JP6569662B2 - 新規タンパク質脱アミド酵素 - Google Patents
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Description
[1]
タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
[2]
タンパク質中のペプチド結合を加水分解する反応を触媒する活性を実質的に有さない、[1]に記載のタンパク質。
[3]
下記(A)、(B)、または(C)に記載のタンパク質である、[1]または[2]に記載のタンパク質:
(A)配列番号10若しくは11に示すアミノ酸配列、配列番号10の63〜1260位、245〜1378位、245〜1260位、若しくは131〜1260位のアミノ酸配列、または配列番号11の47〜1257位、59〜1258位、96〜1101位、241〜1378位、244〜1258位、244〜1257位、244〜1101位、129〜1258位、120〜1257位、若しくは120〜1101位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号10若しくは11に示すアミノ酸配列、配列番号10の63〜1260位、245〜1378位、245〜1260位、若しくは131〜1260位のアミノ酸配列、または配列番号11の47〜1257位、59〜1258位、96〜1101位、241〜1378位、244〜1258位、244〜1257位、244〜1101位 、129〜1258位、120〜1257位、若しくは120〜1101位のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(C)配列番号10若しくは11に示すアミノ酸配列、配列番号10の63〜1260位、245〜1378位、245〜1260位、若しくは131〜1260位のアミノ酸配列、または配列番号11の47〜1257位、59〜1258位、96〜1101位、241〜1378位、244〜1258位、244〜1257位、244〜1101位 、129〜1258位、120〜1257位、若しくは120〜1101位のアミノ酸配列に対し、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
[4]
下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、[1]〜[3]のいずれかに記載のタンパク質:
(a)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列に対し、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
[5]
[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[6]
[5]に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[7]
[6]に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
[8]
[7]に記載の形質転換体を培地で培養し、[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
[9]
[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該タンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
[10]
前記微生物が、アクチノバクテリア(Actinobacteria)綱に属する細菌である、[9]に記載の方法。
[11]
前記細菌が、ルテイミクロビウム(Luteimicrobium)属、アグロマイセス(Agromyces)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、またはレイフソニア(Leifsonia)属に属する細菌である、[10]に記載の方法。
[12]
前記細菌が、ルテイミクロビウム・アルバム(Luteimicrobium album)、アグロマイセス属の1種(Agromyces sp.)、ミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)、レイフソニア・キシリー(Leifsonia xyli)、またはレイフソニア・アクアティカ(Leifsonia aquatica)である、[11]に記載の方法。
[13]
前記タンパク質をプロセッシング酵素で処理することを含む、[8]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
前記プロセッシング酵素がプロテアーゼである、[13]に記載の方法。
[15]
タンパク質及び/又はペプチドに、[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質を作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質及び/又はペプチドの製造法。
[16]
前記タンパク質及び/又はペプチドが、飲食品又はその原料に含有されている、[15]に記載の方法。
[17]
さらに、トランスグルタミナーゼ及び/又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び/又はペプチドに作用させることを含む、[15]または[16]に記載の方法。
[18]
タンパク質及び/又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質を作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法。
[19]
タンパク質及び/又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質を作用させることを含む、改質された飲食品又はその原料の製造法。
[20]
