JP6535359B2

JP6535359B2 - 光パッド顕微鏡

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Publication number: JP6535359B2
Application number: JP2017075754A
Authority: JP
Inventors: クノップミハエル; バッハスムートマルテ; カプラードジェレミー
Original assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Current assignee: Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date: 2011-02-14
Filing date: 2017-04-06
Publication date: 2019-06-26
Anticipated expiration: 2032-02-14
Also published as: EP2985649A1; JP2021184094A; HK1220258A1; EP2676163B1; CN103649813A; EP2676163A2; WO2012110488A2; JP2014507014A; JP6912516B2; JP6174493B2; US20120206798A1; JP2019174827A; CN105116529B; WO2012110488A3; CN110764242A; CN105116529A; JP2017129880A; US10908403B2

Description

本発明は，光学顕微鏡，特に，制限された焦点体積を有する光学顕微鏡と，標本濃度変化測定に適合させた方法とに関する。

拡散は可溶性分子の移動性に基本的に貢献し，したがって，細胞***の調整及び細胞内の信号伝達から，組織形成中のホルモン調整及び発達におけるモルフォゲン勾配に至る多くの生物学的過程の時空間態様に貢献する。複雑な細胞環境内の生体分子の拡散特性を定量化することは難題である。拡散過程を直接分析できるようにする方法及び装置はまれであり，個々の課題に特化したものである。

生体分子，特にタンパク質の，かつ特に自然環境における特性及び振舞は，細胞及び発達の過程の背後にある機能及び機構を解明し，分析する主要なステップである。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）［１，２］は，標識付けした分子の可動性断片及び不動性断片，それらの拡散特性及び濃度，並びに相互作用する別様に標識付けされた分子の同時拡散についての情報を提供する分子移動性分析の既知の方法である。

共焦点レーザ走査顕微鏡（共焦点顕微鏡）は，アバランシェ光ダイオード（ＡＰＤ）を用いた超高感度光子計数と組み合わせて回折限界撮像を可能にするため，現在，高解像度生細胞撮像［３］及びＦＣＳ用に選ばれる器具である。共焦点レーザ走査顕微鏡を用いたＦＣＳ測定は，信号伝達にかかわるタンパク質複合体形成過程の定量化（ＥＭＢＬ［４］及びその他［５］による），排出能力のある（ｅｘｐｏｒｔ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の成熟研究［６，７］，又はモルフォゲン勾配の特徴付け［８］に適用されている。本明細書においては，共焦点レーザ走査顕微鏡を用いたＦＣＳ測定を共焦点ＦＣＳと呼ぶ。しかし，共焦点ＦＣＳ実験は，焦点はずれの照明による標本への光子入力に関する蛍光光子の低総発生量と共に，共焦点ＦＣＳデータ取得の，一点ごとの順次運用法によって強いられる固有限界のために，未だ難題である［９］。通常，共焦点レーザ走査顕微鏡は，特別に選択された位置におけるセル当たり一つ又は数個の単一点測定だけが可能である［４，１０，１１］。

換言すれば，共焦点ＦＣＳは，細胞又は生体全体に渡る，拡散過程及びほかのＦＣＳに由来するタンパク質パラメータ（例えばタンパク質相互作用）を可視化できるようにする細胞及びほかの生物学的標本の画像を生成するために十分な，空間的に解像された情報を提供しない。

既知の方法及び装置のほかの欠点は，空間的に解像された拡散の撮像が制限されるか，不可能なことである。

本明細書は，標本又は対象を照明するための照明光路と，標本を見るための観察光路とを有する顕微鏡を教示する。この顕微鏡は照明光路内に照明光路焦点合わせ装置を備え，照明光路焦点合わせ装置は照明光路の照明方向とそれを横断する方向に沿って伸びる，実質的に２次元の標本又は対象照明領域を規定する。２次元対象又は標本照明領域は，光縞又は光シートと考えることができる。照明光路焦点合わせ装置はまた，照明光が２次元標本照明領域に成形されるため，光路成形装置と理解してもよい。

顕微鏡は，実質的に２次元の対象照明領域の一部を選択的に照明する照明光路における照明領域制限素子を更に備える。実質的に２次元の対象照明領域の一部は，少なくとも照明方向及び／又は照明方向を横断する方向に制限される。したがって，光縞は照明方向及び照明方向に垂直の方向のうち少なくとも一つに制限され，本質的に「光パッド」とも呼ばれる実質的に２次元の対象照明領域の一部を形成する。実質的に２次元の対象照明領域及び光パッドの厚みは，照明方向の長さ及び照明方向を横断する方向の幅よりずっと薄い。例えば，実質的に２次元の対象照明領域の一部の照明方向の長さ及び照明方向を横断する方向の幅は，実質的に２次元の対象照明領域の一部の厚みの約６倍又はそれ以上であってよい。

照明光路焦点合わせ（及び成形）装置は，円柱レンズと，アナモルフィックレンズと，球面又は非球面レンズの一次元配列とのうち少なくとも一つを備えてもよい。照明光路焦点合わせ（及び成形）装置はまた，少なくとも一つのアナモルフィック鏡を備える。

照明領域制限素子は，実質的に２次元の対象照明領域の一部を照明方向に制限するための少なくとも第１開口部を備えてもよい。照明領域制限素子はまた，実質的に２次元の対象照明領域の一部を照明方向の横断方向に制限する第２開口部を少なくとも備えてもよい。第１開口部及び第２開口部のうち少なくとも一つは調整可能であってよく，また，円形虹彩，又は長方形開口部若しくはスリットであってよい。

観測光路の観測方向は，照明方向に実質的に垂直であってよい。したがって，実質的に２次元の対象照明領域は検出対物レンズの焦点面にあるよう調整される。この点で，顕微鏡は，少なくとも照明方向に制限された照明領域を有する単一面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）に基づいてもよい。本発明ではほかの観察方向を用いてもよい。

検出光路又は観察光路は，検出範囲を実質的に２次元の照明領域の一部に制限することができる少なくとも一つの空間フィルタを含んでもよい。

標本の観察及び検出は，ＣＣＤ又は電子増倍ＣＣＤ（ＥＭ−ＣＣＤ）のうち少なくとも一つのような１又は複数の検出器画素配列によって行ってもよく，観察光路を用いて検出器画素配列の上に実質的に２次元の対象照明及び検出領域が投影／撮像される。

本明細書はまた，標本を観察／検出する方法も教示する。この方法は，照明光ビームの照明方向及び照明方向の横断方向に延びる実質的に２次元の対象照明領域に照明光ビームを集中させることによって，標本の２次元部分を照明するステップを有する。２次元部分を照明するステップは，実質的に２次元の対象照明領域の一部を選択的に照明するために，実質的に２次元の対象照明領域を制限するステップを更に有し，実質的に２次元の対象照明領域の一部は，照明方向と照明方向の横断方向のうち少なくとも一つのに制限される。実質的に２次元の対象照明領域の一部は光パッドと呼んでもよい。

