JP6543668B2 - 成長ホルモンポリペプチド並びにその作成及び使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)からのSBIR助成2R44GM079873−02のもと、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本出願は、全てが係属中である、2009年6月8日に出願の米国仮特許出願第61/185,112号、2009年8月25日に出願の同61/236,836号、及び2009年11月10日に出願の同61/280,955号、並びにその両方が2010年2月3日に出願された米国特許出願第12/699,761号、及びPCT出願第PCT/US10/23106号の優先権を主張するものであり、これらの全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
(XTEN)x−GH−(XTEN)y:I
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;xは0又は1のいずれかであり、及びyは0又は1であり、ここでx+y≧1であり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態においては、XTENを成長ホルモンのN−又はC−末端を介して成長ホルモンに融合させる。いくつかの実施形態において単離した融合タンパク質は、ヒト成長ホルモン並びにAE912、AM923、AE144、及びAE288から選択される第一及び第二のXTENを含む。
(XTEN)x−(GH)−(S)y−(XTEN)y:II
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり及びyは0又は1のいずれかであり、ここでx+y≧1であり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(GH)−(S)x−(XTEN)−(S)y−(GH)−(S)z−(XTEN)z:III
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;zは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(S)y−(GH)−(S)z−(XTEN)−(GH):IV
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;zは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(GH)x−(S)x−(GH)−(S)y−(XTEN):V
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)−(S)x−(GH)−(S)y−(GH):VI
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)−(S)x−(GH)−(S)y−(GH)−(XTEN):VII
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
((S)m−(GH)x−(S)n−(XTEN)y−(S)o)t:VIII
式中、(1)x+y>1、(2)t=1、x>0及びy>0である場合、(3)1つより多いGH、S、又はXTENが含まれ、GH、XTEN、又はSがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合;及び(4)t>1であり、各サブユニット中に含まれるm、n、o、x、又はyがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合以外は、tは0より大きい整数であり(1、2、3、など);m、n、o、x、及びyはそれぞれ独立して整数であり(0、1、2、3、など)、GHは成長ホルモンであり;Sは任意に開裂部位を含むスペーサーであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
表1から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%同一である成長ホルモン(GH)を含む単離した融合タンパク質であって、前記成長ホルモンは少なくとも約200アミノ酸残基の伸張組換えポリペプチド(XTEN)に結合しており、そして該XTENが、
(a)該XTEN配列が、表3から選択された同等の長さのアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を示す、少なくとも約200の連続したアミノ酸を含み;
(b)−9又はそれを超えるスコアに基づくTEPITOPEアルゴリズムによってXTEN配列中にあるエピトープの予測を行った場合に、該XTEN配列は予測されるT細胞エピトープを含まず;
(c)10未満の部分列スコアを有し;及び
(d)グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)及びプロリン(P)残基の総和が、XTENの全アミノ酸残基の約90%より多くを構成することを特徴とする、
単離した融合タンパク質。
(項目2)
該成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、項目1に記載の単離した融合タンパク質。
(項目3)
第二のXTEN配列をさらに含む単離した融合タンパク質であって、かつ、該融合タンパク質が表5に示した多重XTEN配置をとる、項目1又は2に記載の単離した融合タンパク質。
(項目4)
該成長ホルモンペプチド及び該XTENがスペーサーを介して結合しており、ここで該スペーサー配列が1〜約50までのアミノ酸残基を含み、そして該スペーサーが開裂配列を任意に含む、項目1〜3のいずれか1項に記載の単離した融合タンパク質。
(項目5)
該融合タンパク質が、XTENをもたない対応する天然の成長ホルモンと同じ標的受容体に結合し、かつ、前記融合タンパク質が、XTENをもたない対応する成長ホルモンの結合親和性の少なくとも約0.1%〜30%を保持する、項目1〜4のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
(項目6)
表35、表36、及び表37から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目1〜5のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
(項目7)
項目1〜6のいずれかに記載の単離した融合タンパク質及び薬学上許容可能な担体を含む医薬組成物。
(項目8)
式Iに従って配置される、項目1〜6のいずれかに記載の単離したタンパク質であって、
(XTEN)x−GH−(XTEN)y (I)
式中、各産物について独立して:
(a)xは0又は1のいずれかであり;及び
(b)yは0又は1のいずれかであり、
ここでx+y≧1である、
単離したタンパク質。
(項目9)
該XTENを、該成長ホルモンのN末端又はC末端を介して成長ホルモンに融合させた、項目1〜6のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
(項目10)
ヒト成長ホルモン、並びにAE912、AM923、AE144、及びAE288から選択された第一の及び第二のXTENを含む、項目1〜6及び8〜9のいずれかに記載の単離した融合タンパク質。
(項目11)
項目1〜6及び8〜10のいずれかに記載の単離した融合タンパク質であって、
(i)対象に投与した場合のXTENをもたない対応する成長ホルモンと比較して、同等のモル用量で対象に投与した場合に、該融合タンパク質がより長い終末相半減期を有する;
(ii)他の点では同等な投与計画で、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも、少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積(AUC)を達成する;
(iii)他の点では同等な投与計画で、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも、少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する;
(iv)他の点では同等なモル量で、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも、該融合タンパク質を低頻度で投与した場合に、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積(AUC)を達成する;
(v)他の点では同等なモル量で、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも、該融合タンパク質を低頻度で投与した場合に、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する;
(vi)他の点では同等な投与期間、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも、累積してより少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等の濃度曲線下面積(AUC)を達成する;又は
(vii)他の点では同等な投与期間、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも、累積してより少ないモル量の該融合タンパク質を投与した場合に、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等の治療効果を達成する
、ことを特徴とする、
単離した融合タンパク質。
(項目12)
1つ以上の伸張組換えポリペプチド(XTEN)に融合させた成長ホルモン(GH)を含む融合タンパク質の生産方法であって、
(a)項目1又は6に記載の融合タンパク質をコードしている組換えポリヌクレオチド分子を含む宿主細胞を準備する工程;
(b)該融合タンパク質が発現できる条件下において該宿主細胞を培養する工程;及び
(c)該融合タンパク質を回収する工程を含む、生産方法。
(項目13)
該融合タンパク質の該成長ホルモンが、
(a)ヒト成長ホルモン;又は
(b)表1から選択された配列
と、少なくとも90%の配列同一性を有する、項目12に記載の方法。
(項目14)
発現した融合タンパク質中の1つ以上のXTENが、表3から選択された配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、項目12又は13に記載の方法。
(項目15)
該融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド分子が、表35、表36、及び表37から選択された核酸配列と少なくとも90%の配列同一性を示す核酸配列を含む、項目12〜14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記融合タンパク質の該宿主細胞中での発現を高めるために、該ポリヌクレオチドのコドンを最適化する、項目12〜15のいずれかに記載の方法。
(項目17)
該宿主細胞が原核細胞である、項目12〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
該宿主細胞の細胞質から、該単離した融合タンパク質を実質的に可溶性の形態で回収する、項目12〜17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
項目1〜6及び8〜11の融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む、単離した核酸。
(項目20)
項目19に記載の核酸を含む、発現ベクター。
(項目21)
項目19に記載の核酸を含み、かつ、原核宿主細胞である、単離した宿主細胞。
(項目22)
治療上有効量の、項目1〜6及び8〜11のいずれかに記載の融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、対象における成長ホルモンに関連した状態の治療方法。
(項目23)
該成長ホルモンに関連した状態が、成長ホルモンの欠如、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、特発性低身長、AIDS消耗症候群、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び筋ジストロフィーから選択される、項目22に記載の方法。
(項目24)
該治療上有効量が、該融合タンパク質の治療ウインドウ中での該融合タンパク質の血中濃度を、同等の量で対象に投与されるXTENをもたない対応する天然の成長ホルモンと比較して、少なくとも3倍長く維持する、項目22又は23に記載の方法。
(項目25)
治療上効果的な用量計画に則って該融合タンパク質を対象に1回以上連続して投与すると、該融合タンパク質の血中レベルの連続したCmaxのピーク及び/又はCminの谷の間の時間が、GHの確立された治療上の投与計画に則って投与される該融合タンパク質に結合していない対応する成長ホルモンと比較して長くなる、項目22〜24のいずれかに記載の方法。
(項目26)
項目22〜25のいずれかに記載の方法であって、
(i)他の点では同等の投与計画で、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも少ないモル量の該融合タンパク質を対象に投与すると、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等な治療効果を達成する;
(ii)他の点では同等のモル量で、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンよりも該融合タンパク質を低頻度で投与すると、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等な治療効果を達成する;又は