さらに、トランスグルタミナーゼ及び/又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び/又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、[18]または[19]に記載の方法。
[21]
前記飲食品が、マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、ヨーグルト、肉製品、およびパンから選択される、[16]〜[20]のいずれかに記載の方法。
[22]
前記タンパク質及び/又はペプチド1g当たり、[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質が0.001〜500U使用される、[15]〜[21]のいずれかに記載の方法。
本発明は、タンパク質脱アミド酵素(protein deamidase)を提供する。
タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主を利用して製造することができる。すなわち、本発明は、タンパク質脱アミド酵素を生産する能力を有する宿主を培地で培養し、タンパク質脱アミド酵素を生成させること、および培養物よりタンパク質脱アミド酵素を採取すること、を含む、タンパク質脱アミド酵素の製造法を提供する。同方法を、「本発明のタンパク質脱アミド酵素の製造法」ともいう。なお、タンパク質脱アミド酵素は、タンパク質脱アミド酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
(1)Cbz-Asn-Glyを唯一のN源とした培地に、土壌などの微生物給源を接種し集積培養する。
(2)Cbz-Asn-Glyを唯一のN源とした寒天培地に(1)で得られた培養液を摂取し、生育した菌株を得る。
(3)得られた菌株を適当な液体栄養培地で培養し、培養液中のCbz-Asn-Gly及びカゼインからのアンモニア遊離活性をチェックする。
本発明においては、タンパク質脱アミド酵素を利用して、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化することができる。すなわち、本発明は、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質に作用させることを含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する方法を提供する。同方法を、「本発明の脱アミド化法」ともいう。また、同方法の一態様は、タンパク質脱アミド酵素をタンパク質に作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質の製造法である。
土壌サンプルをCbz-Asn-Gly(ペプチド研究所)を唯一の窒素源として含有する培地A(下記)に接種し、5日間振とう培養した。該培養液をToryptic soy培地(Difco社製)の平板寒天培地に塗布して、生育したコロニーを選択して取得した。取得したコロニーをA培地と同様の2種類の寒天培地(Cbz-Asn-Gly 0.3%含有と非含有)に塗布し、Cbz-Asn-Glyの有無によって生育に有意差が見られる株を選択した。それら菌株を培地Aで再度培養し、培養液上清を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、脱アミド化生成物(Cbz-Asp-Gly)の生成が確認できた株をプロテインアスパラギナーゼ生産菌の候補株とした。これらの候補株について、16SrDNA配列解析による相同性検索により属種の同定を行った。結果を表1に示す。
培地A:蒸留水にYeast Carbon Base(Difco社製)1.17%、Cbz-Asn-Gly 0.3%を溶解後、フィルター濾過滅菌した。培地のpHは7.2に調整した。
実施例1で得られた微生物から、ルテイミクロビウム・アルバム(Luteimicrobium album)AJ111072(NITE P-01650)を選択し、以下の実験を行った。
培地B:蒸留水にYeast Carbon Baseを2.34%溶解後フィルター濾過滅菌したものと、オートクレーブ滅菌(121℃、20分)済み2%ポリペプトン(日本製薬社製)溶液を等量ずつ混合した。培地のpHは7.2に調整した。
活性測定方法:30 mmol/L Cbz-Asn-Glyを含む0.2 mol/Lリン酸緩衝液(pH6.5)125μLに酵素溶液25μLを添加して、37℃、60分間インキュベートした後、12%トリクロロ酢酸溶液150μLを加えて反応を停止させた。反応液を遠心分離(15,000 rpm、4℃、5分間)した後、上清のアンモニア濃度をF-kit ammonia(ベーリンガー・マンハイム社製)を用いて測定し、プロテインアスパラギナーゼ活性を算出した。1分間に1μmolのアンモニアを生成する酵素活性を1単位(U)のプロテインアスパラギナーゼ活性とした。
実施例2で得られた精製プロテインアスパラギナーゼをプロテインシークエンサー(島津製作所PPSQ-21A)に供し、5残基のN末端アミノ酸配列を決定した。ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072(NITE P-01650)のプロテインアスパラギナーゼのN末端アミノ酸配列は、Ala-Val-Thr-Ala-Asp(配列番号1)であった。
プロテインアスパラギナーゼの全長アミノ酸配列は、次世代シーケンサーで得られたゲノム配列をデータベースとしてLC-MS/MSのデータからタンパク質同定を行う手法を用いて決定した。すなわち、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072(NITE P-01650)をTryptic soy寒天培地で30℃、24時間培養し、生育した菌体からゲノムDNAを抽出し、Miseq(イルミナ株式会社)で塩基配列の取得を行った。次に、実施例2で得られた精製プロテインアスパラギナーゼをSDS-PAGEに供し、目的のバンドを切り出し、トリプシン消化した。消化断片をLC-MS/MS分析に供し、同酵素の部分アミノ酸配列を取得した。そして、上述の方法で得られたゲノム配列情報、部分アミノ酸配列、及びN末端アミノ酸配列(配列番号1)から、プレプロ領域を含むルテイミクロビウム・アルバムAJ111072(NITE P-01650)のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列1355残基(配列番号2)及び同酵素をコードする遺伝子の塩基配列全長(配列番号3)を取得した。
