JP6554095B2

JP6554095B2 - 結核組成物及びそれを使用する方法

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Publication number: JP6554095B2
Application number: JP2016523852A
Authority: JP
Inventors: ラヴィ・アナンザ; ナタリー・カディオー; トーマス・ジー・エヴァンズ; マイケル・ストーン; バリー・ウォーカー
Original assignee: アエラスグローバルティービーワクチンファウンデーション
Priority date: 2013-06-25
Filing date: 2014-06-24
Publication date: 2019-07-31
Anticipated expiration: 2034-06-24
Also published as: ES2925950T3; US20190322709A1; US10266574B2; US20210371474A1; JP2016529223A; EP3013364B1; US20140377300A1; US11787842B2; EP3013364A4; EP4176897A1; CN105431166A; US11014969B2; ZA201509262B; CN105431166B; US20240101612A1; WO2014210018A1; EP3013364A1; JP7269806B2; JP2019187441A

Description

本開示は、部分的に、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍｔｂ）抗原を含む融合タンパク質、それをコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、それを含む組成物、及び結核に対する免疫応答を誘発する方法に関する。

結核（ＴＢ）は、毎年８００万の新しい症例及び２００万の死亡をもたらす世界的な健康問題である。ＴＢの多剤耐性株及び完全薬剤耐性株の出現は、この問題をより深刻にするだけである。Ｍｔｂのライフサイクルは３つのステージを有する。最初の感染に後続する急性期において細菌は宿主中で複製し、毒性因子が発現され、宿主による免疫応答の生成をもたらす。免疫応答が感染を制御し始めると、Ｍｔｂは潜伏した無症候性の状態に入り、その場合細菌は非複製となり、肉芽腫中に包まれる。細菌は感染個体中でこの潜伏した状態を長年持続することができ、疾患の診断及び治療を困難にする。いくつかの症例において、細菌は再活性化され、再び複製し始め、疾患状態に戻ることを引き起こす。再活性化は多数の理由で起こり得て、これらには疾患（ＨＩＶ等）、治療（化学療法等）または老化に起因する免疫系の弱体化によって引き起こされる免疫抑制が含まれる。推定２０億人が世界中でＭｔｂにより潜伏して感染し、潜伏したＭｔｂの再活性化は活性のあるＴＢ疾患の新しい症例の大部分を占める。再活性化は、肺の炎症、壊死、及び空洞化（気管支の中への病巣の流出をもたらすプロセス）に関連する。気管支病巣を持つ個体が咳をする時に生成されるエアロゾルは、感染していない感受性のある人へのＭｔｂ微生物の播種を引き起こし、このようにして伝染サイクルは維持される。

ＴＢに対する現在利用可能な唯一のワクチンであるウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）（カルメット・ゲラン桿菌）（ＢＣＧ）は、１９２１年に初めて導入された。ＢＣＧは広く利用され、研究は、いくつかの目的についてはＢＣＧが効果的である（例えば播種性ＴＢに対して）ことを示すが、潜伏したＴＢの発症、持続及び再活性化の防止に関して効果がないことが公知である。改善されたより効果的なＴＢに対するワクチンを開発する継続的な必要性がある。特に、潜伏結核感染の発症、維持及び／または再活性化からの保護を提供するワクチンを開発する必要性がある。Ｍｔｂの全体のゲノム配列の利用可能性、ならびにＭｔｂ抗原のバイオインフォマティクス及び実験分析のためのツールにより、多くの新しい可能性のあるＭｔｂワクチン候補が近年同定されている。これらには、Ｍｔｂの急性感染、潜在の維持または再活性化に関与する抗原が含まれる。臨床開発において広範囲にわたる送達戦略があり、それらはこれらの抗原及び動物モデルにおいて試験された他の抗原の組み合わせからなり、現在またはまもなく臨床治験に進むだろう。

ワクチンは、病原体感染またはヒト疾患に対して個体を予防的または治療的に免疫付与することについて大抵の場合効果的であるが、改善されたワクチンの必要性がある。促進された免疫応答を産生する組成物及び方法についての必要性もある。同様に、いくつかの免疫療法剤は患者における免疫応答を修飾するのに有用であるが、改善された免疫療法組成物及び方法についての必要性が依然として存在する。

本開示は、疾患の３つの同定されたステージ［１）感染または急性感染、２）潜伏期間または潜伏状態、及び３）活動性疾患の蘇生または再活性化］に関与する規定されたヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む結核ワクチンの生成に使用できる抗原カセット（及び規定されたバリアント）を記述する。本開示は、至適化された免疫応答を得るために抗原送達のマッチした組み合わせのマトリックスへの経路を提供するという手段で、多様な送達プラットフォームの中へ組み込まれる抗原の戦略的組み合わせも記述する。本明細書において記述される対象物は、予防的または治療的なＴＢワクチンとして使用することができる。使用可能なカセットの中への包含のための抗原の最初の選択は、多数のパラメーターに基づき、それらには、例えば、文献の充分な調査、発現データ、ヒトＴ細胞による応答、ヒト免疫原性領域の包含、マウス保護研究、及び完全なゲノム配列を備えたＴＢの大部分の株にわたる配列中の保存が含まれる。次いで、特異的抗原を調査して、それらが多様なシステム（ＢＣＧ、タンパク質、ウイルスベクター、核酸）において発現させることができること、免疫原性であること、下流の製造問題を単純化するためにタンパク質または他のベクターにおいて融合物としてそれらを作製できることが確かめられた。次いですべての選択された抗原は、単独または多様な組み合わせのいずれかで使用された場合に、マウスにおいて免疫原性であることが示され、本出願に到達した。

本明細書において記述されるコンストラクトは、以下のクラスの代表的な送達プラットフォーム、１）ウイルスベクター送達システム、２）組換えＢＣＧ、３）組換え精製タンパク質融合物、４）ＤＮＡプラスミドベクターシステム、及び５）ＲＮＡベクターシステム（しかし網羅的でない）が含まれる規定された範囲の送達プラットフォームの中へ組み込まれた。これらの送達プラットフォームは、単一のプラットフォーム単独、またはマッチした抗原プライミングブーストアプローチとしての組み合わせのいずれかにおいて使用することができる。加えて、単一ｒＢＣＧベクターシステムにおけるこれらの抗原の使用は、抗原とマッチしたプライミングとして上記の形式（タンパク質、ウイルスベクター、核酸または他のものが含まれる）のうちの任意によるブーストのために使用されると想定される。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む融合タンパク質であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む該融合タンパク質を提供する。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む融合タンパク質であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む該融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。

本開示は、融合タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む組成物；融合タンパク質をコードするベクター；ベクター及び薬学的に許容される担体を含む組成物；ベクターを含む細胞；細胞及び薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む該組成物も提供する。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む該組成物も提供する。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む１つまたは複数の融合タンパク質を免疫学的に十分な量で哺乳類へ投与することを含み、少なくとも１つの融合タンパク質が、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む、哺乳類におけるヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含む該組成物を、免疫学的に十分な量で哺乳類へ投与することを含む、哺乳類におけるヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む該組成物を、免疫学的に十分な量で哺乳類へ投与することを含む、哺乳類におけるヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における使用のための融合タンパク質であって、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む該融合タンパク質も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止における使用のための融合タンパク質であって、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む該融合タンパク質も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における融合タンパク質の使用であって、該融合タンパク質は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む、該融合タンパク質の使用も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止における融合タンパク質の使用であって、該融合タンパク質は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む、該融合タンパク質の使用も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における使用のための組成物であって、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含む該組成物も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止における使用のための組成物であって、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含む該組成物も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における組成物の使用であって、該組成物は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含む、該組成物の使用も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止における組成物の使用であって、該組成物は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含む、該組成物の使用も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における使用のための組成物であって、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む該組成物も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止における使用のための組成物であって、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む該組成物も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における組成物の使用であって、該組成物は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、該組成物の使用も提供する。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止における組成物の使用であって、該組成物は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、該組成物の使用も提供する。

添付の実施例及び／または図を参照して記述されるように、本開示は、融合タンパク質、組成物、細胞、ベクター、方法及び使用も、実質的に本明細書において記載されるように提供する。

Ａ及びＢは、ＢＣＧＳＳＩまたはＢＣＧの他の株の染色体の中への興味ある遺伝子の挿入に使用されるプラスミドのマップを示す。（Ａ）融合物の分泌のためのＡｇ８５Ｂシグナル配列を備えたコンストラクト；及び（Ｂ）膜の中へ融合物をアンカーする１９ｋＤａシグナル配列を備えたコンストラクト。抗原カセットを保有するＢＣＧ株によるワクチン接種後のインビトロ抗原応答性を示す。Ａ及びＢは、（Ａ）インビトロ刺激；タンパク質刺激に続く脾細胞におけるＩＮＦ−γ誘導を示し、（Ｂ）ＥＬＩＳｐｏｔ分析；１０μｇの５抗原融合タンパク質（コンストラクトＤ）及び合成のポリＩ：Ｃアジュバントにより２回免疫付与されたＣＢ６Ｆ１マウスからのＩＮＦ−γを発現する脾細胞の数を示す。Ａ及びＢは、（Ａ）インビトロ刺激及び（Ｂ）ＥＬＩＳｐｏｔを示す。３μｇの５抗原融合タンパク質（コンストラクトＤ）または４抗原融合タンパク質（コンストラクトＡ）及び合成ＭＰＬＴＬＲ４アジュバントにより、２回免疫付与されたＣＢ６Ｆ１マウスからの脾細胞の分析。Ａｇ８５Ｂが５抗原融合タンパク質から除去される場合、４抗原タンパク質における他の４つの抗原への応答は増加する。Ａ及びＢは、（Ａ）インビトロ刺激及び（Ｂ）ＥＬＩＳｐｏｔを示す。３μｇの野生型または修飾したＲｖ１７３３を備えた５抗原融合タンパク質（コンストラクトＤ）及び４抗原融合タンパク質、またはＲｐｆＤがＲｐｆＢによって置き換えられ、融合タンパク質の３’末端もしくは５’末端のいずれかでＲｐｆＢを備えた４抗原タンパク質により、２回免疫付与されたＣＢ６Ｆ１マウスからの脾細胞の分析。タンパク質に合成ポリＩ：Ｃアジュバントを添加した。特にＲｐｆＢが融合タンパク質の５’末端にある場合、ＲｐｆＢはＲｐｆＤよりもはるかに強い免疫応答を誘導し；修飾したＲｖ１７３３及び野生型Ｒｖ１７３３のどちらも強い免疫応答を誘導しなかった。Ａ及びＢは、ＢＣＧによりプライミングされ、４抗原融合タンパク質または５抗原融合タンパク質のいずれかによりブーストされたＣＢ６Ｆ１マウスの、ヒト型結核菌Ｈ３７Ｒｖによる攻撃投与の４週間後の（Ａ）肺及び（Ｂ）脾臓中の細菌数を示す。

本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記述する目的のためだけであり、限定するとは意図されない。

本明細書において使用される時、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」には、文脈が別段明確に指示しない限り複数の指示物が含まれる。

本明細書における数値範囲の列挙については、同程度の精度でその間に介在する各々の数が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲については、数７及び８が６及び９に加えて企図され、６．０〜７．０の範囲については、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０が明示的に企図される。

本明細書において使用される時、「急性Ｍｔｂ抗原」は、急性期結核感染に関与する任意のＭｔｂ抗原を意味する。

本明細書において使用される時、「アジュバント」は、本明細書において記載される任意の組成物へ添加してＭｔｂ抗原の免疫原性を促進する任意の分子を意味する。

本明細書において使用される時、「コード配列」または「コード核酸」はＭｔｂ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列には、調節エレメントへ作動可能に連結された開始シグナル及び終結シグナルがさらに含まれ、それらには、核酸が投与される個体または哺乳類の細胞における発現を指令することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルが含まれ得る。

本明細書において使用される時、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、特定のＭｔｂ抗原の複数のサブタイプのアライメントの分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。かかる抗原をコードするコンセンサス配列及び／または核酸分子を含むＭｔｂ抗原を含むワクチンを使用して、特定の抗原の複数のサブタイプまたはセロタイプに対する幅広い免疫を誘導することができる。

本明細書において使用される時、「エレクトロポレーション」は、生体膜における微視的な経路（孔）を誘導し、それらの存在が、細胞膜の１つの側面から他の側面へ生体分子（プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン及び水等）が通過することを可能にする、膜貫通電場パルスの使用を意味する。

本明細書において使用される時、核酸配列に関して「断片」は、全長の野生型Ｍｔｂ抗原と交差反応する、哺乳類における免疫応答を誘発できるＭｔｂ抗原の部分をコードする、核酸配列またはその部分を意味する。断片は、以下に説明されるタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。

本明細書において使用される時、ポリペプチド配列に関して「断片」または「免疫原性断片」は、全長の野生型株Ｍｔｂ抗原と交差反応する、哺乳類における免疫応答を誘発できる、ＭＴＢ抗原の部分を意味する。コンセンサスまたは野生型のＭｔｂ抗原の断片は、コンセンサスまたは野生型のＭｔｂ抗原の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％を含むことができる。いくつかの実施形態において、コンセンサスタンパク質の断片は、コンセンサスまたは野生型のタンパク質のうちの少なくとも２０アミノ酸以上、少なくとも３０アミノ酸以上、少なくとも４０アミノ酸以上、少なくとも５０アミノ酸以上、少なくとも６０アミノ酸以上、少なくとも７０アミノ酸以上、少なくとも８０アミノ酸以上、少なくとも９０アミノ酸以上、少なくとも１００アミノ酸以上、少なくとも１１０アミノ酸以上、少なくとも１２０アミノ酸以上、少なくとも１３０アミノ酸以上、少なくとも１４０アミノ酸以上、少なくとも１５０アミノ酸以上、少なくとも１６０アミノ酸以上、少なくとも１７０アミノ酸以上、少なくとも１８０アミノ酸以上を含むことができる。

本明細書において使用される時、「遺伝子コンストラクト」は、Ｍｔｂ抗原をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、調節エレメントへ作動可能に連結された開始シグナル及び終結シグナルが含まれ、それらには、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を指令することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルが含まれる。

本明細書において使用される時、「発現可能な形態」は、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、Ｍｔｂ抗原をコードするコード配列へ作動可能に連結された必要な調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。

本明細書において使用される時、「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的相同性または完全相同性（すなわち同一性）があり得る。完全に相補的な配列が標的核酸へハイブリダイズすることを、少なくとも部分的に阻害する部分的に相補的な配列は、機能的な用語「実質的に相同」を使用して表される。二本鎖核酸配列（ｃＤＮＡまたはゲノムクローン等）に関して使用される場合、「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖へハイブリダイズできるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合、「実質的に相同な」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸鋳型配列へハイブリダイズできる（すなわち、その相補物である）プローブを指す。

本明細書において使用される時、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一である」または「同一性」は、配列が規定された領域にわたって規定されたパーセンテージの同じ残基を有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させること、規定された領域にわたって２つの配列を比較すること、同一の残基が両方の配列において生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得ること、規定された領域中の位置の合計の数によってマッチした位置の数を割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。２つの配列が異なる長さであるかまたはアライメントが１つまたは複数の付着末端を産生し、比較の規定された領域が単一配列のみを含む事例において、単一配列の残基は、計算の分子ではなく分母中に含まれる。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）残基は等価であると判断できる。同一性は、手動でまたはコンピューター配列アルゴリズム（ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０等）の使用によって行うことができる。