(iii)他の点では同等の投与期間、対象に投与されるXTENをもたない対応する成長ホルモンと比較して、累積してより少ないモル量の該融合タンパク質を投与すると、該融合タンパク質がXTENをもたない対応する成長ホルモンと同等な治療効果を達成する
、方法。
(項目27)
該治療効果が、IGF−1濃度、IGFBP3濃度、身長発育速度、除脂肪体重、総体脂肪、体幹脂質、インスリン耐性試験への反応、軟骨細胞の***速度、軟骨細胞数、骨密度、骨成長、及び骨端板幅の増加、から選択される測定指標である、項目26に記載の方法。
(項目28)
項目7に記載の医薬組成物、該医薬組成物を識別するラベル、並びに、保管、再構成及び/又は該医薬組成物の対象への投与についての取扱説明書を含むキット。
本明細書で使用する場合、以下の用語は、特段の指定のない限り、それらに割り当てられた意味を有する。
本発明の実施においては、別段の指定のない限り、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、遺伝学及び組換えDNAの、当該分野において標準的な技術が用いられる。その内容の全体が参照することにより本明細書に組み入れられる、Sambrook, J. et al.,「Molecular Cloning: A Laboratory Manual,」3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001;「Current protocols in molecular biology」, F. M. Ausubel, et al. eds.,1987; the series「Methods in Enzymology」Academic Press, San Diego, CA.;「PCR 2: a practical approach」, M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., Oxford University Press, 1995; 「Antibodies, a laboratory manual」Harlow, E. 及び Lane, D. eds., Cold Spring Harbor Laboratory,1988;「Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,」11th Edition, McGraw−Hill, 2005; 及び Freshney, R.I.,「Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique」4th edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000、を参照のこと。
本発明は部分的には、ヒト成長ホルモン(hGH)を含む、成長ホルモン(GH)の融合タンパク質組成物に関する。
「成長ホルモン」又は「GH」は、成長ホルモンタンパク質、並びにその種及び配列変異体を意味し、ヒトGHの191一本鎖アミノ酸配列を含むが、これには限定されない。GHは、天然の、完全長タンパク質であってもよく、又は、天然のタンパク質の生理活性を少なくとも部分的に保持する切断型断片又は配列変異体であってもよい。下垂体由来のヒトGH(以下「hGH」)については2つの型が知られている。1つは約22,000ダルトンの分子量を有し(22kD hGH)、もう一方は約20,000ダルトンの分子量を有する(20kD hGH)。20kD HGHは、191のアミノ酸からなる22kD hGHから、32番目から46番目の15アミノ酸残基を欠いたものと一致するアミノ酸配列を有する。いくつかの報告は、20kD hGHが22kD hGHよりも低いリスク及び高い活性を示すことが確認されたことを示した。本発明は、GHXTEN組成物用の、本明細書において開示したXTENの融合パートナーとしての使用に適切な、22 kD、20kD hGH、並びにその種及び配列変異体、及びその切断型断片の使用について検討する。クローニングしたhGH遺伝子の分泌型での大腸菌(Eschericha coli)内における発現(米国特許第4,898,830号;Chang, C. N., et al., Gene 55:189 [1987])、及びそのDNA及びアミノ酸配列が報告されている(Goeddel, et al. Nature ,281:544 [1979);Gray, et al., Gene 39: 247[1985])。
本発明は部分的には、成長ホルモン(GH)の融合タンパク質組成物に関する。一態様において本発明は、伸張組換え組換えポリペプチド(「XTEN」)に共有結合した、GHの完全長配列又は配列変異体を含む、GHの単離した単量体融合タンパク質を提供する。以下により詳細に記載するように、融合タンパク質は、プロテアーゼを作用させた場合にXTEN配列からGHを分離し、融合タンパク質からGHを放出するための開裂配列をさらに含むスペーサー配列を任意に含む。
一態様において本発明は、GHXTEN融合タンパク質を生じる、GHが結合するのに有用な融合タンパク質パートナーとしてのXTENポリペプチド組成物を提供する。XTENは通常、主に小さい親水性アミノ酸からなる、天然に生じない、実質的に非反復的な配列の、伸張した長さのポリペプチドであり、生理的な条件下において二次構造又は三次構造の程度が低い、又はそれら構造をとらないものである。
いくつかの実施形態において、組成物のXTEN配列は実質的に非反復性である。通常、反復性アミノ酸配列は、コラーゲン及びロイシンジッパーのような天然の反復性配列に代表されるように、凝集する又は高次構造を形成する傾向に、又は結晶若しくは疑似結晶構造を生じるように接触する傾向にある。一方、非反復性配列が凝集しにくい傾向にあることは、もしも配列が反復性ならば凝集しやすくなるであろう、相対的に少ない数の荷電したアミノ酸頻度を有する、長い配列のXTENを設計することを可能にする。通常GHXTEN融合タンパク質は、実質的に非反復配列であり、約100よりも長く約3000アミノ酸残基までの長さの、好ましくは累積して400より長く約3000残基までの長さの、XTEN配列を含む。一実施形態においてXTEN配列は、セリン以外の同一のアミノ酸型が配列中で3つ連続することがなく、同一のアミノ酸型が3つ連続する場合にはそのアミノ酸はセリンでしかない、約100より長く約3000までの長さのアミノ酸残基、好ましくは400より長く約3000までの長さのアミノ酸残基を有する。前述した実施形態において、XTEN配列は、実質的に非反復性となるであろう。
本発明は、アミノ酸配列が非反復性であるより短い配列又はモチーフの単位を複数含む、XTENを包含する。XTEN配列の設計においては、XTEN配列を作出するために多量体化した配列モチーフのライブラリーを用いた「ビルディングブロック(building block)」法の使用にもかかわらず、非反復性の基準を満たしうることを発見した。従って、XTEN配列がわずか4つの異なる型の配列モチーフを、複数単位含む場合でも、モチーフ自体が通常非反復性アミノ酸配列からなることから、XTEN配列全体は実質的に非反復性となる。
*は、様々な置換を入れて用いた場合にも、個々のモチーフ配列が「ファミリー配列」を生じることを示す。
本発明の別の態様においては、本発明は、伸張した長さの配列を有するXTENポリペプチドの担体を含むGHXTEN組成物を包含する。本発明は、非反復性の、非構造性ポリペプチドの長さの増大がXTENの非構造性の特性を向上させ、その結果、XTEN担体を含む融合タンパク質の生物学的及び薬物動態学的特性を向上させるという発見を活用する。実施例においてより詳細に記載するように、XTENの長さを比例的に増大させると、それが単一ファミリーの配列モチーフ(例えば、表2の4種類のAEモチーフ)を固定した順番で繰り返すことによって作出したものであっても、GORアルゴリズムにより決定されるランダムコイル形成のパーセンテージが、より短い長さのXTENと比較した場合よりも高くなる。実施例において記載するように、通常、非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを増大させると、より短い長さの配列の非構造性ポリペプチドパートナーを有する融合タンパク質に比べて、融合タンパク質の終末相半減期は不釣り合いなまでに増大する。
一実施形態において本発明は、XTEN構成要素の累積した長さが約100より長く約3000アミノ酸残基までの長さであり、XTEN構成要素が表3、8、9、10、11、及び12から選択された少なくとも1種類のポリペプチド配列セグメントを含み、XTEN配列のその他の部分が全体にわたって少なくとも約90%、又は少なくとも約91%、又は少なくとも約92%、又は少なくとも約93%、又は少なくとも約94%、又は少なくとも約95%、又は少なくとも約96%、又は少なくとも約97%、又は少なくとも約98%又はそれ以上の親水性アミノ酸を含み、そしてXTEN配列のその他の部分が約2%未満の疎水性又は芳香族アミノ酸、又はシステインからなる、単離したGHXTEN融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態においてXTENは、同一の又は異なる複数のセグメントを含む。別の実施形態において本発明は、XTEN構成要素の累積した長さが約100より長く約3000アミノ酸残基までの長さであり、XTEN構成要素が少なくとも約100〜約923、又は少なくとも約100〜約875、又は少なくとも約100〜約576、又は少なくとも約100〜約288、又は少なくとも約100〜約144までのアミノ酸残基の少なくとも1種類の配列セグメントを含み、ここで配列セグメントは少なくとも3種類の異なる型のアミノ酸を含み、かつ、配列セグメント中のグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)及びプロリン(P)残基の総和が配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約90%、又は少なくとも約91%、又は少なくとも約92%、又は少なくとも約93%、又は少なくとも約94%、又は少なくとも約95%、又は少なくとも約96%、又は少なくとも約97%、又は少なくとも約98%、又は少なくとも約99%を構成し、そしてXTEN配列のその他の部分の及び少なくとも約90%、又は少なくとも約91%、又は少なくとも約92%、又は少なくとも約93%、又は少なくとも約94%、又は少なくとも約95%、又は少なくとも約96%、又は少なくとも約97%、又は少なくとも約98%が親水性アミノ酸を含み、XTEN配列のその他の部分の未満約2%が疎水性芳香族アミノ酸、又はシステインを含む、単離したGHXTEN融合タンパク質を提供する。別の実施形態において本発明は、XTEN構成要素の累積した長さが約100より長く約3000アミノ酸残基までの長さであり、かつ、XTEN構成要素が少なくとも約200〜約923、又は少なくとも約200〜約875、又は少なくとも約200〜約576、又は少なくとも約200〜約288アミノ酸残基の少なくとも1種類の配列セグメントを含み、ここで配列セグメント中のグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)及びプロリン(P)残基の総和は配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約90%、又は少なくとも約91%、又は少なくとも約92%、又は少なくとも約93%、又は少なくとも約94%、又は少なくとも約95%、又は少なくとも約96%、又は少なくとも約97%、又は少なくとも約98%、又は少なくとも約99%を構成し、そしてセグメントの部分列スコアが12未満、より好ましくは10未満、より好ましくは9未満、より好ましくは8未満、より好ましくは7未満、より好ましくは6未満、及び最も好ましくは5未満であり、XTEN配列のその他の部分の少なくとも約90%、又は少なくとも約91%、又は少なくとも約92%、又は少なくとも約93%、又は少なくとも約94%、又は少なくとも約95%、又は少なくとも約96%、又は少なくとも約97%、又は少なくとも約98%が親水性アミノ酸を含み、かつ、XTEN配列のその他の部分の未満約2%が疎水性、芳香族又はシステインアミノ酸を含む、単離したGHXTEN融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において本発明は、GHXTEN融合タンパク質のN末端に組み込まれる短い長さのXTEN配列を提供する。結合融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドに組み込まれた、最適化されたN末端リーダーポリヌクレオチド配列(N末端XTENをコードする)を含む好適な発現ベクターで形質転換した宿主細胞における、融合タンパク質の発現が高められる。実施例14〜17に記載したように、結合融合タンパク質中に最適化されたN末端リーダー配列(NTS)を含む、そのような発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞における融合タンパク質の発現が、NTSを含まないポリヌクレオチドの対応する融合タンパク質の発現と比較して、非常に高くなること、及び発現を高めるために用いられる、非XTENリーダー配列を組み込む必要がなくなることが見いだされてきた。一実施形態において本発明は、NTSを含むGHXTEN融合タンパク質であって、結合融合タンパク質をコードしている遺伝子の宿主細胞中での発現が、N末端XTEN配列を含まないGHXTEN融合タンパク質(NTSを欠損した遺伝子をコードしている)の発現と比較して、約50%、又は約75%、又は約100%、又は約150%、又は約200%、又は約400%高められたGHXTEN融合タンパク質を提供する。
AE48:MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS(配列番号80)
AM48:MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS(配列番号81)。
