ３１５７７には、リン酸緩衝生理食塩水とともに、同量６０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵを投与した。ＢｒｄＵは、ＨＢＳＳ（ハンクス液）（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ユタ州ローガン）中に１０ｍｇ／ｍｌで懸濁させた。ＢｒｄＵ６０ｍｇ／ｋｇを２〜３ｍｌ／分の速度で経静脈（伏在静脈）注射した。図８Ａ〜Ｃから、ＬＡ治療後の単球消耗および高単球ターンオーバーが明らかである。ＬＡ治療は、血液単球の大部分を、ＣＤ４５染色の側方散乱に対する分布によって評価される度数（図８Ａ）と、絶対単球数（図８Ｂ）とに基づいて消耗させた。ＢｒｄＵ染色（図８Ｃ）は、ＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻（古典）単球個体群およびＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻（中間）単球個体群の両方でＬＡ治療後の単球ターンオーバーのレベルが高いことを明らかにした。示されている値は、ＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻（古典）個体群およびＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋（中間）個体群のＢｒｄＵに対してポジティブに染色されるものの合計の百分率を表している。ＬＡ治療後の単球ターンオーバーのレベルを判定するため、２体のアカゲザル（Ｒｈ２８４３８およびＲｈ２９０５４）に１０ｍｇ／ｋｇのＬＡを、６０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵとともに経静脈注射し、２ｄ．ｐ．ｉ．の間、ＢｒｄＵ^＋およびＲｒｄＵ⁻の単球度数を監視した。対照標準動物Ｒｈ３１５７７に、リン酸緩衝生理食塩水とともに、同量６０ｍｇ／ｋｇのＢｒｄＵを投与した。図８Ａに示すように、Ｒｈ２８４３８およびＲｈ２９０５４におけるＬＡ治療が、再び、１ｄ．ｐ．ｉ．で単球の度数の深刻な減少をもたらした。意外なことに、対照標準動物Ｒｈ３１５７７でも、小幅ではあるが、単球の減少を示した。

Ｒｈ３１５７７において単球度数の減少がみられた（図８Ａ）ことを考慮し、この動物が実際に適切な対象標準であったかを確認するため、全３体のアカゲザルにおいて、絶対単球数をＬＡ治療前後に評価した。予想に違わず、図８Ｂに示すように、ＬＡ治療された動物では単球数の大幅な減少がみられたが、Ｒｈ３１５７７の単球数は、リン酸緩衝生理食塩水注射後変化しなかった。

骨髄からの単球の遊出（ＢｒｄＵ^＋）を、ＬＡ治療対象動物を対照標準と比較することによって監視した（図８Ｃ）。興味深いことに、ＬＡ治療対象動物では、対照標準動物に比べて、１ｄ．ｐ．ｉ．で、ＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻ＢｒｄＵ^＋単球の度数が高値を示し、Ｒｈ２８４３８においてＢｒｄＵに対してポジティブな染色となったＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻単球の半数を超えた（図８Ｃ、左側パネル）。また、図８Ｃには、ＬＡ治療を受けた動物は１ｄ．ｐ．ｉ．においてＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋単球の１０％以上が、ＢｒｄＵに対してポジティブに染色され、１ｄ．ｐ．ｉ．でＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋ＢｒｄＵ^＋単球がゼロの対照標準動物Ｒｈ３１５７７とは鋭い対照をなしていることも示されている。急性の炎症は、患部組織に単球が入ってマクロファージに分化するため単球ターンオーバーの増加をもたらす［３４］。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染したアカゲザルの場合、単球のターンオーバーは、ＡＩＤＳへの進行の有力な予測指標である［３０］。同様に、高レベルの単球ターンオーバーは、アカゲザルにおけるＳＩＶ誘発脳炎の重篤度と相関している［３５］。刮目すべきは、ＬＡ治療を受けた動物において１ｄ．ｐ．ｉ．で見られた単球ターンオーバーのレベルが、ＳＩＶ感染したアカゲザル（重篤な脳炎を急速に進行させている個体群を含む）において見られるのと同様もしくはそれ以上であったということである［３０、３５］。このように、ＬＡ治療が血液単球ターンオーバーを増加させ、骨髄単球生成と血液単球消耗の増加というデータを根拠づける知見である。また、血液単球ターンオーバーのこれらのレベルは、著しい単球のターンオーバーが見られる進行ＳＩＶ感染に匹敵するものである。

