JP6539511B2 - 運動機能の判定用マーカー - Google Patents
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Description
これまでに、ロコモティブシンドロームなどの運動器の加齢性疾患に関連する遺伝子やタンパク質の研究が進んでいる。しかし、これまでに運動器の疾患に関連する因子の特定には至っていない。
しかし、日常生活に必要な運動機能や運動器の加齢性疾患を判定、評価するためのバイオマーカーとしてMYBPHを使用できることについては知られていない。
また本発明は、前記バイオマーカーを用いた、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管肥大の程度の評価方法の提供を課題とする。
運動器官の1つであり身体を動かす骨格に結合する骨格筋には、多くのタンパク質が発現することが知られている。これらのタンパク質のうち、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子(以下、「MYBPH遺伝子」ともいう)の発現レベルが、個体の運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、及び筋管肥大との間で相関性を有することを見出した。そして、このMYBPH又はMYBPH遺伝子が、個体の運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管肥大の程度を評価するためのバイオマーカーとして有用であることを見出した。さらに、個体から採取されたMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、測定した発現レベルに基づいて個体の運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、及び筋管肥大の程度を評価できることを見出した。
本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。
また本発明は、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子を含む、筋量の評価用マーカーに関する。
また本発明は、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子を含む、骨格筋細胞の分化評価用マーカーに関する。
また本発明は、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子を含む、筋管肥大の評価用マーカーに関する。
また本発明は、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、測定した発現レベルに基づいて筋量を評価する、筋量の評価方法に関する。
また本発明は、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、測定した発現レベルに基づいて骨格筋細胞の分化の程度を評価する、骨格筋細胞の分化の評価方法に関する。
さらに本発明は、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、測定した発現レベルに基づいて筋管肥大の程度を評価する、筋管肥大の評価方法に関する。
また本発明の評価方法は、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管肥大の程度を的確かつ簡便に評価することができる。さらに本発明の評価方法に基づいて、運動機能を向上させる物質、筋量を増加させる物質、骨格筋細胞の分化を促進させる物質、又は筋管肥大を促進させる物質のスクリーニングなどに好適に適用することができる。
また本発明において「運動機能」とは、身体を構成し、支え、身体運動を可能にする運動器官の運動能力を指す。
したがって、本発明のマーカーは、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、及び筋管肥大の程度の指標とすることができる。さらに本発明のマーカーは、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、及び筋管肥大の程度を簡便かつ的確に評価する方法に好適に用いることができる。
なお本発明で用いるMYBPHはこれらに限定するものではなく、これらのアミノ酸配列において、1又は数個、通常1〜100個、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらに好ましくは1〜25個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質も含まれる。また、これらのアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質も含まれる。ここで本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、Lipman-Pearson法(Science,227,1435,(1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