その他の実施形態において、XTENポリペプチドは、実効電荷を有するアミノ酸を組み込んだこと、及び/又はXTEN配列中の疎水性アミノ酸の割合を低下させたことにより付与された、非構造性の特徴を有する。全実効電荷及び実効電荷密度は、XTEN配列における荷電したアミノ酸の含量を変えることにより制御される。いくつかの実施形態において、組成物のXTENの実効電荷密度は、1残基当たり、+0.1より高い又は−0.1未満の電荷である場合がある。その他の実施形態において、XTENの実効電荷は、約0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、又は約20%又はそれ以上になる可能性がある。
別の態様において、本発明は、XTEN配列が低度の免疫原性しかもたない、又は実質的に非免疫原性である組成物を提供する。XTENの免疫原性には、例えば、非反復配列、非構造性構造、高度の溶解性、低度な自己凝集性又は自己凝集性の欠如、配列中のタンパク質分解部位が低頻度であるか又は無い、及びXTEN配列中のエピトープが低頻度であるか又は無い、などの複数の因子が関与している可能性がある。
別の態様において本発明は、XTENポリペプチドが長い流体力学半径を有し、XTENを組み込んだGHXTEN融合タンパク質に見かけの分子量の相当する増加を付与する、XTENを提供する。実施例37に詳述したように、XTENとGH配列の結合は、XTENに結合していないGHと比較して、流体力学半径が長い、見かけの分子量が大きい、及び見かけの分子量因子が大きい可能性がある、GHXTEN組成物を生じる。例えば、延長された半減期が望まれる治療上の適用においては、長い流体力学半径のXTENを1つ以上のGHを含む融合タンパク質に組み込むことにより、組成物の流体力学半径を効果的に、およそ3〜5nmである糸球体細孔径を超えるものに増大させることができ(約70kDAの見かけの分子量に相当する)(Caliceti. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)−protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55:1261−1277)、その結果、血中タンパク質の腎クリアランスが低下する。タンパク質の流体力学半径は、その分子量と形状、又は緊密さを含むその構造によって決定される。特定の理論に拘束されず、XTENはペプチドの個々の電荷間の静電反発、又は二次構造を与える能力を欠いた、配列中の特定のアミノ酸による固有の柔軟性によって、オープン構造をとることができる。オープンな、伸張した、かつ、非構造性の構造をもつXTENポリペプチドは、一般的な球状タンパク質のような二次及び/又は三次構造をもつ同等の配列長及び/又は分子量を有するポリペプチドと比較して、比例的により長い流体力学半径をもつことができる。米国特許第6,406,632号及び同第7,294,513号に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)の使用などの流体力学半径の決定方法は当該分野において周知である。実施例37に示す結果のように、長い長さのXTENの付加は、流体力学半径、見かけの分子量、及び見かけの分子量因子などの指標の増大をもたらし、所望される特徴的な見かけの分子量又は流体力学半径のカットオフを有するようにGHXTENを設計することを可能にする。従って、特定の実施形態においてGHXTEN融合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも約5nm、又は少なくとも約8nm、又は少なくとも約10nm、又は12nm、又は少なくとも約15nmの流体力学半径を有することができるように、XTENを含めて構成することができる。前述の実施形態において、GHXTEN融合タンパク質中のXTENによって与えられる長い流体力学半径は、生じる融合タンパク質の腎クリアランスの低下を引き起こすことができ、その結果、相当する終末相半減期の増大、平均滞留時間の増加、及び/又は腎クリアランス率の低下を引き起こす。
対象組成物のGHは、天然の、完全長ポリペプチドには限定されず、組み換えたもの、並びに生物学的及び/又は薬理学的に活性な変異体又はその断片をも含む。当然のことながら、GHの生理活性又は薬理学的特性に関するGH変異体を、本発明の精神から逸脱することなく作出するために、例えば、様々なアミノ酸の欠失、挿入及び置換を行うことができる。ポリペプチド配列中の保守的アミノ酸置換の例を表4に示した。しかしながら、GHの配列同一性が、本明細書において開示した特定の配列と比較して100%未満であるGHXTENを用いた実施形態においては、本発明は、指定されたGHの指定されたアミノ酸残基を、任意のその他19種類の天然のL−アミノ酸で置換することを検討する。ここで置換されるアミノ酸の位置は、隣接した残基を含む、GH配列中の任意の位置であってよい。任意の1置換が生理活性の望ましくない変化を生じる場合には、次に別のアミノ酸のうちの1つを使用して置換することができ、そして本明細書において記載した方法又は、例えば、その全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,364,934号に示された保守的及び非保守的突然変異についての指針を用いて、又は当該分野において一般的に知られている方法を用いて、構築物を評価することができる。加えて、変異体は例えば、GHの完全長天然アミノ酸配列のN又はC末端に1つ以上のアミノ酸残基を付加したポリペプチド、又はGHの完全長天然アミノ酸配列のN又はC末端から1つ以上のアミノ酸残基を欠失したポリペプチドを含む得場合があり、このポリペプチドは天然のペプチドの生理活性を全てではなくても、いくらか保持する。
本発明は、GH及びXTEN構成要素をN末端側からC末端側への特定の配置で含む、GHXTEN融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの実施形態においては、ブロック共重合体を形成するように、1つ以上のGHが1つ以上のXTENのN末端又はC末端のいずれかに、スペーサーと共に又はスペーサーを伴わずに結合し、その結果、生じるGHXTEN融合タンパク質中でのGH及びXTENの配置はブロック共重合体化学において既知の配置と同様になる。1つ以上のGH、XTEN、又はスペーサーを含む場合、各GH、XTEN、又はスペーサーは同じ又は異なる配列を有し、GH及び/又はXTENは連続して又は交互に(規則的に又は変則的に)結合する。従って、本明細書で提供する全ての式において、1つ以上のGH、XTEN、又はスペーサーが含まれる場合、各GH、XTEN、及びスペーサーは同じか又は異なるものである。いくつかの実施形態においてGHXTENは、1つのXTENポリペプチドに結合したGHを含む、単量体融合タンパク質である。その他の実施形態においてGHXTENは、2つ以上のXTENポリペプチドに結合したGHを含む単量体融合タンパク質である。その上さらにその他の実施形態においてGHXTENは、1つのXTENポリペプチドに結合した2つ以上のGHを含む単量体融合タンパク質である。その上さらにその他の実施形態においてGHXTENは、2つ以上のXTENポリペプチドに結合した2つ以上のGHを含む単量体融合タンパク質である。表5に本発明のGHXTEN融合タンパク質に包含される配置の非限定的な例を示すが、本明細書において開示した又は当該分野において既知のスペーサー及び開裂配列の組み込みを含むその他の数多くの変異型が当業者には明かであろう。
*単一とは1つの構成要素であり、複数が2つ以上の構成要素であることを特徴とする
**成長因子及びXTEN構成要素のN末端側からC末端側への配置を反映する
(XTEN)x−GH−(XTEN)y:I
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;xは0又は1のいずれかであり及びyは0又は1のいずれかであり、ここでx+y≧1であり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(GH)−(S)y−(XTEN)y:II
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又はz1のいずれかであり及びyは0又は1のいずれかであり、ここでx+y≧1であり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(GH)−(S)x−(XTEN)−(S)y−(GH)−(S)z−(XTEN)z:III
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;zは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(S)y−(GH)−(S)z−(XTEN)−(GH):IV
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;zは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(GH)x−(S)x−(GH)−(S)y−(XTEN):V
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)−(S)x−(GH)−(S)y−(GH):VI
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
(XTEN)−(S)x−(GH)−(S)y−(GH)−(XTEN):VII
式中、独立した各産物について、GHは成長ホルモンであり;Sは1〜約50個の範囲のアミノ酸残基を有し任意に開裂配列を含む場合があるスペーサー配列であり;xは0又は1のいずれかであり;yは0又は1のいずれかであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
((S)m−(GH)x−(S)n−(XTEN)y−(S)o)t:VIII
式中、(1)x+y>1、(2)t=1、x>0及びy>0である場合、(3)1つより多いGH、S、又はXTENが含まれ、GH、XTEN、又はSがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合;及び(4)t>1であり、各サブユニット中に含まれるm、n、o、x、又はyがそれぞれ同じ又はそれぞれ独立して異なる場合以外は、tは0より大きい整数であり(1、2、3など);m、n、o、x、及びyはそれぞれ独立して整数であり(0、1、2、3など)、GHは成長ホルモンであり;Sは任意に開裂部位を含むスペーサーであり;及びXTENは伸張組換えポリペプチドである。
↓は開裂部位を示す
NA:適用なし
*スラッシュの前、間、又は後に記載されている複数のアミノ酸は、その位置で置換できる別のアミノ酸を示す
「−」は、いずれのアミノ酸も、中列に記載した、対応するアミノ酸で置換できることを示す。
本発明は、XTENに結合していないGHと比較して向上した薬物動態を有するGHXTEN融合タンパク質であって、本明細書に記載した方法を用いてこの組成物について決定した用量で使用した場合に、薬理学的効果をもたらす血中濃度ではあるが、同等の用量のXTENに結合していないGHと比較して、組成物の生物学的な有効成分の安全域に長期間滞留することを達成することができる、GHXTEN融合タンパク質を提供する。このような例において、GHXTENは、融合タンパク質組成物の治療ウインドウ中に長期間維持される。本明細書で使用する場合、「同等な用量」とは、等価なモル/kgの、比較可能な方法で対象に投与される活性なGH薬理作用団を含む用量を意味する。当該分野においては容易に理解されるように、「同等な用量の」GHXTEN融合タンパク質を含む薬剤の重量はより重くなるだろうが、融合タンパク質用量中のGHのモル等価物は本質的には同じであり、及び/又はGHと比較してほぼ同じモル濃度を有するだろう。
本発明は、XTENに共有結合したGHを含み、XTENに結合していないGHと比較して向上した特性を有し得るGHXTEN組成物、並びに組成物中の2つのGH構成要素それぞれの治療用及び/又は生理活性を向上させるための方法を提供する。加えて本発明は、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短いポリペプチド及び/又は反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含む、当該分野において既知の融合タンパク質と比較して、向上した特性を有するGHXTEN組成物を提供する。加えてGHXTEN融合タンパク質は、ペグ構築物のような化学結合体よりも、特に、研究及び開発の両方、並びに製品の製造の時点で時間及び費用を削減することができ、そして、GHXTENの製品及び代謝物の両面においてペグ結合体よりも低い毒性を有する、より均一で明確な製品を生じる細菌細胞発現系において組換えGHXTEN融合タンパク質を作出できることから、大きな利益をもたらす。
別の態様において本発明は、GHが介在する疾患、障害又は状態に有益な効果をもたらす方法を提供する。本発明においては、相対的に短い終末相半減期及び/又は狭い治療ウインドウを有するGHの欠点及び/又は限界を取り扱う。
本発明は、GHXTENキメラ融合タンパク質をコードしている単離したポリ核酸及びGHXTENキメラ融合タンパク質をコードしているポリ核酸分子に相補的な配列(その相同変異体を含む)を提供する。別の態様において本発明は、GHXTENキメラ融合タンパク質をコードしている単離したポリ核酸及び、GHXTENキメラ融合タンパク質をコードしているポリ核酸分子に相補的な配列(その相同変異体を含む)、の生産方法を包含する。通常、そして図4〜6に示したように、GHXTEN融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列の生産方法及び得られた遺伝子産物の発現方法には、GH及びXTENをコードしているヌクレオチドを組み合わせる工程、構成要素をインフレームで結合させる(ライゲーションする)工程、コード遺伝子を宿主細胞にとって適切な発現ベクター中に組み込む工程、発現ベクターを適切な宿主細胞に形質転換する工程、及び形質転換した宿主細胞中で融合タンパク質の発現を誘導する又はその発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培養する工程、及びその結果、当該分野において既知の標準的なタンパク質の精製方法により、単離した融合タンパク質として回収される、生物学的に活性なGHXTENポリペプチドを生産する工程、が含まれる。本発明のポリヌクレオチド及び発現を作出するために、分子生物学における標準的な組換え技術が用いられる。