［単球とマクロファージに対するＬＡの効果の概要］
このように、ＬＡがヒト以外の霊長類モデルにおける単球および組織マクロファージの消耗の安全かつ効果的な手段であることが、示されるのは初めてである。肝要なのは、ＣＤ１４^＋ＣＤ１６⁻単球およびＣＤ１４⁻ＣＤ１６^＋単球がＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋サブセットと比較して強い消耗を示すという、選択的な単球サブセットの消耗が、ここに、初めて実証されているということである。ＬＡの投与は、一貫して、肝臓および結腸における絶対単球数および組織マクロファージ度数を減少させた。この消耗は、骨髄における単球生成の著しい増加と関連付けられたのであり、ＤＮＡ ＢｒｄＵ組み込みによって測定される血液中の単球ターンオーバー増加によって根拠づけられる知見である。

ＬＡ媒介単球消耗は、ヒト以外の被験霊長類すべてにおいて高度に一過性の現象であったが、この知見は、ウサギやネズミやヒト（ＬＡ単球消耗はやはり一過性である）を対象とした先行研究において完全に根拠づけられる。重要なことは、一過性の単球消耗が、たとえば、ＬＡ治療後の再狭窄や子宮内膜症の発生減少として実証されている［２３、３６、３７］ような、深刻かつ持続的な抗炎症効果を誘発することが示されているということである。したがって、ヒト以外の霊長類へのＬＡ投与の有用性は、単球消耗のタイムフレームを充分に超えて拡張することができる。

肝臓および結腸とは対照的に、肺においては、ＬＡ治療後に、肺胞マクロファージの消耗は検出されなかった。この相違の理由は、明らかではないが、理論にとらわれずにいえば、肺におけるＬＡの生体内分布もしくはマクロファージターゲティングによるものかもしれない。肺に多数のマクロファージがある（肺免疫細胞の約７０％）と想定すれば、経静脈または腹腔内注射後に肺に到達するＬＡの量が検出可能な細胞数を消耗させるには充分でない可能性がある［３８］。また、全身浸透性ＬＡ投与（経静脈および腹腔内投与）が、肝臓に残った少量のＬＡが血管を通して運ばれることを想定すれば、肺の粘膜表面で肺胞マクロファージの消耗を阻害するかもしれない。このＬＡは、間質マクロファージのような、交互肺組織マクロファージに遭遇し、それを標的とする可能性があるだろう。

マクロファージの主要な２つの個体群がアカゲザルの組織で観察された。すなわち、ＭＡＣ３８７^＋ＣＤ１６３^＋およびＭＡＣ３８７^＋ＣＤ１６３⁻である。しかし、ヒトにおいては、ＭＡＣ３８７^＋マクロファージは、Ｍ１様（M1-like）と特徴記載され、ＣＤ１６３^＋マクロファージはＭ２様（M2-like）と特徴記載され、同じ細胞上でこれらのマーカーを共通に表現する表現は、ほとんど、ないし、まったく存在しない。ＭＡＣ３８７^＋ＣＤ１６３^＋組織マクロファージのこのような同定を根拠づけるものとして、アカゲザルにおける最近の研究が、肺常在マクロファージの異なる個体群により表現されるマーカーを、包括的に特徴記載しており、血液単球および間質マクロファージがともに高レベルのＭＡＣ３８７およびＣＤ１６３を共通に表現するものであることを示している［３８］。ＭＡＣ３８７^＋ＣＤ１６３^＋間質マクロファージが古典的マクロファージ活性化信号（ＩＦＮγおよびＬＰＳ）に応答することを、この細胞集団の機能分析が明らかにした。したがって、ＭＡＣ３８７^＋ＣＤ１６３^＋マクロファージはアカゲザルの脳組織にはほとんど見られない［２６］ので、解剖学的部位がこれらのマーカーの表現に影響を与えるかもしれないとはいえ、ＭＡＣ３８７^＋ＣＤ１６３^＋は、マクロファージのＭ１様個体群を定義するもののようである。