本方法は，実質的に２次元の対象照明領域及び実質的に２次元の対象照明領域の一部のうち少なくとも一つを，標本を通過して移動させるステップを有する。このステップは，標本を走査するために用いてもよい。実質的に２次元の対象照明領域及び／又はその一部を移動させるステップは，照明対物レンズを移動させるステップと，照明光路焦点合わせ装置又はその素子を移動させるステップと，走査ユニットで操作するステップと，照明領域制限素子を移動させるステップと，照明光路のコリメーションを変化させるステップと，のうち少なくとも一つによって，標本内で３Ｄで行ってもよい（これは，例えば空間光変調器（ＳＬＭ）又は変更可能曲率を有する鏡によって波面を操作するステップによって行うことができる）。

検出器画素配列の各画素上の標本からの光の記録は，例えば，実質的に２次元の対象照明及び検出領域における蛍光分子の分布の画像を取得するために，一定の期間積分してもよい。

検出器画素配列の各画素上の標本からの光は，一連の短時間の期間に記録され，検出器配列の画素ごとにＦＣＳデータを得るために，時空間相関分析を適用してもよい。

本方法は，実質的に２次元の対象照明領域の一部において信号の変動を測定するステップを更に有する。実質的に２次元の対象照明領域の一部の各画素又は領域における蛍光強度時間記録は，変動分析を行ってもよい。変動分析は，時間自己相関分析，別個のスペクトルチャネルからの信号間の時間相互相関分析，光子計数ヒストグラム，別個の画素からの信号間の光子一致分析，及び当業者には既知のほかの方法のうち少なくとも一つのであってよい。

本発明の更なる態様及び詳細は，添付の図面を参照して詳細な説明を読むことによって明らかになるであろう。

回折制限光パッドによる光シートベースのＦＣＳ撮像を示す図である。図１のＡの顕微鏡をより詳細に示す図である。光学光パッドを示す図である。光学光パッドを示す図である。光学光パッドを示す図である。光パッド顕微鏡の光学特性を示す図である。溶液中の１Ｄ−ＦＣＳ測定を示す図である。光シートへの焦点合わせに関する細胞培養液の効果を示す図である。ＭＤＣＫ細胞内部のタンパク質濃度及び移動性のＦＣＳ撮像結果並びに光パッド顕微鏡によって記録されたショウジョウバエ幼虫の成虫羽原基を示す図である。比較のために生体内の共焦点ＦＣＳ測定値を示す図である。ショウジョウバエ幼虫の成虫羽原基及び３Ｔ３細胞の１Ｄ−ＦＣＳ測定値を示す図である。ＦＣＳ撮像による３Ｔ３細胞内のＨＰ１α移動性の空間解像分析を示す図である。

ここで，本発明を図面を参照して説明する。ここで説明する本発明の実施例，実施形態及び態様は例に過ぎず，本願請求項の保護範囲をいかようにも制限するものではないことを理解されたい。本発明は請求項及びその均等物によって規定される。本発明の一つの態様又は実施形態の特徴は，本発明の別の態様及び／又は実施形態の特徴と組み合わせてもよく，本発明を実現するために実施例及び実施形態のすべての特徴が必要な訳ではないことを理解されたい。

本明細書は，光パッド顕微鏡１と呼ぶ新規な顕微鏡を教示する。光パッド顕微鏡１は，例えば図１のＡ及び図２により詳細に示すような三つのモジュールからなる。すなわち，（ｉ）照明光ビーム２０から回折制限光シート２２を生成する照明ユニット２であって，回折制限光シート２２は少なくとも一つの方向に制限され，したがって光パッド１０を規定する，照明ユニットと，（ｉｉ）光シート２２及び／又は光パッド１０の焦点範囲の少なくとも一つの検出光路４０，５０にそって観察を可能にする検出ユニット４と，（ｉｉｉ）任意選択で試料又は標本８の特定範囲を光パッド１０の焦点に都合よく配置することを可能にする倒立顕微鏡６と，である。

本発明の光パッド顕微鏡１は，光シート２２によって試料８の断面だけが照明され，不必要な焦点はずれ露光が避けられるため，蛍光の励起に完全な空間的制御を提供する。同時に，すべての発行光子は光シート２２の焦点面から発生し，空間的起源に基づく光子のフィルタは必要ない。

光パッド顕微鏡１は，二つの直交配置された対物レンズ，すなわち照明対物レンズ２１及び検出対物レンズ４１に基づいている。照明対物レンズ２１及び検出対物レンズ４１は，制限ではないが４０ｘ／０．８ＮＡ対物レンズのような長作動距離対物レンズであってよい。別の倍率及び／又は開口数を用いてもよいことを理解されたい。照明対物レンズ２１及び検出対物レンズ４１は同一であってもよいし，別の倍率及び／又は別の開口数を有する別の対物レンズであってもよい。照明対物レンズ２１及び検出対物レンズ４１は，試料８を含むペトリ皿８２に浸してもよい。

光パッド顕微鏡１は，撮像又はＦＣＳに有用と考えられる任意の波長又は波長の組合せで使用することができ，標本８及び標本８を調べるために用いられる染料に依存することがある。ＧＦＰ蛍光の検出には，例えば出力２Ｗのアルゴンレーザ２２０（図２に示す，例えばCoherent社のInnova Sabre SBRC-R-DBW/20）の例えば４８８ｎｍ線を用いることができる。照明ビーム２０の出力は，例えば照明ビームを，音響光学可変フィルタ２２６（例えば，AA Opto-Electronic社のAOTF, AA.AOTFnC-400.650-TN）が後に続く偏光器２２４（例えば，Thorlabs社のGL5-Aのようなグランテーラー偏光器）の前に置かれた半波長板を通過させることによって調整できる。光をブレッドボード７に含まれる装置に伝達するために，単モード光ファイバ２２８（例えば，Point Source社のkineFLEX-P-3-S-458-640-2.0-2.0-PL）を用いることができる。別の実現形態では，鏡（図示していない）のような光学素子を用いてレーザ光を直接装置に伝達してもよい。