別の態様において本発明は、所望される長さ及び配列のXTENをコードする遺伝子を組み合わせるために用いられる、XTEN配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
から選択された配列又はその相補鎖と、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%の配列同一性を示す配列を含む。
本発明は、GHXTENを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、GHXTEN融合タンパク質及び少なくとも1種類の薬学上許容可能な担体を含む。本発明のGHXTENポリペプチドを、ポリペプチドを水溶液又は緩衝液、薬学上許容可能な懸濁液及び乳濁液のような薬学上許容可能な担体媒体と共に混合する、薬学上有用な組成物を調製するための既知の方法に従って処方することができる。非水性溶媒の例としてはプロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール及び植物油が挙げられる。保管のためには、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に記載されているように、所望される純度の有効成分を、任意に生理的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液として調製する。
別の態様において、本発明は、GHXTENポリペプチドの使用を促進するためのキットを提供する。このキットは、本明細書において示した医薬組成物、医薬組成物について記載したラベル、並びに、医薬組成物の保管、再構成及び/又は対象への投与についての説明を含む。いくつかの実施形態において、キットは好ましくは、(a)それを必要とする対象に投与することで、疾患、状態又は障害を治療するために十分な、一定の量のGHXTEN融合タンパク質組成物、及び(b)一定量の薬学上許容可能な担体を含み;注入又は再構成に直ちに用いられる製剤には水、緩衝液、若しくはデキストロースが共に;GHXTEN薬剤及び保管及び取扱い条件を記載したラベル、及び薬剤の認可された適用を示すシート、予防的使用における再構成及び/又はGHXTEN薬剤の投与についての説明、及び/又は認可された適用の治療、適切な用量及び安全情報、及び薬剤のロット及び有効期限を示す情報が共に含まれる。前述の別の実施形態においてキットは、対象に送達するための適切な濃度のGHXTENを使用者に提供する、好適に希釈されたGHXTEN組成物を含む場合がある、第二の容器を含む場合がある。
以下の実施例においては、36アミノ酸のモチーフ配列をコードしている、コドン最適化した遺伝子コレクションの構築について記載する。第一の工程として、pETベクターベースで、かつ、T7プロモーターを含むstufferベクターである、pCW0359を構築した。pCW0359は、セルロース結合ドメイン(CBD)及びTEVプロテアーゼ認識部位、それに続くstuffer配列と隣接したBsaI、BbsI、及びKpnI部位をコードする。BsaI及びBbsIは、消化後に一致する突出末端が生成されるように挿入された。stuffer配列の後には切断型のGFP遺伝子及びHisタグが続く。stuffer配列は終止コドンを含むため、stufferプラスミドpCW0359を含む大腸菌(E.coli)細胞は蛍光を発しないコロニーを形成する。stufferセグメントを除去するためにstufferベクターpCW0359をBsaI及びKpnIで消化し、得られたベクター断片をアガロースゲル精製により単離した。モチーフのADファミリーを反映させ、配列をXTEN_AD36と命名した。そのセグメントは、[X]3で表せるアミノ酸配列を有し、ここでXは、配列がGESPGGSSGSES(配列番号136)、GSEGSSGPGESS(配列番号137)、GSSESGSSEGGP(配列番号138)、又はGSGGEPSESGSS(配列番号139)の、12merのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
36アミノ酸の長さのXTEN配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。XTEN配列はXTEN_AE36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3で表せるアミノ酸配列を有し、ここでXは、配列がGSPAGSPTSTEE(配列番号225)、GSEPATSGSETP(配列番号226)、GTSESATPESGP(配列番号227)、又はGTSTEPSEGSAP(配列番号228)の、12merのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
36アミノ酸の長さのXTEN配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。XTEN配列をXTEN_AF36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3で表せるアミノ酸配列を有し、ここでXは、配列がGSTSESPSGTAP(配列番号313)、GTSTPESGSASP(配列番号314)、GTSPSGESSTAP(配列番号315)、又はGSTSSTAESPGP(配列番号316)の、12merのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
36アミノ酸の長さのXTEN配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。XTEN配列はXTEN_AG36と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列[X]3で表せるアミノ酸配列を有し、ここでXは、配列がGTPGSGTASSSP(配列番号415)、GSSTPSGATGSP(配列番号416)、GSSPSASTGTGP(配列番号417)、又はGASPGTSSTGSP(配列番号418)の、12merのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
XTEN_AE36を順次二量体化し、AE72、144、288、576及び864にすることにより、XTEN_AE864を構築した。37種類の異なるXTEN_AE36セグメントから、XTEN_AE72セグメントのコレクションを構築した。37種類の異なる36−アミノ酸セグメントの全てを含む大腸菌培養を混合し、そしてプラスミドを単離した。このプラスミドプールをBsaI/NcoIで消化し、挿入断片となる短い断片を生成した。同じプラスミドプールをBbsI/NcoIで消化し、ベクターとしての長い断片を生成した。挿入断片及びベクター断片を倍の長さになるようにライゲーションし、ライゲーション混合物を用いてBL21Gold(DE3)細胞を形質転換し、そしてXTEN_AE72のコロニーを得た。
37種類の異なるXTEN_AE36セグメント、44種類のXTEN_AF36セグメント、及び44種類のXTEN_AG36セグメントを出発材料として、XTEN_AM144セグメントのコレクションを構築した。
LCW0462ライブラリー全体を実施例6に記載したように二量体化し、XTEN_AM288クローンのライブラリーを得て、これをLCW0463と命名した。LCW0463ライブラリー由来の1512の単離体を実施例6に記載したプロトコールを用いてスクリーニングした。176の多く発現しているクローンについて配列決定を行い、40の好ましいXTEN_AM288セグメントを、288アミノ酸残基を有する、複数のXTENセグメントを含む多機能タンパク質の構築のために選択した。
XTEN_AM144セグメントのLCW0462ライブラリー由来のセグメントとXTEN_AM288セグメントのLCW0463ライブラリー由来のセグメントとを再び組み合わせることにより、XTEN_AM432セグメントのライブラリーを生成した。この新しい、XTEN_AM432セグメントのライブラリーをLCW0464と命名した。LCW0462及びLCW0463をそれぞれ含む培養した大腸菌から、プラスミドを単離した。LCW0464由来の1512の単離体を、実施例6に記載したプロトコールを用いてスクリーニングした。発現の高い176のクローンについて配列決定を行い、39の好ましいXTEN_AM432セグメントを、より長いXTENの構築、及び432アミノ酸残基を有する複数のXTENセグメントを含む多機能タンパク質の構築のために選択した。
stufferセグメントを除去するためにstufferベクターpCW0359をBsaI及びKpnIで消化し、生じたベクター断片をアガロースゲル精製によって単離した。
(配列番号583)と、リン酸化していいないオリゴヌクレオチドBsaI−AscI−KpnIrev:
(配列番号584)とをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、BsaI及びKpnIで消化し、上述したように準備したstufferベクターpCW0359とライゲーションさせ、SI−Aを含むpCW0466を得た。次に、実施例8からの43種類の好ましいXTEN_AM432セグメントとpCW0466からのSI−AセグメントのC末端を、実施例5に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせ、XTEN_AM443セグメントのライブラリーを構築した。この新しいXTEN_AM443セグメントのライブラリーをLCW0479と命名した。
GPEPTGPAPSG(配列番号588)のアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素FseIの認識部位であるヌクレオチド配列GGCCGGCCを含むシークエンスアイランドB(SI−B)を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドBsaI−FseI−KpnIforP:
(配列番号586)と、リン酸化していないオリゴヌクレオチドBsaI−FseI−KpnIrev:
(配列番号587)とをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、実施例9で用いたようなBsaI及びKpnIで消化したstufferベクターpCW0359とライゲーションさせ、SI−Bを含むpCW0467を得た。次に、実施例8からの43種類の好ましいXTEN_AM432セグメントとpCW0467からのSI−BセグメントのC末端を、実施例5に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、XTEN_AM443セグメントのライブラリーを構築した。この新しいXTEN_AM443セグメントのライブラリーをLCW0479と命名した。この新しいXTEN_AM443セグメントのライブラリーをLCW0480と命名した。
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例1に挙げたXTEN_AD36のセグメントを出発材料として、XTEN_AD864配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例5に記載したように組み合わせた。XTEN_AD864由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。1種類のXTEN_AD576の中間構築物について配列決定を行った。このクローンをカニクイザルを用いたPK実験において評価し、半減期が約20時間であることを測定した。
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例3に挙げたXTEN_AF36のセグメントを出発材料として、XTEN_AF864配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例5に記載したように組み合わせた。XTEN_AF864由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。1種類のXTEN_AF540の中間構築物について配列決定を行った。このクローンをカニクイザルを用いたPK実験において評価し、半減期が約20時間であることを測定した。XTEN_AF864の完全長クローンの1つが非常に高い溶解度を有し、カニクイザルにおいて60時間を超える半減期を示した。シークエンスアイランドを含むXTEN_AF配列の二番目のセットを実施例9に記載したように組み合わせた。
複数回、連続して二量体化を行うことにより、実施例1に挙げたXTEN_AD36のセグメントを出発材料として、XTEN_AG864配列配列のコレクションを構築した。これらの配列を実施例5に記載したように組み合わせた。XTEN_AG864由来の複数の単離体を評価し、生理学的な条件下で高く発現し、非常に良い溶解度を示すクローンを見いだした。XTEN_AG864の完全長クローンの1つが非常に高い溶解度を有し、カニクイザルにおいて60時間を超える半減期を示した。