インスリンB鎖(シグマ社)を2.5 mg/mlとなるよう0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、基質溶液とした。45μLの基質溶液に対し、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072(NITE P-01650)のプロテインアスパラギナーゼ溶液(約0.3 U/ml)を45μL又は対照として水を45μL添加し、37℃で1時間反応させた後、1 N塩酸を10μL添加して反応を停止させた。その後、遠心上清後の上清をフィルターろ過し、HPLCにより分析した。結果を図2に示す。対照区(実線)のインスリンB鎖の溶出時間が4.88 minであるのに対し、酵素添加区(破線)のインスリンB鎖の溶出時間は4.96 minであり、わずかに溶出時間のずれが見られた。そこで反応後の溶液をプロテインシーケンサー(島津製作所PPSQ-21A)に供したところ、酵素添加区のインスリンB鎖のN末端配列はPhe-Val-Asp-Gln-であることが確認された。一方、対照区のインスリンB鎖のN末端配列はPhe-Val-Asn-Gln-であった。よって、本酵素によりインスリンB鎖のN末端から3残基目のアスパラギンが脱アミドによりアスパラギン酸に変換されることが証明された。一方、N末端から4残基目のグルタミンには変化がなかった。
カゼインナトリウム(日本新薬、商品名:ミプロダン)を2%w/vとなるよう20mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、基質溶液とした。この基質溶液500μLに対し、ルテイミクロビウム・アルバムAJ111072(NITE P-01650)のプロテインアスパラギナーゼ溶液(0.68 U/mlまたは2.7 U/ml)を25μL添加し、37℃で1時間反応後、100℃で5分の処理で酵素を失活させた。0.68 U/mlの酵素溶液の添加区を試験区1、2.7 U/mlの酵素溶液の添加区を試験区2とした。対照として、酵素溶液の代わりに水を25μL添加して同様に処理を行った(対照区)。反応液中のアンモニア定量を行い、対照区の値を差し引いた結果、0.68 U/ml、2.7 U/mlの酵素溶液を添加したときのアンモニア遊離量はそれぞれ1.0 mM、1.3 mMであった。これらのサンプルについて、等電点電気泳動(IEF)を行った結果を図3に示す。本酵素を添加したサンプル(試験区1、2)はいずれも、対照区に比べ等電点(pI)が酸性側にシフトしており、脱アミド化によるタンパク質のpI低下が確認できた。
pHバッファー:酢酸バッファー(pH4〜6.0)、リン酸バッファー(pH6.0〜7.5)、トリス塩酸バッファー(pH7.5〜9.0);いずれも濃度は0.2M。
トランスグルタミナーゼは、タンパク質中のグルタミン残基とリジン残基間にイソペプチド結合を形成し、タンパク質を架橋させる酵素である。トランスグルタミナーゼとプロテイングルタミナーゼは、いずれもタンパク質中のグルタミンを基質とするため、これらを併用すると反応が競合するという課題がある。一方、本発明のプロテインアスパラギナーゼは、タンパク質中のアスパラギンを基質とするので、トランスグルタミナーゼと競合することなく、よって、これらを併用することにより脱アミド化の効果と架橋の効果の両方を得ることができる。そこで、本実施例では、プロテインアスパラギナーゼとプロテイングルタミナーゼについて、トランスグルタミナーゼの併用効果を比較した。トランスグルタミナーゼとしては、アクティバ(登録商標)TG原末からの精製品を、プロテイングルタミナーゼとしては、WO2006/075771記載の方法で調製した精製品を、それぞれ用いた。比較として、カゼインナトリウム 2%v/v溶液500μLに対し、プロテイングルタミナーゼ(10 U/ml)を25μL添加し、37℃で1時間反応後、100℃で5分の処理で酵素を失活させた(比較区)。対照区、試験区2、比較区のカゼイン溶液に、トランスグルタミナーゼをカゼイン1 g当たり6.5U添加し、37℃で100分間反応させた後、95℃で5分処理により酵素を失活させた。各反応液をSDS-PAGEに供し、カゼインの分子量変化を調べた。結果を図4に示す。比較区(プロテイングルタミナーゼ処理カゼイン)ではトランスグルタミナーゼによる架橋が抑制されているのに対し、試験区2(プロテインアスパラギナーゼ処理カゼイン)では対照区とほぼ同様に架橋物の形成が確認できた。よって、トランスグルタミナーゼとプロテインアスパラギナーゼを併用することで、架橋による物性強化と同時に、脱アミド化による溶解性等の機能向上も見込めることが示唆された。
実施例1で得られた微生物から、レイフソニア・キシリー(Leifsonia xyli)AJ111071(NITE P-01649)を選択し、以下の実験を行った。
培地C:蒸留水にYeast Carbon Baseを1.17%溶解後フィルター濾過滅菌したものと、オートクレーブ滅菌(121℃、20分)済み1%カゼインナトリウム(和光純薬)溶液を等量ずつ混合した。培地のpHは7.2に調整した。
実施例1で得られた微生物から、アグロマイセス属の1種(Agromyces sp.)AJ111073(NITE BP-01782)を選択し、実施例2〜4と同様に実験を行った。すなわち、アグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)の培養液からプロテインアスパラギナーゼを精製し、SDS-PAGEに供した。目的のバンドを切り出した後、トリプシン消化し、酵素のトリプシン消化物からペプチドを分取し、プロテインシークエンサー(島津製作所PPSQ-21A)に供した。その結果、配列番号4に示す12残基の内部アミノ酸配列(Ala-Arg-Gly-Gln-Leu-Ile-Leu-Asp-Thr-Leu-Thr-Met)を決定した。予め次世代シーケンサーにより取得したアグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)の全ゲノム配列をデータベースとして、配列番号4のアミノ酸をコードする遺伝子を検索したところ、プレプロ領域を含むアグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列1180残基(配列番号5)及び同酵素をコードする遺伝子の塩基配列全長(配列番号6)を取得した。