本明細書において使用される時、「免疫応答」は、Ｍｔｂ抗原の導入に応答して、宿主の免疫系（例えば哺乳類の免疫系）の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性応答もしくは液性応答の形態、または両方であり得る。

本明細書において使用される時、「潜伏Ｍｔｂ抗原」は、潜伏期結核感染に関与する任意のＭｔｂ抗原を意味する。

本明細書において使用される時、「Ｍｔｂ抗原」は、ヒト型結核菌からの抗原（単離された抗原であり得る）、または他の抗原（複数可）との融合タンパク質の一部分を形成する抗原を意味する。

本明細書において使用される時、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または、「ポリヌクレオチド」は、ともに共有結合で連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、与えられた核酸と同じ目的のために使用できる。したがって、核酸は実質的に同一の核酸及びその相補物も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列へハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。核酸は一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖配列及び一本鎖配列の両方の部分を含有することができる。核酸はＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびに塩基の組み合わせ（ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンが含まれる）を含有することができる。核酸は化学合成法または組換え法によって得ることができる。

本明細書において使用される時、「作動可能に連結される」は、遺伝子の発現が、遺伝子が空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、プロモーターの制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置することができる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターとプロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とおよそ同じであり得る。当該技術分野において公知のように、この距離におけるバラツキは、プロモーター機能の損失なしに適合させることができる。

本明細書において使用される時、「プロモーター」は、細胞中での核酸の発現を付与、活性化または促進することができる、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに促進するならびに／または核酸の空間的発現及び／もしくは時間的発現を変更する、１つまたは複数の特異的転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含むことができ、それらは転写の開始部位から数千塩基対ほどに配置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫及び動物が含まれる源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現が起こる発生ステージに関して、または外部刺激（生理的ストレス、病原体、金属イオンまたは誘導剤等）に応答して、遺伝子構成要素の発現を構成的にまたは差異的に調節することができる。

本明細書において使用される時、「蘇生Ｍｔｂ抗原」は、結核感染の蘇生または再活性化に関与する任意のＭｔｂ抗原を意味する。

本明細書において使用される時、互換的に使用される「シグナルペプチド」及び「リーダー配列」は、本明細書において説明されるＭｔｂ抗原性タンパク質のアミノ末端に連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的にはタンパク質の局所化を指令する。本明細書において使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質が産生される細胞からのタンパク質の分泌を促進するか、または膜中にタンパク質をアンカーすることができる。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、細胞からの分泌に際して、タンパク質の残り（多くの場合成熟タンパク質と称される）から切断される。シグナルペプチド／リーダー配列はタンパク質のＮ末端に連結される。

本明細書において使用される時、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合体混合物等中で、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）へハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況において異なるだろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特異的配列についての熱融解点（Ｔ_m）よりも約５〜１０℃低いように選択することができる。Ｔ_mは、標的へ相補的なプローブの５０％が、平衡で標的配列へハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）であり得る（標的配列がＴ_mで過剰に存在するので、平衡ではプローブの５０％は占領される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が、約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度等の約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば約１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃及び長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃である、条件であり得る。ストリンジェントな条件は、不安定化剤（ホルムアミド等）の添加により達成することもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下の、４２℃でのインキュベーションで、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、または６５℃でのインキュベーションで、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、そして６５℃での０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中の洗浄が含まれる。

本明細書において使用される時、「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の相補物へ、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるか、または２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。

本明細書において使用される時、「実質的に同一」は、第１及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０もしくはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または第１の配列が第２の配列の相補物へ実質的に相補的であるならば、核酸に関する領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であることを意味する。

本明細書において使用される時、核酸に関して「バリアント」は、ｉ）参照されたヌクレオチド配列の部分もしくは断片；ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列もしくはその部分の相補物；ｉｉｉ）参照された核酸もしくはその相補物に実質的に同一の核酸；またはｉｖ）参照された核酸、その相補物もしくはそれに実質的に同一の配列へストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味する。

本明細書において使用される時、ペプチドまたはポリペプチドに関して「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列は異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持することを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を備えた参照されたタンパク質に実質的に同一のアミノ酸配列を備えたタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、類似する特性（例えば親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸によりアミノ酸を置き換えることは、典型的にはわずかな変化を伴うと当技術分野において認識される。生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、アミノ酸の相対的な類似性及び特にそれらのアミノ酸の側鎖（疎水性、親水性、電荷、サイズ及び他の特性によって現わされるような）に依存することが理解される。

本明細書において使用される時、「ベクター」は、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、バクテリア人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製する染色体外ベクターであり得る。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む。

いくつかの実施形態において、任意の特定のＭｔｂ抗原をコードする核酸分子は、マイコバクテリウムの配列、細菌のコドンに至適化された配列（大腸菌に至適化された配列等）、または哺乳類に至適化された配列（ヒトに至適化された配列等）であり得る。大腸菌に至適化された配列は、例えば融合タンパク質の産生に使用することができる。ヒトに至適化された配列は、例えばウイルスベクター中で使用することができる。コドン至適化（細菌または哺乳類のためのものにかかわらず）の方法は当業者に周知である。

いくつかの実施形態において、急性Ｍｔｂ抗原は、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＭＰＴ６４、ＰＰＥ１５、ＰＰＥ５１またはＲｖ３６１５ｃである。いくつかの実施形態において、急性Ｍｔｂ抗原は、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６またはＲｖ３６１５ｃである。いくつかの実施形態において、急性Ｍｔｂ抗原はＡｇ８５ＢまたはＥＳＡＴ６である。追加の急性Ｍｔｂ抗原は当業者に周知である。

急性Ｍｔｂ抗原Ａｇ８５ＢはＲｖ１８８６ｃとしても公知である。Ａｇ８５Ｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）、配列番号：２（大腸菌に至適化された）及び配列番号：３（ヒトに至適化された）として表１中で示され、Ａｇ８５Ｂのアミノ酸配列は、配列番号：４（マイコバクテリウムの配列）及び配列番号：５（大腸菌及びヒトに至適化された）として表１中で示される。

急性Ｍｔｂ抗原ＥＳＡＴ−６はＲｖ３８７５としても公知である。ＥＳＡＴ−６をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：６（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）及び配列番号：７（ヒトに至適化された）として表１中で示され、ＳＡＴ−６のアミノ酸配列は配列番号：８として表１中で示される。

急性Ｍｔｂ抗原ＭＰＴ６４はＲｖ１９８０ｃとしても公知である。急性Ｍｔｂ抗原ＭＰＴ６４をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：９（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）及び配列番号：１０（ヒトに至適化された）として表１中で示され、ＭＰＴ６４のアミノ酸配列は配列番号：１１として表１中で示される。

急性Ｍｔｂ抗原ＰＰＥ１５はＲｖ１０３９ｃとしても公知である。急性Ｍｔｂ抗原ＰＰＥ１５をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１２（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）及び配列番号：１３（ヒトに至適化された）として表１中で示され、ＰＥ１５のアミノ酸配列は配列番号：１４として表１中で示される。

急性Ｍｔｂ抗原ＰＰＥ５１はＲｖ３１３６としても公知である。急性Ｍｔｂ抗原ＰＰＥ５１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１５（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）、配列番号：１６（大腸菌に至適化された）及び配列番号：１７（ヒトに至適化された）として表１中で示され、ＰＰＥ５１のアミノ酸配列は配列番号：１８として表１中で示される。

急性Ｍｔｂ抗原Ｒｖ３６１５ｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１９（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）及び配列番号：２０（ヒトに至適化された）として表１中で示され、Ｒｖ３６１５ｃのアミノ酸配列は配列番号：２１として表１中で示される。

いくつかの実施形態において、潜伏Ｍｔｂ抗原はＲｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ３４０７またはＲｖ２６２８ｃである。いくつかの実施形態において、潜伏Ｍｔｂ抗原はＲｖ１７３３ｃまたはＲｖ２６２６ｃである。追加の潜伏Ｍｔｂ抗原は当業者に周知である。

野生型潜伏Ｍｔｂ抗原Ｒｖ１７３３ｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２２（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）、配列番号：２３（大腸菌に至適化された）として表２中で示され、野生型Ｒｖ１７３３ｃのアミノ酸配列は配列番号：２４として表２中で示される。これらの配列はＲｖ１７３３ｃの２つの膜貫通領域を含む。両方の膜貫通領域を欠失したＲｖ１７３３ｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２５（大腸菌に至適化された）及び配列番号：２６（ヒトに至適化された）として表２中で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号：２７（大腸菌に至適化された）及び配列番号：２８（ヒトに至適化された）として表２中で示される（Ｒｖ１７３３ｃΔ_TM）。いくつかの実施形態において、第１及び／もしくは第２の膜貫通領域の部分のみまたは両方の膜貫通領域が欠失される。大腸菌に至適化されたヌクレオチド配列（配列番号：２３）において、ＸｍａＩ制限部位を加え、これはアミノ酸ＰＧの追加に対応し；ＸｂａＩ制限部位を加え、これはアミノ酸ＳＲの追加に対応する（下線が引かれ太字で示される、加えられた配列を参照）。

潜伏Ｍｔｂ抗原Ｒｖ２６２６ｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：２９（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）、配列番号：３０（大腸菌に至適化された）及び配列番号：３１（ヒトに至適化された）として表２中で示され、Ｒｖ２６２６ｃのアミノ酸配列は配列番号：３２として表２中で示される。

潜伏Ｍｔｂ抗原Ｒｖ３４０７をコードするヌクレオチド配列は、配列番号：３３（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）、配列番号：３４（大腸菌に至適化された）及び配列番号：３５（ヒトに至適化された）として表２中で示され、Ｒｖ３４０７のアミノ酸配列は配列番号：３６として表２中で示される。

潜伏Ｍｔｂ抗原Ｒｖ２６２８ｃをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：３７（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）及び配列番号：３８（ヒトに至適化された）として表２中で示され、Ｒｖ２６２８ｃのアミノ酸配列は配列番号：３９として表２中で示される。

いくつかの実施形態において、蘇生Ｍｔｂ抗原は、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤまたはＲｐｆＥである。いくつかの実施形態において、蘇生Ｍｔｂ抗原はＲｐｆＢまたはＲｐｆＤである。追加の蘇生抗原には、Ｒｖ０８６７ｃ、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ１００９、Ｒｖ０６８５、Ｒｖ０８２４ｃ、Ｒｖ２７４４ｃ、Ｒｖ３３４７ｃ、Ｒｖ１１３０、Ｒｖ１１６９ｃ、Ｒ
ｖｌ８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ及びＲｖ２４５０ｃが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、蘇生抗原は、Ｒｖ０８６７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃまたはＲｖ２３８９ｃである。追加の蘇生Ｍｔｂ抗原は当業者に周知である。いくつかの実施形態において、蘇生抗原は、以下のＲｖ０８６７ｃ、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ１００９、Ｒｖ０６８５、Ｒｖ０８２４ｃ、Ｒｖ２７４４ｃ、Ｒｖ３３４７ｃ、Ｒｖ１１３０、Ｒｖ１１６９ｃ、Ｒｖｌ８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ及びＲｖ２４５０ｃのうちの任意の１つまたは複数ではない。いくつかの実施形態において、蘇生抗原は、Ｒｖ０８６７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃまたはＲｖ２３８９ｃではない。

蘇生Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＢはＲｖ１００９としても公知である。蘇生Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＢをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：４０（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）及び配列番号：４１（マイコバクテリウムの配列；シグナル配列を欠失）として表３中で示され、それらに対応するＲｐｆＢのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４２及び配列番号：４３として表３中で示される。

蘇生Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＤはＲｖ２３８９ｃとしても公知である。蘇生Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＤをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：４４（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）、配列番号：４５（大腸菌に至適化された；リーダー配列を欠失）及び配列番号：４６（ヒトに至適化された；リーダー配列は存在）として表３中で示され、ＲｐｆＤのアミノ酸配列は、配列番号：４７（大腸菌に至適化された）及び配列番号：４８（マイコバクテリウムの配列でありヒトに至適化された）として表３中で示される。

蘇生Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＥはＲｖ２４５０ｃとしても公知である。蘇生Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＥをコードするヌクレオチド配列は配列番号：４９（マイコバクテリウムの配列；非至適化コドン）として表３中で示され、ＲｐｆＥのアミノ酸配列は配列番号：５０として表３中で示される。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも４つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも５つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも６つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも３から少なくとも６つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも３から少なくとも５つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも３または少なくとも４つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも４から少なくとも６つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも４または少なくとも５つのＭｔｂ抗原を含む。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＲｐｆＢ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ及びＲｖ２６２６ｃＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＰＥ５１、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２８ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＰＰＥ５１、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２８ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｒｖ３４０７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含む。

本明細書において説明される融合タンパク質の任意の実施形態において、個々のＭｔｂ抗原は任意の順序で存在し得る。例えば、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含む融合タンパク質について、第１の（またはＮ末端の）抗原は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃまたはＲｐｆＤであり得；第２の抗原は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃまたはＲｐｆＤであり得；第３の抗原は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃまたはＲｐｆＤであり得；第４の（またはＣ末端の）抗原は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃまたはＲｐｆＤであり得る。本明細書において開示されるすべての融合タンパク質について同様である。

個々のＭｔｂ抗原は、Ｃ末端をＮ末端へという様式でリンカーなしにともに連結することができる（すなわちＥＳＡＴ６のＣ末端はＲｖ１７３３ｃのＮ末端に直接連結される）。あるいは、リンカーを、本明細書において開示される任意の融合タンパク質内の２つの任意のＭｔｂ抗原の間に存在させることができる。いくつかの実施形態において、リンカーは１つまたは複数の制限部位を任意で含有するＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントであり、そこでリンカーは、本明細書において開示される任意の融合タンパク質のうちの２つのＭｔｂ抗原をコードする核酸分子の間に挿入される。表５は、融合タンパク質コンストラクトの中への制限部位の導入に使用される、特定のＭｔｂ抗原についての代表的なプライマーを示す。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤを含む（コンストラクトＡ；ヌクレオチド配列は、配列番号：５１（大腸菌に至適化された；挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる）及び配列番号：５２（ヒトに至適化された；挿入されたＢｓｔＢＩ、ＰｖｕＩ及びＡｓｃＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる）であり；対応するアミノ酸配列は配列番号：５３（大腸菌に至適化された）及び配列番号：５４（ヒトに至適化された）である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＢを含む（コンストラクトＢ；ヌクレオチド配列は配列番号：５５であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：５６である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＲｐｆＢ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃを含む（コンストラクトＣ；ヌクレオチド配列は配列番号：５７であり、挿入されたＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＳａｃＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：５８である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤを含む（コンストラクトＤ；ヌクレオチド配列は、配列番号：５９（大腸菌に至適化された；挿入されたＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる）及び配列番号：６０（ヒトに至適化された；挿入されたＸｍａＩ、ＢｓｔＢＩ、ＰｖｕＩ及びＡｓｃＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる）であり；アミノ酸配列は配列番号：６１（大腸菌に至適化された）及び配列番号：６２（ヒトに至適化された）である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＰＥ５１−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２８ｃ−ＲｐｆＤを含む（コンストラクトＥ；ヌクレオチド配列は配列番号：６３であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：６４である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＰＥ５１−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２８ｃ−ＲｐｆＢを含む（コンストラクトＦ；ヌクレオチド配列は配列番号：６５であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：６６である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＲｖ３４０７−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＢを含む（コンストラクトＧ；ヌクレオチド配列は配列番号：６７であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：６８である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＲｖ３４０７−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤを含む（コンストラクトＨ；ヌクレオチド配列は配列番号：６９であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：７０である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＰＥ５１−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤを含む（コンストラクトＩ；ヌクレオチド配列は配列番号：７１であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：７２である；表４を参照）。