この実施例では、XTEN融合が融合タンパク質のN末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、XTENタンパク質のN末端を最適化する工程について詳細に記載する。これまで、XTENをN末端に有するタンパク質の発現は低く、得られる値は本質的に、GFP蛍光アッセイにおいては検出できなかった(N末端CBDヘルパードメインを有するタンパク質の発現の<25%)。コドンレベルでの多様性を作出するために、7種類のアミノ酸配列を選択し、コドン多様性を有するものを準備した。異なるコドンを有し、12アミノ酸をコードしている7対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、NdeI/BsaIで制限消化したstufferベクターpCW0551(Stuffer−XTEN_AM875−GFP)とライゲーションし、そして、7種類のライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞中に形質転換した。得られたクローンは、発現のスクリーニングにGFPの蛍光を用いることができるように、XTEN_AM875−GFPにN末端XTEN12merをインフレームで融合させた配列を有するものである。作出した7種類のライブラリーから個別のコロニーを選択し、深型の96ウェルプレートに入れた500μlのsuper broth培地中で飽和に達するまで一晩生育させた。理論的なライブラリーの多様性のおよそ1/2から1/3の数の範囲のコロニーを選択した(表13を参照のこと)。
この実施例では、XTEN融合が融合タンパク質のN末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、XTENタンパク質のN末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の2つのコドン(前記実施例を参照のこと)を含む配列の3番目及び4番目のコドンを、好ましいコドンを決定するために無作為化したLCW546、LCW547及びLCW552由来のクローンに基づく3種類のライブラリーの3番目及び4番目の残基を、これらの位置が可能な限り全てのXTENコドンの組み合わせを含むように変更した(図10を参照のこと)。各ライブラリーに可能な限り全てのXTENコドンが含まれるようにするため、3番目と4番目のコドンが異なり、12アミノ酸をコードしている9対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、NdeI/BsaIで制限消化したstufferベクターpCW0551(Stuffer−XTEN_AM875−GFP)とライゲーションし、そして、LCW0569〜571の3種類のライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞中に形質転換した。24のXTENコドンを用いた場合、各ライブラリーの理論的な多様性は576のユニークなクローンとなる。作出した3種類のライブラリー由来の総和504の個別のコロニーを選択し、深型の96ウェルプレートに入れた500μlのsuper broth培地中で飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーできる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい500μl培養中に播種し、これを26℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるGFPの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした(励起395nm、放射510nm)。スクリーニングから得られた最も良い75クローンについて配列決定を行い、レポーターであるGFPの発現対基準試料についての再試験を行った(図11を参照のこと)。52のコロニーから使用可能なシークエンスデータが得られ、これをその後の解析に用いた。ライブラリー毎に分類した結果は、LCW546が最も良いライブラリーであったことを示す。結果を表15に示す。驚くべきことに、基準であるCBDN末端のベースラインの測定値がたったの〜600AUであったのに対し、最も良いクローンのベースラインでの蛍光の測定値が〜900AUであったことを発見した。このことは、基準であるCBDN末端の発現とおよそ同じ発現レベルを有した前段階のライブラリーの最もよいクローン(実施例14)よりも、このライブラリーがおよそ33%改良されたことを示すものである。
この実施例では、XTEN融合が融合タンパク質のN末端にある融合タンパク質の発現を、ヘルパードメインなしで可能にするような翻訳の開始を促進するために、XTENタンパク質のN末端を最適化する工程について詳細に記載する。確立した、好ましい最初の2つのコドン(前記実施例を参照のこと)に加えて、選択した12の12mer配列(前記実施例を参照のこと)を一番N末端側に、その後に125の先に構築した36merセグメント(前記実施例を参照のこと)をコンビナトリアル手法を用いて組み合わせることにより、幅広い視点から、N末端について試験した。このことにより、XTENタンパク質のN末端に新規の48merを作出し、そして、N末端でのより長い配列の相互作用が、より長い配列の発現に及ぼす影響について評価することを可能にした(図12)。36merを組み合わせるために用いた二量体化工程と同様に(以下の実施例を参照のこと)、125種類の選択した36merセグメントを含むプラスミドを制限酵素BbsI/NcoIで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。クローンAC94(CBD−XTEN_AM875−GFP)からのプラスミドもまたBsaI/NcoIで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。これらの断片を一緒にライゲーションし、LCW0579ライブラリーを得るために、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞を形質転換した。このライブラリーは、一番N末端側の、選択した12種類の12merの今後のクローニングにおけるベクターとしても用いた。LCW0579のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化し、適切な断片をゲルを用いて精製した。選択した12種類の12mer配列をコードしている12対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、NdeI/EcoRI/BsaIで消化したLCW0579ベクターとライゲーションし、そしてLCW0580ライブラリーのコロニーを得るために、大腸菌BL21Gold(DE3)コンビテント細胞を形質転換した。理論的には多様性は1500のユニークなクローンとなるため、作出したライブラリーから、総和して1512個の個別のコロニーを選択し、深型の96ウェルプレートに入れた500μlのsuper broth培地中で、飽和に達するまで一晩生育させた。これにより、相対的なライブラリーの効率及び好ましい配列を把握するために必要なコロニーを十分にカバーされる。飽和した一晩培養を自動誘導培地を用いた新しい500μl培養中に播種し、これを26℃で一晩培養した。次に、含まれるレポーターであるGFPの量を決定するために、これらの発現培養を、蛍光プレートリーダーを用いてアッセイした(励起395nm、放射510nm)。最も良かった90のクローンについて配列決定を行い、レポーターであるGFPの発現について再試験した。83のクローンについて使用可能なシークエンスデータが得られたため、これらをその後の解析に用いた。それぞれのクローンに含まれるリーダーである12merを決定するためにシークエンスデータを用い、そして各12merが発現に及ぼす影響について評価した。クローンLCW546_06及びLCW546_09が非常に優れたN末端であるとして突出していた(表17を参照のこと)。
GHXTEN組成物の作出及び評価の一般的な模式図が図6に示されており、そしてこれは本実施例の基本的な説明の基礎となる。開示した方法及び当業者に既知の方法を、例示となる実施例に示した指針と共に用いることにより、熟練者は、XTEN、GH及び当該分野において既知のGH変異体を含む、広範囲のGHXTEN融合タンパク質を作出及び評価することができる。そのため、本実施例は単に例示するためだけのものであると解釈され、かつ、方法を制限するものでは一切なく;数々の変異型が当業者には明かであろう。本実施例においては、AEファミリーモチーフのXTENに結合した、ヒト成長ホルモンのGHXTENが作出されるだろう。
KシリーズのGHXTEN構築物
XTENデスティネーションベクター中のstufferに隣接したBbsI及びHindIII制限部位(BbsI及びHindIIIと末端が一致している)を導入した、hGHをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。pCBD−XTENプラスミドはセルロース結合ドメイン(CBD)−XTEN−Stufferの形態をもつ、Novagen社のpET30の派生物であり、ここでStufferは緑色蛍光タンパク質(GFP)であり、XTENは36〜576又はそれを超える任意の長さであってよい。pCBD−XTEN中のstuffer配列をhGHをコードしている断片(図7B)と置換することにより、構築物を生成した。pCBD−XTENの特徴としては、CBDの上流のT7プロモーター、及びその後の、stuffer配列の上流にインフレームで融合したXTEN配列がある。用いたXTEN配列はXTEN_Yファミリーに属し、かつ、36、72、144、288、及び576アミノ酸を含む長さの配列をコードする。BbsI及びHindIIIエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、stuffer断片を除去した。T4DNAリガーゼを用いて、制限消化したhGH DNA断片と開裂させたpCBD−XTENベクターとをライゲーションし、そしてBL21(DE3)Gold(Stratagene)にエレクトロポレーションで導入した。DNAミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をDNAシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、T7プロモーターの制御下にあるCBD_XTEN_hGH遺伝子である。得られたDNA配列は、36、72、144、及び288アミノ酸それぞれの長さのXTENに結合したGHをコードするものであった。
XTENデスティネーションベクター中のstufferに隣接したNdeI及びBbsI制限部位(NdeI及びBsaIと末端が一致している)を導入した、hGHをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。ThepXTENプラスミドはStuffer−XTENの形態をもつ、Novagen社のpET30の派生物であり、ここでStufferは緑色蛍光タンパク質(GFP)又はCBDのいずれかであってもよく、かつ、XTENは36〜1318アミノ酸又はそれを超える任意の長さであってよい(図7)。pXTEN中のstuffer配列をhGHをコードしている断片と置換することにより、構築物を生成した。pXTENの特徴としては、stuffer配列の上流のT7プロモーター、及びstuffer配列の下流にインフレームで融合したXTEN配列がある。用いたXTEN配列は、XTENのAE又はAMファミリーに属し、かつ、36、72、144、288、576、864、875及び1318アミノ酸を含む長さの配列をコードするコードする。NdeI及びBsaIエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、stuffer断片を除去した。T4DNAリガーゼを用いて、制限消化したhGH DNA断片と開裂させたpXTENベクターとをライゲーションし、そしてBL21(DE3)Gold(Stratagene)にエレクトロポレーションで導入した。DNAミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をDNAシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、T7プロモーターの制御下にあるhGH−XTEN遺伝子であり、hGHをN末端に有する融合タンパク質を発現させるために使用されるだろう。
XTENデスティネーションベクター中のstufferに隣接したBbsI及びHindIII制限部位(BbsI及びHindIIIと末端が一致している)を導入した、hGHをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。pCBD−XTENプラスミドはセルロース結合ドメイン(CBD)−XTEN−Stufferの形態をもつ、Novagen社のpET30の派生物であり、ここでStufferは緑色蛍光タンパク質(GFP)であり、XTENは36〜1318又はそれを超える任意の長さであってよい(図7)。pCBD−XTEN中のstuffer配列をhGHをコードしている断片と置換することにより、構築物を生成した。pCBD−XTENの特徴としては、CBDの上流のT7プロモーター、及びその後の、stuffer配列の上流にインフレームで融合したXTEN配列がある。用いたXTEN配列はXTEN_AE及びXTEN_AMファミリーに属し、かつ、36、72、144、288、576、864、875及び1318アミノ酸を含む長さの配列をコードする。BbsI及びHindIIIエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、stuffer断片を除去した。T4DNAリガーゼを用いて、制限消化したhGH DNA断片と開裂させたpCBD−XTENベクターとをライゲーションし、そしてBL21(DE3)Gold(Stratagene)にエレクトロポレーションで導入した。DNAミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をDNAシークエンシングで確認した。最終的なベクターは、T7プロモーターの制御下にあるCBD_XTEN_hGH遺伝子であり、hGHをC末端に有する融合タンパク質を発現させるために使用されるだろう。
