JP6566479B2 - イチゴ属植物の四季成り性関連マーカーとその利用 - Google Patents
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Description
(1)イチゴ属植物の染色体における配列番号1に示す塩基配列及び配列番号5に示す塩基配列により挟まれる連続する核酸領域からなる、イチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
(2)上記核酸領域は、配列番号1〜5からなる群から選ばれるいずれか1の塩基配列又は当該塩基配列の一部を含むことを特徴とする(1)記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
(3)上記核酸領域は、イチゴ属植物の染色体における配列番号3に示す塩基配列と配列番号4に示す塩基配列とにより挟み込まれる領域に位置することを特徴とする(1)記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカー。
(4)少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
上記で得られた染色体における上記(1)乃至(3)いずれか1に記載のイチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を判定する工程とを含む、四季成り性を示すイチゴ属植物系統の製造方法。
(5)上記判定する工程では、上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を判定することを特徴とする(4)記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
(6)上記判定する工程では、上記イチゴ属植物四季成り性関連マーカーに対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする(4)記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
(7)上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする(4)記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
本発明に係るイチゴ属植物四季成り性関連マーカーとは、イチゴ属植物の染色体上に存在する特定の領域であり、イチゴ属植物四季成り性という形質を判別できる機能を有する。すなわち、既知のイチゴ属植物を用いて得られた後代系統において、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーの存在・非存在を確認することで四季成り性系統であるか否かを判断することができる。なお、本発明において、四季成り性とは、日本の自然条件下における露地栽培において、春季に開花したのち、春季から初夏にかけての高温長日条件下において再び花芽分化し、夏季〜秋季にかけても開花が認められる形質をさす。四季成り性の判定は、上述のとおり自然条件下における夏季〜秋季の開花の有無に基づいて行われるほかに、人為的な長日条件下(16〜24時間日長)で植物体を栽培し、開花の有無を調べる方法によっても行うことができる。
本発明では、上述したように、イチゴ品種「みやざきなつはるか」から取得した8,218個のマーカー及びイチゴ系統「08と−f」から取得した8,039個のマーカーからイチゴ属植物四季成り性関連マーカーを特定した。ここでは、これら8,218個と8,039個のマーカーについて説明する。このマーカーを同定する際には、特開2011-120558号公報や国際公開公報2011/074510に開示された方法を適用したDNAマイクロアレイを使用することができる。
イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用することで、四季成り性が未知であるイチゴ属植物(例えば、後代系統)について四季成り性を示す系統であるか判断することができる。ここで、イチゴ属植物四季成り性関連マーカーを利用するとは、当該マーカーを含む核酸断片を特異的に増幅する方法を利用する形態、当該マーカーに対応するプローブを有するDNAマイクロアレイを利用する形態を含む意味である。
(1)材料
イチゴ品種「みやざきなつはるか」と「08と−f」を用いた。
これらイチゴ品種それぞれについて、Dneasy Plant Mini kit(QIAGEN社)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNA(150ng)を制限酵素PstI(NEB社、5unit)で37℃、1時間処理した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(150ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(配列番号6)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(配列番号7))とT4 DNA Ligase(NEB社、200 unit)を加え、16℃で1時間、その後55℃で20分間、その後37℃で30分間の条件でライゲーション反応を行った。次に、処理したサンプルに制限酵素BstNI(NEB社、6 unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(3)で得られた、BstNI処理後のサンプル(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(配列番号8))とTaq polymerase(タカラバイオ社、PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間、30サイクル後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でDNA断片を増幅した。
(4)においてPCR増幅したゲノムDNA断片について、Hiseq2000、Miseq(Illumina社)により塩基配列情報を取得した。
(5)のゲノムシークエンス情報をもとに50〜60bpのプローブを設計した。設計したプローブの塩基配列情報をもとに、これらプローブを有するDNAマイクロアレイを作製した。
(1)材料
イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「08と−f」及びこれらの交雑後代147系統を用いた。