ここで行った分析においては、単球とマクロファージの特定用にそれぞれ血液および組織に汎用的に使用されていた１１色フローサイトメトリー染色パネルの設計が役に立った。前記実施例２、表４参照。研究は、Ｕ９３７などのマクロファージ細胞株と生体外単球由来マクロファージとに多くを依拠しているが、これらは、組織常在マクロファージの複雑性を真に要約するものではないかもしれない［４２〜４４］。フローサイトメトリーによる組織常在マクロファージの評価は、生きている細胞を分類するという利点があり、従来の免疫組織化学染色技法や免疫蛍光検定染色技法によっては提供されない技術である。生理学的プロセスにおいてマクロファージが非常に多くの役割を担っていることを考慮に入れれば、マクロファージに対し、直接、生体外で、機能分析検査を実行することができるということは、多くの研究分野を越境した含意を有する。

ヒト以外の霊長類は、ヒトの生態の強力なモデルを提供する。ここで、ヒト以外の霊長類モデルは、単球およびマクロファージが実験的にＬＡの投与によって消耗可能であることを初めて示すことによって、先進的モデルとなっている。ヒト以外の霊長類におけるＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の消耗により得られた科学的見識［８〜１３］を念頭に置けば、ここに記載した技術がヒト以外の霊長類モデルをさらに強化するものであり、血液単球および組織マクロファージの多くの生理的プロセスの研究に独自の手段を提供するものであることは確かである。

［実施例７−ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療プロトコル］
ＨＡＡＲＴ休止後の血漿ウイルス量および末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞数に対するリポソームアレンドロネートの効果を動物モデルにおいて評価した。具体的に、ＨＩＶリザーバーを減少ないし消耗させるＬＡの能力を、ＡＩＤＳのインドアカゲザルモデルにおいて検査した。アカゲザルは、ＡＩＤＳ研究では広く利用されてきており、この種は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳに対するヒト以外の霊長類モデルとして最良の特徴を備えたものの一つである。（Pereira, L.E. et al., Immunodeficiency, Ch. 15参照、http://dx.doi.org/10.5772/53556にて入手可能。）２体のアカゲザル（macaques）をハイブリッド型サル／ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）に感染させ、血漿ウイルス量および末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞数が長期的に追跡された。この研究で使用されたＳＨＩＶであるＳＨＩＶ ＤＨ１２のクローン７は、ヒトにおけるＨＩＶ感染の後慢性期と同様に、全身的にＣＤ４^＋Ｔ細胞を消耗させてからマクロファージにおいて複製を開始する。図９および１０に示すように、動物は、ウイルスがマクロファージの中で複製を開始するＳＨＩＶ感染後８週間近くから始まるウイルス複製を抑制するため、ＨＡＡＲＴを施された。

ＬＡは、実施例１に記載したプロトコルに沿って調製された。

ＨＡＡＲＴ期間中の本発明による製剤の効果を検査するため、１体の動物に、１ｍｇ／ｋｇ（体重）のＬＡを経静脈投与し、対照標準としての他の１体の動物にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経静脈注射した。この投与のタイミングは、図９および１０において矢印で表してある。この投与に続けて、さらに１．５週間の間、つまり感染後１５週近くになるまでＨＡＡＲＴを継続することで、ＬＡを媒介とする標的細胞の消耗によりマクロファージ区画の循環（cycling）中の当該標的細胞を保護した。前記２体の動物の血漿ウイルス量および末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞数を、感染から感染後約２０週間になるまで定期的に監視した。