<1>アグロマイセス属の1種由来プロテインアスパラギナーゼの精製
実施例1で得られた微生物から、アグロマイセス属の1種(Agromyces sp.)AJ111073(NITE BP-01782)を選択し、以下の実験を行った。
培地C(下記)にアグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)を接種し、37℃、24時間振盪培養して培養液を得た。
培地C:蒸留水にYeast Carbon Baseを1.17%溶解後フィルター濾過滅菌したものと、オートクレーブ滅菌(121℃、20分)済み1%トリプトンペプトン(Difco製)溶液を等量ずつ混合した。培地のpHは7.2に調整した。
得られた培養液にBacillus subtilisの培養上清(下記)を1/10量混合し、一晩静置した。この操作により、培養液上清のプロテインアスパラギナーゼ活性が0.005U/mlから1.06U/mlに向上した。
Bacillus subtilisの培養上清:Bacillus subtilis subsp. subtilisT JCM1465を上述の培地Cに接種し、37℃、24時間振盪培養して培養液を得た。得られた培養液を4℃、8,000rpm、15分間の遠心分離により菌体を除去し、Stericup 0.22μm(ミリポア社製)でフィルター濾過し、培養上清を得た。
活性化処理後の培養液を4℃、40,000rpm、1時間の遠心分離により菌体を除去し、得られた遠心上清をStericup 0.22μm(ミリポア社製)でフィルター濾過した。終濃度2.0MのNaClを溶解し、2.0M NaClを含む20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)で平衡化した疎水クロマトグラフィー用カラムHiprep Phenyl FF 10/16(GE ヘルスケア社製)に供した。2.0Mから0MのNaCl直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させて活性画分を集め、20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)へバッファー交換した。同緩衝液で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムHiprep DEAE FF 10/16(GE ヘルスケア社製)に供して、0Mから0.5Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により吸着したタンパク質を溶離させた。精製テーブルを表4に示す。活性画分を還元剤含有SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)用サンプルバッファーと混合し熱処理後、4-12%Bis-Tris gel(Invitrogen, NuPAGE) で電気泳動し、泳動後のゲルをSimplyBlue SafeStain(Invitrogen製)にて染色した。結果を図6に示す。活性の大きさとバンドの濃さから判断すると、アグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)のプロテインアスパラギナーゼの分子量は、約12万であることが判明した。また、最終精製工程により得られた活性画分には、遊離のアスパラギンに作用するアスパラギナーゼ活性及びタンパク質を分解するプロテアーゼ活性は検出されなかった。
電気泳動後のゲルからプロテインアスパラギナーゼに該当するバンドを切り出し、ゲル内消化を行った。すなわち、切り出したゲル片を洗浄後、リジルエンドペプチダーゼを含むトリス塩酸緩衝液(pH8.5)を加えて、35℃、20時間の処理を行った。次いで、処理後のサンプルを逆相HPLCに供し、断片ペプチドを分離した。分析可能なペプチドピークを分取し、プロテインシークエンサー(Procise 494 HT Protein Sequencing System)に供したところ、Ala-Arg-Gly-Gln-Leu-Ile-Leu-Asp-Thr-Leu-Thr-Met(配列番号4)を含む配列が確認された。また、上記で得られた精製プロテインアスパラギナーゼをプロテインシークエンサー(島津製作所PPSQ-21A)に供し、5残基のN末端アミノ酸配列を決定した。アグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)のプロテインアスパラギナーゼ(成熟タンパク質)のN末端アミノ酸配列は、Ala-Ala-Thr-Glu-Asp(配列番号12)であった。
実施例1で得られた微生物から、アグロマイセス属の1種(Agromyces sp.)AJ111073(NITE BP-01782)を選択し、培養液中のプロテインアスパラギナーゼ前駆体を成熟体に変換するプロセッシング酵素の検討を行った。
Bacillus subtilisの培養上清:Bacillus subtilis subsp. subtilisT JCM1465を上述の培地Cに接種し、37℃、24時間振盪培養して培養液を得た。得られた培養液を4℃、8,000rpm、15分間の遠心分離により菌体を除去し、Stericup 0.22μm(ミリポア社製)でフィルター濾過し、培養上清を得た。
