JP6530114B1 - Membrane sheet blocking method - Google Patents
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Abstract
【課題】イムノクロマトグラフィーにおける偽陽性の発生を抑制し、さらにイムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートの黄変を抑制するメンブランシートのブロッキング方法の提供。【解決手段】イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートをブロッキングする方法であって、（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、（ｂ）固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および（ｃ）浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程を含んでなり、前記浸透処理工程（ｂ）におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、方法。【選択図】なしPROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for blocking a membrane sheet which suppresses the occurrence of false positives in immunochromatography and further suppresses yellowing of the membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography. A method for blocking a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, wherein (a) at least one type of test antibody that specifically binds to a test substance and a reference antibody are different from each other Preparing a solid phase-treated membrane sheet, (b) permeabilizing allowing the blocking solution to permeate the solid phase-treated membrane sheet, and (c) permeabilizing membrane And drying the sheet, wherein the penetration direction of the blocking solution in the permeation treatment step (b) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end. ,Method. 【Selection chart】 None
Description
本発明はイムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートのブロッキング方法に関する。 The present invention relates to a method for blocking a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography.
イムノクロマトグラフィーは、毛細管現象により検体がメンブランシート上を移動する際、検体中の抗原、着色粒子に結合させた標識抗体、およびメンブランシートに固相化された捕捉抗体（テスト抗体）の三者により免疫複合体が形成され、その標識物の集積を目視で確認する免疫測定法である。インフルエンザウイルスなどの感染症検査や妊娠検査において、イムノクロマトグラフィーの原理を用いた簡易診断薬が広く用いられる。簡易診断薬はその用いられる目的の性質上、迅速かつ高感度で、正確な判定が求められている。 Immunochromatography is performed by the three parties of an antigen in a sample, a labeled antibody bound to colored particles, and a capture antibody (test antibody) immobilized on a membrane sheet as the sample moves on the membrane sheet by capillary action. This is an immunoassay in which an immune complex is formed and the accumulation of its label is visually confirmed. In infectious disease examinations such as influenza virus and pregnancy tests, simple diagnostic agents using the principle of immunochromatography are widely used. Because of the nature of the purpose for which a simple diagnostic is used, rapid, sensitive, accurate determination is required.
イムノクロマトグラフィー用キットを構成する試験片については、古くから試料中に混在する蛋白質等の非特異因子の吸着のため、被検物質が存在しない場合にも検出部位の発色が発生するという問題があった。この非特異的吸着（非特異的反応ともいう）は、検出時のＳ／Ｎを下げるばかりでなく、偽陽性の原因にもなりうるため、かかる非特異的吸着を抑えることが課題となっていた。これに対して、不溶性担体を牛血清アルブミンでブロッキングし、メンブランシートをカゼインでブロッキングすることにより非特異的吸着が抑制されることが報告されている（特許文献１）。 The test strip that constitutes the kit for immunochromatography has a problem in that coloring of the detection site occurs even in the absence of the test substance due to the adsorption of nonspecific factors such as proteins that have been mixed in the sample from long ago. The Since this nonspecific adsorption (also referred to as nonspecific reaction) can not only lower the S / N at the time of detection but also be a cause of false positives, it is an issue to suppress such nonspecific adsorption. The On the other hand, it has been reported that nonspecific adsorption is suppressed by blocking an insoluble carrier with bovine serum albumin and blocking a membrane sheet with casein (Patent Document 1).
さらに、イムノクロマトグラフィー用キットを使用するにあたり、規定された反応時間を守らず、あるいは反応時間終了後も当該キットを放置することにより、吸収パッドにいったん吸収された試料液がクロマトグラフ媒体に逆流することがあった。この場合、標識物質と複合体を形成した被検物質が再度判定部を通過することで、余分な被検物質が追加で捕捉されるような現象が見られた。これは、本来ならば陰性と判定されるべき検査試料が陽性と判定されてしまうこととなり、判定を誤らせる原因となっていた。このため、試料液が吸収パッドからクロマトグラフ媒体に逆流することを抑えることが課題となっていた。これに対して、親水性繊維中に高吸水性ポリマー粒子を含有した構造を有する吸収パッドを用いることにより、当該逆流が抑制されることが報告されている（特許文献２）。 Furthermore, when using the kit for immunochromatography, the sample liquid absorbed once by the absorbent pad flows back to the chromatography medium by not observing the defined reaction time or leaving the kit after the reaction time is over. There was a thing. In this case, when the test substance in a complex with the labeling substance passes again through the determination unit, a phenomenon is observed in which an extra test substance is additionally captured. This causes the test sample to be determined to be negative if it should be determined to be positive, which causes the determination to be incorrect. Therefore, it has been an issue to suppress the backflow of the sample solution from the absorption pad to the chromatography medium. On the other hand, it is reported that the said backflow is suppressed by using the absorption pad which has a structure which contained the highly water-absorbing polymer particle in hydrophilic fiber (patent document 2).