血漿ウイルス量（viral loads：「ＶＬ」）、すなわち、血液中の自己複製するＨＩＶの量を、血漿のｍＬ当たりのウイルスＲＮＡコピー数を計測することによって評価した。計測は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ研究における従来からある検定法であり、Friedrich, T.C. et al., “Subdominant CD8+ T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication.” J. VIROLOGY, 81(7): 3465-76 (2007) に記載されているプロトコルにしたがって行われた。

図９に、ＳＨＩＶ感染したアカゲザル（macaque）のＶＬに対する、経静脈注射したＬＡの効果を、ＳＨＩＶ感染したアカゲザル（macaque）にプラセボ（経静脈投与ＰＢＳ）対照標準を投与した場合と比較して示す。ＶＬは、血漿の１ｍＬ当たりのウイルスＲＮＡコピーとして示されている。網掛け領域は、ＨＡＡＲＴ療法の継続期間を表し、矢印は、リポソームアレンドロネートを投与する時点を指している。特に、図９は、研究全体の過程を通じてのウイルス量の動態と大きさを示している。両動物とも、ＨＡＡＲＴ休止後最初の週の内に自己複製ウイルスが増加したが、ＬＡ治療を施した動物は、血漿ウイルス量が一貫して１〜２ｌｏｇの減少を示しており、対照標準動物が感染後少なくとも２０週までだったのと対照をなしている。

末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞の数は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの重篤度を反映し、少数であるほどより高度のＨＩＶ自己複製が進んでおり免疫系への損傷も大きいことを示す。末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞数は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ研究における従来からある検定法において計測することができるが、この実施例では、Friedrich, T.C. et al., “Subdominant CD8+ T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication.” J. VIROLOGY, 81(7): 3465-76 (2007) に記載されているプロトコルにしたがって計測した。

図１０に、ＳＨＩＶ感染したアカゲザル（macaque）の末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞数に対する、経静脈注射したＬＡの効果を、ＳＨＩＶ感染したアカゲザル（macaque）にプラセボとして経静脈ＰＢＳ（対照標準）投与した場合と比較して示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞数は、血液μＬ当たりのＣＤ４^＋Ｔ細胞の数で示してある。網掛け領域は、ＨＡＡＲＴ療法の継続期間を表し、矢印は、リポソームアレンドロネートを投与する時点を指している。特に、図１０は、研究全体の過程を通じてのＣＤ４^＋Ｔ細胞数の変化を示している。両動物のＣＤ４^＋Ｔ細胞は、ＳＨＩＶ感染後急速に減少し、２週間後には、ほぼ枯渇した。両動物は、ともに抗ウイルス療法開始後の末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞数の増加は限定的だった。図１０に示すように、ＬＡ治療を施した動物には、ＬＡ投与後の末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞数の顕著なリバウンドがあり、リバウンドは、少なくとも約５週間は続いた。ＬＡ治療を施さなかった対照標準動物は、研究を通じて、末梢ＣＤ４^＋Ｔ細胞のレベルは最小値を維持した。

当該技術分野における熟練技術者であれば、諸実施形態によって本稿に具体的に示され記載された内容に対して、本発明の趣旨または範囲を逸脱することなく、多くの変形、追加、修正、他の応用が可能であることを理解するであろう。したがって、下記の特許請求の範囲に記載した本発明の範囲は、すべての予見可能な変形、追加、修正、応用を含むものであることが意図されている。