照明光ビーム２０を光シート２２の生成用に成形するために，照明光ビーム２０は最初にコリメートされ，ある方向に，ガウス分布からおよそ一定の部分が切り出されるようにアナモルフィックに拡大される。他の方向では，照明光ビーム２０は円柱レンズ２３（例えば，ｆ＝７５．６ｍｍ）で集束される。標本内に光シート２２を正確に配置するために，照明光ビーム２０は，Ｆシータ走査レンズ２６４（Sill Optics社S4LFT0061，ｆ＝６０ｍｍ）の後方焦点面に配置された，例えばガルバノメータ駆動鏡２６２（GSI社VM-500+）からなる走査モジュール２５を通過する。チューブレンズ２４（例えばｆ＝２４５．６０ｍｍ）と，３．３ｍｍの長代表作動距離を有する水浸照明対物レンズ２１（例えば，Leica社のPlan-Apochromat，４０ｘ／０．８ＮＡ）とを用いて標本８内に光シート２２を生成してもよい。光シート２２の幅は，例えばチューブレンズ２４の後方焦点面に配置された幅制限スリット又は幅制限虹彩２７のサイズを変更することによって，例えば約２０〜２００μｍの間で調整することができる。これによって，標本の一部だけを照明することが可能になり，したがって，測定又は画像取得の際に隣接領域の光退色を防ぐことができる。走査レンズ２６４とチューブレンズ２４との間の鏡はビームを４５°偏向させ，それによって照明対物レンズ２１が，試料又は標本８を含む水平面（ペトリ皿の底）に対して下４５°を向く。

照明光路２０内の多スリット装置は，照明領域制限素子によって光シート２２を光パッド１０に制限するために用いられる。照明領域制限素子は，光シート２２の幅ｗを制限するための幅制限スリット又は虹彩２７を備えてもよい。照明領域制限素子は，照明光路２０の照明方向における照明領域又は光シート２２の長さ１を制限するために，例えばチューブレンズ２４と照明対物レンズ２１との間に配置した長さ制限スリット又は虹彩２９を更に備えてもよい。このようにして光シート２２は長さ１，幅ｗに制限され，図１のＢ及び３ａに示すように（幅ｗ，長さ１の）光パッド１０を形成することができる。図３ａの上側の図は，図１のＡ及びＢ並びに図２のｚ方向に沿った検出対物レンズ４１を通じた光パッド１０の図である。図３ａの下側の図は，図１のＡ及びＢ並びに図２のｘ方向に沿って見た光シート２２及び光パッド１０であり，光シート２２及び光パッド１０の厚みｄを示している。走査モジュール２６の調整並びに長さ制限スリット２９及び幅制限スリット２７の位置は，試料８の選択された領域の内側に光パッド１０を都合よく配置する（図１のＡ〜Ｂ及び図３ａ〜３ｃ）。

発光した蛍光を集光するために，検出対物レンズ４１，すなわち観察レンズは，照明対物レンズ２１に対して９０°の角度（図２）に配置される。反射されたレーザ光を避けるために，ダイクロイックミラー４４（例えば４８８ｎｍの励起が用いられたときは，AHF Analysentechnik社のBS HC R488）を，対物レンズ４１に続く検出チューブレンズ４３の前に配置してもよい。二つの代替検出光路，すなわち第１検出光路４０及び第２検出光路５０に蛍光光を切り替える（ｆｌｉｐ）ために，フリップミラー４５を用いてもよい。標本８とフリップミラー４５との間は，第１検出光路４０及び第２検出光路５０が重畳され，同一の素子を用いる。本発明は，第１検出光路４０及び第２検出光路５０双方に用いてもよいし，第１検出光路４０だけ若しくは第２検出光路５０だけを実装してもよい。一つの光路だけを用いるときは，フリップミラー４５は省略してもよい。

第１検出光路４０は，強度光シート撮像に用いることができ，帯域通過フィルタ４７（例えば，AHF Analysentechnik社のBrightLine HC 525/45）と，全体の倍率に影響するケプラー望遠鏡４６とを備えてもよい。蛍光信号は第１検出光路４０に沿って，撮像カメラ４８と呼ばれる電子増倍電荷結合素子（ＥＭ−ＣＣＤ）カメラ４８（例えば，Photometrics社QuantEM:512SC）に集束される。この撮像カメラ４８の画素サイズは，標本面において１３１×１３１ｎｍ^２（チップ上の実際のサイズは１６×１６μｍ^２）であってよく，視野は標本における６７×６７μｍ^２の面積に対応する。より小さい又はより大きいチップの画素サイズ及び／又は異なる幾何学形状のチップを用いてもよい。

図１のＡ及び図２に示す，撮像カメラ４８及び第１検出光路４０を用いる光パッド顕微鏡検査に関しては，標本８は標本８を保持するモータ駆動ステージ８４を用いて３Ｄで撮像できる。（ビーズ又は酵母菌細胞のような）丸みを帯びた対象の場合，検出の光学軸（ｚ軸）に沿った等距離の標本位置で画像スタックを取得することができる。ショウジョウバエ幼虫の成虫羽原基のように横に伸びた物体が標本８として用いられる場合は，水平方向（ｙ−ｚ方向）に画像のスタックを取得してもよい。隣接領域をタイル式に撮像することによって，より大きな実効視野を得ることができる。

ＦＣＳ撮像（１Ｄ／２ＤＦＣＳ記録）及び／又は強度撮像に第２検出光路５０を用いてもよい。第２検出光路５０は，帯域通過フィルタ５５（例えば，AHF Analysentechnik社のBrightLine HC 525/45）及び走査モジュール５６を含んでもよい。空間ろ波は，二つのレンズ，例えばアクロマチック２重レンズ，すなわち第１レンズ５７１及び第２レンズ５７２（例えば，Thorlabs社ｆ＝６０ｍｍ）と，第１レンズ５７１の画像面に配置された調整可能スリット５７３（例えば，Melles-Griot社07 SLT 701）とを備える空間フィルタ５７によって行われる。調整可能スリット５７３はまた，スリットに垂直に配置された光パッド１０の制限も可能にする。走査モジュール５６は，標本８の照明された範囲内にＦＣＳ撮像のための領域を配置することを可能にし，一方，空間フィルタ５７は照明された範囲の画像のサイズの調整を可能にする。換言すれば，第２検出光路５０に沿った撮像又は検出のために，光パッド１０の部分又は一部を選択することができる。これは，照明光路２０における空間フィルタ２７（虹彩）による光シート２２の横方向制限と共に，光パッド１０を規定する（図１のＢ及び図２ａ）。最後に，集光レンズ５９，例えば非球面レンズ（Thorlabs社ｆ＝４０ｍｍ）が，ＦＣＳカメラ５８と呼ばれる第２ＥＭ−ＣＣＤカメラ（例えば，Sensovation社SamBa SE-34）に蛍光光を集光させる。第２検出光路５０の全体倍率は例えば３９倍であってよく，これは標本空間における画素サイズ（１９０×１９０ｎｍ^２（チップ上の実際のサイズは７．４×７．４μｍ^２）と，標本における１２４×９４μｍ^２に対応する最大視野とにつながる。本発明と共に，ほかの倍率，ほかの画素サイズ及び別の検出器配列を用いてもよく，顕微鏡及び調査すべき標本８に適合させてもよい。