さらに、メンブランシートへのブロッキング工程を行う従来の手法においては、ブロッキング工程によりメンブランに固相化した抗体がブロッキング溶液中に流出する可能性があり、これに対処するために、ブロッキング工程を経ないメンブランシートを使用することが報告されている（特許文献３）。しかしながら、特許文献３では、シグナル強度および検出感度の低下が課題となっており、本来偽陽性を抑制する為にあるブロッキング工程において、その操作手法の如何によっては新たに偽陽性を発生させる原因があることについては、一切言及されていない。 Furthermore, in the conventional method of performing the blocking step on the membrane sheet, the antibody immobilized on the membrane may flow out into the blocking solution by the blocking step, and in order to cope with this, the blocking step is not performed. It has been reported to use a membrane sheet (Patent Document 3). However, in Patent Document 3, the reduction in signal intensity and detection sensitivity is an issue, and in the blocking step originally intended to suppress false positives, the cause of newly generating false positives depending on the operation method is There is no mention of anything.
本発明は、イムノクロマトグラフィーにおける偽陽性の発生を抑制することを可能とするメンブランシートのブロッキング方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for blocking a membrane sheet which makes it possible to suppress the occurrence of false positives in immunochromatography.
本発明者らは、抗体固相化メンブランシートのブロッキング工程中に、固相化した抗体が遊離し、さらに他の検出部位まで流れて固着することで、偽陽性を発生させ、正確な判定が妨げられるという問題を新たに見出した。そして、本発明者らは、ブロッキング溶液をメンブランシートに浸透させる方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御することにより、偽陽性を防止できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。 The present inventors liberate the immobilized antibody during the blocking step of the antibody-immobilized membrane sheet, flow to another detection site, and fix it, thereby generating false positive and accurate determination. I found a new problem of being blocked. The present inventors can prevent false positives by controlling the direction in which the blocking solution penetrates the membrane sheet in the forward direction from the test antibody side end to the reference antibody side end. Found out. The present invention is based on these findings.
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートをブロッキングする方法であって、
（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、
（ｂ）固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および
（ｃ）浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程
を含んでなり、
前記浸透処理工程（ｂ）におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、方法。
［２］前記浸透処理工程（ｂ）が、前記固相化処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬させて、ブロッキング溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行われる、［１］に記載の方法。
［３］前記浸透処理工程（ｂ）が、前記固相化処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行われる、［１］に記載の方法。
［４］前記浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、該浸透処理されたメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる吸収工程（Ａ）をさらに含んでなり、
前記吸収工程（Ａ）におけるブロッキング溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記吸収工程（Ａ）が、前記浸透処理されたメンブランシートの、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液が浸透したメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる操作によって行われる、［４］に記載の方法。
［６］前記浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含んでなる、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの全体を洗浄溶液に浸漬することによって行われる操作を含んでなる、［６］に記載の方法。
［８］前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端を洗浄溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、洗浄溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させることによって行われる操作を含んでなり、
前記洗浄工程の後に、得られたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、洗浄溶液が浸透したメンブランシート上の余分な洗浄溶液を吸収させる吸収工程（Ｂ）をさらに含んでなり、
前記吸収工程（Ｂ）における洗浄溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、［６］または［７］に記載の方法。
［９］イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートを製造する方法であって、
（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とを、メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化する抗体固相化工程、並びに
（ｂ）［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により、該メンブランシートをブロッキングする工程
を含んでなる、方法。
［１０］［９］に記載の方法により製造される、メンブランシート。
［１１］イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートであって、
被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、該メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化されており、
遊離したリファレンス抗体が、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置から前記テスト抗体側末端とは反対側の末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）の方により多く付着している、メンブランシート。
［１２］［１０］または［１１］に記載のメンブランシートを含んでなる、イムノクロマトグラフィー用試験片。
［１３］［１２］に記載のイムノクロマトグラフィー用試験片を含んでなる、イムノクロマトグラフィー用試験キット。
That is, the present invention includes the following inventions.