いくつかの実施形態において、融合タンパク質はＰＰＥ５１−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＢを含む（コンストラクトＪ；ヌクレオチド配列は配列番号：７３であり、挿入されたＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位は、それぞれ太字で下線が引かれる；アミノ酸配列は配列番号：７４である；表４を参照）。

任意のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）は、表１〜４中でリストされる特定のアミノ酸配列へ１００％または７０％〜９９．９％同一のアミノ酸配列を有することができる。任意の個々のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）のアミノ酸配列は、表１〜４中でリストされる特定のアミノ酸配列へ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列に関して、同一性または類似性は、配列をアライメントさせ、必要であるならばギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後で、表１〜４中で示されるＭｔｂ抗原についてのアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一（すなわち同じ残基）である、特定のＭｔｂ抗原中のアミノ酸残基（または事例に応じてヌクレオチド残基）のパーセンテージとして本明細書において定義される。パーセント配列同一性は、例えばＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，８２−４８９）を使用するＧａｐプログラム（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘのためのバージョン８、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって、デフォルト設定を使用して、決定することができる。％同一性として計算された任意のアミノ酸数は、事例に応じて、最も近い整数へ切り上げまたは切り捨てることができる。

任意のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）は、表１〜３中でリストされる特定のアミノ酸配列の断片であり得る。任意の個々のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）のアミノ酸配列は、表１〜３中でリストされる特定のアミノ酸配列のうちの少なくとも２０％、少なくとも１５％、少なくとも１０％、少なくとも５％、少なくとも４％、少なくとも３％、少なくとも２％または少なくとも１％を構成する連続アミノ酸を欠損することができる。省略された連続アミノ酸は、抗原のＣ末端部分またはＮ末端部分からであり得る。あるいは、省略された連続アミノ酸は抗原の内部部分からであり得、したがって少なくとも抗原のＣ末端及びＮ末端のアミノ酸を保持する。

任意のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）は、表１〜３中でリストされる特定のアミノ酸配列に比較して、１つまたは複数のアミノ酸の追加、欠失または置換を有することができる。任意の個々のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）は、表１〜３中でリストされる特定のアミノ酸配列に比較して、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２のアミノ酸の追加、欠失または置換を有することができる。アミノ酸追加、欠失または置換はＭｔｂ抗原内の任意のアミノ酸位置で起こり得る。

特定のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）が、少なくとも１つまたは複数の置換を含む場合には、置換アミノ酸（複数可）は、各々独立して任意の天然に存在するアミノ酸または任意の天然に存在しないアミノ酸であり得る。したがって、特定のＭｔｂ抗原は、天然に存在するアミノ酸である１つもしくは複数のアミノ酸置換及び／または天然に存在しないアミノ酸である１つもしくは複数のアミノ酸置換を含むことができる。個々のアミノ酸置換は、以下の、１）非極性側鎖を備えたアミノ酸のセット（例えばＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；２）負に荷電した側鎖を備えたアミノ酸のセット（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）；３）正に荷電した側鎖を備えたアミノ酸のセット（例えばＡｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；ならびに４）Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ及びＰｈｅを加えた、非荷電性極性側鎖を備えたアミノ酸のセット（例えばＡｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のうちの任意の１つから選択される。１つのクラスのメンバーを同じクラスの別のメンバーにより置換することは本明細書において企図される。天然に存在するアミノ酸には、例えばアラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）が含まれる。天然に存在しないアミノ酸には、例えばノルロイシン、オミチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ）、ノルバリン、ホモセリン、及びＥｌｌｍａｎｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１９９１，２０２，３０１−３３６中で記述されるもの等の他のアミノ酸残基アナログが含まれる。かかる天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，１８２及びＥｌｌｍａｎｅｔａｌ．（前出）の手順を使用することができる。簡潔には、これらの手順は天然に存在しないアミノ酸残基によりサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化すること、続いてＲＮＡのインビトロ転写及び翻訳を行うことを含む。

本明細書において記載されるように修飾されるＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）は、ヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する能力を保持する。すなわち、特定のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内の任意のＭｔｂ抗原が含まれる）の修飾は、生じたＭｔｂ抗原またはそれを含む融合タンパク質が、ヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発することをまだ可能にするだろう。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む、本明細書において記述される任意の融合タンパク質をコードする核酸分子も提供する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む。

本明細書において及び表１〜４中で記述される核酸分子は代表的なものである。すなわち、表１〜４中で列挙された具体的な配列は、融合タンパク質内の特定のＭｔｂ抗原をコードできる核酸分子の単に１つの例である。遺伝コードの知識を有する当業者は、同じＭｔｂ抗原をコードするおびただしい数の核酸分子をルーチンに調製しデザインすることができる。任意の特定の核酸分子の長さ及びヌクレオチドの含有量は、コードされたＭｔｂ抗原の所望されるアミノ酸配列によって規定される。ＲＮＡ核酸分子も企図されるが、表１〜４中で示される核酸分子配列はＤＮＡである。

本開示は、任意のＭｔｂ抗原（本明細書において記述される任意の融合タンパク質内のＭｔｂ抗原が含まれる）をコードするベクター（本明細書において記述される任意の修飾バージョンが含まれる）も提供する。ベクターは、哺乳類において免疫応答を誘発するのに効果的な量で哺乳類の細胞中でＭｔｂ抗原を発現することができる。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができる。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、Ｍｔｂ抗原をコードする核酸により細胞をトランスフェクションするのに有用であり得、その形質転換された宿主細胞は培養され、抗原の発現が起こる条件下で維持される。

いくつかの実施形態において、コード配列は、発現の安定性及び高レベルの発現のために至適化することができる。いくつかの場合において、コドンはＲＮＡの二次構造形成（分子内の結合に起因して形成されたもの等）を低減するように選択される。

いくつかの実施形態において、ベクターは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドンまたはポリアデニル化シグナルであり得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、Ｍｔｂ抗原をコードする異種核酸を含むことができ、開始コドン（それは抗原コード配列の上流である）及び終止コドン（それは抗原コード配列の下流である）をさらに含むことができる。開始コドン及び終止コドンは抗原コード配列とインフレームである。

ベクターは、抗原コード配列へ作動可能に連結されるプロモーターも含むことができる。Ｍｔｂ抗原コード配列へ作動可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター（ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター等）、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ最初期プロモーター等）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーターもしくはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、または同種のものであり得る。プロモーターは、ヒト遺伝子（ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネイン等）からのプロモーターでもあり得る。プロモーターは、天然または合成の組織特異的プロモーター（筋肉または皮膚特異的プロモーター等）でもあり得る。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、マイコバクテリウムのＨｓｐ６０プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、及びＣＭＶＩＥプロモーターが含まれる。

ベクターは、抗原コード配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ＣＭＶポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナルまたはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。

ベクターは、コンセンサスＢｏＮＴ−Ａ、ＢｏＮＴ−Ｂ、ＢｏＮＴ−Ｅ及びＢｏＮＴ−Ｆ抗原配列の上流にエンハンサーも含むことができる。エンハンサーはＤＮＡ発現のために必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはウイルスのエンハンサー（ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶまたはＥＢＶからのエンハンサー等）であり得る。ポリヌクレオチド機能を促進するものは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、及びＷＯ９４／０１６７３７（各々の内容は参照として完全に援用される）中で記述される。

ベクターは、細胞中でベクターを染色体外に維持しベクターの複数のコピーを産生するために、哺乳類の複製起点も含むことができる。ベクターは（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４またはｐＲＥＰ４であることができ、それらはエプスタインバーウイルス複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１のコード領域を含み、組み込みなしで高コピーエピソーム複製を産生することができる。ベクターは、ｐＶＡＸ１または変化を備えたｐＶａｘ１バリアント（本明細書において記述される異なるプラスミド等）であり得る。異なるｐＶａｘ１プラスミドは、骨格ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の２９９８塩基対のバリアントである。ＣＭＶプロモーターは塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位は塩基６６４〜６８３にある。複数のクローニング部位は塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣ起点は塩基２３２０〜２９９３にある。

ベクターは、ベクターが投与される哺乳類細胞またはヒト細胞中での遺伝子発現に良好に合わせることができる調節配列も含むことができる。コンセンサスコード配列は、宿主細胞中でのコード配列のより効果的な転写を可能にできるコドンを含むことができる。

ベクターはｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）またはｐＥＴ２８ｂ（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｃａ、Ｍａｓｓ．）であり得、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大腸菌）中でのタンパク質生産のために使用することができる。ベクターはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）でもあり得、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株中でのタンパク質生産のために使用することができる。ベクターはＭＡＸＢＡＣ（商標）の完全なバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）でもあり得、昆虫細胞中でのタンパク質生産のために使用することができる。ベクターはｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）でもあり得、哺乳類細胞（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）中でのタンパク質生産のために使用することができる。ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）（参照として完全に援用される）が含まれる、ルーチンの技法及び容易に利用可能な出発材料によってタンパク質を産生する発現ベクターまたは発現システムであり得る。

いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター及びパラミクソウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。適切なアデノウイルスベクターには、アデノウイルス４、アデノウイルス５、チンパンジーアデノウイルス３、チンパンジーアデノウイルス６３及びチンパンジーアデノウイルス６８が含まれるが、これらに限定されない。適切なワクシニアウイルスベクターには、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）が含まれるが、これらに限定されない。適切なパラミクソウイルスベクターには、改変パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ２）及び組換えヒトパラインフルエンザウイルス（ｒＨＰＩＶ２）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベクターは薬学的に許容される担体を含む組成物内に存在する。当業者は、その多くが商業的に入手可能である多数のベクターに容易に精通している。

本開示は、本明細書において開示される任意の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。宿主細胞は、例えばＭｔｂ抗原またはその断片の発現に使用することができる。Ｍｔｂ抗原またはその断片は、細胞中でインビボでも発現させることができる。Ｍｔｂ抗原またはその断片を産生するように形質転換された（例えばトランスフェクションされた）宿主細胞は、リンパ系起源の細胞株（例えばミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマまたはクアドローマ細胞株）等の不死化哺乳類細胞株であり得る。宿主細胞には、ウイルス（例えばエプスタインバーウイルス）による形質転換によって不死化された正常なリンパ系組織（Ｂ細胞等）も含まれ得る。

いくつかの実施形態において、宿主細胞には、細菌細胞（大腸菌、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の種及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等）；酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ等）；昆虫細胞株（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａからの細胞株（例えばＳｆ９及びＳｆ２１細胞株ならびにｅｘｐｒｅｓＳＦ（商標）細胞（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐ．、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ、米国））、ショウジョウバエＳ２細胞、及びＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ属のＨｉｇｈＦｉｖｅ（登録商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）等）；ならびに哺乳類細胞（ＣＯＳ１細胞及びＣＯＳ７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、Ｐｒｏｃｅｌｌ９２Ｓ、ｐｅｒＣ６、ＨＥＰＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、ＷＩ３８、マウスＥＳ細胞株（例えば１２９／ＳＶ、Ｃ５７／ＢＬ６、ＤＢＡ−１、１２９／ＳＶＪ系統から）、Ｋ５６２、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ならびにＢＷ５１４７等）が含まれるが、これらに限定されない。他の有用な哺乳類細胞株は周知であり、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）、及びＣｏｒｉｅｌｌＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓのＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＩＧＭＳ）ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃＣｅｌｌＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ、米国）から容易に利用可能である。いくつかの実施形態において、細胞は組換えＢＣＧである。これらの細胞タイプは代表的なものにすぎず、網羅的なリストであることは意味しない。

他の考慮事項の中で、そのいくつかは上記されており、宿主細胞株は、所望される様式で発現されるＭｔｂ抗原またはその断片をプロセスする能力について選択することができる。ポリペプチドの翻訳後修飾には、糖鎖付加、アセチル化、カルボキシル化及びリン酸化、脂質化及びアシル化が含まれるが、これらに限定されず、本開示の態様は、そのＭｔｂ抗原にこれらの翻訳後修飾のうちの１つまたは複数を提供する。

いくつかの実施形態において、組換えＢＣＧは、中性付近のｐＨ値（例えば約ｐＨ６〜８または約６．５〜７．５）で生体活性がある機能的なエンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）タンパク質を発現するように遺伝子操作された。エンドソーム溶解性タンパク質は、マイコバクテリウム属の菌を含有するエンドソーム（典型的には中性付近の内部ｐＨを有する）内で活性がある。ｒＢＣＧによって産生されるエンドソーム溶解性タンパク質の活性はエンドソームの崩壊をもたらし、ｒＢＣＧがエンドソームから細胞の細胞質の中へ脱出することを可能にする。いくつかの実施形態において、ＷＯ２００７／０５８６６３（その全体は参照として本明細書に援用される）中で記述されるように、遺伝子操作によってｒＢＣＧの中へ導入されるエンドソーム溶解性タンパク質はウェルシュ菌またはその変異体（ＰｆｏＡ_G137Q）からのパーフリンゴリジンＯ（ＰｆｏＡ）である。

いくつかの実施形態において、ＢＣＧによって例示されるように、マイコバクテリウム属の菌は弱毒化されている。しかしながら、当業者は、本明細書における使用のために好適な他の弱毒化マイコバクテリウム属の菌及び非弱毒化マイコバクテリウム属の菌も存在することを認識するだろう。追加のタイプのマイコバクテリウム属の菌の例には、ヒト型結核菌株ＣＤＣ１５５１、ヒト型結核菌株Ｂｅｉｊｉｎｇ、ヒト型結核菌株Ｈ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ＃：２５１７７）、ヒト型結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ＃：２５６１８）、ウシ型結核菌（ＡＴＣＣ＃：１９２１１及び２７２９１）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１５０７３）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）（ＡＴＣＣ＃：１２０５１及び１２５４９）、バテー杆菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（ＡＴＣＣ＃：３５７７２及び１３２０９）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）（ＡＴＣＣ＃：２１９８２及び３５７７５）マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１９４２１及び２５２９１）、マイコバクテリウム・ガリナラム（Ｍ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１９７１１）、マイコバクテリウム・バッカエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）（ＡＴＣＣ＃：１５４８３及び２３０２４）、癩菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）（ＡＴＣＣ＃：）、マイコバクテリウム・マリナルム（Ｍ．ｍａｒｉｎａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃：１１５６６及び１１５６７）、及びマイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｔｉ）（ＡＴＣＣ＃：１１１５２）が含まれるが、これらに限定されない。