［参考文献］
１．Pollard, J. W. (2009) Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol 9, 259-270.
２．Schneemann, M., Schoeden, G. (2007) Macrophage biology and immunology: man is not a mouse. J Leukoc Biol 81, 579; discussion 580.
３．Murray, P. J., Wynn, T. A. (2011) Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. J Leukoc Biol 89, 557-563.
４．Haigwood, N. L. (2009) Update on animal models for HIV research. Eur J Immunol 39, 1994-999.
５．Yang, S. H., Cheng, P. H., Banta, H., Piotrowska-Nitsche, K., Yang, J. J., Cheng, E. C., Snyder, B., Larkin, K., Liu, J., Orkin, J., Fang, Z. H., Smith, Y., Bachevalier, J., Zola, S. M., Li, S. H., Li, X. J., Chan, A. W. (2008) Towards a transgenic model of Huntington’s disease in a non-human primate. Nature 453, 921-924.
６．Sacha, J. B., Kim, I. J., Chen, L., Ullah, J. H., Goodwin, D. A., Simmons, H. A., Schenkman, D. I., von Pelchrzim, F., Gifford, R. J., Nimityongskul, F. A., Newman, L. P., Wildeboer, S., Lappin, P. B., Hammond, D., Castrovinci, P., Piaskowski, S. M., Reed, J. S., Beheler, K. A., Tharmanathan, T., Zhang, N., Muscat-King, S., Rieger, M., Fernandes, C., Rumpel, K., Gardner, J. P., Gebhard, D. H., Janies, J., Shoieb, A., Pierce, B. G., Trajkovic, D., Rakasz, E., Rong, S., McCluskie, M., Christy, C., Merson, J. R., Jones, R. B., Nixon, D. F., Ostrowski, M. A., Loudon, P. T., Pruimboom-Brees, I. M., Sheppard, N. C. (2012) Vaccination with Cancer- and HIV Infection-Associated Endogenous Retrotransposable Elements Is Safe and Immunogenic. J Immunol 189, 1467-1479.
７．Tachibana, M., Sparman, M., Sritanaudomchai, H., Ma, H., Clepper, L., Woodward, J., Li, Y., Ramsey, C., Kolotushkina, O., Mitalipov, S. (2009) Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature 461, 367-372.
８．Choi, E. I., Reimann, K. A., Letvin, N. L. (2008) In vivo natural killer cell depletion during primary simian immunodeficiency virus infection in rhesus monkeys. J Virol 82, 6758-6761.
９．Friedrich, T. C., Valentine, L. E., Yant, L. J., Rakasz, E. G., Piaskowski, S. M., Furlott, J. R., Weisgrau, K. L., Burwitz, B., May, G. E., Leon, E. J., Soma, T., Napoe, G., Capuano, S. V., Wilson, N. A., Watkins, D. I. (2007) Subdominant CD8+ T-cell responses are involved in durable control of AIDS virus replication. J Virol 81, 3465-3476.
１０．Ortiz, A. M., Klatt, N. R., Li, B., Yi, Y., Tabb, B., Hao, X. P., Sternberg, L., Lawson, B., Carnathan, P. M., Cramer, E. M., Engram, J. C., Little, D. M., Ryzhova, E., Gonzalez-Scarano, F., Paiardini, M., Ansari, A. A., Ratcliffe, S., Else, J. G., Brenchley, J. M., Collman, R. G., Estes, J. D., Derdeyn, C. A., Silvestri, G. (2011) Depletion of CD4(+) T cells abrogates post-peak decline of viremia in SIV-infected rhesus macaques. J Clin Invest 121, 4433-4445.
１１．Haberthur, K., Engelmann, F., Park, B., Barron, A., Legasse, A., Dewane, J., Fischer, M., Kerns, A., Brown, M., Messaoudi, I. (2011) CD4 T cell immunity is critical for the control of simian varicella virus infection in a nonhuman primate model of VZV infection. PLoS Pathog 7, e1002367.
１２．Hansen, S. G., Powers, C. J., Richards, R., Ventura, A. B., Ford, J. C., Siess, D., Axthelm, M. K., Nelson, J. A., Jarvis, M. A., Picker, L. J., Fruh, K. (2010) Evasion of CD8+ T cells is critical for superinfection by cytomegalovirus. Science 328, 102-106.
１３．Gordon, S. N., Cecchinato, V., Andresen, V., Heraud, J. M., Hryniewicz, A., Parks, R. W., Venzon, D., Chung, H. K., Karpova, T., McNally, J., Silvera, P., Reimann, K. A., Matsui, H., Kanehara, T., Shinmura, Y., Yokote, H., Franchini, G. (2011) Smallpox vaccine safety is dependent on T cells and not B cells. J Infect Dis 203, 1043-1053.