なお本発明で用いるMYBPH遺伝子はこれらに限定するものではなく、これらの塩基配列において、1又は数個、通常1〜389個、好ましくは1〜292個、より好ましくは1〜195個、さらに好ましくは1〜98個、特に好ましくは1〜39個、最も好ましくは1〜20個、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつ前述のMYBPHをコードする核酸も含まれる。また、これらの塩基配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有する塩基配列からなり、かつ前述のMYBPHをコードする核酸も含まれる。ここで本明細書において塩基配列の相同性は、Lipman-Pearson法(Science,227,1435,(1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出される。
また本発明において、MYBPH遺伝子はDNA及びRNAのいずれであってもよく、MYBPH遺伝子そのもの(DNA)、mRNA、cDNA、及びcRNAのいずれであってもよい。
このうち本発明では、核酸プライマーを用いてPCR法によりMYBPH遺伝子の発現レベルを測定することが好ましい。また前記核酸プライマーとしては、下記表1に示す核酸プライマーセット1〜3のいずれか1つを好ましく用いることができる。
よって、個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管に関して標準的な個体から採取されたMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルと比較を行う。そして、測定した発現レベルが上昇した場合には、運動機能が向上した、筋量が増加した、骨格筋細胞の分化が進行した、又は筋管が肥大した、と判断する。一方、MYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが低下した場合には、運動機能が低下した、筋量が減少した、骨格筋細胞の分化が進行していない、又は筋管が縮小した、と判断する。また、MYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルに変化が確認できない場合は、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、及び筋管は標準的な状態であると判断する。あるいは、運動など筋量を増加させるような外部刺激を個体に行ってもMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが増加しない場合には、その個体がロコモティブシンドロームに罹患している、又はロコモティブシンドロームに罹患するリスクが高い、と判断する。
通常用いられる、前記骨格筋のタンパク質分子マーカーとしては、β-アクチンなどが挙げられる。
通常用いられるハウスキーピング遺伝子としては、36B4遺伝子、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、GAPDH)遺伝子、β-アクチン遺伝子などが挙げられる。
このキットは、前述した、タンパク質分子マーカーやハウスキーピング遺伝子の発現レベルを測定するための抗体、ペプチドアプタマー、核酸プローブ、核酸アプタマー又は核酸プライマーを含んでもよい。
なお本明細書において「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止若しくは遅延、又は個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。また、本明細書において「改善」とは、疾患、症状若しくは状態の好転、疾患、症状若しくは状態の悪化の防止若しくは遅延、又は疾患、症状若しくは状態の進行の逆転、防止若しくは遅延をいう。
また本発明のバイオマーカーは、ロコモティブシンドロームの罹患の有無又は罹患するリスクの有無の評価方法にも好適に用いることができる。この評価方法では、運動など筋量を増加させるような外部刺激を行った個体の骨格筋細胞由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、MYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが増加しない場合に、ロコモティブシンドロームに罹患している、又は罹患するリスクが高い、と評価することができる。
さらに本発明のバイオマーカーは、ロコモティブシンドロームの治療又は予防効果の評価方法にも好適に用いることができる。ロコモティブシンドロームに罹患した被験者にロコモティブシンドロームの治療又は予防措置が効果的であった場合、それに応じてMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルも上昇する。したがって、ロコモティブシンドロームの治療又は予防措置の前後でMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、発現レベルが上昇した場合には治療又は予防措置が効果的であると評価することができる。
<3>前記MYBPH又はMYBPH遺伝子がヒラメ筋、ヒフク筋又は足底筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子である、前記<1>又は<2>項に記載のマーカー。
<4>前記MYBPHが、NCBI RefSeqにNP_058029、NP_956852.1、NM_001100137.1、若しくはNP_004988で登録されているタンパク質、これらのタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個、通常1〜100個、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらに好ましくは1〜25個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質、又はこれらのタンパク質のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質、である、前記<1>〜<3>のいずれか1項に記載のマーカー。