弱毒化されたマイコバクテリウム属の菌の株の例には、ヒト型結核菌パントテン酸塩栄養要求体株、ヒト型結核菌ｒｐｏＶ変異株、ヒト型結核菌ロイシン栄養要求体株、ＢＣＧデンマーク株（ＡＴＣＣ＃３５７３３）、ＢＣＧ日本株（ＡＴＣＣ＃３５７３７）、ＢＣＧＣｈｉｃａｇｏ株（ＡＴＣＣ＃２７２８９）、ＢＣＧＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株（ＡＴＣＣ＃：２７２９０）、ＢＣＧＰａｓｔｅｕｒ株（ＡＴＣＣ＃：３５７３４）、ＢＣＧＧｌａｘｏ株（ＡＴＣＣ＃：３５７４１）、ＢＣＧＣｏｎｎａｕｇｈｔ株（ＡＴＣＣ＃３５７４５）、ＢＣＧＭｏｎｔｒｅａｌ（ＡＴＣＣ＃３５７４６）、ＢＣＧ１３３１株、ＢＣＧＴｏｋｙｏ株、ＢＣＧＭｏｒｅａｕ株、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒＡｅｒａｓ、及びＢＣＧＭｏｓｃｏｗ株が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、１つまたは複数のベクターを含む細胞は、薬学的に許容される担体を含む組成物内に存在する。

いくつかの実施形態において、Ｍｔｂ抗原またはその断片は検出可能なマーカーにより標識される。検出可能なマーカーには、放射性同位体（Ｐ³²及びＳ³⁵等）、酵素（ホースラディシュペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）及び同種のもの等）、蛍光色素、発色団、コロイド金、色素及びビオチンが含まれるが、これらに限定されない。標識したＭｔｂ抗原またはその断片を使用して、多様な細胞タイプまたは組織タイプにおける診断手順を実行することができる。インビトロまたはインビボの画像化手順のために、Ｍｔｂ抗原は、追加の薬剤（ＮＭＲ造影剤、Ｘ線造影剤または量子ドット等）により標識することができる。ポリペプチドへ検出可能な薬剤を付加する方法は当技術分野において公知である。Ｍｔｂ抗原は不溶性支持体（ビーズ、ガラスもしくはプラスチックのスライドまたは同種のもの等）へも付加することができる。

いくつかの実施形態において、Ｍｔｂ抗原またはその断片は、放射性同位体（¹¹¹Ｉｎまたは⁹⁰Ｙ等）、毒素（破傷風トキソイドまたはリシン等）、トキソイド及び化学療法剤が含まれるが、これらに限定されない治療用の薬剤へコンジュゲートすることができる。

いくつかの実施形態において、Ｍｔｂ抗原またはその断片は画像化剤へコンジュゲートすることができる。画像化剤には、例えば容易な単離または検出のための標識部分（ビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ等）が含まれる。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む該組成物も提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのＭｔｂ抗原は融合タンパク質中に存在しない。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのＭｔｂ抗原は、タンパク質の形態であり、Ｍｔｂ抗原をコードする核酸分子ではない。

いくつかの実施形態において、急性Ｍｔｂ抗原は、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＭＰＴ６４、ＰＰＥ１５、ＰＰＥ５１またはＲｖ３６１５ｃである。いくつかの実施形態において、潜伏Ｍｔｂ抗原はＲｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ３４０７またはＲｖ２６２８ｃである。いくつかの実施形態において、Ｒｖ１７３３ｃの第１及び／または第２の膜貫通領域が欠失される（Ｒｖ１７３３ｃΔＴＭ）。いくつかの実施形態において、蘇生Ｍｔｂ抗原は、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤまたはＲｐｆＥである。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも４つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；ＲｐｆＢ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ及びＲｖ２６２６ｃＭｔｂ抗原；Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；ＰＰＥ５１、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２８ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；ＰＰＥ５１、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２８ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；Ｒｖ３４０７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；またはＲｖ３４０７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む該組成物も提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、タンパク質形態で１つのＭｔｂ抗原、及び２つのＭｔｂ抗原をコードする１つまたは２つの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、タンパク質形態で２つのＭｔｂ抗原（任意で融合タンパク質として）、及び１つのＭｔｂ抗原をコードする１つの核酸分子を含む。したがって、本組成物は、タンパク質のＭｔｂ抗原（複数可）、及びＭｔｂ抗原（複数可）をコードする核酸分子（複数可）の混合物である。

いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＭｔｂ抗原が、１つまたは複数のベクター内の１つまたは複数の核酸分子によってコードされる。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のベクターは、１つまたは複数のウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターまたはパラミクソウイルスベクターのうちの任意の１つまたは複数である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターは、アデノウイルス４、アデノウイルス５、チンパンジーアデノウイルス３、チンパンジーアデノウイルス６３またはチンパンジーアデノウイルス６８である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のワクシニアウイルスベクターは改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のパラミクソウイルスベクターは、改変パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ２またはＰＩＶ３）または組換えヒトパラインフルエンザウイルス（ｒＨＰＩＶ２）のうちの任意の１つまたは複数である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＭｔｂ抗原は、融合タンパク質として同じ発現ベクター内で単一核酸分子によってコードされる。

いくつかの実施形態において、急性Ｍｔｂ抗原は、Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、ＭＰＴ６４、ＰＰＥ１５、ＰＰＥ５１またはＲｖ３６１５ｃである。いくつかの実施形態において、潜伏Ｍｔｂ抗原はＲｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ３４０７またはＲｖ２６２８ｃである。いくつかの実施形態において、Ｒｖ１７３３ｃの第１及び／または第２の膜貫通領域が欠失される。いくつかの実施形態において、蘇生Ｍｔｂ抗原は、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤまたはＲｐｆＥである。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも４つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；ＲｐｆＢ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ及びＲｖ２６２６ｃＭｔｂ抗原；Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；ＰＰＥ５１、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２８ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；ＰＰＥ５１、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２８ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；Ｒｖ３４０７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＢＭｔｂ抗原；またはＲｖ３４０７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原を含み；任意の２つ以上のＭｔｂ抗原は融合タンパク質内にあり得る。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも４つのＭｔｂ抗原を含む。いくつかの実施形態において、組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。

いくつかの実施形態において、ｒＢＣＧが、Ｍｔｂ抗原もしくは融合タンパク質、またはそれらを含むかもしくはコードする核酸及び／もしくはベクターを送達するビヒクルとして使用される場合、ＤｏｓＲレギュロンのうちのすべてまたは一部分の発現はｒＢＣＧ中でアップレギュレートされない。いくつかの実施形態において、以下のＤｏｓＲレギュロン抗原（Ｒｖ１７３８、Ｒｖ２６２３、Ｒｖ２０３１ｃ、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２６ｃ、Ｒｖ２００５ｃ、Ｒｖ３１２７、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１９９６、Ｒｖ２６２８ｃ、Ｒｖ００７９、Ｒｖ３１３０ｃ、Ｒｖ３１３１、Ｒｖ１８１３ｃ、Ｒｖ２００６、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２６２７ｃ、Ｒｖ２０３０ｃ、Ｒｖ３１３２ｃ及びＲｖ２６２９）のうちの１つまたは複数は、ｒＢＣＧ中でアップレギュレートされない。いくつかの実施形態において、ｒＢＣＧは、１）「古典的な」Ｍｔｂ抗原（８５Ａ、８５Ｂ及びＴＢ１０．４等）が含まれる、１つまたは複数のＭｔｂ抗原；２）Ｒｖ０８６７ｃ、Ｒｖ１００９、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０ｃ、Ｒｖ０２８８、Ｒｖ１００９、Ｒｖ０６８５、Ｒｖ０８２４ｃ、Ｒｖ１３４９、Ｒｖ２７４４ｃ、Ｒｖ３３４７ｃ、Ｒｖ１１３０及びＲｖ１１６９ｃから選択される少なくとも１つのＭｔｂ蘇生抗原、のアップレギュレーションを含まない。いくつかの実施形態において、ｒＢＣＧは、以下の組み合わせ、古典的抗原Ｒｖ１８８６ｃ、Ｒｖ３８０４ｃ；蘇生抗原Ｒｖ０８６７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ；及びＭｔｂ特異的抗原Ｒｖ３４０７の発現を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＢＣＧは、以下の組み合わせ、Ｒｖ３８０４ｃ、Ｒｖ１８８６ｃ及びＲｖ３４０７、または加えて、Ｒｖ３１３３ｃと、ならびにＲｖ０８６７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ及びＲｖ２３８９ｃの組み合わせの発現を含まない。いくつかの実施形態において、ｒＢＣＧは、以下の組み合わせ、ＴＢ１０．４、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ａ及びＲｖ３４０７の発現を含まない。いくつかの実施形態において、細胞はｒＢＣＧではない。

本開示は、融合タンパク質、Ｍｔｂ抗原、Ｍｔｂ抗原をコードする核酸分子のうちの任意の１つまたは複数（その融合タンパク質、細胞及び／またはベクターが含まれる）及び薬学的に許容される担体を含む組成物も提供する。組成物には例えば医薬組成物が含まれる。薬学的に許容される担体は、通常は活性成分の投与のために使用される医薬品のうちの少なくとも１つの構成要素を指す。それゆえ、担体は、当技術分野において使用される任意の医薬品賦形剤、及び投与のための任意の形態のビヒクルを含有することができる。担体には、リン酸緩衝生理食塩水、生理的食塩水、水、クエン酸塩／ショ糖／Ｔｗｅｅｎ製剤、及びエマルション（例えば油／水乳化物）が含まれるが、これらに限定されない。

組成物は、活性のある治療用の薬剤、及び多様な他の薬学的に許容される構成要素も含むことができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ（第１５版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０））を参照されたい。所望される形態は、意図される投与モード及び治療適用に依存する。組成物は、所望される製剤に依存して、薬学的に許容される非毒性の担体または希釈剤（通常は動物またはヒト投与のための医薬組成物の製剤化に使用されるビヒクルとして定義される）も含むことができる。希釈剤は組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択される。かかる希釈剤の例には、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及びハンクス液が含まれるが、これらに限定されない。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または非毒性の非治療用の非免疫原性の安定剤及び同種のものも含むことができる。

経口投与のための組成物の固形製剤は、適切な担体または賦形剤（トウモロコシデンプン、ゼラチン、ラクトース、アカシア、ショ糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、炭酸カルシウム、塩化ナトリウムまたはアルギン酸等）を含有することができる。使用できる崩壊剤には、微結晶性セルロース、トウモロコシデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム及びアルギン酸が限定されずに含まれる。使用できる錠剤結合剤には、アカシア、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ポビドン（商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、デンプン及びエチルセルロースが含まれる。使用できる潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリコーン液、タルク、ワックス、油及びコロイダルシリカが含まれる。追加の賦形剤には、例えば着色剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁剤、圧縮剤、腸溶コーティング、持続放出補助剤及び同種のものが含まれる。

いくつかの実施形態において、組成物は、デポー注射またはインプラント調製物の形態で投与することができ、それは持続放出を可能にするような様式で製剤化することができる。例示的な組成物は、水性緩衝液中で製剤化された本明細書において記載される組成物のうちの任意の１つまたは複数を含む。

いくつかの実施形態において、水または他の水性ビヒクル中で調製される経口投与のための医薬組成物の液体製剤は、様々な懸濁化剤（メチルセルロース、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ペクチン、ケルギン（ｋｅｌｇｉｎ）、カラギーナン、アカシア、ポリビニルピロリドン及びポリビニルアルコール等）を含有することができる。医薬組成物の液体製剤は、溶液、エマルション、シロップ及びエリキシルも含むことができ、活性化合物（複数可）、湿潤剤、甘味料、ならびに着色剤及び風味添加剤と共に含有する。医薬組成物の様々な液体製剤及び粉末製剤は、治療される哺乳類の肺の中への吸入のために従来の方法によって調製することができる。

いくつかの実施形態において、注射のための医薬組成物の液体製剤は、様々な担体（植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール及びプロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）及び同種のもの等）を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物はクエン酸塩／ショ糖／Ｔｗｅｅｎ担体を含む。静脈注射のために、組成物の水溶性バージョンは点滴法によって投与することができ、それによって抗真菌剤及び生理学的に許容される賦形剤を含有する医薬製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤は、例えば５％デキストロース、０．９％食塩水、リンゲル液または他の適切な賦形剤を含むことができる。適切な不溶性形態の組成物は、水性基材または薬学的に許容される油基材（例えばオレイン酸エチル等の長鎖脂肪酸のエステル等）中での懸濁物として調製及び投与することができる。

組成物は、例えば注射可能溶液、水性の懸濁物または溶液、非水性の懸濁物または溶液、固体及び液体の経口製剤、膏薬、ゲル、軟膏、皮内パッチ、クリーム、ローション、錠剤、カプセル、持続放出製剤、ならびに同種のものであり得る。いくつかの実施形態において、局所適用のために、医薬組成物は適切な軟膏中で製剤化することができる。いくつかの実施形態において、局所半固体軟膏製剤は、担体（医薬クリーム基材等）中で、典型的には約１〜２０％、または５〜１０％の濃度の活性成分を含む。局所使用のための組成物の製剤のいくつかの例には、活性成分ならびに様々な支持体及びビヒクルを含有する、ドロップ、チンキ、ローション、クリーム、溶液及び軟膏が含まれるが、これらに限定されない。

典型的には、組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとして注射可能物として調製され；注射の前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁物に好適な固体の形態も調製することができる。調製物は、リポソームまたはマイクロ粒子（アジュバント効果促進のためのポリラクチド、ポリグリコリドまたはコポリマー等）中で乳化またはカプセル化することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０，２４９，１５２７及びＨａｎｅｓ，ＡｄｖａｎｃｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖｉｅｗｓ，１９９７，２８，９７を参照）。滅菌注射可能調製物（例えば滅菌注射可能な水性または油性の懸濁物等）も調製することができる。この懸濁物は、適切な分散剤、湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当技術分野において公知の技法に従って製剤化することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、タンパク質に対する宿主の免疫応答を低減または防止するようにマイクロカプセル化デバイスにおいて送達することができる。

本開示の組成物の効果的な用量は、病態の治療のために、様々な因子（投与の手段、標的部位、対象の生理的状態、対象がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬物、及び治療は予防的または治療的なものであるかが含まれる）に依存して変動する。通常は、対象はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類が含まれる非ヒト哺乳類も治療することができる。

いくつかの実施形態において、組成物は、標準的な方法の使用によって、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、髄内、脳室内、硬膜内、動脈内、血管内、関節内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、髄腔内、腫瘍内、頭蓋内、腸経由、肺内、経粘膜、子宮内、舌下、または炎症もしくは腫瘍増殖の部位での局所の注射によって、対象へ投与することができる。あるいは、組成物は、経口、鼻腔、目、直腸、または局所が含まれる経路によって対象へ投与することができる。他の経路は効果的であり得るが、投与の最も典型的な経路は血管内、皮下、または筋肉内である。いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出組成物またはデバイス（Ｍｅｄｉｐａｄ（商標）デバイス等）として投与される。組成物は、例えば乾燥粉末吸入装置、ネビュライザーまたは用量測定式吸入器を使用して、気道経由でも投与することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射装置、「マイクロプロジェクタイル爆撃遺伝子銃（ｇｏｎｅｇｕｎｓ）」または他の物理的方法（エレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」または超音波等）によっても投与することができる。