豚由来酸ゼラチン(新田ゼラチン製)の5%wt水溶液(pH7.0に調整)を調製した。水溶液に対し、アグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)のプロテインアスパラギナーゼをゼラチン原料1 g当たり1U、2U、または10U添加し、37℃で2時間の処理を行った。比較として、酵素の代わりに水を加えて同様に処理したものを調製した。反応終了後のサンプルを水で50倍希釈し、自動滴定装置(MPT-2)付のゼータ電位計(マルバーン社:ゼータサイザーナノZS)を用いて等電点(pI)を調べた結果を表6に示す。酵素添加量の増加に伴い、ゼラチンの等電点は低下し、表面電荷の異なるゼラチンが作製できた。このように、本発明のプロテインアスパラギナーゼを用いることにより、ゼラチンタンパク質の機能発現において重要な表面電荷を制御することが可能である。
豚由来酸ゼラチンおよび牛由来アルカリゼラチン(いずれも新田ゼラチン製)の5%wt水溶液(pH7.0に調整)をそれぞれ調製した。各水溶液に対し、まずアグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)のプロテインアスパラギナーゼをゼラチン原料1 g当たり15U添加した。続いてすぐに、WO2006/075771記載の方法で調製したプロテイングルタミナーゼ(精製酵素)をゼラチン原料1 g当たり50 U添加し、37℃で2時間の処理を行った。酸ゼラチン、アルカリゼラチンを酵素処理した区を、それぞれ試験区A、試験区Bとした。対照として、酵素の代わりに水を添加して同様に処理を行い、それぞれ対照区A、対照区Bとした。反応終了後、これらのサンプルを水で50倍希釈し、上述と同様の手法で等電点(pI)を調べたところ、対照区A、BのpIがそれぞれ8.98、5.03であったのに対し、試験区A、BのpIはそれぞれ4.85、4.81となり、いずれもpIが酸性側にシフトすることを確認した。特に、酵素処理酸ゼラチン(試験区A)については、pIの著しい変化がもたらされ、ゼラチンの電気的性質が大きく変化することが示された。また、酵素処理アルカリゼラチン(試験区B)についても、pIの更なる低下が認められた。
魚由来酸ゼラチン(ニッピ製)および牛由来アルカリゼラチン(Sigma製)それぞれの1%wt水溶液を20 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)で調製した。各水溶液に対し、まずアグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)のプロテインアスパラギナーゼをゼラチン原料1 g当たり50 U添加し、37℃で1時間の処理を行った。次いで、WO2006/075771記載の方法で調製したプロテイングルタミナーゼ(精製酵素)をゼラチン原料1 g当たり80 U添加し、55℃で1時間の処理を行った。次いで、100℃で5分の処理で酵素を失活させた。酸ゼラチンおよびアルカリゼラチンを酵素処理した区を、それぞれ試験区A、試験区Bとした。対照として、酵素の代わりに水を添加して同様に処理を行い、それぞれ対照区A、対照区Bとした。これらのサンプルについて、ゼータ電位計(マルバーン社:ゼータサイザーナノZS)を用いて等電点(pI)を調べたところ、対照区A、BのpIがそれぞれ8.63、5.25であったのに対し、試験区A、BのpIはそれぞれ4.59、4.61となり、いずれもpIが酸性側にシフトすることを確認した。特に、酵素処理酸ゼラチン(試験区A)については、pIの著しい変化がもたらされ、ゼラチンの電気的性質が大きく変化することが示された。また、酵素処理アルカリゼラチン(試験区B)についても、pIの更なる低下が認められた。
<1>Corynebacterium glutamicumによるアグロマイセス属の1種由来プロテインアスパラギナーゼの分泌発現
<1−1>プロテインアスパラギナーゼの分泌発現プラスミドの構築
プロテインアスパラギナーゼを異種発現させる場合、本来有するプロ配列をN末端側に有した形態でプロテインアスパラギナーゼを発現させることが、プロテインアスパラギナーゼの構造安定化に寄与する可能性がある。ある目的タンパク質を、当該目的タンパク質以外のアミノ酸配列と融合させた形で発現させる場合、目的タンパク質のアミノ酸配列と、融合させたアミノ酸配列との間に特定の基質特異性の高いプロテアーゼ認識配列を配位する事により、発現した融合タンパク質を特定のプロテアーゼで切断し、簡便に目的タンパク質を得る方法が広く知られている。一方、基質特異性の高いプロテアーゼとして、Factor XaプロテアーゼやProTEVプロテアーゼなどが知られており、それぞれタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg(=IEGR)(配列番号14)およびGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln(=ENLYFQ)(配列番号15)の配列を認識して各配列のC末端側を特異的に切断する。よって、例えば、プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼにおいて、プロテインアスパラギナーゼのプロ配列アミノ酸残基をコードする塩基配列と成熟プロテインアスパラギナーゼをコードする塩基配列との間にFactor Xaプロテアーゼの認識配列(IEGR)もしくはProTEVプロテアーゼの認識配列(ENLYFQ)をコードする塩基配列を挿入したプロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ遺伝子を構築し、プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼを発現させる事によって、これらのプロテアーゼを用いて、簡便にプロ配列融合プロテインアスパラギナーゼからプロ配列を除去し、成熟プロテインアスパラギナーゼを得る事が可能となる。