<5>前記MYBPH遺伝子が、NCBI RefSeqにNM_016749、NM_200558.1、NP_001093607.1、若しくはNM_004997で登録されている遺伝子、これらの遺伝子の塩基配列において、1又は数個、通常1〜389個、好ましくは1〜292個、より好ましくは1〜195個、さらに好ましくは1〜98個、特に好ましくは1〜39個、最も好ましくは1〜20個、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつMYBPHをコードする核酸、又はこれらの遺伝子の塩基配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有する塩基配列からなり、かつMYBPHをコードする核酸、である、前記<1>〜<4>のいずれか1項に記載のマーカー。
<6>前記MYBPHが、MYBPHと特異的に認識される抗体又はペプチドアプタマー、好ましくは抗体、により検出されたものである、前記<1>〜<5>のいずれか1項に記載のマーカー。
<7>前記MYBPH遺伝子が、核酸プローブ、核酸アプタマー又は核酸プライマー、好ましくは核酸プライマー、により検出されたものである、前記<1>〜<6>のいずれか1項に記載のマーカー。
<8>前記MYBPH遺伝子が、前記表1に示す核酸プライマーセット1〜3のいずれか1つにより検出されたものである、前記<7>項に記載のマーカー。
<9>前記MYBPH又はMYBPH遺伝子が、運動など筋量を増加させる外部刺激を個体に負荷してから1〜6時間後に採取されたMYBPH又はMYBPH遺伝子である、前記<1>〜<7>のいずれか1項に記載のマーカー。
<11>個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子を、運動機能の判定用マーカー、筋量判定用マーカー、骨格筋細胞の分化の判定用マーカー、又は筋管肥大の判定用マーカーとして使用する方法。
<12>個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子を使用する、運動機能の判定方法、筋量判定方法、骨格筋細胞の分化の判定方法、又は筋管肥大の判定方法。
<14>前記MYBPH又はMYBPH遺伝子がヒラメ筋、ヒフク筋又は足底筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子である、前記<10>〜<13>のいずれか1項に記載の使用又は方法。
<15>前記MYBPHが、NCBI RefSeqにNP_058029、NP_956852.1、NM_001100137.1、若しくはNP_004988で登録されているタンパク質、これらのタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個、通常1〜100個、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらに好ましくは1〜25個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質、又はこれらのタンパク質のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質、である、前記<10>〜<14>のいずれか1項に記載の使用又は方法。
<16>前記MYBPH遺伝子が、NCBI RefSeqにNM_016749、NM_200558.1、NP_001093607.1、若しくはNM_004997で登録されている遺伝子、これらの遺伝子の塩基配列において、1又は数個、通常1〜389個、好ましくは1〜292個、より好ましくは1〜195個、さらに好ましくは1〜98個、特に好ましくは1〜39個、最も好ましくは1〜20個、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつMYBPHをコードする核酸、又はこれらの遺伝子の塩基配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有する塩基配列からなり、かつMYBPHをコードする核酸、である、前記<10>〜<15>のいずれか1項に記載の使用又は方法。
<17>前記MYBPHが、MYBPHと特異的に認識される抗体又はペプチドアプタマー、好ましくは抗体、により検出されたものである、前記<10>〜<16>のいずれか1項に記載の使用又は方法。
<18>前記MYBPH遺伝子が、核酸プローブ、核酸アプタマー又は核酸プライマー、好ましくは核酸プライマー、により検出されたものである、前記<10>〜<17>のいずれか1項に記載の使用又は方法。
<19>前記MYBPH遺伝子が、前記表1に示す核酸プライマーセット1〜3のいずれか1つにより検出されたものである、前記<18>項に記載の使用又は方法。
<20>前記MYBPH又はMYBPH遺伝子が、運動など筋量を増加させる外部刺激を個体に負荷してから1〜6時間後に採取されたMYBPH又はMYBPH遺伝子である、前記<10>〜<19>のいずれか1項に記載の使用又は方法。
測定した発現レベルに基づいて個体の運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管肥大の程度を評価する、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管肥大の程度の評価方法。
<23>前記発現レベルが、前記MYBPH又はMYBPH遺伝子の発現の有無、又は前記MYBPH又はこれをコードする遺伝子の発現量である、前記<21>又は<22>項に記載の方法。