これらイチゴ品種及び交雑後代からそれぞれゲノムDNAをDneasy Plant Mini kit(QIAGEN社)により抽出した。抽出したゲノムDNA(150ng)を制限酵素PstI(NEB社、6unit)で37℃、1時間処理した。
(2)で処理したゲノムDNA断片(150ng)にPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(配列番号6)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’(配列番号7))とT4 DNA Ligase(NEB社、200 unit)を加え、16℃で1時間、その後55℃で20分間、その後37℃で30分間の条件でライゲーション反応を行った。次に、処理したサンプルに制限酵素BstNI(NEB社、6 unit)を添加、60℃で1時間処理した。
(3)で得られたBstNI処理後のサンプル(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(配列番号8))とTaq polymerase(タカラバイオ社PrimeSTAR、1.25unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でゲノムDNA断片を増幅した。
上述した(4)で増幅したDNA断片をカラム(QIAGEN社)で精製後、 NimbleGen Arrays User’s Guideに従い、NimbleGen One-Color DNA Labeling Kit(ロシュ・ダイアグノステックス社)を用いラベル化した。
(5)のラベル化サンプルと、上記1.で作製したDNAマイクロアレイとを用いて、アジレントIn-situ オリゴDNAマイクロアレイ キット アレイCGH(aCGH)法に従いハイブリ処理をし、各サンプルのシグナルを検出した。
(1)遺伝地図データシート作成
「みやざきなつはるか」と「08と−f」との交雑後代147系統のシグナルデータから、「みやざきなつはるか」型の8,218マーカー及び「08と−f」型の8,039マーカーの遺伝子型データを取得した。遺伝子型データをもとに、遺伝地図作成ソフトAntMap ((Iwata H, Ninomiya S 2006) AntMap: constructing genetic linkage maps using an ant colony optimization algorithm. Breed Sci 56: 371-378)を用い、遺伝距離計算式Kosambiによりマーカーの遺伝地図データを取得した。
「みやざきなつはるか」と「08と−f」との交雑後代147系統について、最低気温17℃、24時間日長条件下にあるハウス内において栽培し開花の有無を調べることによって季性を判定した(図3)。四季成り性については、この実験条件にて花芽を形成したものを「四季成り」とし、花芽を形成しなかったものを「一季成り」とした。
上記(1)で得られた遺伝地図データ及び上記(2)で得られた四季成り性試験データをもとに、遺伝解析ソフトQTL Cartographer (Wang S., C. J. Basten, and Z.-B. Zeng (2010). Windows QTL Cartographer 2.5. Department of Statistics, North Carolina State University, Raleigh, NC)を使い、Composite interval mapping (CIM)法により、QTL解析を行った。LODの閾値は2.5を用いた。その結果、「みやざきなつはるか」の第20連鎖群のマーカーIB303507RからIB303642Rの区間にLOD値が47.4のイチゴ四季成り性に関する遺伝子の存在を確認した(表2、図4)。
第20連鎖群の0cM〜5.45cMの区間にあるイチゴ四季成り性遺伝子領域周辺のマーカーを選抜マーカーとして選定した(図4、表1)。
(1)イチゴ四季成り性表現型データの取得
上記3.(2)イチゴ四季成り性表現型データの取得で記載した系統とは別に、「みやざきなつはるか」と「08と−f」との交雑後代種子をハウス内で育苗し(50系統:以降A集団とする)、秋季に野外圃場に定植して、翌年の夏季に自然日長下において季性を調査した。また、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代種子(42系統:以降B集団とする)についても同様に育苗、定植し、翌年夏季に自然日長下において季性を調査した(図5−1及び図5−2)。
新たに、イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「08と−f」及びA集団について、Dneasy Plant Mini kit(QIAGEN社)によりゲノムDNAを抽出した。
抽出したゲノムDNA(150ng)を制限酵素PstI(NEB社、5unit)で37℃、1時間処理後、PstI処理したサンプルにPstI配列アダプター(5’-CACGATGGATCCAGTGCA-3’(配列番号6)、5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’ (配列番号7))とT4 DNA Ligase(NEB社、200 unit)を加え、16℃で1時間処理後、55℃で20分、その後、37℃で30分処理した。処理したサンプルに制限酵素BstNI(NEB社、6 unit)を添加、60℃で1時間処理した。
上記(3)にてBstNI処理したサンプル(15ng)にPstI配列アダプター認識プライマー(5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’(配列番号8))とTaq polymerase(タカラバイオ社、PrimeSTAR、1.25 unit)を加え、PCR(98℃を10秒間、55℃を15秒間、72℃を1分間、を1サイクルとして30サイクル実施後、72℃で3分間処理後、4℃で保存)でDNA断片を増幅した。
上記(4)にて増幅したDNA断片をカラム(QIAGEN社)で精製後、 NimbleGen Arrays User’s Guideに従い、NimbleGen One-Color DNA Labeling Kit(ロシュ・ダイアグノステックス社)を用いラベル化した。
上記(5)で蛍光標識したサンプルと上記1.で作成したアレイを用い、アジレントIn-situ オリゴDNAマイクロアレイ キット アレイCGH (aCGH) 法に従いハイブリ処理をし、各サンプルのシグナルを検出した。