pNTS−XTENデスティネーションベクター中のstufferに隣接したBbsI及びHindIII制限部位(BbsI及びHindIIIと末端が一致している)を導入した、hGHをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。pNTS−XTEN_AEプラスミドは48アミノ酸のN末端XTEN発現配列−XTEN−Stufferの形態をもつ、Novagen社のpET30の派生物であり、ここでStufferは緑色蛍光タンパク質(GFP)であり、XTENは36〜576又はそれを超える任意の長さであってよい。pNTS−XTEN中のstuffer配列をhGHをコードしている断片と置換することにより、構築物を生成した。pNTS−XTENの特徴としては、NTSの上流にあるT7プロモーターと、その後ろの、stuffer配列の上流にインフレームで融合したXTEN配列がある。用いたXTEN配列はXTEN_AEファミリーに属し、かつ、36、72、144、288、576、864、及び1296アミノ酸を含む長さの配列をコードする。BbsI及びHindIIIエンドヌクレアーゼを用いて制限消化することにより、stuffer断片を除去した。T4DNAリガーゼを用いて、制限消化したhGH DNA断片と開裂させたpNTS−XTENベクターとをライゲーションし、そしてBL21(DE3)Gold(Stratagene)にエレクトロポレーションで導入した。いくつかの例においては、144又は288アミノ酸の第二のXTEN_AE配列をhGHコードしている遺伝子のC末端にライゲーションさせた。この工程は図8に示す。pNTS−XTENデスティネーションベクター中のstufferに隣接したBsaI及びHindIII(BbsI及びHindIIIと末端が一致し、HindIIIの上流にさらにBbsI部位を含む)を導入した、hGHをコードしている遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。制限酵素消化、ライゲーション及び形質転換の後に得られた中間体プラスミドは、pNTS−XTEN−hGHの形態を有し、hGHのC末端にBbsI/HindIII制限部位を有する。中間体プラスミドをさらにBbsI及びHindIIIで消化し、XTEN−hGH遺伝子のC末端にAE144又はAE288をコードしている配列を配置するように、BsaI及びHindIIIに隣接した144又は288アミノ酸の第二のXTEN_AE配列とライゲーションし、そしてBL21(DE3)Gold中に形質転換した。DNAミニプレップで形質転換体をスクリーニングし、所望の構築物をDNAシークエンシングで確認した。上述した最終的なベクターの配置はNTS_XTEN_hGH又はNTS_XTEN_hGH_XTENのいずれかであり、図7C及び7Dに示したようにT7プロモーターの制御下にある。
上述したプラスミドをBL21(DE3)−Gold大腸菌株(Novagen)中に形質転換し、適切な抗生物質を含むLB寒天培地上にプレーティングし、そして37℃で一晩生育させた。単一のコロニーを5mlのTB125培地中に播種し、37℃で一晩生育させた。翌日、播種した材料を500mlのTB125を入れ2Lのベッセル中に移し、そしてOD=0.6になるまで生育させ、その後0.1mM IPTGを加えて26℃で16時間生育させた。
次に、タンパク質を交換した緩衝液を、10K MWCO Vivacell 100遠心限外ろ過を用いて15mg/ml未満にならないように濃縮した。濃縮したものを0.22μmのシリンジフィルターをもちいて滅菌した。最終的な溶液を小分けにし、−80℃で保存した。
SDS−PAGE解析
Y576に結合したGH(Y576のN末端又はC末端のいずれかに)の、最終的に精製したGHXTENタンパク質5μgを、InvitrogenのNuPAGE4−12%Bis−Trisゲルを用いた、製造業者による仕様書に従って行った、非還元及び還元SDS−PAGEにかけた。結果のゲルを図20に示す。
TSKGel−G4000 SWXL(7.8mmx30cm)カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー解析を行った。濃度1mg/mlの精製したタンパク質20μgを、20mMリン酸塩pH6.8、114mM NaClを用いて、流速0.6ml/分で分離した。クロマトグラムプロファイルは、OD214nm及びOD280nmでモニターした。カラムの校正(calibration)は、チログロブリン(670kDa)、ウシガンマ−グロブリン(158kDa)、トリオボアルブミン(44kDa)、ウマミオグロブリン(17kDa)及びビタミンB12(1.35kDa)を含むマーカーである、BioRadのサイズ排除較正基準を用いて行った。生成したY576−GHのクロマトグラフィープロファイルは、同じアッセイで泳動した基準となるタンパク質との比較することにより、それぞれの構築物の見かけの分子量が球状タンパク質の予測される分子量よりも有意に大きいことを示す(データは示さない)。
C4(7.8mmx20cm)カラムを用いて、分析RP−HPLCクロマトグラフィー解析を行った。流速1ml/分の移動相中で、0.1%TFAを加えた100%アセトニトリルを用いてカラムを平衡化した。変性させた及び変性させていない、0.2mg/mlの濃度の精製したタンパク質20μgを別々にインジェクションした。0.1%TFAを含むHPLCグレードのH20を含む緩衝液を15分以内に5%〜60%にする直線勾配により、タンパク質を分離及び溶出した。クロマトグラムプロファイルはOD214nm及びOD280nmでモニターした。天然の及び変性させたY576−GHのクロマトグラフィープロファイルを重ねて図21に示す。
GHと結合したXTEN融合体の、GH受容体への結合能力を評価するために、それらを標準的なELISAベースのアッセイにおいて試験した。アッセイは、組換えhGH受容体(hGHR−Fc)をELISAプレートにコーティングした、サンドイッチELISAの形式によって実施した。その後ウェルをブロッキングし、洗浄し、そしてGHXTENを捕捉するために、様々な倍率に希釈したGHXTEN試料をウェル中でインキュベートする。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル又はモノクローナル抗GH又は抗XTEN抗体及びストレプトアビジンHRPを用いて、結合したタンパク質を検出した。各血清希釈の比色反応を、結合させていないGHの検量線と比較することにより、結合したタンパク質の割合を算出することができる。図15に示す、K288に結合したhGHと組換えhGHとを比較した最初のアッセイの結果は、GHXTENがhGH受容体に結合する能力を示す。第二のアッセイにおいては、AM864−hGH及びhGH−AM864の配置をとる2種類のGHXTENを組換えhGHと比較した。図16に示した結果は、天然のhGHのEC50値が0.0701nMであり、AM864−hGHでは0.3905、及びhGH−AM864では2.733であることをはっきりと示す。第三のアッセイにおいては、GHXTEN融合タンパク質のhGH構成要素にC末端XTENを付加することが、結合親和性を低下させる能力を有することを示すために、組換えhGHをAE912−hGH−AE144と比較した。結果(図18)は、結合親和性がhGHと比較しておよそ17倍低下することを示す。
結合した治療用分子に構造的な安定性を付与する、XTENの能力について調査した。hGH及びAM864−hGHの試料を25℃及び80℃でインキュベートし、その後ゲル電気泳動及びクマシー染色で解析した。図17は、25℃及び80℃で15分間処理した2種類の調製物のSDS−PAGEゲルであり、図17Bは25℃で処理した試料に対する80℃で処理した試料の受容体結合活性の、対応するパーセンテージを示すものである。結果は、hGHはこの処理条件下で変性するが、GHXTEN構築物はこの実験条件下では、およそ80%の受容体結合活性を保持する、高い安定性を維持することを示す。
投与した化合物に対する血中IGF−1の反応を測定指標として用い、GHXTENの薬理学的効力を保持する能力を評価した。図24は、カニクイザル(n=4/群)の血中IGF−1レベルに及ぼす、hGH(0.071mg/kg/日)の毎日の投与又はAM864−hGH(5mg/kg;1.1mg/kgと等価)の単回投与の効果を示し、基準に対する変化(パーセンテージ)として図示する。結果は、実験開始時の1回のみの投与にもかかわらず、GHXTEN構築物により活性が向上したことを示す。
投与した化合物に対する低酸素ラットの体重増加を測定指標として用い、GHXTENの、薬理学的効力を保持する能力を評価した。図25は、示した用量及び投与頻度で投与したhGH又はAM864−hGHの低酸素ラットの体重に及ぼす効果を示す。結果は、GHXTEN構築物はより低頻度での投与でも、hGHと同等の用量と等価の効力である生物学的な活性を維持することを示す。AM864−hGHの投与量を増加させると体重の増加を生じることは、hGHと比較して、これらの条件におけるGHXTENの薬物動態特性の向上を示している。
低酸素ラットの脛骨骨端板の増加を測定指標として用い、GHXTENの薬理学的効力を保持する能力を評価した。図26は、処理9日後のラット脛骨の組織学的な横断切片において見られた、偽薬、hGH、及びAM864−hGHの投与の比較効果を示すものであり、脛骨の端を点線で示した。群は図26において示したものと同じである。図26Aは、処理9日後の偽薬群の横断切片の幅の平均が344±38.6μmであったことを示す。図26Bは、9日後のhGH(1日当たり10μg)群の横断切片の幅の平均が598±8.5μmであったことを示す。図26Cは、9日後のAM864−hGH(15mg/kg、q3d)群の横断切片の幅の平均が944±8.5μmであったことを示す。結果は、より低頻度での投与間隔にもかかわらず、hGHと比較して、GHXTEN構築物により活性が向上したことを示す。
インビボでの薬物動態学的指標を決定するために、GH−Y576及びY576h−GH(この例では、N末端側からC末端側へのGH及びXTENの順序を表している)をカニクイザルに注入した。水性の緩衝液中に組成物を調製し、個別の動物に静脈経路を介して、0.15mg/kgの用量で投与した。投与後、様々な時点で血清試料を採取し、アクセサリータンパク質の血清濃度を解析した。解析は、サンドイッチELISAの形式において実施した。ウサギポリクローナル抗XTEN(Y型XTENに対する)抗体でELISAプレートのウェルをコーティングした。次に、コーティングした抗体が化合物を捕捉することができるように、様々な倍率に希釈した血清試料をウェル中でインキュベートした。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル抗XTEN抗体及びストレプトアビジンHRPを用いて結合したタンパク質を検出した。それぞれの希釈倍率の試料の比色反応を検量線と比較することにより、各時点での血清タンパク質濃度を算出した。WinNonLinソフトウェアパッケージを用いて薬物動態学的指標を算出した。
hGHXTENポリペプチドのインビボでの薬物動態学的指標を決定するために、GHXTEN融合タンパク質AE912−hGH、AM864−hGH(本実施例及び以下の実施例においてはAM875−hGHと同義である)、AE912−hGH−AE144及びAE912−hGH−AE288をラットを用いて評価した。全ての組成物を水性の緩衝液中に調製し、皮下経路(SC)を介して1.5mg/kgの組成物を、個別の動物に単回投与した。投与後、様々な時点で血漿試料を採取し、被験物質の濃度について解析を行った。解析はサンドイッチELISAの形式において実施した。組換えhGHR−Fcを用いてELISAプレートのウェルをコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、その後コーティングした抗体が化合物を捕捉することができるように、様々な倍率で希釈した血漿試料をウェル中でインキュベートした。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル抗hGH抗体及びストレプトアビジンHRPを用いて、結合したタンパク質を検出した。それぞれの希釈倍率の試料の比色反応を検量線と比較することにより、各時点での被験物質の濃度を算出した。WinNonLinソフトウェアパッケージを用いて薬物動態学的指標を算出した。
hGHXTENポリペプチドのインビボでの薬物動態学的指標に及ぼす第二のXTENを組み込むことの影響を決定するために、1つ又は2つのXTEN分子を含むGHXTEN融合タンパク質(AE912−hGH、AM864−hGH、及びAE912−hGH−AE144)についての評価をカニクイザルを用いて行った。全ての組成物を水性の緩衝液中に調製し、皮下経路(SC)を介して1.5mg/kgの組成物を、個別の動物に単回投与した。投与後、様々な時点で血漿試料を採取し、被験物質の濃度について解析を行った。解析はサンドイッチELISAの形式において実施した。組換えhGHR−Fcを用いてELISAプレートのウェルをコーティングした。ウェルをブロッキングし、洗浄し、その後コーティングした抗体が化合物を捕捉することができるように、様々な倍率で希釈した血漿試料をウェル中でインキュベートした。ウェルをしっかりと洗浄し、ビオチン化したポリクローナル抗hGH抗体及びストレプトアビジンHRPを用いて、結合したタンパク質を検出した。それぞれの希釈倍率の試料の比色反応を検量線と比較することにより、各時点での被験物質の濃度を算出した。WinNonLinソフトウェアパッケージを用いて薬物動態学的指標を算出した。図28は、皮下投与後、336時間にわたる3種類のhGHXTEN構築物の濃度プロファイルを示す。融合タンパク質の平均終末相半減期は、AM864−hGHが33時間、AE912−hGHが44時間、及びAE912−hGH−AE144(hGHのN及びC末端に結合した2つのXTENを含む)が110時間であった.