<24>前記MYBPH又はMYBPH遺伝子がヒラメ筋、ヒフク筋又は足底筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子である、前記<21>〜<23>のいずれか1項に記載の方法。
<25>前記MYBPHが、NCBI RefSeqにNP_058029、NP_956852.1、NM_001100137.1、若しくはNP_004988で登録されているタンパク質、これらのタンパク質のアミノ酸配列において、1又は数個、通常1〜100個、好ましくは1〜75個、より好ましくは1〜50個、さらに好ましくは1〜25個、特に好ましくは1〜10個、最も好ましくは1〜5個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び/若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質、又はこれらのタンパク質のアミノ酸配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ機能的に同等なタンパク質、である、前記<21>〜<24>のいずれか1項に記載の方法。
<26>前記MYBPH遺伝子が、NCBI RefSeqにNM_016749、NM_200558.1、NP_001093607.1、若しくはNM_004997で登録されている遺伝子、これらの遺伝子の塩基配列において、1又は数個、通常1〜389個、好ましくは1〜292個、より好ましくは1〜195個、さらに好ましくは1〜98個、特に好ましくは1〜39個、最も好ましくは1〜20個、の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、かつMYBPHをコードする核酸、又はこれらの遺伝子の塩基配列と80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは98%以上、最も好ましくは99%以上、の相同性を有する塩基配列からなり、かつMYBPHをコードする核酸、である、前記<21>〜<25>のいずれか1項に記載の方法。
<27>MYBPHと特異的に認識される抗体又はペプチドアプタマー、好ましくは抗体、によりMYBPHを検出し、MYBPHの発現レベルを測定する、前記<21>〜<26>のいずれか1項に記載の方法。
<28>核酸プローブ、核酸アプタマー又は核酸プライマー、好ましくは核酸プライマー、によりMYBPH遺伝子を検出し、MYBPH遺伝子の発現レベルを測定する、前記<21>〜<27>のいずれか1項に記載の方法。
<29>前記表1に示す核酸プライマーセット1〜3のいずれか1つによりMYBPH遺伝子を検出し、MYBPH遺伝子の発現レベルを測定する、前記<28>項に記載の方法。
<30>測定したMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが上昇した場合に、運動機能が向上した、筋量が増加した、骨格筋細胞の分化が進行した、又は筋管が肥大した、と判断する、前記<21>〜<29>のいずれか1項に記載の方法。
<31>測定したMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが低下した場合に、運動機能が低下した、筋量が減少した、骨格筋細胞の分化が進行していない、又は筋管が縮小した、と判断する、前記<21>〜<30>のいずれか1項に記載の方法。
<32>測定したMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルに変化が確認できない場合に、運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管は標準的な状態であると判断する、前記<21>〜<31>のいずれか1項に記載の方法。
<33>筋量を増加させるような外部刺激を行った個体から採取された骨格筋由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、測定した発現レベルが増加しない場合に、その個体がロコモティブシンドロームに罹患している又はロコモティブシンドロームに罹患するリスクが高いと判断する、前記<21>〜<32>のいずれか1項に記載の方法。
<34>骨格筋のタンパク質分子マーカー、好ましくはβ-アクチン、の発現レベルとMYBPHの発現レベルとを比較し、測定したMYBPHの発現レベルを補正する、前記<21>〜<33>のいずれか1項に記載の方法。
<35>ハウスキーピング遺伝子、好ましくは36B4遺伝子、GAPDH遺伝子、又はβ-アクチン遺伝子、の発現レベルとMYBPH遺伝子の発現レベルとを比較し、測定したMYBPH遺伝子の発現レベルを補正する、前記<21>〜<34>のいずれか1項に記載の方法。
<36>前記MYBPH又はMYBPH遺伝子が、運動など筋量を増加させる外部刺激を個体に負荷してから1〜6時間後に採取されたMYBPH又はMYBPH遺伝子である、前記<21>〜<35>のいずれか1項に記載の方法。
<38>骨格筋のタンパク質分子マーカー、好ましくはβ-アクチン、又はハウスキーピング遺伝子、好ましくは36B4遺伝子、GAPDH遺伝子、又はβ-アクチン遺伝子、の発現レベルを測定するための抗体、ペプチドアプタマー、核酸プローブ、核酸アプタマー又は核酸プライマーをさらに含む、前記<37>に記載のキット。
ヒト若しくは非ヒト動物、又は骨格筋由来の細胞株に前記剤の候補となる物質を投与又は摂取させ、
物質の投与又は摂取の前後で前記<21>〜<35>のいずれか1項に記載の評価方法に基づいて個体の運動機能、筋量、骨格筋細胞の分化の程度、又は筋管肥大の程度を評価し、