１次元（１Ｄ）ＦＣＳデータ取得に関しては，ＦＣＳカメラ５８に至る光学経路５０を用いてもよい（図１のＡ及び図２）。時間解像度を増加させるために，ＦＣＳカメラ５８のＥＭ−ＣＣＤは，所望であればライン走査モードで動作させてもよい。連続する露光期間の間にチップのセンサ領域から記憶領域に完全なフレームを転送する代わりに，一つのラインだけがシフトされる。したがって，ラインの一部又は完全なラインが，チップのＡ／Ｄ変換及び増幅チェーンを介してフレーム取り込み装置（ｇｒａｂｂｅｒ）カード（例えば，National Instruments社PCI-1422）に転送される。読出し過程はＣＣＤ画像取得の時間を制限する段階であり，この手続が時間解像度を，例えば１２０画素からなるラインの一部を４０μｓ（又は２５，０００ライン／ｓ）まで著しく増加させる。生体内計測に関しては，視野を拡大するために，例えば時間解像度７０μｓで３４０画素（１ラインの半分）を取得してもよい。データ点当たりの光電子数を増加させるために，第２検出光路５０内の空間フィルタ５７を，いくつかのラインが照明されるようにしてもよい。

蛍光信号は，測定ごとに例えば３０〜６０秒間取得してもよい。測定値の背景雑音全体を評価するために，測定の前及び／又は測定中（例えば５秒間）レーザを停止してもよい。

２次元（２Ｄ）ＦＣＳ測定は，１Ｄ−ＦＣＳと同一の手続で実行することができる。例えば，ＦＣＳカメラ５８のＥＭ−ＣＣＤチップの２０ラインを照明するために空間フィルタ５７を調整してもよい。そして対応する２０ラインは連続する露出期間の間に記憶領域に転送され，次いで変換され，増幅されて，一つのフレームとしてフレーム取り込み装置に転送される。ここで，２０ライン，３４０画素のフレームサイズを用いたとき，例えば７００μｓの時間解像度を得ることができる。１Ｄ−ＦＣＳについては，例えば各測定の始め又は途中の５秒間を信号の背景雑音全体を測定するために用いてもよい。（画像又は２Ｄキモグラフの時系列が図１のＤ及び４のｇに示されている。）

図１及び２に関する上記の例においては，撮像カメラ４８を含む撮像光路４０及びＦＣＳカメラ５８を含む別個のＦＣＳ光路５０を説明したが，ＦＣＳ及び撮像双方に用いられる一つのカメラ又は撮像装置を含む結合された撮像及びＦＣＳ光路を用いることも可能である。フリップミラー４５は省略してもよい。

ＦＣＳ撮像に用いられるレーザ出力は，例えばPD300検出器を備えたNova II出力計（Ophir Optronics，イスラエル，エルサレム）を用いて照射レンズの焦点面で測定することができる。生体内実験における１Ｄ／２Ｄ−ＦＣＳの典型例において，光シート２２の焦点におけるレーザの強度は数ｋＷ・ｃｍ^２の範囲であろう。これは，通常の共焦点ＦＣＳ構成において通常用いられる焦点強度の下限に対応する。このように，一つのＦＣＳ測定を行うための共焦点構成において用いられる強度は，例えば，（２０画素に沿って）２０の測定を行うことを可能にする。したがって，焦点はずれの照明を避けることに加えて，光パッド顕微鏡１は，この例に関しては，従来の共焦点ＦＣＳ構成に比べて少なくとも約２０倍効率が向上する。

さらに，検出走査モジュール５６又は検出空間フィルタ／スリット５７３の同期走査による照明対物レンズ２１の軸方向走査及び検出範囲の同期走査によって，検出対物レンズ４１の視野内の光パッド１０を走査できるようになる。代替として，同一の効果を得るために円柱レンズ２３を走査してもよい。代替として，光りパッド１０の同軸走査を実現するために，例えば鏡２５を空間光変調器，例えば調整可能曲率を有する鏡で置き換えることによるビームの制御されたコリメーション／デコリメーションを適用してもよい。

ＦＣＳカメラ５８の各画素は、光パッド１０（図１のＢ）の対応する観察体積要素から発せられた光を集める。蛍光分子が、例えば拡散によって光パッド１０内に移動し、個々の体積要素を横断したとき、ＧＦＰタグ付きタンパク質のような蛍光分子の個々の分子が時空間濃度（及び蛍光）変動を生じさせる。ＦＣＳカメラ５８のようなＥＭ−ＣＣＤチップの使用によって、これらの変動を高時間解像度及び単一光子感度で記録することができる。各画素（図１のＣ）における強度時間記録の時間相関分析が、体積要素の個々の要素の蛍光分子の内向き運動及び外向き運動の頻度及び速度に関する統計的情報を提供する。（図１のＤ〜Ｆ）。この情報は、較正時に、例えばタンパク質濃度及び可溶分子の場合の拡散係数のようなタンパク質移動性の空間解像されたマップに変換される。

光パッド顕微鏡１の光学特性は，光パッド顕微鏡１が，近共焦点個別体積の配列（図１のＢ，図３ａ〜３ｃ及び図４参照）を提供する，照明軸に沿った例えば約４μｍの長さの回折制限光パッドを生成するものである。光パッド１０の幅は，照明光路２０内のスリット２７によって調節可能である。ＦＣＳカメラ５８の画素は，例えば，３．８×６５μｍ^２（図４のａ）の最大利用可能光パッド範囲を３４０画素の２０ラインに細分してもよいが，他の細分化も可能である。観察体積は約１．０６ｃｄ／ｃｍ^２（０．３１ｆＬ）であり，ほとんど等方性の点広がり関数（ＰＳＦ）に対応する（図４のｃ〜ｈ）。観察体積の寸法は，（ｚ軸に沿った１／ｅ^２が）約０．７μｍ以下である光シート２２の厚みと，検出対物レンズ４１の横方向解像度によって決定される。これは，標準共焦点顕微鏡よりも例えば約１．６倍の観察体積になる（図４のｉ〜l）。

光パッド顕微鏡１は，図１のＡ及び図２に示すように，垂直に立てたブレッドボード７の上に作ってもよい。この垂直の構成は，（アガロースのようなゲル内で標本を培養又は埋め込んだ３Ｄセルを必要とせずに）例えば，二つの対物レンズを直接浸した培養基で満たされた直径６０ｍｍの従来のペトリ皿８２を使用できるようにするという更なる利点がある（図Ｓ１ｂ，図２）。この垂直構成はまた，照明用の乾式の対物レンズを有する従来の光シート顕微鏡検査を用いたとき遭遇する可能性のある，空気−ガラス，ガラス−培養基又は培養基−アガロースの境界面における屈折率の変化による光学収差も避けることができる。標本８を自由に移動できるようにするため，ペトリ皿８２は３軸モータ駆動ステージ８４（例えば，５０ｎｍの精度で標本８を配置することができる，Cell Biology Trading/Luigs & Nuemannのステップモータ，LN=Mini 23マニピュレータブロックXY及びLN-Mini Z vario）の上に固定してもよい。