１４．Van Rooijen, N., Sanders, A. (1994) Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J Immunol Methods 174, 83-93.
１５．Gutman, D., Golomb, G. (2012) Liposomal alendronate for the treatment of restenosis. J Control Release 161, 619-627.
１６．van Rooijen, N., Hendrikx, E. (2010) Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol Biol 605, 189-203.
１７．Epstein-Barash, H., Gutman, D., Markovsky, E., Mishan-Eisenberg, G., Koroukhov, N., Szebeni, J., Golomb, G. (2010) Physicochemical parameters affecting liposomal bisphosphonates bioactivity for restenosis therapy: internalization, cell inhibition, activation of cytokines and complement, and mechanism of cell death. J Control Release 146, 182-195.
１８．Epstein, H., Gutman, D., Cohen-Sela, E., Haber, E., Elmalak, O., Koroukhov, N., Danenberg, H. D., Golomb, G. (2008) Preparation of alendronate liposomes for enhanced stability and bioactivity: in vitro and in vivo characterization. AAPS J 10, 505-515.
１９．Kim, W. K., Sun, Y., Do, H., Autissier, P., Halpern, E. F., Piatak, M. J., Lifson, J. D., Burdo, T. H., McGrath, M. S., Williams, K. (2010) Monocyte heterogeneity underlying phenotypic changes in monocytes according to SIV disease stage. J Leukoc Biol 87, 557-567.
２１．Danenberg, H. D., Fishbein, I., Epstein, H., Waltenberger, J., Moerman, E., Monkkonen, J., Gao, J., Gathi, I., Reichi, R., Golomb, G. (2003) Systemic depletion of macrophages by liposomal bisphosphonates reduces neointimal formation following balloon-injury in the rat carotid artery. J Cardiovasc Pharmacol 42, 671-679.
２２．van Beek, E. R., Cohen, L. H., Leroy, I. M., Ebetino, F. H., Lowik, C. W., Papapoulos, S. E. (2003) Differentiating the mechanisms of antiresorptive action of nitrogen containing bisphosphonates. Bone 33, 805-811.
２３．Banai, S., Finkelstein, A., Almagor, Y., Assali, A., Hasin, Y., Rosenschein, U., Apruzzese, P., Lansky, A. J., Kume, T., Edelman, E. R. (2013) Targeted anti-inflammatory systemic therapy for restenosis: the Biorest Liposomal Alendronate with Stenting sTudy (BLAST)-a double blind, randomized clinical trial. Am Heart J 165, 234-40.e1.
２４．Ziegler-Heitbrock, L., Ancuta, P., Crowe, S., Dalod, M., Grau, V., Hart, D. N., Leenen, P. J., Liu, Y. J., MacPherson, G., Randolph, G. J., Scherberich, J., Schmitz, J., Shortman, K., Sozzani, S., Strobl, H., Zembala, M., Austyn, J. M., Lutz, M. B. (2010) Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood 116, e74-e80.
２５．Goebeler, M., Roth, J., Teigelkamp, S., Sorg, C. (1994) The monoclonal antibody MAC387 detects an epitope on the calcium-binding protein MRP14. J Leukoc Biol 55, 259-261.
２６．Soulas, C., Conerly, C., Kim, W. K., Burdo, T. H., Alvarez, X., Lackner, A. A., Williams, K. C. (2011) Recently infiltrating MAC387(+) monocytes/macrophages a third macrophage population involved in SIV and HIV encephalitic lesion formation. Am J Pathol 178, 2121-2135.
２７．Williams, D. W., Eugenin, E. A., Calderon, T. M., Berman, J. W. (2012) Monocyte maturation, HIV susceptibility, and transmigration across the blood brain barrier are critical in HIV neuropathogenesis. J Leukoc Biol 91, 401-415.
２８．Mansfield, K., Lang, S. M., Gauduin, M. C., Sanford, H. B., Lifson, J. D., Johnson, R. P., Desrosiers, R. C. (2008) Vaccine protection by live, attenuated simian immunodeficiency virus in the absence of high-titer antibody responses and high-frequency cellular immune responses measurable in the periphery. J Virol 82, 4135-4148.
２９．Rogler, G., Hausmann, M., Vogl, D., Aschenbrenner, E., Andus, T., Falk, W., Andreesen, R., Scholmerich, J., Gross, V. (1998) Isolation and phenotypic characterization of colonic macrophages. Clin Exp Immunol 112, 205-215.