運動機能を向上させる物質、筋量を増加させる物質、骨格筋細胞の分化を促進させる物質、又は筋管を肥大させる物質を前記剤として選択する、スクリーニング方法。
<40>前記<1>〜<9>のいずれか1項に記載のマーカーを用いて、骨格筋細胞に発現するMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、
MYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルの高い細胞を分化が進行した骨格筋細胞又は筋管が肥大した骨格筋細胞として検出する、
分化が進行した骨格筋細胞又は筋管が肥大した骨格筋細胞の検出方法。
<41>前記<1>〜<9>のいずれか1項に記載のマーカーを用いて、骨格筋細胞由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、
骨格筋細胞由来のMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、
筋量を増加させるような外部刺激を個体に行ってもMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが増加しない場合に、その個体がロコモティブシンドロームに罹患している、又は罹患するリスクが高い、と評価する、
ロコモティブシンドロームの罹患の有無又は罹患するリスクの評価方法。
<42>前記<1>〜<9>のいずれか1項に記載のマーカーを用いて、骨格筋細胞に発現するMYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルを測定し、
MYBPH又はMYBPH遺伝子の発現レベルが上昇した場合には前記治療又は予防措置が効果的であると評価する、
ロコモティブシンドロームの治療又は予防効果の評価方法。
ここで、下記試験例及び比較例で用いた、各種遺伝子の増幅に用いたプライマーの塩基配列を表2に示す。なお下記プライマーは、標的遺伝子の断片を約100〜200bpのサイズで増幅するように設計した。
(1)ヒラメ筋の筋量及び筋力の測定
室温を23±2℃、湿度を55±10%とし、照明時間を7〜19時と設定した飼育環境下で、7週齢の雄性C57BL/6Jマウス(オリエンタルバイオサービス社より購入)に対して一週間の環境馴化を行った後、個別飼育に馴化させた。その後、体重を基準に32匹のマウスを選抜した。これら32匹のマウスを非運動条件飼育群(対象群:個別飼育)16匹と、自発運動条件飼育群(運動群:回転カゴ付ケージで個別飼育)16匹とに分けた。試験食(商品名:CE-2、日本クレア社製)自由摂食下でこれら2群のマウスを飼育し、運動開始より1ヶ月目及び2ヶ月目に、各群8匹ずつの解剖を実施した。解剖は自由摂食条件下でセボフレン(商品名、丸石製薬社製)を麻酔した後、下腹部大静脈より全採血し、ヒラメ筋を採取した。採取したヒラメ筋の筋量及び筋力を測定し、すみやかに液体窒素で凍結し-80℃で保存した。運動開始より2カ月後のヒラメ筋の筋量の結果を図1に、運動開始より2カ月後のヒラメ筋の筋力の結果を図2に、それぞれ示す。
なおヒラメ筋の筋力測定は、左肢のヒラメ筋を縫合糸(#5-0 silk)でトランスデューサー(商品名:FORT100、World Precision Instruments社製)に固定し、37℃のKrebs溶液(95%O2、5%CO2通気、pH7.2)に浸し、2本のプラチナ電極より電気刺激を与えて単収縮刺激を施した後、トランスデューサーより得られるシグナルを筋力として評価した。
保存したヒラメ筋から、RNeasy Fibrous Mini Kit(商品名、Qiagen社製)を使用してTotal RNAを抽出した。抽出したTotal RNAの濃度を揃え、65℃にて10分間の熱処理を行い、急冷後下記に示す逆転写反応に使用した。
125ng相当のRNAを鋳型とし、逆転写反応液{1×PCR buffer 2(商品名、Applied Biosystems社製)、5mM MgCl2、1mM dNTP mix、2.5μM oligo d(T) 18(商品名、New England Biolabs社製)、1U/μL Rnase inhibitor(商品名、タカラバイオ社製)}20μLと混合して、(42℃、1時間)→(52℃、30分)→(99℃、5分)→4℃の条件下で逆転写反応を行った。得られたcDNAサンプルを-20℃で保存した。
また、下記に示すreal-time PCRのスタンダード用として、500ng相当のRNAに対して同様の反応系で逆転写反応を行った。
また、図3に示すように、運動開始から1か月目に、運動群でMYBPHのmRNAの発現量が有意に増加した。
これらの結果は、筋形成時(運動開始から1か月程度)にMYBPH遺伝子の発現量が増加すると、運動開始から2か月目にヒラメ筋の重量が増加することを示している。すなわちこれらの結果は、ヒラメ筋の筋量が増加する過程のいずれかの段階でMYBPHの一過的な発現量の増加が必要であり、筋形成時にMYBPHの発現を増加させることができない個体は筋量及び運動機能を維持又は増強できないことを示唆するものである。
(1)足底筋の筋量の測定
C57BL/6Jマウス(オリエンタルバイオサービス社より購入、16週齢)を非施術群3匹と施術群3匹とに分けた。施術群のマウスのヒフク筋及びヒラメ筋を切除し(SA,Synergist Ablation手術)、足底筋への負荷を増加させた。
非施術群及び施術群のマウスを飼育し、施術群のマウスのヒフク筋及びヒラメ筋の切除から3日後に、各群のマウスから足底筋を採取した。採取した足底筋の筋量を測定し、すみやかに液体窒素で凍結し-80℃で保存した。測定した足底筋の筋量の結果を図4に示す。
保存した足底筋におけるMYBPHのmRNAの発現量を試験例1と同様にして測定した。得られた結果を図5に示す。