0.80〜1.13mlの範囲の容量で、0.3、1.5、及び7.5mg/kgのAE912−hGH−AE144を、オス及びメスのカニクイザルに投与した。投与前、及び2、4、8、24、48、72、96、120、168、216、264、336、388、432、504時間後(16)の血液試料(1.0mL)を、予め凍結させた、ヘパリン処理したチューブに採取し、血漿へと処理した。抗XTEN捕捉抗体及びビオチン化抗hGH検出抗体を用いたELISAアッセイにより、PKを測定した。IGF−1試料をMilliporeに送付し、解析した。WinNonLinソフトウェアパッケージを用いて算出したPK指標を、以下の表に示す。3種類の用量を投与した場合のGHXTEN及びIGF−1レベルの血漿濃度プロファイルをそれぞれ、図29及び図30に示す(白丸=0.3mg/kg;四角=1.5mg/kg;三角=7.5mg/kg)。結果は、AE912−hGH−AE144を投与するとIGF−1のレベルが持続して増加することを示し、これは成長ホルモンの生物学的な作用機序及びAE912−hGH−AE144の長い血漿半減期の両方と一致するものである。
1.5mg/kgのAE912−hGH−AE144を、静脈内、皮下、及び筋内経路を介してオス及びメスのカニクイザルに投与した。投与前、及び2、4、8、24、48、72、96、120、168、216、264、336、388、432、504時間後(16)の血液試料(1.0mL)を、予め凍結させたヘパリン処理したチューブに採取し、その後血漿へと処理した。抗XTEN捕捉抗体及びビオチン化抗hGH検出抗体を用いたELISAアッセイにより、各時点における血漿レベルを測定した。WinNonLinソフトウェアパッケージを用いて算出したPK及びバイオアベイラビリティ指標を以下の表に示す。血漿濃度プロファイルを図31に示す(白丸=皮下;三角=IV;四角=筋内)。バイオアベイラビリティの算出は、静脈内投与のAUCを100%と定義して行った。結果は、AE912−hGH−AE144が高いバイオアベイラビリティを示し、かつ、注入後に注入部位から速やかに血管要素へと分散することを示す。
低酸素ラットの、化合物の投与に反応した体重増加の測定指標を用いて、GHXTEN AE912−hGH−AE144の特異的活性を評価した。図32は、低酸素ラットの体重に及ぼす、媒体(白丸)、5nmol/kg/日用量で投与した組換えhGH(白丸)、様々な用量及び様々な投与頻度で投与したGHXTEN AE912−hGH−AE144(黒三角=0.5nmol/kg/日;白三角=1.5nmol/日;四角=3nmol/kg/Q2D)の効果を示す。結果は、1.5nmol/kg/日ほどの低用量でのGHXTEN AE912−hGH−AE144の投与で、hGHの単独投与と同等の成長が生じることを示す。しかしながら、より低用量、0.5nmol/kg/日の投与はこれら動物の成長を促進しない。ラットにおいて決定した薬物動態学的プロファイルに基づき、反復投与後の血漿レベルのモデルを、図33に示すように構築した(符号は図32と同じ)。このモデルは、より低い用量の非有効量と有効量を明確に区別するものである。結果は、低酸素ラットモデルにおける最適な成長を維持するためにには、AE912−hGH−AE144の血漿濃度は通常、約1nmol/Lの濃度よりも高くなければならないことを示す。
対応する成長ホルモン生物製剤と比較して、GHXTEN組成物の効力及び利点をヒトにおいて検証できるように、臨床試験をデザインすることができる。例えば、上記実施例において記載したような成長を含むGHXTEN融合構築物を、組成物の効力を特徴付けるための臨床試験において使用することができる。試験は、成長ホルモンの投与により、改善される、回復する、又は抑制される、1つ以上の成長ホルモン関連疾患、障害、又は状態において実施することができる。成人患者におけるそのような研究には、3相が含まれる。第一に、最大耐量及びヒト(正常対象、又は成長疾患若しくは状態を呈する患者のいずれか)における薬物動態学及び薬力学を決定し、そして今後の研究における指針となる、潜在的な毒性及び有害事象を定義するための、成人患者における第I相安全性及び薬物動態学的研究を実施する。この研究は、GHXTENの融合タンパク質の組成物を漸増単回投与により投与し、生化学、PK、及び臨床指標を測定することによって実施する。この研究により、最大耐量の決定、並びに、それぞれの化合物の治療ウインドウを構成する用量及び血中薬剤の、閾値及び最大濃度を決定することができる。その後、疾患、障害又は状態を呈する患者における、臨床試験を実施する。
小児患者におけるGH欠損による低身長の反転、ターナー症候群の治療、慢性腎不全、プラダー・ウィリー症候群、胎児の成長遅延、又は成人患者(HIV+又は後天性下垂体腫瘍患者など)におけるボディマス組成物の回復(除脂肪体重の増加、脂肪の減少)などの、血中の成長ホルモン薬力学及びその他の生理的、PK、安全性及び臨床指標(以下に列挙したような)が試験にとって適切な患者において、第II相投与試験を実施する。投与した融合タンパク質組成物の機能としては、指標及び臨床エンドポイントを測定する。このことにより、有害事象に関連した安全性データの収集に加えて、次の第III相試験における適切な用量範囲情報が得られる。PK指標は、GHXTEN組成物の治療ウインドウ及び治療用投与計画を確立するための、生理的、臨床的及び安全指標データと関連し、臨床医がGHXTEN組成物の適切な用量範囲を確立することを可能にする。最後に、患者には投与計画に則ったGHXTEN組成物、及びポジティブコントロール(市販されている、認可された成長ホルモンなど)を投与し、又は偽薬を毎日、若しくは対象組成物が薬物動態学的及び薬力学的特性を示すのに適当だとみなされるその他の投与計画に則って偽薬を投与する第III相効力試験を実施する。ここでは全ての薬剤は研究のエンドポイントに達するまでの適切な長さの期間にわたって投与される。モニターする指標には、GH、IGF−1及びIGFBP3濃度、身長成長速度の変化、除脂肪体重、総体脂肪、体幹脂肪、インスリン抵抗性症候群に関連する指標、軟骨細胞の***及び複製の測定、及び/又は骨密度及び/又は骨成長の変化;偽薬若しくはポジティブコントロール群がとるであろう指標が含まれる。効力アウトカムは標準的な統計分析を用いて決定されるだろう。記載した方法において使用する場合、この研究においては、この化合物が安全であることを確認するための毒性及び有害事象マーカーもまた追跡する。
様々な治療用タンパク質及び伸張した長さの非構造性組換えタンパク質を含む融合タンパク質について、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。TSKGel−G4000 SWXL(7.8mmx30cm)カラムを用いた例示的なアッセイにおいて、1mg/ml濃度の精製したグルカゴン融合タンパク質40μgを、20mMリン酸塩pH6.8、114mM NaClを用い、流速0.6ml/分で分離した。クロマトグラムプロファイルをOD214nm及びOD280nmでモニターした。全てのアッセイにおいて、カラムの校正は、チログロブリン(670kDa)、ウシガンマ−グロブリン(158kDa)、トリオボアルブミン(44kDa)、ウマミオグロブリン(17kDa)及びビタミンB12(1.35kDa)を含むマーカーである、BioRadのサイズ排除校正基準を用いて行った。図34に、グルカゴン−Y288、グルカゴン−Y144、グルカゴン−Y72、グルカゴン−Y36の代表的なクロマトグラフィープロファイルを重ねて示す。データは、各化合物の見かけの分子量は結合させたXTEN配列の長さに比例することを示す。しかしながら、データはまた、各構築物の見かけの分子量が球状タンパク質の予測される分子量よりも有意に大きいことを示す(同じアッセイで解析した基準と成るタンパク質との比較により示すように)。GHXTEN組成物を含む、評価した全ての構築物のSEC分析に基づく、見かけの分子量、見かけの分子量因子(算出した分子量に対する見かけの分子量の比率として示す)及び流体力学半径(RH、単位nm)を表24に示す。結果は、576アミノ酸又はそれより大きい異なるXTENを組み込むと、融合タンパク質の見かけの分子量がおよそ339kDa〜760大きくなり、864アミノ酸又はそれより大きいXTENはおよそ800kDAの見かけの分子量を付与することを示す。見かけの分子量が実際の分子量に対して比例的に増加するという結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー、すなわちAD、AE、AF、AG、及びAM由来のXTENを含むように作出した融合タンパク質と一致するものであり、その増加は少なくとも4倍であり、かつ比率は約17倍ほど高かった。加えて、576又はそれ以上のアミノ酸のXTEN融合パートナーを、様々なペイロード(グルカゴンをY288に融合させた場合にはさらに288残基)を含む融合タンパク質中に組み込むと、流体力学半径は7nm又はそれより大きくなり、これはおよそ3−5nmである糸球体細孔径よりもかなり大きいものである。従って、成長及びXTENを含む融合タンパク質の腎クリアランスが低減すると予測され、このことは、対応する融合していない生物学的ペイロードタンパク質と比較して、終末相半減期の増大及び治療用又は生物学的効果の向上に寄与する。
PK指標に及ぼす組成物及び非構造性ポリペプチドの長さの効果を決定するために、GFP−L288、GFP−L576、GFP−XTEN_AF576、GFP−XTEN_Y576及びXTEN_AD836−GFPの薬物動態学的をカニクイザルにおいて試験した。注入後、様々な時点で血液試料を解析し、捕捉抗体として抗GFPポリクローナル抗体及び検出抗体として同じポリクローナル抗体をビオチン化したものを用いたELISAによって、血漿中のGFP濃度を測定した。結果を図35にまとめた。それらは、XTEN配列の長さが長くなると、半減期が驚くほど長くなっていることを示す。例えば、GFP−XTEN_L288(XTENが288アミノ酸残基である)の半減期は10時間であると決定された。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを576アミノ酸へと倍にすることにより、複数の融合タンパク質構築物、すなわちGFP−XTEN_L576、GFP−XTEN_AF576、GFP−XTEN_Y576の半減期が20〜22時間へと増加した。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さをさらに836残基へと増加させると、XTEN_AD836−GFPの半減期は72〜75時間になった。従って、ポリマーの長さを288から576残基へと288残基増加させることで、インビボでの半減期が約10時間長くなった。しかしながら、ポリペプチドの長さを576残基から836残基へと260残基させることによっては、半減期は50時間よりも長くなった。これらの結果は、非構造性ポリペプチドの長さが、比例的よりも高くインビボ半減期を長くする、驚くべき閾値を有することを示す。従って、伸張した、非構造性ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して向上した薬物動態学的特性を有すると予測される。