いくつかの実施形態において、組成物は、持続放出投与によって、外科手術の間に直接適用される分解性インプラントのデポー注射のような手段によって、または対象の中への注入ポンプもしくは生体適合性持続放出インプラントの埋込みによって、対象へ投与することができる。あるいは、組成物は、注射可能デポー投与経路によって（１、３または６か月のデポー注射可能または生物分解性の材料及び方法の使用によって等）、または対象の皮膚へ組成物を含有する経皮パッチを適用すること、及び一般的に１パッチあたり１〜５時間対象の皮膚と接触させてパッチを放置することによって、対象へ投与することができる。

いくつかの実施形態において、組成物は約１ナノグラム〜約１０ｍｇの核酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０ｍｇ以上；及び２）１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ナノグラム以下、または１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム以下、または１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５もしくは１０ｍｇ以下を含む。

いくつかの実施形態において、組成物は約５ナノグラム〜約１０ｍｇの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約２５ナノグラム〜約５ｍｇの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約５０ナノグラム〜約１ｍｇの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約０．１〜約５００マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１〜約３５０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約５〜約２５０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１０〜約２００マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１５〜約１５０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約２０〜約１００マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約２５〜約７５マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約３０〜約５０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約３５〜約４０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１００〜約２００マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１０〜約１００マイクログラムの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約２０〜約８０マイクログラムの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約２５〜約６０マイクログラムの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は約０．１〜約５００マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１〜約３５０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約２５〜約２５０マイクログラムの核酸分子を含有する。いくつかの実施形態において、組成物は約１００〜約２００マイクログラムの核酸分子を含有する。

組成物は使用される投与のモードに従って製剤化することができる。組成物が注射可能医薬組成物である事例において、それらは滅菌済み、パイロジェン無し、及び微粒子無しである。等張の製剤を使用することができる。一般的に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースが含まれ得る。いくつかの事例において、等張液（リン酸緩衝生理食塩水等）は適切である。安定剤にはゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤へ添加される。

組成物は薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤としての機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、それには、界面活性剤（免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳアナログ（モノホスホリルリピドＡが含まれる）、ムラミルペプチド、キノンアナログ、小胞（スクアレン及びスクアラン等）、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオンもしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリＬ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）が含まれる）または脂質である。トランスフェクション促進剤はポリＬ−グルタミン酸塩であり、より適切には、ポリＬ−グルタミン酸塩は６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で組成物中に存在する。トランスフェクション促進剤には、界面活性剤（免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳアナログ（モノホスホリルリピドＡが含まれる）、ムラミルペプチド、キノンアナログ及び小胞（スクアレン及びスクアラン等）も含まれ、ヒアルロン酸は遺伝子コンストラクトと併用して投与されて使用することもできる。いくつかの実施形態において、プラスミド組成物には、トランスフェクションを促進する薬剤（脂質、リポソーム（ＤＮＡ−リポソーム混合物として、レシチンリポソームまたは当技術分野において公知の他のリポソーム（例えばＷ０９３２４６４０を参照）が含まれる）、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオンもしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤等）も含まれ得る。いくつかの実施形態において、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリＬ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）が含まれる）または脂質である。組成物中のトランスフェクション薬剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。

薬学的に許容される賦形剤はアジュバントであり得る。アジュバントは、代替のプラスミド中で発現されるか、または上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される、他の遺伝子であり得る。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナル配列を欠失し、任意でＩｇＥからのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５が含まれる）からなる群から選択することができる。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはその組み合わせであり得る。

有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ-ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ及びＳｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩkＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答性遺伝子、ＮＦkＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びその機能的断片をコードするものが含まれる。

プラスミド組成物は、１９９４年４月１日に出願された米国シリアル番号０２１，５７９（それは参照として完全に援用される）中で記述されるような遺伝子ワクチン促進剤をさらに含むことができる。

本開示は、本明細書において記述される、Ｍｔｂ抗原、その断片、融合タンパク質、核酸分子、ベクターまたは細胞のうちの任意のものを含むキットも提供する。キットは、例えばラベル及び投与または使用のための説明書と共に、容器（複数可）、パッケージ（複数可）または分配器（複数可）を含むことができる。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む１つまたは複数の融合タンパク質を免疫学的に十分な量で哺乳類へ投与することを含み、少なくとも１つの融合タンパク質が、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む、哺乳類におけるヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。本明細書において記述される任意の融合タンパク質を投与することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は少なくとも４つのＭｔｂ抗原を含む。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含む該組成物を、免疫学的に十分な量で哺乳類へ投与することを含む、哺乳類におけるヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。３つ以上Ｍｔｂ抗原を含む任意の組成物を投与することができる。いくつかの実施形態において、組成物は少なくとも４つのＭｔｂ抗原を含む。

本開示は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；ならびに薬学的に許容される担体を含み；Ｍｔｂ抗原のうちの少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む該組成物を、免疫学的に十分な量で哺乳類へ投与することを含む、哺乳類におけるヒト型結核菌に対する免疫応答を誘発する方法も提供する。本明細書において記述される１つまたは複数のＭｔｂ抗原タンパク質及び１つまたは複数のＭｔｂ抗原をコードする１つまたは複数の核酸分子の混合物を含む任意の組成物を投与することができる。

本明細書において記載される融合タンパク質及び組成物を使用して、結核を治療または防止することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、結核感染が減退または防止されるように、本明細書において記載される任意の融合タンパク質または組成物を、治療上効果的な量または予防的に効果的な量で、ヒトへ投与することを含む。

いくつかの実施形態において、治療されている対象は以前に結核を有すると診断されているだろう。したがって、かかる対象は、かかる治療を必要としていると診断されているだろう。あるいは、治療は、まだ結核に罹患していない対象における結核感染または結核が流行している地域へ旅行する対象への結核感染を防止することを意図し得る。

結核を患う対象の治療は標準的な方法を使用してモニターすることができる。いくつかの方法は、例えば、薬剤の投薬量を投与する前に対象における抗体レベルまたはプロファイルのベースライン値を決定すること、及び治療後にこれをプロファイルまたはレベルについての値と比較することを要する。例えば、同じサンプルの反復測定における典型的な許容実験誤差（レベルまたはプロファイルのかかる測定値の平均からの１標準偏差として表現される）より大きい等の有意な増加は、陽性の治療転帰のシグナルである（すなわち、薬剤のその投与は所望される応答を達成した）。免疫応答についての値が有意に変化しないかまたは減少するならば、陰性の治療転帰が示される。

他の実施形態において、レベルまたはプロファイルの対照値（平均及び標準偏差等）は、対照集団について決定される。典型的には、対照集団中の個体は事前の治療を受けていない。次いで、治療用の薬剤の投与後の対象におけるレベルまたはプロファイルの測定値は、対照値と比較される。対照値と比較して有意な増加（平均からの１標準偏差より大きい等）は、陽性または十分な治療転帰のシグナルである。有意な増加の欠如または減少は陰性または不十分な治療転帰のシグナルである。レベルが対照値と比較して増加している間、治療剤の投与は一般的には継続される。前述のように、対照値と比較してプラトーの到達は、治療の投与を中止または投薬量及び／または頻度を低減することができる指標である。

他の実施形態において、レベルまたはプロファイルの対照値（平均及び標準偏差等）は、治療用の薬剤による治療を受け、そのレベルまたはプロファイルが治療に応答してプラトーに達した個体の対照集団から決定される。対象におけるレベルまたはプロファイルの測定値は、対照値と比較される。対象における測定レベルが対照値と（１標準偏差を超える等）有意に異ならないならば、治療は中止することができる。対象におけるレベルが対照値より有意に下であるならば、薬剤の継続的な投与が当然とされる。対象におけるレベルが対照値より下で持続されるならば、治療の変更が指摘され得る。

他の実施形態において、現時点で治療を受けていないが、以前に治療過程を受けた対象は、抗体レベルまたはプロファイルについてモニターして、治療の再開が必要とされるかどうかを決定する。対象における測定レベルまたはプロファイルは、以前の治療過程後の対象において以前に達成された値と比較することができる。以前の測定と比較して有意な減少（同じサンプルの反復測定における典型的な許容誤差より大きい等）は、治療を再開することができるという指標である。あるいは、対象において測定した値は、治療過程を受けた後に、対象の集団において決定された対照値（平均＋標準偏差）と比較することができる。あるいは、対象における測定値は、疾患の症状がないままである予防的に治療された対象の集団、または疾患特徴の寛解を示す治療的に治療された対象の集団における対照値と比較することができる。これらのすべての事例において、対照レベルと比較して有意な減少（標準偏差より大きい等）は、対象における治療が再開されるべきである指標である。

いくつかの方法において、対象において与えられた抗原への抗体のベースライン測定を投与の前に行い、第２の測定をその後すぐに行ってピーク抗体レベルを決定し、１つまたは複数のさらなる測定を間隔を置いて行い、抗体レベルの減衰をモニターする。抗体のレベルがベースライン、またはベースラインを差し引いたピークの既定のパーセンテージ（５０％、２５％または１０％等）へ低下した場合、さらなる投薬量の抗原の投与が施される。いくつかの実施形態において、バックグラウンドを差し引いたピークまたは後続の測定レベルを、以前に決定された参照レベルと比較して、他の対象において有益な予防的または治療的な治療レジームを構成する。測定した抗体レベルが、有意に参照レベル未満（治療から利益を得る対象の集団における参照値の１標準偏差を引いた平均未満等）であるならば、抗原の追加投与の投与が指摘される。

いくつかの実施形態において、上述の方法によって治療できる対象（複数可）は、哺乳類等の動物であり、それらには、ヒト、非ヒト霊長目の動物、齧歯目の動物（ラット、マウス、ハムスター及びモルモットが含まれる）、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ及びネコが含まれるが、これらに限定されない。大部分の場合において、哺乳類はヒトである。

本開示は、ヒト型結核菌感染の治療または防止のための医薬品の調製における融合タンパク質の使用であって、融合タンパク質は、少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含み、少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原；または少なくとも２つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原を含む、該融合タンパク質の使用も提供する。

本開示は、実質的に添付の実施例及び／または図を参照して記述されるような、本明細書において記述される任意の融合タンパク質、または本明細書において記載される任意の組成物、または本明細書において記述される任意の細胞、または本明細書において記述される任意のベクター、または本明細書において記述される任意の方法、または本明細書において記述される任意の使用も提供する。

本明細書において開示される対象物がより効率的に理解されるために、実施例を以下に提供する。これらの実施例が例示の目的のためのみであること、及び任意の様式において請求される対象物を限定すると決して解釈できないことを理解すべきである。これらの実施例を通して、分子クローニング反応、及び他の標準的な組み換えＤＮＡ技法は、特別に指摘された場合を除いて、商業的に入手可能な試薬を使用して、Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔａｌ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ（１９８９）中で記述される方法に従って実行した。

実施例１：後続のプラットフォーム挿入のための基礎的なツールとしての抗原カセットの構築
５つの抗原カセット（コンストラクトＤ）はヒトコドンに至適化されており、Ａｌｄｅｖｒｏｎによって商業的に合成され、ｐＶＡＸ−１の中へクローン化された。ＭＶＡベクター中での使用のために、抗原８５Ｂはその生来のリーダー配列を備えて合成された。ＭＶＡ以外のウイルスベクターのために、抗原８５Ｂはリーダー配列を含有する遺伝子または含有しない遺伝子のいずれかと置き換えられ、これはユニークなＥｃｏＲＩ及びＸｍａＩヌクレアーゼ標的配列を使用して達成された。アデノウイルスベクターまたはＣＭＶベクターの中へ５つの抗原カセットをクローン化するために、相同性アームを備えたプライマーを使用してカセットをＰＣＲ増幅し、このＰＣＲ産物はＢＡＣの適切な領域の中へ組換えられた。

コンストラクトＤの組換えタンパク質発現のために、８５Ｂ、Ｒｖ１７３３、Ｒｖ２６２６及びＲｐｆＤ遺伝子をＤＮＡ２．０によって合成し、大腸菌発現のためにコドンを至適化した。抗原８５Ｂ及びＲｐｆＤは生来のリーダー配列なしに合成された。各々の遺伝子を、適切な制限部位を付加してそれぞれのＤＮＡ２．０ベクターからＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ｂの中へ連続してクローン化した。ＥＳＡＴ−６はＨ３７ＲｖＤＮＡからＰＣＲ増幅した。

より具体的には、タンパク質抗原をコードする遺伝子を、表５中のプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、示された制限酵素部位を介してｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の中へクローン化した。ＥＳＡＴ６をＭｔｂからＰＣＲ増幅し、最初にｐＥＴ２３ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の中へクローン化した。続いてそれをＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ｂの中へクローン化した。抗原８５Ｂ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤについてのすべての遺伝子は、大腸菌（ＤＮＡ２．０）における発現のために至適化されたそれらのコドンにより合成された。抗原Ａｇ８５Ｂ及びｒｐｆＤはＮ末端のシグナル配列をコードする塩基なしに合成され、ｒｐｆＢはＮ末端のシグナル配列なしにＭｔｂからＰＣＲ増幅された。コドン至適化遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ｂの中へクローン化し、Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグを付加した融合タンパク質を生成した。遺伝子はスペーサー配列なしに、各々の遺伝子の間の制限酵素部位のみを備えてクローン化した。Ｒｖ１７３３ｃの２つの膜貫通領域を除去するために、Ｒｖ１７３３ｃをともにライゲーションした３片においてＰＣＲ増幅した。

別の実施形態において、４抗原タンパク質及び５抗原タンパク質は、膜貫通領域を含む野生型Ｒｖ１７３３ｃにより構築された。ｐＥＴ２８ｂコンストラクトを大腸菌クローニング株中でクローン化し、制限消化によってスクリーニングし、シーケンスして各々のコンストラクトを検証した。