足底筋の協働筋であるヒラメ筋及びヒフク筋を切除した場合、足底筋に大きな負荷がかかる。よって図4及び5に示す結果は、足底筋に大きな負荷をかけて短期間で筋量を増加させると、MYBPH遺伝子の発現量が増加することを示している。
Balb/cマウス(チャールス・リバー社より購入、10週齢)を1週間の尾懸垂により後肢不活動状態とし、その後尾懸垂を解除した(再接地)。再接地から3日後にヒラメ筋を採取した。
尾懸垂直後のマウス、及び再接地後のヒラメ筋の筋量を測定し、すみやかに液体窒素で凍結し-80℃で保存した。測定したヒラメ筋の筋量の結果を図6に示す。
保存したヒラメ筋におけるMYBPHのmRNAの発現量を試験例1と同様にして測定した。得られた結果を図7に示す。
これらの結果は、尾懸垂直後に再接地させることで短期間で筋量を増加させた場合、筋量増加とともにMYBPH遺伝子の発現量も増加することを示している。
(1)mRNAの発現量の測定
マウス骨格筋由来細胞株C2C12を0.5×105cells/well又は1.5×105cells/wellとなるように24wellプレートに播種し(n=3)、10%ウシ胎児血清(FBS、AusGeneX)を含むDMEM培地{増殖培地、10%FBS-DMEM;10%FBS、1%Pen Strep(Gibco社製)}を用いて維持した。細胞の播種から24時間後に、増殖区の細胞サンプルを回収した(細胞密度:80%コンフルエント)。さらに、分化誘導区の細胞サンプルに対して、播種から48時間後(細胞密度:100%コンフルエント)に2%ウマ血清(HS、Kohjin Bio社製)を含むDMEM培地{分化誘導培地、2%HS-DMEM;2%HS、1%Pen Strep(Gibco社製)}を用いて分化誘導を施した。分化誘導から0時間後、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後、及び120時間後に細胞サンプルを回収した。
図8に示すように、MYBPHのmRNAの発現量は、骨格筋細胞の分化と共に増加した。
マウス骨格筋由来細胞株C2C12を0.5×105cells/well又は1.5×105cells/wellとなるように6wellプレートに播種し(n=3)、10%ウシ胎児血清(FBS、AusGeneX)を含むDMEM培地{増殖培地、10%FBS-DMEM;10%FBS、1%Pen Strep(Gibco社製)}を用いて維持した。細胞の播種から24時間後に、増殖区の細胞サンプルを回収した(細胞密度:80%コンフルエント)。さらに、分化誘導区の細胞サンプルに対して、播種から48時間後(細胞密度:100%コンフルエント)に2%ウマ血清(HS、Kohjin Bio社製)を含むDMEM培地{分化誘導培地、2%HS-DMEM;2%HS、1%Pen Strep(Gibco社製)}を用いて分化誘導を施した。分化誘導から0時間後、8時間後、24時間後、48時間後、72時間後、及び120時間後に細胞サンプルを回収した。
0.1%Tween20-TBS(T-TBS、Bio-Rad社製)でメンブレンを洗浄した後、抗ウサギIgG抗体(MYBPH及びβ-actin検出用、Cell signaling社製)又は抗マウスIgG抗体(MyHC検出用、Cell signaling社製)をCan Get Signal Solution 2(商品名、TOYOBO社製)で1000倍に希釈して2次抗体溶液を作成し、室温にて1時間の2次抗体処理を行った。T-TBSによる洗浄後、LumiGLO Reagent and Peroxide(商品名、Cell signaling社製)で5分間処理して化学発光を起こし、発光強度をChemiDoc XRS(商品名、Bio Rad社製)で測定し、MYBPH、MyHC及びβ-actinの発現量とした。
図9に示すように、MYBPHの発現量は筋細胞の分化と共に増加した。
(1)siRNA溶液の調製
MYBPHのmRNAに特異的に設計された、2種類のsmall interfering RNA(siRNA)溶液(MYBPH siRNA1及びMYBPH siRNA2)(Silencer Select Pre-designed and Validated siRNA、Ambion社製)及びネガティブコントロールsiRNA溶液(Silencer Select Negative Control #2 siRNA、Ambion社製)を終濃度25nMとなるよう調製した。
マウス骨格筋由来細胞株C2C12を0.5×105cells/well又は1.5×105cells/wellとなるように24wellプレートに播種した(n=3)。
細胞の播種から24時間後に、前記siRNA溶液及びLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(商品名、Invitrogen社製)を用い、添付のプロトコルに従って下記に示すように、C2C12へsiRNAのトランスフェクションを実施した。
まず抗生物質無添加の10% FBS-DMEM 500μLを24wellプレートに添加した。そして、20μM siRNA保存溶液をOpti-MEM I Reduced-Serum Medium(商品名、Invitrogen社製)で300μM(終濃度の12倍)となるよう希釈した。一方Lipofectamine RNAiMAX Transfection ReagentをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium(商品名、Invitrogen社製)で2%となるよう希釈した。これらの溶液それぞれを5分間静置した。その後両溶液を混合し、10分間反応させた。反応後の混合液100μLを24wellプレートに添加した。