上記A集団中で、イチゴ四季成り性遺伝子領域周辺のマーカーを選定し(表1)、選抜マーカーとしたものでアレイシグナル値とA集団の表現型とを比較すると92.0%〜98.0%一致していた(図6−1〜図6−3)。なお、図6−1〜図6−3において、高いアレイシグナル値には下線を付した。これらの結果から、表1に示したマーカーを利用することで、四季成り性を示す系統、一季成り性を示す系統の選抜が可能と考えられた。
(1)ゲノムDNAの抽出
イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「08と−f」、「おおきみ」、「みやざきなつはるか」と「08と−f」との交雑後代(A集団)、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代(B集団)について、Dneasy Plant Mini kit(QIAGEN社)によりゲノムDNAを抽出した。
PCRプライマー解析ソフトPrimer3を使い、IB204594Rの配列情報(配列番号4)から、IB204594Rを識別するプライマーを作製した(S40884 _v1F: CCGGAGTACATGGTAACCTATGC(配列番号9)、S40884 _v1R: TTTTCTGCCTCGGTCATCTG(配列番号10))。なお、IB204594Rは、四季成り性を示す系統には見られない相反マーカーである。
交雑後代A集団、B集団のゲノムDNA(15 ng)に、上記プライマー(S40884 _v1F及びS40884 _v1R)とTaq polymerase(タカラバイオ社、Tks Gflex DNA Polymerase、1.25 unit)を加え、PCR(94℃で1分間、98℃で10秒間、60℃で15秒間、68℃で30秒間を1サイクルとして30サイクル実施後、4℃で保存)で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、TapeStation D1000(アジレント社)により確認した。A集団及びB集団について行った結果を図7−1及び図7−2並びに図8−1及び図8−2にそれぞれ示した。なお、図7−1及び図7−2並びに図8−1及び図8−2において、四角で囲ったものは四季成り性の表現型を意味している。なお、図7−1〜図8−2において、Mのレーンは「みやざきなつはるか」を示し、Zのレーンは「08と−f」を示している。また、これらの結果を図9−1及び図9−2にまとめて示した。なお、図9−1及び図9−2において下線は、表現型とPCRベースマーカーの結果とが一致しなかった場合を示している。図7−1〜図9−2に示したように、バンドパターンと表現型の一致率は非常に高く(96.7%)、IB204594Rを特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅方法により、四季成り性を示す系統、一季成り性を示す系統の選抜ができることが明らかとなった。
(1)ゲノムDNAの抽出
イチゴ品種「みやざきなつはるか」、「08と−f」、「おおきみ」、「みやざきなつはるか」と「08と−f」との交雑後代(A集団)、「みやざきなつはるか」と「おおきみ」との交雑後代(B集団)について、Dneasy Plant Mini kit(QIAGEN社)によりゲノムDNAを抽出した。
PCRプライマー解析ソフトPrimer3を使い、IBA38559の配列情報(配列番号3)から 、IBA38559を識別するプライマーを作製した(S2430859_v1F: CGCCCATGTCTTGATTCC (配列番号11)、S2430859_v1R: ATGAATTATTGCGCAGGCT (配列番号12))。なお、 IBA38559は、四季成り性を示す系統に見られる相引マーカーである。
交雑後代A集団、B集団のゲノムDNA(15 ng)に、上記プライマー(S2430859_v1F及びS2430859_v1R)とTaq polymerase(タカラバイオ社、Tks Gflex DNA Polymerase、1.25 unit)を加え、PCR(94℃で1分間、98℃で10秒間、61℃で15秒間、68℃で30秒間を1サイクルとして30サイクル実施後、4℃で保存)で増幅した。PCR増幅したDNA断片は、TapeStation D1000(アジレント社)により確認した。A集団及びB集団について行った結果を図10−1及び図10−2並びに図11−1及び図11−2にそれぞれ示した。なお、図10−1及び図10−2並びに図11−1及び図11−2において、四角で囲ったものは四季成り性の表現型を意味している。なお、図10−1〜図11−2において、Mのレーンは「みやざきなつはるか」を示し、Zのレーンは「08と−f」を示している。また、これらの結果を図12−1及び図12−2にまとめて示した。なお、図12−1及び図12−2において下線は、表現型とPCRベースマーカーの結果とが一致しなかった場合を示している。図10−1〜図12−2に示したように、バンドパターンと表現型の一致率は非常に高く(95.6%)、 IBA38559を特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅方法により、四季成り性を示す系統、一季成り性を示す系統の選抜ができることが明らかとなった。
Claims (6)
- イチゴ属植物の染色体における配列番号1、4及び5からなる群から選ばれる1つの塩基配列における少なくとも15塩基以上の連続する核酸であって、イチゴ属植物四季成り性を示さない形質に関連する単離された核酸。
- イチゴ属植物の染色体における配列番号2又は3の塩基配列における少なくとも15塩基以上の連続する核酸であって、イチゴ属植物四季成り性を示す形質に関連する単離された核酸。
- 少なくとも一方の親がイチゴ属植物である後代植物の染色体及び/又は当該親のイチゴ属植物の染色体を抽出する工程と、
上記で得られた染色体における配列番号1〜5からなる群から選ばれる1つの塩基配列における少なくとも15塩基以上の連続する核酸の存在・非存在を判定する工程とを含む、四季成り性を示すイチゴ属植物系統の製造方法。 - 上記判定する工程では、上記核酸を特異的に増幅するプライマーを用いた核酸増幅反応により当該核酸の存在・非存在を判定することを特徴とする請求項3記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記判定する工程では、上記核酸に対応するプローブを備えるDNAチップを使用することを特徴とする請求項3記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
- 上記後代植物は種子又は幼苗であり、当該種子又は幼苗から染色体を抽出することを特徴とする請求項3記載のイチゴ属植物系統の製造方法。
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