実施例２：組換えＢＣＧ（ｒＢＣＧ）株の構築
活動性感染、潜伏期間及び蘇生に関与する抗原を過剰発現するｒＢＣＧ株が構築された。興味ある遺伝子は、ａｔｔＢ組み込み部位でＢＣＧの染色体中の遺伝子の挿入を可能にするプラスミド中で最初にクローン化した（ｐＪＦＩＮＴ−ＲＩＡＲ）。このプラスミドは３つの異なるクローニング部位を有するので、５つの遺伝子はともに融合されず、３つの群へと分割された。Ａｇ８５ＢをＥＳＡＴ−６へ融合し（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６；配列番号：９１（ヌクレオチド）及び配列番号：９２（アミノ酸）、Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えた；配列番号：９３（ヌクレオチド）及び配列番号：９４（アミノ酸）、１９ｋＤａリポタンパク質シグナル配列を備えた）、第１のクローニング部位中に配置し、Ｒｖ１７３３ｃを単独でクローン化し、Ｒｖ２６２６ｃをＲｐｆＤと融合し（Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ；配列番号：９５及び配列番号：９６、Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えた；配列番号：９７及び配列番号：９８、１９ｋＤａリポタンパク質シグナル配列を備えた）、次いで第３の部位の中へ置いて、以下のＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６＋Ｒｖ１７３３ｃ＋Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤのコンストラクトを生成した。各々のインサートをＨｓｐ６０プロモーターの制御下に配置し、Ｒｖ１７３３ｃが既にマイコバクテリウムの膜タンパク質であるので、Ｒｖ１７３３ｃ以外の両方の融合物へシグナル配列を付加した。２つの異なるシグナル配列（融合物の分泌を可能にするＡｇ８５Ｂシグナル配列、及び膜の中へ融合物をアンカーする１９ｋＤａリポタンパク質シグナル配列）を備えたコンストラクトを作製して、どれが抗原のより良好な発現及び／または免疫原性を可能にするかを調査した。それらのｒＢＣＧ株の複製バージョン及び非複製バージョンの両方を構築した。ｒＢＣＧ株の構築に使用されたプラスミドのマップを、図１Ａ（Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えた融合物）及び図１Ｂ（１９ｋＤａシグナル配列を備えた融合物）中で示す。

ｒＢＣＧ株を、ＢＣＧＳＳＩ、ＢＣＧＳＳＩΔＰａｎＣＤまたは他のＢＣＧ株の染色体中でのシャトルプラスミドの組み込みによって構築した後に、細胞溶解物及び上清を調製して、異なる抗原の相対的な発現に加えて、ｒＢＣＧ細胞中でのそれらの局所化を評価した。プローブとしてＥＳＡＴ−６に対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットデータは、以下の通りに示された。ＢＣＧＳＳＩ対照（それはＥＳＡＴ−６についての遺伝子を有していない）は、細胞溶解物または培養上清のいずれかにおいてモノクローナル抗体との反応性を示さず；１９ｋＤａシグナル配列へ連結されたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物を発現するｒＢＣＧについて、低いレベルの融合物が検出されたが、複製ｒＢＣＧ株及び非複製ｒＢＣＧ株の両方の培養上清中でではなく細胞溶解物中でのみであり、このシグナル配列が予想されるように融合物の分泌をもたらさないことを示し；Ａｇ８５Ｂシグナル配列へ連結されたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物を発現するｒＢＣＧ株は、細胞溶解物及び培養上清の両方中で非常に高レベルの発現を示し、このシグナル配列がこの融合物の分泌をもたらすことを確認した（データ不掲載）。

抗原発現研究に続いて、予備的な免疫原性実験をＣ５７／ＢＬ６マウス中で実行し、ＢＣＧＳＳＩ対照及び２つの異なるシグナル配列を備えた融合物を発現するｒＢＣＧ株を比較した。マウスを、１０⁵または１０⁶ＣＦＵのいずれかの異なるＢＣＧ株により１回皮下で免疫付与し、６週間後に屠殺した。脾細胞を組換えＡｇ８５ＢまたはＥＳＡＴ−６タンパク質により７２時間刺激し、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、培養上清中に放出された抗原特異的ＩＦＮγのレベルを測定した。以下の結果はＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物により得られた（図２を参照）。最低用量で与えられたＢＣＧＳＳＩ対照はＩＦＮγのバックグラウンドレベルを示し、ナイーブマウスにより得られたものに類似するが、最高用量を与えられたマウスはより高いレベルのＡｇ８５Ｂ特異的ＩＦＮγを示し、しかし、ＥＳＡＴ６特異的応答はなく、これは、ＢＣＧＳＳＩ対照はＥＳＡＴ−６についての遺伝子を有していないので、予想されていた。これとは対照的に、Ａｇ８５Ｂシグナル配列へ連結されたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物を発現するｒＢＣＧ株は、両方の用量ではるかに強いＡｇ８５Ｂ特異的応答を与えたが、より高い用量でのみバックグラウンドより上のＥＳＡＴ−６応答があり；類似する結果は、１９ｋＤａシグナル配列へ連結された融合物を発現するｒＢＣＧ株により得られたが、それはより高い用量でのみであり、このことは、発現レベルがその株においてはるかに低かったことから判断すれば、意外でない（データ不掲載）。

Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物のＤＮＡ配列：
ａｔｇａｃａｇａｃｇｔｇａｇｃｃｇａａａｇａｔｔｃｇａｇｃｔｔｇｇｇｇａｃｇｃｃｇａｔｔｇａｔｇａｔｃｇｇｃａｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｔｇｔａｇｔｃｃｔｔｃｃｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｇｇｃｔｔｇｃｃｇｇｃｇｇａｇｃｇｇｃａａｃｃｇｃｇｇｇｃｇｃｇｔｔｃｔｃｃｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｔｇｃｃｇｇｔｃｇａｇｔａｃｃｔｇｃａｇｇｔｇｃｃｇｔｃｇｃｃｇｔｃｇａｔｇｇｇｃｃｇｃｇａｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｔｃｃａｇａｇｃｇｇｔｇｇｇａａｃａａｃｔｃａｃｃｔｇｃｇｇｔｔｔａｔｃｔｇｃｔｃｇａｃｇｇｃｃｔｇｃｇｃｇｃｃｃａａｇａｃｇａｃｔａｃａａｃｇｇｃｔｇｇｇａｔａｔｃａａｃａｃｃｃｃｇｇｃｇｔｔｃｇａｇｔｇｇｔａｃｔａｃｃａｇｔｃｇｇｇａｃｔｇｔｃｇａｔａｇｔｃａｔｇｃｃｇｇｔｃｇｇｃｇｇｇｃａｇｔｃｃａｇｃｔｔｃｔａｃａｇｃｇａｃｔｇｇｔａｃａｇｃｃｃｇｇｃｃｔｇｃｇｇｔａａｇｇｃｔｇｇｃｔｇｃｃａｇａｃｔｔａｃａａｇｔｇｇｇａａａｃｃｔｔｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇａｇｃｔｇｃｃｇｃａａｔｇｇｔｔｇｔｃｃｇｃｃａａｃａｇｇｇｃｃｇｔｇａａｇｃｃｃａｃｃｇｇｃａｇｃｇｃｔｇｃａａｔｃｇｇｃｔｔｇｔｃｇａｔｇｇｃｃｇｇｃｔｃｇｔｃｇｇｃａａｔｇａｔｃｔｔｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｃａｃｃｃｃｃａｇｃａｇｔｔｃａｔｃｔａｃｇｃｃｇｇｃｔｃｇｃｔｇｔｃｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｃｃｔｃｔｃａｇｇｇｇａｔｇｇｇｇｃｃｔａｇｃｃｔｇａｔｃｇｇｃｃｔｃｇｃｇａｔｇｇｇｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｇｇｔｔａｃａａｇｇｃｃｇｃａｇａｃａｔｇｔｇｇｇｇｔｃｃｃｔｃｇａｇｔｇａｃｃｃｇｇｃａｔｇｇｇａｇｃｇｃａａｃｇａｃｃｃｔａｃｇｃａｇｃａｇａｔｃｃｃｃａａｇｃｔｇｇｔｃｇｃａａａｃａａｃａｃｃｃｇｇｃｔａｔｇｇｇｔｔｔａｔｔｇｃｇｇｇａａｃｇｇｃａｃｃｃｃｇａａｃｇａｇｔｔｇｇｇｃｇｇｔｇｃｃａａｃａｔａｃｃｃｇｃｃｇａｇｔｔｃｔｔｇｇａｇａａｃｔｔｃｇｔｔｃｇｔａｇｃａｇｃａａｃｃｔｇａａｇｔｔｃｃａｇｇａｔｇｃｇｔａｃａａｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｃａｃａａｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃａａｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｃｇｇｃａｃｇｃａｃａｇｃｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｇｇｇｃｇｃｔｃａｇｃｔｃａａｃｇｃｃａｔｇａａｇｇｇｔｇａｃｃｔｇｃａｇａｇｔｔｃｇｔｔａｇｇｃｇｃｃｇｇｃａｔｇａｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔｇｇａａｔｔｔｃｇｃｇｇｇｔａｔｃｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｇｃｇｃａａｔｃｃａｇｇｇａａａｔｇｔｃａｃｇｔｃｃａｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｇａｃｇａｇｇｇｇａａｇｃａｇｔｃｃｃｔｇａｃｃａａｇｃｔｃｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｔｔｃｇｇａｇｇｃｇｔａｃｃａｇｇｇｔｇｔｃｃａｇｃａａａａａｔｇｇｇａｃｇｃｃａｃｇｇｃｔａｃｃｇａｇｃｔｇａａｃａａｃｇｃｇｃｔｇｃａｇａａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｇａｃｇａｔｃａｇｃｇａａｇｃｃｇｇｔｃａｇｇｃａａｔｇｇｃｔｔｃｇａｃｃｇａａｇｇｃａａｃｇｔｃａｃｔｇｇｇａｔｇｔｔｃｇｃａｔｇａ（配列番号：９１）。

Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物のアミノ酸配列：
ＭＴＤＶＳＲＫＩＲＡＷＧＲＲＬＭＩＧＴＡＡＡＶＶＬＰＧＬＶＧＬＡＧＧＡＡＴＡＧＡＦＳＲＰＧＬＰＶＥＹＬＱＶＰＳＰＳＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶＹＬＬＤＧＬＲＡＱＤＤＹＮＧＷＤＩＮＴＰＡＦＥＷＹＹＱＳＧＬＳＩＶＭＰＶＧＧＱＳＳＦＹＳＤＷＹＳＰＡＣＧＫＡＧＣＱＴＹＫＷＥＴＦＬＴＳＥＬＰＱＷＬＳＡＮＲＡＶＫＰＴＧＳＡＡＩＧＬＳＭＡＧＳＳＡＭＩＬＡＡＹＨＰＱＱＦＩＹＡＧＳＬＳＡＬＬＤＰＳＱＧＭＧＰＳＬＩＧＬＡＭＧＤＡＧＧＹＫＡＡＤＭＷＧＰＳＳＤＰＡＷＥＲＮＤＰＴＱＱＩＰＫＬＶＡＮＮＴＲＬＷＶＹＣＧＮＧＴＰＮＥＬＧＧＡＮＩＰＡＥＦＬＥＮＦＶＲＳＳＮＬＫＦＱＤＡＹＮＡＡＧＧＨＮＡＶＦＮＦＰＰＮＧＴＨＳＷＥＹＷＧＡＱＬＮＡＭＫＧＤＬＱＳＳＬＧＡＧＭＴＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬＡＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴＧＭＦＡ（配列番号：９２）。

１９ｋＤａシグナル配列を備えたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物のＤＮＡ配列：
ａｔｇａａｇｃｇｔｇｇａｃｔｇａｃｇｇｔｃｇｃｇｇｔａｇｃｃｇｇａｇｃｃｇｃｃａｔｔｃｔｇｇｔｃｇｃａｇｇｔｃｔｔｔｃｃｇｇａｔｇｔｔｃａａｇｃａａｃａａｇｔｃｇａｃｔａｃａｇｇａａｇｃｇｇｔｇａｇａｃｃａｃｇａｃｃｇｃｇｇｃａｇｇｔａｃｃａｃｇｇｃａａｇｃｃｃｃｇｇｃｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｔｇｃｃｇｇｔｃｇａｇｔａｃｃｔｇｃａｇｇｔｇｃｃｇｔｃｇｃｃｇｔｃｇａｔｇｇｇｃｃｇｃｇａｃａｔｃａａｇｇｔｔｃａｇｔｔｃｃａｇａｇｃｇｇｔｇｇｇａａｃａａｃｔｃａｃｃｔｇｃｇｇｔｔｔａｔｃｔｇｃｔｃｇａｃｇｇｃｃｔｇｃｇｃｇｃｃｃａａｇａｃｇａｃｔａｃａａｃｇｇｃｔｇｇｇａｔａｔｃａａｃａｃｃｃｃｇｇｃｇｔｔｃｇａｇｔｇｇｔａｃｔａｃｃａｇｔｃｇｇｇａｃｔｇｔｃｇａｔａｇｔｃａｔｇｃｃｇｇｔｃｇｇｃｇｇｇｃａｇｔｃｃａｇｃｔｔｃｔａｃａｇｃｇａｃｔｇｇｔａｃａｇｃｃｃｇｇｃｃｔｇｃｇｇｔａａｇｇｃｔｇｇｃｔｇｃｃａｇａｃｔｔａｃａａｇｔｇｇｇａａａｃｃｔｔｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇａｇｃｔｇｃｃｇｃａａｔｇｇｔｔｇｔｃｃｇｃｃａａｃａｇｇｇｃｃｇｔｇａａｇｃｃｃａｃｃｇｇｃａｇｃｇｃｔｇｃａａｔｃｇｇｃｔｔｇｔｃｇａｔｇｇｃｃｇｇｃｔｃｇｔｃｇｇｃａａｔｇａｔｃｔｔｇｇｃｃｇｃｃｔａｃｃａｃｃｃｃｃａｇｃａｇｔｔｃａｔｃｔａｃｇｃｃｇｇｃｔｃｇｃｔｇｔｃｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇａｃｃｃｃｔｃｔｃａｇｇｇｇａｔｇｇｇｇｃｃｔａｇｃｃｔｇａｔｃｇｇｃｃｔｃｇｃｇａｔｇｇｇｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｇｇｔｔａｃａａｇｇｃｃｇｃａｇａｃａｔｇｔｇｇｇｇｔｃｃｃｔｃｇａｇｔｇａｃｃｃｇｇｃａｔｇｇｇａｇｃｇｃａａｃｇａｃｃｃｔａｃｇｃａｇｃａｇａｔｃｃｃｃａａｇｃｔｇｇｔｃｇｃａａａｃａａｃａｃｃｃｇｇｃｔａｔｇｇｇｔｔｔａｔｔｇｃｇｇｇａａｃｇｇｃａｃｃｃｃｇａａｃｇａｇｔｔｇｇｇｃｇｇｔｇｃｃａａｃａｔａｃｃｃｇｃｃｇａｇｔｔｃｔｔｇｇａｇａａｃｔｔｃｇｔｔｃｇｔａｇｃａｇｃａａｃｃｔｇａａｇｔｔｃｃａｇｇａｔｇｃｇｔａｃａａｃｇｃｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｃａｃａａｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃａａｃｔｔｃｃｃｇｃｃｃａａｃｇｇｃａｃｇｃａｃａｇｃｔｇｇｇａｇｔａｃｔｇｇｇｇｃｇｃｔｃａｇｃｔｃａａｃｇｃｃａｔｇａａｇｇｇｔｇａｃｃｔｇｃａｇａｇｔｔｃｇｔｔａｇｇｃｇｃｃｇｇｃａｔｇａｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔｇｇａａｔｔｔｃｇｃｇｇｇｔａｔｃｇａｇｇｃｃｇｃｇｇｃａａｇｃｇｃａａｔｃｃａｇｇｇａａａｔｇｔｃａｃｇｔｃｃａｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｃｃｔｔｇａｃｇａｇｇｇｇａａｇｃａｇｔｃｃｃｔｇａｃｃａａｇｃｔｃｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｔｔｃｇｇａｇｇｃｇｔａｃｃａｇｇｇｔｇｔｃｃａｇｃａａａａａｔｇｇｇａｃｇｃｃａｃｇｇｃｔａｃｃｇａｇｃｔｇａａｃａａｃｇｃｇｃｔｇｃａｇａａｃｃｔｇｇｃｇｃｇｇａｃｇａｔｃａｇｃｇａａｇｃｃｇｇｔｃａｇｇｃａａｔｇｇｃｔｔｃｇａｃｃｇａａｇｇｃａａｃｇｔｃａｃｔｇｇｇａｔｇｔｔｃｇｃａｔｇａ（配列番号：９３）。