回収した細胞サンプルから、RNeasy Mini Kit(商品名、QIAGEN社製)を使用してTotal RNAを抽出し、試験例1と同様に逆転写反応を行い、MYBPHのmRNAの発現量の解析を行った。得られた解析結果は、内部標準遺伝子(GAPDH)の発現量で補正し、相対的なmRNA発現量として表した。
このようにして得られた結果を図10に示す。図10に示すように、RNA干渉により、MYBPHのmRNAの発現量は減少した。
マウス骨格筋由来細胞株C2C12を0.5×105cells/well又は1.5×105cells/wellとなるように6wellプレートに播種した(n=3)。細胞の播種から24時間後に、前記siRNA溶液及びLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(商品名、Invitrogen社製)を用いて前述の方法と同様にC2C12へsiRNAのトランスフェクションを実施した。そして、siRNAトランスフェクション開始から24時間後(細胞密度:100%コンフルエント)、2%HS-DMEMを用いて細胞に分化誘導を施し、48、72、120時間後に細胞サンプルを回収した。
回収した各細胞サンプルについて、試験例2と同様にMYBPH、MyHC及びβ-actinの発現量を測定した。このようにして得られた結果を図11(MYBPHの発現量)及び図12(MyHCの発現量)に示す。
図11及び12に示すように、RNA干渉により、MYBPH、及び骨格筋細胞の分化マーカーであるMyHCの発現量は減少した。
マウス骨格筋由来細胞株C2C12を0.5×105cells/well又は1.5×105cells/wellとなるように6wellプレートに播種した(n=3)。細胞の播種から24時間後に、前記siRNA溶液及びLipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent(商品名、Invitrogen社製)を用い前述の方法と同様にC2C12へsiRNAのトランスフェクションを実施した。そして、siRNAトランスフェクション開始から24時間後(細胞密度:100%コンフルエント)、2%HS-DMEMを用いて細胞に分化誘導を施し、48、72、120時間後に細胞サンプルを回収した。
PBSで洗浄した後、2次抗体溶液{Alexa Fluor 488 Donkey Anti-mouseIgG(Invitrogen社製)を5%BSA-PBSにより500倍に希釈した溶液}を用い、1時間の2次抗体処理を行った。
PBSによる洗浄後、Prolong Gold antifade reagent with DAPI(Invitrogen社製)を用いて細胞を封入し、細胞の形態観察と写真撮影を行い、筋管直径を測定した。筋管直径の測定は、オールインワン顕微鏡(商品名:BZ-9000、キーエンス社製)と付属の画像解析ソフトウェアを用い、1wellにつき5枚撮影した画像について、画像1枚あたり30本程度の筋管直径をそれぞれ測定し、平均値を算出した。
また、分化誘導から72時間後及び120時間後の平均筋管直径を図14に示す。図14に示すように、MYBPHのmRNAの発現をRNA干渉により抑制することで平均筋管直径が減少し、筋管の肥大が抑制された。
(1)ゼブラフィッシュのMYBPH遺伝子の検索
マウス由来のMYBPH遺伝子と相同性を有する遺伝子をNCBI(National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のHomoloGene検索を利用し、ゼブラフィッシュのMYBPH遺伝子の検索を行った。その結果ゼブラフィッシュは、それぞれ異なる染色体に存在する、2つの相同遺伝子(MYBPHa遺伝子及びMYBPHb遺伝子)を有することを見出した。さらに、MYBPHa遺伝子及びMYBPHb遺伝子の開始コドン近傍のシークエンスを行った。その結果、これらの遺伝子の塩基配列が、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)及びEnsembl(http://asia.ensembl.org/index.html)の情報と差異がないことを確認した。
そこで下記に示すように、これら2つの遺伝子全てをノックアウトした、ダブルノックアウトゼブラフィッシュを作製した。
MYBPHa遺伝子及びMYBPHb遺伝子のノックアウト用TALエフェクターヌクレアーゼ(TALEN)をコードしたプラスミド(和光純薬工業社製)を増幅し、増幅したTALENプラスミドを制限酵素処理反応液{各TALENプラスミド10μL、10×M buffer(TOYOBO社製)5μL、dH2O 34μL、制限酵素HindIII(TOYOBO社製)1μL}を用いて37℃で一晩制限酵素処理した。
得られた消化物をQIAquick PCR Purification Kit(商品名、Qiagen社製)を用いて精製した。そして、精製液を鋳型とし、mMESSAGE mMACHINE Kit(商品名、Applied Biosystems社製)を用いてRNA合成、キャップ構造付加、及びPolyA付加を行ったTALEN mRNAを作製した。ここで、混入したプラスミドを分解するためにDNase処理を行なった。
このようにして得られた産物をRNeasy MiniElute Cleanup Kit(商品名、Qiagen社製)を用いて精製し、TALEN mRNA精製液を得た。なお、TALEN mRNA精製液についてAgilent 2100 バイオアナライザ(商品名、Agilent Technologies社製)にて解析し、RNAが分解されていないことを確認した。