光パッド顕微鏡１は，対物レンズ６１を備えた任意選択の従来型倒立顕微鏡６（例えば，Olympus IX 70）を補助として，標本８を下から（例えば，ペトリ皿を使用するときは，ペトリ皿のガラスの底面を通して）観察できるように設計してもよい。例えば，２０×０．４ＮＡレンズのような長作動距離乾式対物レンズを用いてもよい。当業者であれば，応用の必要に応じた最適なレンズを選択することができるであろう。視野がより大きいため，倒立顕微鏡６は，光パッド内の生物学試料８の大きなものの位置をより容易に，かつより速く特定すること又はＦＣＳに適した培養細胞を迅速に選択することを可能にする。試料の位置特定中の観察のため，例えばペトリ皿８２の上に配置した白色発光ダイオードを用いた透過光照明を用いてもよい。

例えば，共焦点レーザ走査顕微鏡（例えば，HCX PlanApo CS 63x/1.2 NA水浸対物レンズを備えた，Leica社TCS SP5 AOBS SMD FCS）を用いるときは，任意選択で標準共焦点蛍光画像，画像スタック及びＦＣＳデータを倒立顕微鏡６上で取得してもよい。励起には，アルゴンレーザの４８８ｎｍ線又は他の励起波長を用いてもよい。蛍光は，撮像用光電子像倍管及び撮像及び／又はＦＣＳ用アバランシェ光ダイオード（例えば，Perkin-Elmer Optoelectronics社SPCM-AQR-14）で検出できる。特にこの例においては，検出ピンホールの直径は，１エアリディスクの大きさに固定された。標本８におけるレーザ出力は，対物レンズの前で測定したときＦＣＳに関しては約２００μＷ以下，共焦点レーザ走査顕微鏡検査（ＣＬＳＭ）取得に関しては５００μＷ以下であった。ＦＣＳデータ取得に関しては，入射光ビーム６０は先行して取得された画像の関心点に置かれ，レーザ照明及び検出器読み出しは３０〜６０秒間行われた。

図４のａは，撮像カメラ（ｚ軸は観察方向）で撮像され，ここでは水に溶解させたAlexa88内で照明によって可視化された照明光シートを示す。破線で囲んだ領域は，特にこの例では光シート２２が十分に小さい個別観察体積要素を提供するのに十分薄い３．８×６５μｍ^２の領域（図１のB）に調整された光パッド１０を強調している。光シートの厚みを特徴づけるために，水平ミラーを水で満たしたペトリ皿８２の中心に配置し，図４のbに示すように，光シート２２が直接検出対物レンズ４１に反射されるように，当該水平ミラーを有するペトリ皿８２を照明対物レンズ２１及び検出対物レンズ４１双方の焦点面に配置してもよい。第1検出光路４０からダイクロイックミラー４４及び射出フィルタ４７を取り除いた後，光シート２２の焦点断面が撮像カメラ４８で撮像された。得られた画像を図４のｃに示す。ガウス関数を平均水平強度の曲線（ｐｒｏｆｉｌｅ）に当てはめると，１／ｅ^２の全幅が７００±１０ｎｍとなる（図２ｄ）。

全体のＰＳＦは，直径２０ｎｍの個別蛍光ビーズの画像スタックを解析することによって特徴づけられた（軸の定義については図４のｅを参照されたい）。３Ｄガウス関数をビーズの画像スタック（図２ｆ）に当てはめることによって，３７０±２０ｎｍの横方向（ｘ−ｙ）１／ｅ^２半径及び４１０±４０ｎｍの軸方向（ｚ）１／ｅ^２半径を用いることができる。これは，ＰＳＦが１．０６ｃｄ／ｃｍ^２（０．３１ｆＬ）の個別観察体積に関してほとんど等方性であることを意味する。３Ｄスタックから，ＧＦＰに溶解した膜タンパク質Pmalを表す酵母菌細胞を通じて抽出された横方向と軸方向との強度の曲線（図４のｇ〜ｈ）を比較することによって，ＰＳＦの等方性曲線が確認される。

図４のｉ〜ｌは，同一のビーズ，すなわち１．２ＮＡ浸水対物レンズを備えたLeica SP5共焦点顕微鏡を用いて特徴付けられたビーズと共焦点ＦＣＳに用いられたビーズとの直接比較を示す。同一の方式に従って，２４０±１０ｎｍの横方向１／ｅ^２半径及び６００±２０ｎｍの軸方向（ｚ）１／ｅ^２半径が得られた。すなわち，ＰＳＦは０．６５ｃｄ／ｃｍ^２（０．１９ｆＬ）の体積に関して著しく大きな異方性を示す。これらを考慮すると，光りパッド顕微鏡のＰＳＦは等方性であり，標準の共焦点顕微鏡のＰＳＦよりもおよそ１．６倍大きく，したがってＦＣＳ測定を可能にするのに十分小さい。さらに，光パッド顕微鏡１は，従来の光シート顕微鏡検査に比べて，標本を回転させることによって種々の方向から標本を撮像すること，又は画像の逆畳み込みを必要とせずに，標本８を等方性３Ｄ撮像することを可能にする。

図５は生体内１Ｄ／２Ｄ−ＦＣＳ記録の例を示す。この応用例においては，光パッド顕微鏡１は生体外の蛍光標本のＦＣＳに用いられている。標本８として，直径２０ｎｍのFluoSphere蛍光ビーズの１Ｄ−ＦＣＳデータが記録された。図５のａは，挿入された図に示されている破線に沿った１Ｄ−ＦＣＳ記録から計算された２５０個の個別自己相関関数（ＡＣＦ）を示す。蛍光ビーズは不均一な凝集体を形成する傾向があり，これは画像生データにおいてはっきりと見ることができ（図５のａに示された挿入図の明るい点），ＡＣＦの明確な振幅及び減衰の不均一性を生じさせた。したがって，図５のａに示されたＡＣＦはスパイクを除いた後に取得され，強度時間記録の集約に対応する。ペトリ皿８２の底において，表面に近い１Ｄ−ＦＣＳ記録を行ったとき，蛍光ビーズの純粋なブラウン運動が観察され，一方，滴の中心においては，観察可能な運動は対流によって占められていた。凝集体濾過を行ったＦＣＳデータの品質は，２モードの移送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を区別できるようにする。すなわち，ＡＣＦ（図５のｂ）は，（後で定義する式２を用いて）１成分異常拡散モデルに当てはめることができ，それぞれ１．０及び１．８５の異なる異常パラメータを得た。前者は純粋拡散を示し，後者は動画で見ることができる大きな凝集体の動きから予想されるように指向性運動を示す。