３０．Hasegawa, A., Liu, H., Ling, B., Borda, J. T., Alvarez, X., Sugimoto, C., Vinet-Oliphant, H., Kim, W. K., Williams, K. C., Ribeiro, R. M., Lackner, A. A., Veazey, R. S., Kuroda, M. J. (2009) The level of monocyte turnover predicts disease progression in the macaque model of AIDS. Blood 114, 2917-2925.
３１．Bilzer, M., Roggel, F., Gerbes, A. L. (2006) Role of Kupffer cells in host defense and liver disease. Liver Int 26, 1175-1186.
３２．Bischoff, R., Holtzer, H. (1970) Inhibition of myoblast fusion after one round of DNA synthesis in 5-bromodeoxyuridine. J Cell Biol 44, 134-150.
３３．Gunduz, N. (1985) The use of FITC-conjugated monoclonal antibodies for determination of S-phase cells with fluorescence microscopy. Cytometry 6, 597-601.
３４．Van Furth, R., Diesselhoff-den Dulk, M. C., Mattie, H. (1973) Quantitative study on the production and kinetics of mononuclear phagocytes during an acute inflammatory reaction. J Exp Med 138, 1314-1330.
３５．Burdo, T. H., Soulas, C., Orzechowski, K., Button, J., Krishnan, A., Sugimoto, C., Alvarez, X., Kuroda, M. J., Williams, K. C. (2010) Increased monocyte turnover from bone marrow correlates with severity of SIV encephalitis and CD163 levels in plasma. PLoS Pathog 6, e1000842.
３６．Danenberg, H. D., Golomb, G., Groothuis, A., Gao, J., Epstein, H., Swaminathan, R. V., Seifert, P., Edelman, E. R. (2003) Liposomal alendronate inhibits systemic innate immunity and reduces in-stent neointimal hyperplasia in rabbits. Circulation 108, 2798-2804.
３７．Haber, E., Afergan, E., Epstein, H., Gutman, D., Koroukhov, N., Ben-David, M., Schachter, M., Golomb, G. (2010) Route of administration-dependent anti-inflammatory effect of liposomal alendronate. J Control Release 148, 226-233.
３８．Cai, Y., Sugimoto, C., Arainga, M., Alvarez, X., Didier, E. S., Kuroda, M. J. (2014) In vivo characterization of alveolar and interstitial lung macrophages in rhesus macaques: implications for understanding lung disease in humans. J Immunol 192, 2821-2829.
３９．Harker, J. A., Yamaguchi, Y., Culley, F. J., Tregoning, J. S., Openshaw, P. J. (2014) Delayed sequelae of neonatal respiratory syncytial virus infection are dependent on cells of the innate immune system. J Virol 88, 604-611.
４０．Hartwig, S. M., Holman, K. M., Varga, S. M. (2014) Depletion of Alveolar Macrophages Ameliorates Virus-Induced Disease following a Pulmonary Coronavirus Infection. PLoS One 9, e90720.
４１．Zaynagetdinov, R., Sherrill, T. P., Kendall, P. L., Segal, B. H., Weller, K. P., Tighe, R. M., Blackwell, T. S. (2013) Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. Am J Respir Cell Mol Biol 49, 180-189.
４２．Berger, G., Durand, S., Fargier, G., Nguyen, X. N., Cordeil, S., Bouaziz, S., Muriaux, D., Darlix, J. L., Cimarelli, A. (2011) APOBEC3A Is a Specific Inhibitor of the Early Phases of HIV-1 Infection in Myeloid Cells. PLoS Pathog 7, e1002221.
４３．Sacha, J. B., Giraldo-Vela, J. P., Buechler, M. B., Martins, M. A., Maness, N. J., Chung, C., Wallace, L. T., Leon, E. J., Friedrich, T. C., Wilson, N. A., Hiraoka, A., Watkins, D. I. (2009) Gag- and Nef-specific CD4+ T cells recognize and inhibit SIV replication in infected macrophages early after infection. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 9791-9796.
４４．Song, E., Lee, S. K., Dykxhoorn, D. M., Novina, C., Zhang, D., Crawford, K., Cerny, J., Sharp, P. A., Lieberman, J., Manjunath, N., Shankar, P. (2003) Sustained small interfering RNA-mediated human immunodeficiency virus type 1 inhibition in primary macrophages. J Virol 77, 7174-7181.