１９ｋＤａシグナル配列を備えたＡｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６融合物のアミノ酸配列：
ＭＫＲＧＬＴＶＡＶＡＧＡＡＩＬＶＡＧＬＳＧＣＳＳＮＫＳＴＴＧＳＧＥＴＴＴＡＡＧＴＴＡＳＰＧＲＰＧＬＰＶＥＹＬＱＶＰＳＰＳＭＧＲＤＩＫＶＱＦＱＳＧＧＮＮＳＰＡＶＹＬＬＤＧＬＲＡＱＤＤＹＮＧＷＤＩＮＴＰＡＦＥＷＹＹＱＳＧＬＳＩＶＭＰＶＧＧＱＳＳＦＹＳＤＷＹＳＰＡＣＧＫＡＧＣＱＴＹＫＷＥＴＦＬＴＳＥＬＰＱＷＬＳＡＮＲＡＶＫＰＴＧＳＡＡＩＧＬＳＭＡＧＳＳＡＭＩＬＡＡＹＨＰＱＱＦＩＹＡＧＳＬＳＡＬＬＤＰＳＱＧＭＧＰＳＬＩＧＬＡＭＧＤＡＧＧＹＫＡＡＤＭＷＧＰＳＳＤＰＡＷＥＲＮＤＰＴＱＱＩＰＫＬＶＡＮＮＴＲＬＷＶＹＣＧＮＧＴＰＮＥＬＧＧＡＮＩＰＡＥＦＬＥＮＦＶＲＳＳＮＬＫＦＱＤＡＹＮＡＡＧＧＨＮＡＶＦＮＦＰＰＮＧＴＨＳＷＥＹＷＧＡＱＬＮＡＭＫＧＤＬＱＳＳＬＧＡＧＭＴＥＱＱＷＮＦＡＧＩＥＡＡＡＳＡＩＱＧＮＶＴＳＩＨＳＬＬＤＥＧＫＱＳＬＴＫＬＡＡＡＷＧＧＳＧＳＥＡＹＱＧＶＱＱＫＷＤＡＴＡＴＥＬＮＮＡＬＱＮＬＡＲＴＩＳＥＡＧＱＡＭＡＳＴＥＧＮＶＴＧＭＦＡ（配列番号：９４）。

Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えたＲｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ融合物のＤＮＡ配列：
ａｔｇａｃａｇａｃｇｔｇａｇｃｃｇａａａｇａｔｔｃｇａｇｃｔｔｇｇｇｇａｃｇｃｃｇａｔｔｇａｔｇａｔｃｇｇｃａｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｔｇｔａｇｔｃｃｔｔｃｃｇｇｇｃｃｔｇｇｔｇｇｇｇｃｔｔｇｃｃｇｇｃｇｇａｇｃｇｇｃａａｃｃｇｃｇｇｇｃｇｃｇｔｔｃｔｃｃａｔｇａｃｃａｃｃｇｃａｃｇｃｇａｃａｔｃａｔｇａａｃｇｃａｇｇｔｇｔｇａｃｃｔｇｔｇｔｔｇｇｃｇａａｃａｃｇａｇａｃｇｃｔａａｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｃａａｔａｃａｔｇｃｇｔｇａｇｃａｃｇａｃａｔｃｇｇｃｇｃｇｔｔｇｃｃｇａｔｃｔｇｃｇｇｇｇａｃｇａｃｇａｃｃｇｇｃｔｇｃａｃｇｇｃａｔｇｃｔｃａｃｃｇａｃｃｇｃｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｃｔｇｃｇｇｇｃｃｔａｇａｃｃｃｇａａｔａｃｃｇｃｃａｃｇｇｃｔｇｇｃｇａｇｔｔｇｇｃｃｃｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｔａｃｔａｃｇｔｃｇａｔｇｃｇａａｃｇｃａａｇｃａｔｃｃａｇｇａｇａｔｇｃｔｃａａｃｇｔｃａｔｇｇａａｇａａｃａｔｃａｇｇｔｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｔｃａｔｃｔｃａｇａｇｃａｃｃｇｃｔｔｇｇｔｃｇｇａａｔｃｇｔｃａｃｃｇａａｇｃｃｇａｃａｔｃｇｃｃｃｇａｃａｃｃｔｇｃｃｃｇａｇｃａｃｇｃｃａｔｔｇｔｇｃａｇｔｔｃｇｔｃａａｇｇｃａａｔｃｔｇｃｔｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｃｃｔｃｇｃｃａｇｃａｔｇａｃａｃｃｇｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｔａｃｔｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｃｃｇａｃｃａｃｇｔｇａｃａｇｇｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｃｇｔａｔｇｃａｃｇｇｔｇｔｔｃａｔｃｇａａａｃｃｇｃｃｇｔｔｇｔｃｇｃｇａｃｃａｔｇｔｔｔｇｔｃｇｃｇｔｔｇｔｔｇｇｇｔｃｔｇｔｃｃａｃｃａｔｃａｇｃｔｃｇａａａｇｃｃｇａｃｇａｃａｔｃｇａｔｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｃｇｃｇｃａａｔｇｃｇａａｔｃｃｇｇｃｇｇｃａａｔｔｇｇｇｃｇｇｃｃａａｃａｃｃｇｇｔａａｃｇｇｇｔｔａｔａｃｇｇｔｇｇｔｃｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｃａｇｇｃｇａｃｇｔｇｇｇａｔｔｃｃａａｃｇｇｔｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｇｔｃｃｃｃａｇｃａａｃａｇａｔｃｇａｇｇｔｃｇｃａｇａｃａａｃａｔｔａｔｇａａａａｃｃｃａａｇｇｃｃｃｇｇｇｔｇｃｇｔｇｇｃｃｇａａａｔｇｔａｇｔｔｃｔｔｇｔａｇｔｃａｇｇｇａｇａｃｇｃａｃｃｇｃｔｇｇｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｃｃａｃａｔｃｃｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｃｇｃｇｇｃｃｇａｇａｃｔｇｇａｇｇｔｔｇｔｔｃｇｇｇｇａｇｃａｇｇｇａｃｇａｔｔａｇ（配列番号：９５）。

Ａｇ８５Ｂシグナル配列を備えたＲｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ融合物のアミノ酸配列：
ＭＴＤＶＳＲＫＩＲＡＷＧＲＲＬＭＩＧＴＡＡＡＶＶＬＰＧＬＶＧＬＡＧＧＡＡＴＡＧＡＦＳＭＴＴＡＲＤＩＭＮＡＧＶＴＣＶＧＥＨＥＴＬＴＡＡＡＱＹＭＲＥＨＤＩＧＡＬＰＩＣＧＤＤＤＲＬＨＧＭＬＴＤＲＤＩＶＩＫＧＬＡＡＧＬＤＰＮＴＡＴＡＧＥＬＡＲＤＳＩＹＹＶＤＡＮＡＳＩＱＥＭＬＮＶＭＥＥＨＱＶＲＲＶＰＶＩＳＥＨＲＬＶＧＩＶＴＥＡＤＩＡＲＨＬＰＥＨＡＩＶＱＦＶＫＡＩＣＳＰＭＡＬＡＳＭＴＰＧＬＬＴＴＡＧＡＧＲＰＲＤＲＣＡＲＩＶＣＴＶＦＩＥＴＡＶＶＡＴＭＦＶＡＬＬＧＬＳＴＩＳＳＫＡＤＤＩＤＷＤＡＩＡＱＣＥＳＧＧＮＷＡＡＮＴＧＮＧＬＹＧＧＬＱＩＳＱＡＴＷＤＳＮＧＧＶＧＳＰＡＡＡＳＰＱＱＱＩＥＶＡＤＮＩＭＫＴＱＧＰＧＡＷＰＫＣＳＳＣＳＱＧＤＡＰＬＧＳＬＴＨＩＬＴＦＬＡＡＥＴＧＧＣＳＧＳＲＤＤ（配列番号：９６）。

１９ｋＤａシグナル配列を備えたＲｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ融合物のＤＮＡ配列：
Ａｔｇａａｇｃｇｔｇｇａｃｔｇａｃｇｇｔｃｇｃｇｇｔａｇｃｃｇｇａｇｃｃｇｃｃａｔｔｃｔｇｇｔｃｇｃａｇｇｔｃｔｔｔｃｃｇｇａｔｇｔｔｃａａｇｃａａｃａａｇｔｃｇａｃｔａｃａｇｇａａｇｃｇｇｔｇａｇａｃｃａｃｇａｃｃｇｃｇｇｃａｇｇｔａｃｃａｃｇｇｃａａｇｃｃｃｃｇｇｃａｔｇａｃｃａｃｃｇｃａｃｇｃｇａｃａｔｃａｔｇａａｃｇｃａｇｇｔｇｔｇａｃｃｔｇｔｇｔｔｇｇｃｇａａｃａｃｇａｇａｃｇｃｔａａｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｃａａｔａｃａｔｇｃｇｔｇａｇｃａｃｇａｃａｔｃｇｇｃｇｃｇｔｔｇｃｃｇａｔｃｔｇｃｇｇｇｇａｃｇａｃｇａｃｃｇｇｃｔｇｃａｃｇｇｃａｔｇｃｔｃａｃｃｇａｃｃｇｃｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｃａａａｇｇｃｃｔｇｇｃｔｇｃｇｇｇｃｃｔａｇａｃｃｃｇａａｔａｃｃｇｃｃａｃｇｇｃｔｇｇｃｇａｇｔｔｇｇｃｃｃｇｇｇａｃａｇｃａｔｃｔａｃｔａｃｇｔｃｇａｔｇｃｇａａｃｇｃａａｇｃａｔｃｃａｇｇａｇａｔｇｃｔｃａａｃｇｔｃａｔｇｇａａｇａａｃａｔｃａｇｇｔｃｃｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃｇｇｔｃａｔｃｔｃａｇａｇｃａｃｃｇｃｔｔｇｇｔｃｇｇａａｔｃｇｔｃａｃｃｇａａｇｃｃｇａｃａｔｃｇｃｃｃｇａｃａｃｃｔｇｃｃｃｇａｇｃａｃｇｃｃａｔｔｇｔｇｃａｇｔｔｃｇｔｃａａｇｇｃａａｔｃｔｇｃｔｃｇｃｃｃａｔｇｇｃｃｃｔｃｇｃｃａｇｃａｔｇａｃａｃｃｇｇｇｔｔｔｇｃｔｔａｃｔａｃｔｇｃｇｇｇｔｇｃｔｇｇｃｃｇａｃｃａｃｇｔｇａｃａｇｇｔｇｃｇｃｃａｇｇａｔｃｇｔａｔｇｃａｃｇｇｔｇｔｔｃａｔｃｇａａａｃｃｇｃｃｇｔｔｇｔｃｇｃｇａｃｃａｔｇｔｔｔｇｔｃｇｃｇｔｔｇｔｔｇｇｇｔｃｔｇｔｃｃａｃｃａｔｃａｇｃｔｃｇａａａｇｃｃｇａｃｇａｃａｔｃｇａｔｔｇｇｇａｃｇｃｃａｔｃｇｃｇｃａａｔｇｃｇａａｔｃｃｇｇｃｇｇｃａａｔｔｇｇｇｃｇｇｃｃａａｃａｃｃｇｇｔａａｃｇｇｇｔｔａｔａｃｇｇｔｇｇｔｃｔｇｃａｇａｔｃａｇｃｃａｇｇｃｇａｃｇｔｇｇｇａｔｔｃｃａａｃｇｇｔｇｇｔｇｔｃｇｇｇｔｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｇａｇｔｃｃｃｃａｇｃａａｃａｇａｔｃｇａｇｇｔｃｇｃａｇａｃａａｃａｔｔａｔｇａａａａｃｃｃａａｇｇｃｃｃｇｇｇｔｇｃｇｔｇｇｃｃｇａａａｔｇｔａｇｔｔｃｔｔｇｔａｇｔｃａｇｇｇａｇａｃｇｃａｃｃｇｃｔｇｇｇｃｔｃｇｃｔｃａｃｃｃａｃａｔｃｃｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｃｇｃｇｇｃｃｇａｇａｃｔｇｇａｇｇｔｔｇｔｔｃｇｇｇｇａｇｃａｇｇｇａｃｇａｔｔａｇ（配列番号：９７）。

１９ｋＤａシグナル配列を備えたＲｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ融合物のアミノ酸配列：
ＭＫＲＧＬＴＶＡＶＡＧＡＡＩＬＶＡＧＬＳＧＣＳＳＮＫＳＴＴＧＳＧＥＴＴＴＡＡＧＴＴＡＳＰＧＭＴＴＡＲＤＩＭＮＡＧＶＴＣＶＧＥＨＥＴＬＴＡＡＡＱＹＭＲＥＨＤＩＧＡＬＰＩＣＧＤＤＤＲＬＨＧＭＬＴＤＲＤＩＶＩＫＧＬＡＡＧＬＤＰＮＴＡＴＡＧＥＬＡＲＤＳＩＹＹＶＤＡＮＡＳＩＱＥＭＬＮＶＭＥＥＨＱＶＲＲＶＰＶＩＳＥＨＲＬＶＧＩＶＴＥＡＤＩＡＲＨＬＰＥＨＡＩＶＱＦＶＫＡＩＣＳＰＭＡＬＡＳＭＴＰＧＬＬＴＴＡＧＡＧＲＰＲＤＲＣＡＲＩＶＣＴＶＦＩＥＴＡＶＶＡＴＭＦＶＡＬＬＧＬＳＴＩＳＳＫＡＤＤＩＤＷＤＡＩＡＱＣＥＳＧＧＮＷＡＡＮＴＧＮＧＬＹＧＧＬＱＩＳＱＡＴＷＤＳＮＧＧＶＧＳＰＡＡＡＳＰＱＱＱＩＥＶＡＤＮＩＭＫＴＱＧＰＧＡＷＰＫＣＳＳＣＳＱＧＤＡＰＬＧＳＬＴＨＩＬＴＦＬＡＡＥＴＧＧＣＳＧＳＲＤＤ（配列番号：９８）。

実施例３：カセット及びバリアントの融合タンパク質のクローニング及び過剰発現
融合タンパク質としての抗原カセット及びそのバリアントの調製は、以下の修飾した戦略アウトラインを必要とした。