図５のｃは，光パッド顕微鏡１の性能を示し，測定された特異化を検証するために，蒸留水に拡散したAlexa488の溶液の１Ｄ−ＦＣＳ記録を示す。図５のｃに６０個の個別ＡＣＦが示されており，これは，図５のｄに印を付けた画素範囲から記憶されたものであり，振幅のわずかな変動及び時間依存性だけを示している。ＡＣＦを１成分自由拡散モデルに当てはめて，前に決定した４１０ｎｍの軸焦点半径と，相互相関分析（以降の説明及び図５のｅを参照）によって独立に決定した３２０μｍ^２ｓ^−１の拡散係数とが，４９０±３０ｎｍの実効横方向焦点半径（図５のｄ）の取得を可能にした。比較のために，理論的な期待値を計算した。すなわち，データに３画素ビニングを適用したため（図５のｆ），実験結果とよく一致する５００ｎｍの１／ｅ^２半径を有するガウス関数とよく当てはまる実効検出の曲線を得るために，３×１９０ｎｍ長の長方形検出の曲線と上で決定したとおりの３７０ｎｍの１／ｅ^２半径を有するガウス関数とを畳み込み演算した。ビニングを含む実効焦点体積は１．９６ｃｄ／ｃｍ^２（０．５７ｆＬ）であった。当てはめから得られた分子数は，線に沿って仮想的に一定であり，使用された蛍光団濃度をよく取得できるようにする濃度の曲線（図５のｄ）に変換できる。このようにして，Alexa488の１Ｄ−ＦＣＳは，撮像ベースのＰＳＦ測定を独立に完全に確認する。

計算されたＡＣＦに加えて，図５のｅ〜ｆに示すように空間相互相関を画素間の距離によって計算することができ，式２を画素間距離０〜４のＣＣＦ全体に当てはめることによって，独立適合パラメータとして３２０±１０μｍ^２ｓ^−１の拡散係数を得た。

図６は，光シート２２に焦点を当てることについての細胞培養基の屈折率の影響を示す。水と異なる屈折率を有する培養基であって，該培養基用に対物レンズが設計されている培養基内で作動することは，光学収差を招くことが予想される。光パッド顕微鏡１と共に用いることができる対物レンズ２１，４１の長作動距離を考慮すると，わずかな差であっても無視できない影響を与えることがある。光パッド顕微鏡１を用いた１Ｄ／２Ｄ−ＦＣＳから得られたデータに対するこの影響を評価するため，異なる屈折率を有する，水又は緩衝液に溶解したAlexa488を用いて，光シート２２のビームウェストの位置を観察した（図６のａ〜ｂ）。十分に高い強度で照明したとき，照明ビームのウェストは，照明の焦点に近い蛍光団飽和のために，暗く狭い領域として特定することができる。この効果は，光パッド１０の位置を正確に判定するために用いることができる。水の代わりにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いたとき，光パッド１０が照明対物レンズ２１に向かって４．５μｍ又は作動距離の０．１４％変位することが観察できた（図６のｂ参照）。この結果は，培養基の屈折率を考慮しなければならず，それによって検出対物レンズの適切な再焦点合わせ及び再配置によってシステムを調整する必要があることを示す。

図６のｃは，水，１×ＰＢＳ及びＣａ^２＋を含む１×ＰＢＳに溶解された濃度２５０ｎＭのAlexa488の１Ｄ−ＦＣＳＡＣＦを示す。このＡＣＦを１成分自由拡散モデルに当てはめることによって，水に比べてＰＢＳについては４８％，ＰＢＳ／Ｃａ^２＋については６４％の振幅の著しい減少になった。反対に，拡散相関については，ＰＢＳについて９％，ＰＢＳ／Ｃａ^２＋については１３％の小さな相対増加だけが観察された。拡散相関時間の差は，ＰＢＳ及び水の異なる粘性（２５°Ｃにおいて０．９９ｍＰａｓ及び０．８９ｍＰａｓ）に帰する［１２，１３］。これは，焦点半径は培養基の屈折率には影響されず，焦点はずれ信号の増加に起因したことを示す。振幅に対する球面収差の影響を説明するために，データ当てはめから取得した濃度値に，ＰＢＳにおける生体内測定には０．５２の，ＰＢＳ／Ｃａ^２＋における生体内測定には０．３６の補正係数を適用した。

データ処理及び分析
本発明と共に使用できるデータ処理及びデータ分析の例を以下に示す。当業者であれば，調査すべきパラメータに応じて，ほかのデータ処理及びデータ分析も使用できることを理解するであろう。蛍光分子（又は蛍光粒子）の拡散に，既知のデータ処理及びデータ分析方法を本発明と共に用いることができる。

最初の５秒間又は全取得時間の別の部分に取得された背景信号を減算した後，かつ前に説明したとおり画素の階調値を光電子数に変換した後に，画像ファイルから１Ｄ及び２Ｄ−ＦＣＳ測定の画素ごとに，ラインｙ内の画素ｘの強度時間記録Ｆ_ｘ，ｙ（ｔ）を抽出することができる。得られた蛍光強度記録から，また共焦点ＦＣＳ測定からも，自己相関関数（ＡＣＦ）及び相互相関関数（ＣＣＦ）を次の式に従って計算することができる。

例えば光退色による緩やかな変動は，スライド平均法を用いて補正することができる。得られたＡＣＦ及びＣＣＦは，例えばMatlab（MathWorks社）によって，非線形最小二乗Levenberg-Marquardtアルゴリズムを用いて次の一般モデル関数に当てはめることができる。

ここで，Ｎは（見かけ上の）分子数であり，寿命τ_{ｂｌｉｎｋ}の非蛍光状態の分子の一部Θが明滅する分子を説明し，拡散相関時間τ_{ｄｉｆｆ，ｉ}＝ｗ_０ ^２／（４Ｄ_ｉ），横方向及び軸方向焦点半径ｗ_０，ｚ_０，見かけの拡散係数Ｄ_ｉ，及び成分ｉ＝１，２の異常パラメータα_ｉである二つの成分ｆ_１，ｆ_２＝１−ｆ_１の異常拡散を考慮する。ＣＣＦの場合，画素サイズδ及び画素インデクスｘ_１，ｙ_１，ｘ_２，ｙ_２を含む２番目の指数関数項において画素変位が考慮され，一方，ＡＣＦについては当該項は１である。蛍光ビーズ及びAlexa488の１Ｄ及び２Ｄ−ＦＣＳデータに関しては，明滅の寄与なし，すなわちΘ＝０で曲線当てはめを行うことができる。緑色蛍光タンパク質の共焦点及び１Ｄ−ＦＣＳデータに関しては，非蛍光寿命は１００μｓと推定できる。２Ｄ−ＦＣＳデータに関しては，０．７ｍｓの時間解像度が明滅の寄与を無視できるようにする，すなわちΘ＝０である。１成分当てはめに関しては，ｆ_１＝１が設定される。当てはめの良さは，０≦Ｒ_ａｄｊ ^２≦１の自由度に調整されたＲ−ｓｑｕａｒｅ（Ｒ_ａｄｊ ^２）によって評価することができる。これは，Ｒ_ａｄｊ ^２≧０．８又はそれ以上の容認された当てはめに有用である。