MYBPHa特異的TALEN mRNA及びMYBPHb特異的TALEN mRNAの両方を含むインジェクション溶液{TALEN(L)MYBPHa mRNA 3μL、TALEN(R)MYBPHa mRNA 3μL、TALEN(L)MYBPHb mRNA 3μL、TALEN(R)MYBPHb mRNA 3μL、フェノールレッド溶液 2μL、dH2O 6μL}を調製し、1細胞期の胚(卵黄を除く)に数nLずつゼブラフィッシュ100匹程度にインジェクションした。ここで、TALEN mRNAを含まないインジェクション溶液を打ち込むコントロール群100匹程度に対しても、同様のインジェクション操作を行った。
インジェクション後の胚(受精卵)には、未受精卵が混入することがある。また、インジェクション操作によりダメージを受け、死卵が発生することがある。そこで、1日につき2回ずつ、死卵の除去を行なった。
図15(a)に示すコントロール群のゼブラフィッシュは形態及び行動はいずれも正常であった。これに対して図15(b)に示すように、ゼブラフィッシュにTALEN mRNAをマイクロインジェクションした場合、運動能力の低い個体が出現することが確認された。
TALEN mRNAのマイクロインジェクション後5日間生育した仔魚のうち、コントロール群の個体から1匹、ダブルノックアウト群の個体から運動機能が低下した個体を3匹回収した。
回収したサンプルから、Dneasy blood & tissue mini kit(商品名、Qiagen社製)を用いて、ゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型とし、Tks Gflex DNA Polymerase(商品名、タカラバイオ社製)、並びにMYBPHa遺伝子検出用プライマー(配列番号7及び8)及びMYBPHb遺伝子検出用プライマー(配列番号9及び10)を含むPCR反応液{2×Gflex PCR buffer(商品名、タカラバイオ社製)1μL、100μM Forwardプライマー0.1μL、100μM Reverseプライマー0.1μL、dH2O 23μL、Tks Gflex DNA Polymerase(商品名、タカラバイオ社製)1μL}を用いてPCRを行い、MYBPHa遺伝子及びMYBPHb遺伝子の第1エキソン周辺を増幅した。PCR条件は、(94℃1分)→(98℃10秒→MYBPHa:54℃/MYBPHb:58℃ 15秒→68℃1分20秒)×38サイクル→68℃3分→4℃とした。
T7エンドヌクレアーゼ1処理を行ったサンプルについて、1%アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、BioDoc-It 220 Imaging System(商品名、ビーエム機器社製)を用いてDNAバンドを撮影した。その結果を図16に示す。なお図16(a)はMYBPHa遺伝子について、図16(b)はMYBPHb遺伝子についての結果をそれぞれ示す。
一方、Talen mRNAによりMYBPHa遺伝子及びMYBPHb遺伝子をノックアウトした場合、運動機能が低下した全ての個体で2本鎖DNAにはミスマッチが存在する。そのため、ミスマッチが存在するDNAのミスマッチ部でT7エンドヌクレアーゼにより切断されるため、PCR増幅産物のバンドの他に、低分子量の小さいバンドが2本検出された。
10週齢の雄性C57BL/6Jマウス(日本チャールズリバーより購入)に対して1週間の予備飼育を行って環境に馴化させた後、トレッドミル走行運動に慣れさせるためのトレーニングを下記の通り5日間行った。
1日目:10m/分(15分)→15m/分(15分)
2日目:10m/分(10分)→15m/分(20分)
3日目:15m/分(15分)→20m/分(15分)
4日目:15m/分(5分)→20m/分(15分)→25m/分(10分)
5日目:15m/分(5分)→20m/分(10分)→25m/分(15分)
運動群は運動1時間後及び6時間後に解剖し、各群のヒフク筋を採取した。
品質チェック後のTotal RNAを用いて以下の要領でマイクロアレイを実施した。アレイスライドはAgilent社製Mouse SurePrint G3を用いた。ラベル化cRNAの調製は、Agilent社のプロトコルに従って実施した。ハイブリダイゼーション及び洗浄後のアレイスライドは、速やかに窒素充填して遮光し、北海道システム・サイエンス株式会社に依頼してスキャンを行った。
スキャン後、QC reportから全てのアレイスライドに技術的な問題がないことを確認し、データの解析を行った。解析ソフトウェアGeneSpringを用い、Agilent推奨の75%法(Scaling)で正規化を実施した。その後、運動後1時間群、運動後6時間群におけるMYBPHのシグナル値を安静群と比較した。その結果を表3に示す。
Claims (4)
- 個体から採取された骨格筋由来のミオシン結合タンパク質H又はこれをコードする遺伝子を含む、筋管直径の変化による筋量変化の評価用マーカー。
- 個体から採取された骨格筋由来のミオシン結合タンパク質H又はこれをコードする遺伝子を含む、筋管肥大の評価用マーカー。
- 個体から採取された骨格筋由来のミオシン結合タンパク質H又はこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、
測定した発現レベルに基づいて筋管直径の変化による筋量変化を評価する、
筋量の評価方法。 - 個体から採取された骨格筋由来のミオシン結合タンパク質H又はこれをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、
測定した発現レベルに基づいて筋管肥大の程度を評価する、
筋管肥大の評価方法。
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