クローン化：複数の組換え融合タンパク質を生成し、そのうちの２つは本明細書において例示され、４つのＭｔｂ抗原（ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ）を備えたもの、５つの抗原（Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ）を備えたものである。タンパク質抗原をコードする遺伝子を、表５中のプライマーを使用してＰＣＲ増幅し、示された制限酵素部位を介してｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の中へクローン化した。ＥＳＡＴ６をＭｔｂからＰＣＲ増幅し、最初にｐＥＴ２３ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の中へクローン化した。続いてそれをＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ｂの中へクローン化した。抗原８５Ｂ、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤについてのすべての遺伝子は、大腸菌（ＤＮＡ２．０）における発現のために至適化されたそれらのコドンにより合成された。Ａｇ８５Ｂ及びｒｐｆＤはＮ末端のシグナル配列をコードする塩基なしに合成され、ｒｐｆＢはＮ末端のシグナル配列なしにＭｔｂからＰＣＲ増幅された。コドン至適化遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＥＴ２８ｂの中へクローン化し、Ｎ末端の６×Ｈｉｓタグを付加した融合タンパク質を生成した。遺伝子はスペーサー配列なしに、各々の遺伝子の間の制限酵素部位のみを備えてクローン化した。Ｒｖ１７３３ｃの２つの膜貫通領域を除去するために、Ｒｖ１７３３ｃをともにライゲーションした３片においてＰＣＲ増幅した。別の実施形態において、４抗原タンパク質及び５抗原タンパク質は、膜貫通領域を含む野生型Ｒｖ１７３３ｃにより構築された。ｐＥＴ２８ｂコンストラクトを大腸菌クローニング株中でクローン化し、制限消化によってスクリーニングし、シーケンスして各々のコンストラクトを検証した。４抗原融合物及び５抗原融合物のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、Ｒｖ１７３３ｃの膜貫通領域なしに調製された。これらの融合物の後のバージョンでは、４抗原融合物中でＲｐｆＤはＲｐｆＢにより置き換えられ、融合物の５’末端または３’末端のいずれかに配置されたＲｐｆＢを備えていた。

発現：コンストラクトＤ及びその異なる融合タンパク質をコードするプラスミドを、大腸菌Ｔ７エクスプレス（ＮＥＢ）または大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。各々の融合物コンストラクトの複数のコロニーをピックアップし、トリプシン分解ダイズブロス（ＴＳＢ）（Ｓｉｇｍａ）中で３７℃で一晩振盪して増殖させた。一晩の培養物をＴＳＢ中で１：１００に希釈し、ＯＤ６００＝０．６まで３７℃で振盪しながら増殖させた。培養物を１ｍＭＩＰＴＧにより誘導し、３７℃で３時間振盪しながら増殖させた。各々の培養物の誘導アリコート及び非誘導アリコートを、４〜１２％ビス／トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、融合タンパク質の誘導を確認した。融合タンパク質の各々を発現するコロニーを、研究ストックとして−８０℃でＴＳＢ＋２０％グリセロール中で凍結した。

融合タンパク質の精製
１０ｍｌの培養物を、ＢＥ１７２６Ｄ及びその異なる融合物コンストラクトのグリセロールストックから接種し、３７℃で一晩振盪しながら増殖した。一晩の培養物を２５０ｍｌのＴＳＢ中で１：１００に希釈し、ＯＤ６００＝０．６まで３７℃で振盪しながら増殖させた。培養物を１ｍＭＩＰＴＧにより誘導し、３７℃で３時間振盪しながら増殖させた。誘導したサンプルのアリコートを、４〜１２％ビス／トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、タンパク質の誘導を確かめた。誘導した培養物を６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットを−８０℃で凍結した。ペレットを１０ｍｌのＢＰＥＲ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で融解及び再懸濁し、アリコートは試験のために採取した（溶解物）。リゾチーム（２０ｕ／ｍｌ）及びＤＮａｓｅＩ（２５Ｕ／ｍｌ）を添加して完全な細胞溶解を支援した。溶解した細胞を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集した（可溶性画分）。不溶性ペレットを１０ｍｌのＢＰＥＲバッファー中で再懸濁し、１００μｌアリコートを取り出した（不溶性画分）。再懸濁したペレット中の細胞を１０ｍｌの１０％ＢＰＥＲ緩衝液により希釈し、懸濁物を１２，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１０ｍｌの１０％ＢＰＥＲ緩衝液によりさらに３回再び洗浄した。溶解物、可溶性画分及び不溶性画分ならびに洗浄物を４〜１２％ビス／トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動して、発現を確かめ、タンパク質の細胞内局在を決定した。融合タンパク質は封入体中の不溶性ペレットへ局在化していることが見出された。不溶性ペレットを、１０ｍｌの変性結合バッファー（ＤＢＢ）（８Ｍ尿素、９２ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、７ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭトリス）ｐＨ７．８中で再懸濁した。封入体を超音波処理によって溶解し、溶解物を１２，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって残屑を清澄化した。

Ｒｖ１７３３ｃの膜貫通領域を欠失したタンパク質をカラム精製によって精製した。５ｍｌのＨｉｓＰｕｒコバルト樹脂（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＤＢＢにより平衡化し、５ｍｌの清澄化した溶解物と共にインキュベーションした。混合物を室温で９０分間揺り動かした。次いで溶解物／樹脂混合物を３０ｍｌのカラムにロードし、２５体積の変性洗浄バッファー（８Ｍ尿素、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、７５ｍＭＮａＨ₂Ｐ
Ｏ₄、１０ｍＭトリス、１２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム、ｐＨ７．８）により洗浄した。Ｈｉｓタグを付加したタンパク質を、５０、１００、３５０、５００及び１０００ｍＭイミダゾールを備えた溶出バッファー（８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、５％グリセロール）ｐＨ８．０により溶出することによって、Ｃｏ＋カラムから溶出した。溶出したタンパク質を４〜１２％ビス／トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、清浄な画分を、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、５％グリセロールから１０ｍＭトリス、５％グリセロールへ段階的に透析した。透析されたタンパク質を、純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各々の抗原の存在についてウエスタンブロットによって分析し、残存エンドトキシンの存在についてアッセイした。＜０．２５Ｕエンドトキシン／ｍｌの純粋なサンプルをアリコートにし、−８０℃で冷凍した。

ＡＫＴＡ精製機（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、野生型Ｒｖ１７３３ｃを有するタンパク質を精製した。封入体がＢＰＥＲ洗浄によって上述のように分離された後に、不溶性ペレットを１０ｍｌの変性結合緩衝液（ＤＢＢ）＋２０ｍＭイミダゾール中で再懸濁した。封入体を超音波処理によって溶解し、溶解物を１２，０００×ｇで２０分間遠心分離することによって残屑を清澄化した。５ｍｌのＮｉセファロース高性能（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）樹脂をＤＢＢにより平衡化し、１０ｍｌの清澄化した溶解物と共にインキュベーションした。混合物を室温で２時間揺り動かした。次いで混合物をＡＫＴＡ精製機にロードした。ＡＫＴＡ精製機上で使用されるすべてのラインを、ＤＢＢ＋２０ｍＭイミダゾール、変性洗浄バッファー（８Ｍ尿素、２５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、７５ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭトリス、１２ｍＭデオキシコール酸ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール）ｐＨ７．８、または溶出バッファー（８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、５％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール）により、必要に応じて平衡化した。タンパク質を勾配溶出によって溶出し（溶出バッファー１：８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、５％グリセロール、２０ｍＭイミダゾール、１００％〜０で実行；溶出バッファー２：８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、５％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール、０〜１００％で実行）、画分を収集した。陽性画分を４〜１２％ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、８Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、５％グリセロールから１０ｍＭトリス、５％グリセロールへ段階的に透析した。透析されたタンパク質を、純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、各々の抗原の存在についてウエスタンブロットによって分析し、残存エンドトキシンの存在についてアッセイした。＜０．２５Ｕエンドトキシン／ｍｌの純粋なサンプルをアリコートにし、−８０℃で冷凍した。

前述のものは、６×Ｈｉｓタグを備えて発現された４抗原タンパク質及び５抗原タンパク質の精製を記述した。タンパク質はタグなしでも発現させることができる。非タグ付加タンパク質は、クロマトグラフィー法（イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる）及び濾過方法（接線流等）を組み合わせることによって精製することができる。

実施例４：マウスにおける５抗原融合タンパク質及び４つの抗原融合タンパク質の免疫原性
５抗原融合タンパク質を、合成ポリＩ：ＣＴＬＲ３アゴニストによりアジュバント添加して、ＣＢ６Ｆ１マウスにおける免疫原性について試験した。複数の他のアジュバント（ＴＬＲ４アゴニスト等）を試験し、免疫原性であることが示され、したがって実施形態は使用されるアジュバントに非依存性であり、多くのクラスのアジュバントへ適用可能である。マウスを、アジュバントを添加した１または１０μｇの融合タンパク質により２週間間隔で２回皮下で免疫付与した。第２の免疫付与の２週間後に、マウスを屠殺し、脾細胞を単離した。脾細胞は、インビトロ刺激については組換えタンパク質抗原、及びＥＬＩＳｐｏｔ分析については組換えタンパク質または重複ペプチドによりインキュベーションした。５抗原融合タンパク質は、各々の抗原への有意なＩＦＮ−γ応答（インビトロ刺激及びＥＬＩＳｐｏｔの両方によって測定することができる）を誘導した（図３Ａ及び３Ｂを参照）。Ａｇ８５Ｂ（融合タンパク質のうちで最も免疫原性である第１の抗原）への応答は、他の抗原への応答に対してはるかに強かった。

次いで、４抗原タンパク質及び５抗原タンパク質の両方を、合成ＭＰＬＴＬＲ４アゴニストによりアジュバント添加して、ＣＢ６Ｆ１マウスにおける免疫原性について試験した。マウスを、アジュバントを添加した３μｇの融合タンパク質により２週間間隔で２回皮下で免疫付与した。インビトロ刺激及びＥＬＩＳｐｏｔのために脾細胞を単離した。脾細胞を個々の抗原または融合タンパク質により刺激した。４抗原融合タンパク質または５抗原融合タンパク質のいずれかによる免疫付与は、すべての抗原へのＩＦＮ−γ応答を誘導した。ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤへのすべての応答は、４抗原融合タンパク質（Ａｇ８５Ｂを欠損する）において５抗原融合タンパク質よりも高かった（図４Ａ及び４Ｂを参照）。

免疫原性研究は、野生型Ｒｖ１７３３ｃを備えた融合タンパク質（８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃｗｔ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ及びＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃｗｔ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ）及びＲｐｆＤがＲｐｆＢによって置き換えられた４抗原融合物（ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＢ及びＲｐｆＢ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ）上でも行われた。これらの研究は、野生型Ｒｖ１７３３ｃを含有する融合物の免疫原性と修飾したＲｖ１７３３ｃを含有する融合タンパク質の免疫原性を比較し、ＲｐｆＢを含有する融合物の免疫原性とＲｐｆＤを含有する融合タンパク質の免疫原性も比較した。この研究は、修飾したＲｖ１７３３ｃを野生型１７３３ｃにより置き換えることは全体的な免疫原性に影響を与えないが、これらの融合物中でＲｐｆＢはＲｐｆＤよりも有意に免疫原性であることを示した（図５Ａ及び５Ｂを参照）。

実施例５：進行中の保護的有効性
５抗原融合タンパク質及び４抗原融合タンパク質（ＢＥ１７２６Ｄ、Ｅ１７２６Ｄ）をマウスにおけるプライミングブースト保護実験で使用した。マウスを、ＢＣＧＳＳＩ、及び５抗原融合タンパク質を作り上げる５つのＭｔｂ抗原を過剰発現する組換えＢＣＧＳＳＩによりプライミングした。６及び８週間後に、マウスを、５抗原タンパク質または４抗原タンパク質のいずれか＋ポリＩ：Ｃアジュバントによりブーストした。第２のブーストの(４)週間後に、マウスは５０〜１００ＣＦＵのエアロゾルＭｔｂの攻撃投与を受けた。次いで攻撃投与の４及び１２週間後にマウスを屠殺して、肺（図６Ａを参照）及び脾臓（図６Ｂを参照）中の生存細菌を決定した。この実験は、Ａｇ８５Ｂへの大きな応答が、４抗原融合タンパク質における他の４つの抗原へのより幅広い応答よりも、マウスにおいてより保護的であるかどうかを決定した。

本明細書において記述された対象物に加えて、記述されたものの様々な修飾は、前述の記述から当業者に明らかである。かかる修飾も添付の請求項の範囲内であることが意図される。本出願において引用される各々の参照文献（ジャーナル論文、米国特許及び非米国特許、特許出願公報、国際特許出願公報、ジーンバンクアクセッション番号、ならびに同種のものが含まれるが、これらに限定されない）は、その全体が参照として本明細書に援用される。

Claims

５つの抗原からなる融合タンパク質であって、前記５つの抗原がヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原であり、そして、前記融合タンパク質が、以下のアミノ酸配列：
Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ（配列番号６１または配列番号６２）
と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
請求項１に記載の融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするベクター。
アデノウイルス４、アデノウイルス５、チンパンジーアデノウイルス３、チンパンジーアデノウイルス６３、またはチンパンジーアデノウイルス６８である、請求項３に記載のベクター。
請求項３に記載のベクターを含む細胞。
組換えＢＣＧである、請求項５に記載の細胞。
少なくとも３つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む組成物であって、
少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原、少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原及び少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原
を含み、
前記少なくとも１つの急性Ｍｔｂ抗原が、Ａｇ８５Ｂであり；
前記少なくとも１つの潜伏Ｍｔｂ抗原が、Ｒｖ１７３３ｃであり；及び
前記少なくとも１つの蘇生Ｍｔｂ抗原が、ＲｐｆＤであり；
前記Ｍｔｂ抗原の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、該組成物。
１つまたは複数のベクター内の１つまたは複数の核酸分子によって少なくとも２つのＭｔｂ抗原がコードされる、請求項７に記載の組成物。
前記１つまたは複数のベクターが、アデノウイルス４、アデノウイルス５、チンパンジーアデノウイルス３、チンパンジーアデノウイルス６３、チンパンジーアデノウイルス６８、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、改変パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ２）、ＰＩＶ３、またはｈＰＩＶ２から選択される、請求項８に記載の組成物。
前記少なくとも２つのＭｔｂ抗原が同一のベクター内の単一の核酸分子により融合タンパク質としてコードされる、請求項７に記載の組成物。
前記組成物が少なくとも４つのヒト型結核菌（Ｍｔｂ）抗原を含む、請求項７に記載の組成物。
Ａｇ８５Ｂ、ＥＳＡＴ６、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ２６２６ｃ及びＲｐｆＤＭｔｂ抗原；
を含み、
前記Ｍｔｂ抗原の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、請求項７に記載の組成物。
さらに薬学的に許容される担体を含む、請求項７に記載の組成物。
Ａｇ８５Ｂ−ＥＳＡＴ６−Ｒｖ１７３３ｃ−Ｒｖ２６２６ｃ−ＲｐｆＤ（配列番号６１または配列番号６２）である、融合タンパク質。