このようにして，当てはめパラメータ，当てはめの良さＲ_ａｄｊ ^２及び画素強度の曲線（１Ｄ−ＦＣＳ）及びマップ（２Ｄ−ＦＣＳ）を生成することができる。強度及び／又はＲ_ａｄｊ ^２マップにしきい値を設けることによって，ノイズ混じりのデータ及び／又は不十分な当てはめを除外し，これらの領域を抜き出すために，２値マスクを生成してもよい。この領域に関して，最終的に得られた成分の濃度，拡散係数及び部分が対応付けられる。

実施例１
細胞のような生きている試料内のＦＣＳ測定は，細胞の内部が不均一なことと，蛍光標識付けした分子の数が限られることのため，特に難題である。生体内のＦＣＳ撮像の有用性を，内在的に表現された緑色蛍光タンパク質でタグ付されたタンパク質，すなわち細胞周期のＳ／Ｇ２期におけるＭＤＣＫ細胞内の細胞周期報告システムFucci［１４，１５］の40kDa mAG-hGem(1/110)成分，の拡散を測定することによって調査した。ＥＭ−ＣＣＤの１ラインによるＦＣＳ記録（１Ｄ−ＦＣＳ，図７のｂ）は，mAG-hGemタンパク質が局在する細胞核の領域における拡散誘起衰退を特徴付けた自己相関関数（ＡＣＦ）を計算できるようにした。反対に，非相関ＡＣＦは，細胞質領域及び細胞内空間から取得された（図７のｄ）。ＡＣＦを（上述の）１成分異常拡散モデル関数に当てはめることによって，平均見かけ拡散係数２５±７μｍ^２ｓ^−１及びこの特定の細胞のタンパク質濃度４２０±１２０ｎＭが得られた（図７ｅ）。同一細胞系のほかの細胞を用いて行われた共焦点ＦＣＳ測定は各差異計数（２０±３μｍ２ｓ−１，図６のａ〜ｂ）を確認した。細胞核を横断する約３×１９μｍ^２に対応する１５×１０２画素範囲の２Ｄ−ＦＣＳ記録は，拡散係数及び濃度の非常に均一な分布を示し，それは予想通り，研究された種々の細胞の非常に類似した平均値（図７のｈ）を有していた。２Ｄ−ＦＣＳ記録に関係するゆっくりした取得速度が主に，適切に濃度を予測する精度に影響を与えたことが分かった。１μｓと４０，７００又は１４００μｓとの時間解像度を比較すると，拡散相関時間３ｍｓ（ＧＦＰに関して通常測定されるとおり）の場合，当てはめから確信までの期間は１．５，３又は５倍に増加した。反対に，拡散係数の予測はほとんど影響されずに残った。これらのデータは，１Ｄ及び２Ｄ−ＦＣＳ記録が生きた細胞から良い精度で拡散係数を得ることを可能にすることを確認する。２Ｄ−ＦＣＳ記録を用いたときは，タンパク質濃度の測定は信頼度が低いが，この情報は信号強度から概算したものであり，タンパク質の表現におけるセル間変動のため，一過性形質転換システムが用いられるすべての場合には関係が少ないパラメータである。タンパク質濃度測定の精度は，次世代検出器配列（例えばｓＣＭＯＳカメラ）を用いた２Ｄ−ＦＣＳ取得のより良い時間標本化によって改善できる。

全組織内の細胞のタンパク質拡散を研究するために光パッド顕微鏡が使用できるかどうかを調べるために，ショウジョウバエ幼虫の成虫羽原基内のＮＬＳ−ＧＦＰ（核移行シグナルＮＬＳに融合したＧＦＰ）の拡散を調べた。光パッドを通して水平に組織を走査して生成した組織の大きな範囲の３Ｄ再構成が，深さ約５０μｍまでの（部分）細胞構造を明らかにした。新しく用意された成虫羽原基の選択された範囲において行われたＦＣＳ撮像が細胞核内のＮＬＳ−ＧＦＰの拡散係数を与え（図７のｍ，図９のａ），平均１９±６μｍ^２ｓ^−１となった。この値は，共焦点ＦＣＳを用いて行った測定（１４±２μｍ^２ｓ^−１，図８のｃ〜ｄ）と一致する。このことは，光パッド顕微鏡が胚性組織内の蛍光標識付けされたタンパク質の拡散を研究するために使用できることを示す。

実施例２
異質染色質タンパク質１（ＨＰ１）族の要素は，ＤＮＡ及び特に変更された異質染色質と結合したタンパク質及び染色質を形成するタンパク質，特に，Ｌｙｓ９ジ又はトリメチルヌクレオゾームヒストンＨ３，及びゲノムホメオスタシスにかかわる，したがって，異質染色質形成及び維持，真正染色質器質化，転写抑制，ＤＮＡ複製及びＤＮＡ損傷修理における複雑な機能を行う，広範な要因との動的な相互作用を受ける。ＨＰ１のＤＮＡとの相互作用の動態は，前に光退色及び共焦点ＦＣＳによって測定され，異質染色質が制御因子に接近可能であり，異質染色質におけるＨＰ１α濃縮は，タンパク質と染色質，特にメチルヌクレオゾームヒストンＨ３との，増加したが未だ非常に動的な相互作用によるものである。共焦点ＦＲＡＰ（光退色後の蛍光弛緩）又はＦＣＳによる局所測定は，ＨＰ１α染色の明るさによって案内され，この明るさは異質染色質において強く，セル当たり数回に制限された。したがって，このような調査は，核体積のより大きな部分を含む，ＨＰ１αの真正染色質染色の均一な強度を示すことはなく，均一な移動性と関係しているかどうかを示さなかった。ここで，ＨＰ１α全体を表すマウス３Ｔ３細胞における１Ｄ−ＦＣＳ記録（図９のｂ）は，ＨＰ１α移動性の高速及び低速で拡散する成分を有する範囲を示した。低速成分（０．０７μｍ^２ｓ^−１〜０．４１μｍ^２ｓ^−１の間，共焦点ＦＣＳデータと一致，図８のｅ〜ｆ）の測定値は，蛍光強度分布（図９のｂ）に対して部分的な反相関を示した。しかし，１Ｄ−ＦＣＳ記録の空間解像度及び次元性は，真正染色質と異質染色質とを明確に区別するには十分ではなかった。