Claims (18)

1. ビスホスホネートを有効量、それを必要とする個体に、抗ウイルス療法を補助するものとして投与することを含むＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療または管理のための、ビスホスホネートを含む製剤であって、０．０３〜１．０ミクロンの範囲の粒径を有する製剤。
2. 前記ビスホスホネートが、前記製剤粒子にカプセル封入されていることを特徴とする請求項１の製剤。
3. カプセル封入している前記製剤粒子がリポソームであることを特徴とする請求項２の製剤。
4. 前記ビスホスホネートが、前記製剤粒子に包埋されていることを特徴とする請求項１の製剤。
5. 包埋している前記製剤粒子が、微粒子、ナノ粒子、ミクロスフェア、ナノスフェアからなるグループから選択されることを特徴とする請求項４の製剤。
6. 前記製剤粒子が粒子形態のビスホスホネートであることを特徴とする請求項１の製剤。
7. 前記粒子形態が、集合体、凝集体、コロイド、ポリマー鎖、不溶性塩、不溶性錯体からなるグループから選択されることを特徴とする請求項６の製剤。
8. 前記ビスホスホネートが、式（Ｉ）の化合物を含む請求項１〜７のいずれか一項の製剤。
   
   ［ここで、Ｒ_１は、Ｈ、ＯＨまたはハロゲン基であり、
   Ｒ_２は、
   ハロゲン、または、
   直鎖または側鎖のＣ_１−Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２−Ｃ_１０アルケニル（任意選択的にヘテロアリールまたはヘテロシクリルＣ_１−Ｃ_１０アルキルアミノまたはＣ_３−Ｃ_８シクロアルキルアミノによって置換される）、または、
   −ＮＨＹ（ここでＹは水素、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールである）、または、
   −ＳＺ（ここでＺはクロロ置換フェニルまたはピリジニルである）である。］
9. 前記ビスホスホネートが、クロドロネート、エチドロネート、チルドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、リセンドロネートからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の製剤。
10. 前記ビスホスホネートが窒素ビスホスホネートであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項の製剤。
11. 前記ビスホスホネートがアレンドロネートであることを特徴とする請求項１０の製剤。
12. 前記製剤粒子が０．０７〜０．１５ミクロンの粒径を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの製剤。
13. 前記ビスホスホネート製剤が、前記抗ウイルス療法中に投与されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの製剤。
14. 前記ビスホスホネート製剤が前記抗ウイルス療法の中断前の短期間内に投与され、当該短期間が、３日間、５日間、７日間、１０日間からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３の製剤。
15. 前記ビスホスホネート製剤が、前記抗ウイルス療法の中断中に、または、前記抗ウイルス療法中と前記抗ウイルス療法中断中の両方で、投与されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの製剤。
16. 前記抗ウイルス療法が高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）であることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項の製剤。
17. 前記投与が、経静脈、経動脈、筋肉内、皮下、経口からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１〜１６のいずれかの製剤。
18. 前記製剤が、さらに、非ビスホスホネート治療剤を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれかの製剤。