次に、常法に従って、pPK4-Pro-TEV-PAでC. glutamicum YDK010株(WO2004/029254)を形質転換し、YDK010/ pPK4-Pro-TEV-PA株を得た。なお、C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2(CspB)の欠損株である(WO2004/029254)。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院 微生物工業技術研究所(現、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、郵便番号:292-0818、住所:日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室)に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。YDK010/ pPK4-Pro-TEV-PA株を、25 mg/lのカナマイシンを含むMM液体培地(グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、硫酸アンモニウム 30g、リン酸二水素カリウム 1.5g、硫酸鉄七水和物 0.03g、硫酸マンガン四水和物 0.03g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、DL-メチオニン0.15g、および炭酸カルシウム 50gを水で1LにしてpH7.0に調整)で30 ℃、72時間培養した。培養72時間後の培養液を遠心分離(13,800xg, 2分)した後、その上清4μLを還元SDS-PAGEに供し、SimplyBlue SafeStain(Novex製)にて染色を行い、培養液中に分泌されているタンパク質を分析した。その結果、プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼの予想される分子量サイズである115 kDa付近にバンドを確認した(図11)。プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸組成は酸性アミノ酸が多いため、115 kDaよりもやや高分子量側にシフトしているものと推測された。
<2−1>アグロマイセス属の1種(Agromyces sp.)由来プロテインアスパラギナーゼの発現
E.coliのコドン頻度を考慮し、N末から順に、アグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列(ENLYFQG)、およびアグロマイセス属の1種AJ111073(NITE BP-01782)由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体(成熟PA)の配列が連結された融合タンパク質(配列番号20)をコードするDNA配列(配列番号19)を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpCold TF DNA(TaKaRa)へクローニングした。pCold TF DNAは、シャペロンであるトリガーファクター(TF)を可溶化タグとして目的タンパク質に融合した形態で目的遺伝子が発現するようにデザインされた、目的タンパク質の転写が低温で誘発されるコールドショック発現ベクターである。クローニングは、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて以下の手順で実施した。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF DNAを鋳型として、配列番号21および配列番号22のプライマーを用いたPCRにより行った。融合タンパク質をコードするクローニング用DNA断片の増幅は、合成したDNA配列(配列番号19)を鋳型として、配列番号23および配列番号24のプライマーを用いたPCRにより行った。ポリメラーゼとしてはPrime STAR GXL(TOYOBO)を使用した。PCRは、「98℃-10秒、60℃-15秒、68℃-60秒」のサイクルを30回実施した。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換し、アンピシリン50μg/mlを含むLB寒天培地上に塗布して37℃で一晩培養した。その後、出現したコロニーから単一コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体から、TFをコードするDNAの下流に正しくプロ配列、ProTEV認識配列、および成熟PA配列の融合タンパク質をコードするDNAが連結された、アグロマイセス属の1種由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ(proPA_Agro)の発現プラスミド(pCTF-proPA_Agroと命名)を有する株を取得した。
E.coliのコドン頻度を考慮し、N末から順に、レイフソニア・キシリーAJ111071(NITE P-01649)由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列(ENLYFQG)、およびレイフソニア・キシリーAJ111071(NITE P-01649)由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体(成熟PA)の配列が連結された融合タンパク質(配列番号26)をコードするDNA配列(配列番号25)を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpCold TF DNA(TaKaRa)へクローニングした。以下、特記しない限り、実験手順は実施例12<2−1>と同様である。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF DNAを鋳型として、配列番号21および配列番号22のプライマーを用いたPCRにより行った。融合タンパク質をコードするクローニング用DNA断片の増幅は、合成したDNA配列(配列番号25)を鋳型として、配列番号27および配列番号28のプライマーを用いたPCRにより行った。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体から、TFをコードするDNAの下流に正しくプロ配列、ProTEV認識配列、および成熟PA配列の融合タンパク質をコードするDNAが連結された、レイフソニア・キシリー由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ(proPA_Leif)の発現プラスミド(pCTF-proPA_Leifと命名)を有する株を取得した。