GFPのN末端に融合させたXTEN_AE864を含む融合タンパク質を、37℃で最長7日間、サル血漿及びラット腎臓溶解物中でインキュベートした。試料を0時点、1日目及び7日目で採取し、SDS PAGEで解析し、その後ウエスタン解析で解析した。抗GFP抗体を用いた検出を図14に示す。XTEN_AE864の配列は血漿中で7日間にわたりインキュベートしても、無視できるほどしか分解の徴候を示さなかった。しかしながら、XTEN_AE864はラット腎臓溶解物では3日間で速やかに分解された。GFP_AE864を免疫沈降し、上述したようにSDS PAGEで解析して、融合タンパク質のインビボでの安定性を試験した。注入後7日までに採取した試料は、ほとんど分解の徴候を示さなかった。結果は、GHXTEN融合タンパク質の薬物動態学的特性の向上における因子である、血清プロテアーゼによる分解に対してGHXTENが抵抗性であることを示す。
XTENに融合させた治療用タンパク質の、ヒトにおける予測される薬物動態学的プロファイルを決定するために、AE864XTENに融合させたエキセンジン−4を、単一の融合ポリペプチドとして用いて研究を行った。0.5−1.0mg/kgのEx4−XTEN構築物を、4種の異なる動物種の皮下及び静脈内に投与した。投与後、一定の間隔で血清試料を採取し、標準的な方法を用いて血清濃度を決定した。各種での半減期を決定し、表25に示した。この結果を、平均体重に対する終末相半減期、分布容積、及びクリアランス率の異種間物差し法(allometric scaling)を用いて、ヒトにおける半減期を予測するために用いた。図36Aは、動物種における測定した終末相半減期対体重のプロットを示す。エクセナチドの報告された半減期が2.4時間であるのに対し(Bond, A. Proc (Bayl Univ Med Cent) 19(3): 281−284. (2006))、75kgのヒトにおけるEx4−XTEN構築物の予測されるT1/2は140時間である。図36Bは測定した薬剤クリアランス対体重を示し、これによって予測されるクリアランス率の値は、75kgのヒトで30ml/時間である。図36Cは、測定した分布容積対体重を示し、ここで予測される値は、75kgのヒトにおいて5970mlである。
*異種間物差し法に基づく予測値
XTENの、溶解度及び安定性の物理的/化学的特性を向上させる能力を評価するために、グルカゴンとより短い長さのXTENを含む融合タンパク質を調製し、評価した。pHが中性のトリス緩衝食塩水中に被験物質を調製し、タンパク質が溶液中において均一で、かつ、凝集していないことを確認するために、Gcg−XTEN溶液の特徴を逆相HPLC及びサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。データを表26に示す。比較する目的で、同じ緩衝液中に調製した、改変していないグルカゴン60μM(0.2mg/mL)の溶解限度を測定した。結果は、付加した全ての長さのXTENについて、溶解度が十分に向上したことを示す。重要なことは、大部分の例において、グルカゴン−XTEN融合タンパク質は目的の濃度になるように調製され、そして示した構築物の最大溶解限度を決定するために評価されたのではないということである。しかしながら、グルカゴンをAF−144XTENに結合させた例においては溶解限度を決定し、その結果は、XTENに結合させていないグルカゴンと比較して、溶解度が60倍に向上したというものであった。加えて、グルカゴン−AF144GHXTENの安定性を評価し、溶液製剤中でのグルカゴン−AF144GHXTENが、冷蔵条件では少なくとも6ヶ月間、37℃ではおよそ1ヶ月間安定であることを見いだした(データは示さない)。
円二色性分光法により、融合タンパク質Ex4−AE864の二次構造の度合いを評価した。CD分光法は、Jasco Peltier温度コントローラー(TPC−348WI)を備えたJascoJ−715(Jasco Corporation、Tokyo、Japan)円二色性分散計を用いて行った。20mMリン酸ナトリウムpH7.0、50mM NaClを用いて、タンパク質の濃度を0.2mg/mLに調整した。HELLMAのクオーツセルを用い、光路長0.1cmで実験を行った。5°、25°、45°、及び65°CでのCDスペクトルを取得し、Windows(登録商標)用のJ−700 version1.08.01(Build 1)Jascoソフトウェアを用いて処理した。CD測定を行う前に5分間、試料を各温度で平衡化した。300nmから185nmの範囲のスペクトルを、スキャン速度100nm/分、バンド幅1nmで2秒毎に測定し、全てのスペクトルは2回ずつ記録した。図37に示したCDスペクトルは、二次構造の安定性の証拠を示さず、かつ、非構造性ポリペプチドのスペクトルと一致する。
アミノ酸配列の二次構造は、周知のChou−Fasmanアルゴリズム(Chou,P.Y., et al.(1974)Biochemistry,13:222−45)及びGarnier−Osguthorpe−Robson、又は「GOR」法(Garnier J, Gibrat JF, Robson B. (1996). GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol 266:540−553)のような特定のコンピュータープログラム又はアルゴリズムを介して評価することができる。アルゴリズムは、指定した配列中に、例えばアルファ−ヘリックス若しくはベータシーを形成する配列残基の総数及び/又は割合として、又はランダムコイルを形成すると予測される配列残基の割合として表される、いくらかの二次構造が存在するか、又は二次構造がまったくないかどうかを予測することができる。
*H:アルファーヘリックスE:ベータシート
ポリペプチド全体に見られるより短い部分列の回数を定量することにより、ポリペプチドアミノ酸配列の反復性を評価することができる。例えば、200アミノ酸残基のポリペプチドは、オーバーラップしている192個の、9アミノ酸の部分列(又は9−mer「フレーム」)を含むが、ユニークな9−mer部分列の回数は、その配列中の反復性の量に依存するであろう。本解析においては、ポリマー部分の最初の200アミノ酸配列中にあるユニークな3−mer部分列の絶対数で割った、その200アミノ酸にわたって存在する、各3アミノ酸フレームについてのユニークな3−mer部分列の数を総和することにより、異なる配列の反復性を評価した。得られた部分列スコアは、そのポリペプチドの反復性の度合いを反映するものである。
9merペプチド配列のTEPITOPEスコアを、Sturnioloによって記載されたように[Sturniolo, T., et al. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555]、ポケットポテンシャルを加算することにより算出することができる。本実施例においては、個々のHLAアレルについて、別個のTEPITOPEスコアを算出した。表29は例として、コーカサス(白人)集団では高い頻度で生じる、HLA*0101Bのポケットポテンシャルを示す。配列P1−P2−P3−P4−P5−P6−P7−P8−P9を含むペプチドのTEPITOPEスコアを算出するために、対応する個々のポケットポテンシャルを表29に加えた。配列FDKLPRTSG(配列番号667)を有する9merペプチドであるHLA*0101Bのスコアは、0、−1.3、0、0.9、0、−1.8、0.09、0、0の総和となるだろう。
表35:成長ホルモン及び単一のXTENを含むGHXTENの具体例
*配列名は、成長因子及びXTEN構成要素のN末端側からC末端側への配置を反映する
表36:成長ホルモン及び2つのXTEN配列を含むGHXTENの具体例
*配列名は、成長因子及びXTEN構成要素のN末端側からC末端側への配置を反映する
表37:成長ホルモン、XTEN及び開裂配列を含むGHXTENの具体例
*配列名は、成長因子、開裂配列及びXTEN構成要素のN末端側からC末端側への配置を反映する
Claims (10)
- 伸張組換えポリペプチド(XTEN)に結合した配列番号1の配列を有する成長ホルモン(GH)のポリペプチドを含む組成物の液体形状を含む、予め充填されたシリンジであって、該ポリペプチドが、配列番号757の配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、予め充填されたシリンジ。
- 前記ポリペプチドが、配列番号757の配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の予め充填されたシリンジ。
- 前記ポリペプチドが、配列番号757の配列と少なくとも99%の配列同一性を有する、請求項1に記載の予め充填されたシリンジ。
- 前記ポリペプチドが、配列番号757のアミノ酸2〜1251を含む、請求項1に記載の予め充填されたシリンジ。
- 前記ポリペプチドが、配列番号757のアミノ酸2〜1251からなる、請求項1に記載の予め充填されたシリンジ。
- 前記成長ホルモンの受容体に対する前記ポリペプチドの結合親和性が、前記XTENを持たない対応するGHの結合親和性と比較して低くなる、請求項1に記載の予め充填されたシリンジ。
- 前記成長ホルモンの受容体に対する前記ポリペプチドの結合親和性が、XTENに結合していないGHと比較して少なくとも3倍低くなる、請求項6に記載の予め充填されたシリンジ。
- 前記成長ホルモンの受容体に対する前記ポリペプチドの結合親和性が、前記XTENを持たない対応するGHの結合親和性と比較して少なくとも10倍低くなる、請求項6に記載の予め充填されたシリンジ。
- 低下した結合親和性を有する前記ポリペプチドが、低下した受容体介在性クリアランスを示す、請求項6に記載の予め充填されたシリンジ。
- 低下した結合親和性を有する前記ポリペプチドが、前記XTENに結合していない対応するGHと比較して少なくとも3倍の、半減期の対応する延長を有する、請求項6に記載の予め充填されたシリンジ。
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