図１０は，ＦＣＳ撮像による３Ｔ３細胞におけるＨＰ１α移動性の空間分解された分析を示す。図１０のａはＨＰ１α−ＥＧＦＰを表す３Ｔ３細胞の概要である。破線の長方形は光パッド１０を示し，スケールバーは１０μｍに相当する。図１０のｂは，ペトリ皿８２内の標本８としての細胞の照明及び観察の概略を示す図である。照明光シート２２の高開口角（７４°）によって，光パッド１０の範囲外にある細胞は弱く照明されることになる。光学的薄切は，ペトリ皿８２の底に対して４５°以下で行われる。細胞質と同様に真正染色質及び異質染色質を分解するために，強度しきい値に基づく分割が用いられた。ＨＰ１αの平均見かけ拡散係数が異なる真正染色質の領域を識別するために，Ｄ＝０．３６μｍ^２ｓ^−１の拡散係数しきい値（異質染色質における拡散係数の分布の平均値＋１標準偏差）に基づく更なる分割が図８のｅに適用された。スケールバーは１μｍに相当する。図１０のｈは，図１０のｇの分割マップにおいて強調された四つの異なる領域に関して計算され，平均されたＡＣＦを示す。図１０のｉは３Ｔ３細胞における拡散及び染色質結合から得られるＨＰ１α移動性の概略モデルを示す。第１の部分は細胞質及び細胞核において自由に拡散している（ＡＣＦの高速成分）。低速で染色質と相互作用する部分は，真正染色質に比べて異質染色質において染色質に対する親和力がより高いことによる，真正染色質よりも異質染色質において低速の見かけ拡散係数を有する核にだけ発見される（ＡＣＦの低速成分）。しかし，真正染色質のいくつかの部分においては，ＨＰ１α移動性は（したがって染色質親和性も）異質染色質と類似している。これは，真正染色質に関係する過程における重要な因子としてのＨＰ１αの明らかになった役割を確証する。

２Ｄ−ＦＣＳを用いたＨＰ１α移動性の空間的により良く分解された調査は，細胞質における拡散係数が１０〜４０μｍ^２ｓ^−１であることを示した。細胞核においては，２成分当てはめによって，高強度異質染色質においては０．２９±０．０７μｍ^２ｓ^−１の低速部分，低強度真正染色質領域においては０．４８±０．２５μｍ^２ｓ^−１の広域分布が示された。真正染色質を，見かけ拡散係数が０．３６μｍ^２ｓ^−１（異質染色質における拡散係数の平均値＋１標準偏差）のしきい値より上及び下の領域に細分化した。この分析によって，ＨＰ１α移動性が０．２９±０．０５μｍ^２ｓ^−１の真の真正染色質領域が示され，これは異質染色質領域において観察されたもの（上記参照）と非常に良く一致した。しかし，染色質と結合したＨＰ１αの相対量は，曲線の振幅がより低いことによって示されるとおり，より小さかった。残りの真正染色質は，０．６１±０．２６μｍ^２ｓ^−１の高い拡散係数を示した（図１０のｇ〜ｈ）。これは，ＦＣＳ撮像が細胞組織の空間器質化並びにタンパク質の存在量及び移動性が互いにどのように関係するかについての新しい見識を提供する可能性を有することを示す。

ＨＰ１α−ＥＧＦＰを安定に表す３Ｔ３細胞は，当業において既知のとおり培養された。共焦点撮像及びＦＣＳ測定については，細胞は８穴カバーガラスで培養され，培養基は実験の前にフェノールレッドの無い培養基に取り換えられた。光パッド撮像及び１Ｄ／２Ｄ−ＦＣＳ測定については，細胞は４×１０ｍｍ２より小さい１ｍｍ厚のカバーガラス上で培養され，実験の前に１×ＰＢＳの入ったペトリ皿に移された。

結言
上述の実施例は純粋に説明的であり，光パッド顕微鏡をどのように使用し，又は試験できるかの例を示すものであることを理解されたい。本願請求項に規定された応用は特定の実施例又は応用に限定されない。光パッド顕微鏡の多くのほかの応用も可能であり，当業者であれば，光パッド顕微鏡で調査できる多くの別の生物学的及び非生物学的標本を発見するであろう。また，データ評価のほかの方法を光パッド顕微鏡と共に使用してもよい。

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Claims

照明対物レンズ（２１）を介して標本（８）を照明する照明光路（２０）と，検出対物レンズ（４１）を介して第１の観察方向から前記標本（８）を観察するための少なくとも一つの観察光路（４０，５０）とを有する顕微鏡装置であって，
前記照明光路（２０）内の照明光路焦点合わせ装置（２３）であって，前記照明光路（２０）の照明方向と，該照明方向の横断方向とに沿って伸びる実質的に２次元の対象照明領域（２２）を規定する照明光路焦点合わせ装置と，
前記実質的に２次元の対象照明領域（２２）を配置する第１の走査モジュール（２６）と、
前記実質的に２次元の対象照明領域（２２）の一部（１０）を選択的に照明する前記照明光路（２０）内の照明領域制限素子（２７，２９）と，
前記第１の観察方向とは異なる第２の観察方向から前記標本（８）を観察するための追加対物レンズ（６１）と，
を備える顕微鏡装置。
前記照明光路焦点合わせ装置（２３）は，円柱レンズ（２３）と，アナモルフィック形状のレンズ，球面レンズ又は非球面レンズのうち少なくとも一つを含む，請求項１に記載の顕微鏡装置。
前記照明光路焦点合わせ装置（２３）は少なくとも一つのアナモルフィック形状の鏡を含む，請求項１又は２に記載の顕微鏡装置。
前記照明領域制限素子（２３）は，前記実質的に２次元の対象照明領域を生成する第２の走査モジュールを更に備える，請求項１〜３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記第２の走査モジュールは，ガルバノメータ駆動鏡である，請求項４に記載の顕微鏡装置。
前記照明領域制限素子（２３）は，前記実質的に２次元の対象照明領域の前記一部を前記照明方向に制限する第１アパーチャ（２９）を含む，請求項１〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記照明領域制限素子は，前記実質的に２次元の対象照明領域の前記一部を前記照明方向を横断する方向に制限する少なくとも第２開口部（２７）を含む，請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記照明領域制限素子（２３，２７）は光ビーム成形器を含む，請求項１〜６のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記第１の観察方向は，前記照明方向及び前記実質的に２次元の対象照明領域（２２）に実質的に垂直である，請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記第２の観察方向と前記第１の観察方向又は前記照明方向の少なくとも一つとの間の角度は、９０°と異なる，請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
実効的に観察される領域を１次元又は２次元に減少させることができる，検出経路（５０）内の調整可能検出開口部（５７３）を更に備える，請求項１〜１０のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記実質的に２次元の対象照明領域（２２）の前記一部（１０）及び前記実効的に観察される領域は合同及び／又は一致する，請求項１１に記載の顕微鏡装置。
前記実質的に２次元の対象照明領域（２２）の前記一部（１０）及び前記実効的に観察される領域は，前記標本（８）を通って合同して及び／又は一致して移動できる，請求項１２に記載の顕微鏡装置。
前記追加対物レンズ（６１）は，落射蛍光顕微鏡（６）の一部である，請求項１〜１３のいずれか一項に記載の顕微鏡装置。
前記追加対物レンズ（６１）は，倒立顕微鏡（６）の一部である，請求項１〜１４のいずれか一項に記載の顕微鏡。