E.coliのコドン頻度を考慮し、N末から順に、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来プロテインアスパラギナーゼのプロ配列、ProTEVプロテアーゼの認識配列(ENLYFQG)、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来プロテインアスパラギナーゼの成熟体(成熟PA)の配列が連結された融合タンパク質(配列番号30)をコードするDNA配列(配列番号29)を人工遺伝子合成法によって合成し、プラスミドベクターpCold TF DNA(TaKaRa)へクローニングした。以下、特記しない限り、実験手順は実施例12<2−1>と同様である。pCold TF DNA断片の増幅は、pCold TF DNAを鋳型として、配列番号22および配列番号23のプライマーを用いたPCRにより行った。融合タンパク質をコードするDNA断片の増幅は、合成したDNA配列(配列番号29)を鋳型として、配列番号31および配列番号32のプライマーを用いたPCRにより行った。増幅断片をIn-Fusion反応により連結し、反応産物でE. coli JM109株を形質転換した。得られた形質転換体から、TFをコードするDNAの下流に正しくプロ配列、ProTEV認識配列、および成熟PA配列の融合タンパク質をコードするDNAが連結された、ミクロバクテリウム・テスタセウム由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼ(proPA_Micro)の発現プラスミド(pCTF-proPA_Microと命名)を有する株を取得した。
配列番号1:Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼのN末端アミノ酸配列(5残基)
配列番号2:Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列(プレプロ領域を含む)
配列番号3:Luteimicrobium album由来のプロテインアスパラギナーゼ遺伝子の塩基配列全長
配列番号4:Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼの内部アミノ酸配列(12残基)
配列番号5:Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列(プレプロ領域を含む)
配列番号6:Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼ遺伝子の塩基配列全長
配列番号7:Microbacterium testaceum由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号8:Leifsonia xyli由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号9:Leifsonia aquatica由来のプロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号10:配列番号2および5の共通アミノ酸配列
配列番号11:配列番号2、5、7、および8の共通アミノ酸配列
配列番号12:Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼの成熟タンパク質のN末端アミノ酸配列(5残基)
配列番号13:Agromyces sp.由来のプロテインアスパラギナーゼの前駆体(プロタンパク質)のN末端アミノ酸配列(11残基)
配列番号14:Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号15:ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号16:C. glutamicumによる分泌発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号17:C. glutamicumによる分泌発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号18:C. glutamicumによる分泌発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子を含む挿入断片の塩基配列
配列番号19:E. coliによる菌体内発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号20:E. coliによる菌体内発現用のAgromyces sp.由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号21〜24:プライマー
配列番号25:E. coliによる菌体内発現用のLeifsonia xyli由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号26:E. coliによる菌体内発現用のLeifsonia xyli由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号27、28:プライマー
配列番号29:E. coliによる菌体内発現用のMicrobacterium testaceum由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号30:E. coliによる菌体内発現用のMicrobacterium testaceum由来プロ配列融合プロテインアスパラギナーゼのアミノ酸配列
配列番号31、32:プライマー
Claims (19)
- タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有する、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質:
(a)配列番号2、5、若しくは7に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、または配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2、5、若しくは7に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、または配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2、5、若しくは7に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、または配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列に対し、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項2に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培地で培養し、請求項1に記載のタンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。
- 請求項1に記載のタンパク質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該タンパク質を生成させること、および培養物より前記タンパク質を採取すること、を含む、タン
パク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質の製造法。 - 前記微生物が、アクチノバクテリア(Actinobacteria)綱に属する細菌である、請求項6に記載の方法。
- 前記細菌が、ルテイミクロビウム(Luteimicrobium)属、アグロマイセス(Agromyces)属、またはミクロバクテリウム(Microbacterium)属に属する細菌である、請求項7に記載の方法。
- 前記細菌が、ルテイミクロビウム・アルバム(Luteimicrobium album)、アグロマイセス属の1種(Agromyces sp.)、またはミクロバクテリウム・テスタセウム(Microbacterium testaceum)である、請求項8に記載の方法。
- 前記タンパク質をプロセッシング酵素で処理することを含む、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記プロセッシング酵素がプロテアーゼである、請求項10に記載の方法。
- タンパク質及び/又はペプチドに、プロテインアスパラギナーゼを作用させることを含む、アスパラギン残基が脱アミド化されたタンパク質及び/又はペプチドの製造法であって、
前記プロテインアスパラギナーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、方法:
(a)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列に対し、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 - 前記タンパク質及び/又はペプチドが、飲食品又はその原料に含有されている、請求項12に記載の方法。
- さらに、トランスグルタミナーゼ及び/又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び/又はペプチドに作用させることを含む、請求項12または13に記載の方法。
- タンパク質及び/又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、プロテインアスパラ
ギナーゼを作用させることを含む、飲食品又はその原料を改質する方法であって、
前記プロテインアスパラギナーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、方法:
(a)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列に対し、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 - タンパク質及び/又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に、プロテインアスパラギナーゼを作用させることを含む、改質された飲食品又はその原料の製造法であって、
前記プロテインアスパラギナーゼが、下記(a)、(b)、または(c)に記載のタンパク質である、方法:
(a)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質;
(c)配列番号2、5、7、8、若しくは9に示すアミノ酸配列、配列番号2の240〜1355位のアミノ酸配列、配列番号5の181〜1180位若しくは67〜1180位のアミノ酸配列、配列番号7の193〜1172位若しくは70〜1172位のアミノ酸配列、または配列番号8の146〜989位若しくは21〜989位のアミノ酸配列に対し、90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質中のアスパラギン残基を脱アミド化する反応を触媒する活性を有するタンパク質。 - さらに、トランスグルタミナーゼ及び/又はプロテイングルタミナーゼをタンパク質及び/又はペプチドを含有する飲食品又はその原料に作用させることを含む、請求項15または16に記載の方法。
- 前記飲食品が、マヨネーズ、ドレッシング、クリーム、ヨーグルト、肉製品、およびパ
ンから選択される、請求項13〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 前記タンパク質及び/又はペプチド1g当たり、前記プロテインアスパラギナーゼが0.001〜500U使用される、請求項12〜18のいずれか1項に記載の方法。
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