[1] A method for blocking a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, which method comprises:
(A) preparing an immobilized membrane sheet in which at least one test antibody that specifically binds to a test substance and a reference antibody are immobilized at different positions from each other;
(B) permeating treatment step of permeabilizing the blocking solution into the immobilized membrane sheet, and (c) drying step of drying the permeabilization membrane sheet,
The method in which the penetration direction of the blocking solution in the penetration treatment step (b) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end.
[2] The penetration treatment step (b) is carried out by immersing the test antibody side end of the solid phase-treated membrane sheet in a blocking solution and permeating the blocking solution to the reference antibody side end , The method described in [1].
[3] In the permeation treatment step (b), the test antibody side end of the solid phase-treated membrane sheet is immersed in a blocking solution, and the reference antibody side end is brought into contact with a water absorbing material, The method according to [1], which is performed by an operation of permeabilizing a blocking solution to the reference antibody side end.
[4] After the permeation treatment step (b), an absorption step of bringing the permeation treated membrane sheet into contact with a water absorbent material to absorb excess blocking solution on the permeation treated membrane sheet (A) Further include),
In any one of [1] to [3], the absorption direction of the blocking solution in the absorption step (A) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end toward the reference antibody side end Method described.
[5] In the absorption step (A), the reference antibody side end of the permeation-treated membrane sheet is brought into contact with the water-absorbent material to absorb excess blocking solution on the membrane sheet into which the blocking solution has permeated. The method according to [4], which is performed by operation.
[6] The method according to any one of [1] to [5], further comprising a washing step of washing the permeation-treated membrane sheet with a washing solution after the penetration treatment step (b).
[7] The method according to [6], wherein the washing step comprises an operation performed by immersing the whole of the infiltration-treated membrane sheet in a washing solution.
[8] The washing step is performed by immersing the test antibody side end of the permeation-treated membrane sheet in a washing solution and bringing the reference antibody side end into contact with a water-absorbent material to wash the washing solution as the reference antibody Including an operation performed by infiltrating to the side end,
After the washing step, the method further includes an absorbing step (B) of bringing the obtained membrane sheet into contact with a water absorbent material to absorb an excess washing solution on the membrane sheet impregnated with the washing solution,
The method according to [6] or [7], wherein the absorption direction of the washing solution in the absorption step (B) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end .
[9] A method for producing a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, which method comprises:
(A) an antibody immobilization step of immobilizing at least one type of test antibody that specifically binds to a test substance, and a reference antibody at different positions on the membrane sheet, and (b) [1] Blocking the membrane sheet by the method according to any of [8].
[10] A membrane sheet produced by the method described in [9].
[11] A membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, comprising
At least one type of test antibody that specifically binds to the test substance, and a reference antibody are immobilized at different positions on the membrane sheet,
The reference antibody is solid phase in comparison with the distance from the position where the reference antibody is immobilized to the test antibody side end (except the position where the reference antibody is immobilized). A membrane sheet having more adhesion in the direction from the position where it is formed to the end opposite to the above-mentioned test antibody side end (but excluding the position where the reference antibody is immobilized).
[12] A test strip for immunochromatography comprising the membrane sheet according to [10] or [11].
[13] A test kit for immunochromatography comprising the immunochromatographic test strip according to [12].
本発明によれば、イムノクロマトグラフィーにおける偽陽性の発生を抑制できる点で有利である。また、本発明によれば、イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートの黄変を抑制することも可能である。 The present invention is advantageous in that the occurrence of false positives in immunochromatography can be suppressed. Further, according to the present invention, it is also possible to suppress yellowing of the membrane sheet constituting the test piece for immunochromatography.
本発明は、イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートをブロッキングする方法に関するものであり、該方法は、（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、（ｂ）固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および（ｃ）浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程を含む。本発明の方法では、前記浸透処理工程（ｂ）におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される。このような特徴により、イムノクロマトグラフィーにおける偽陽性の発生を抑制することができる。 The present invention relates to a method for blocking a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, which comprises (a) at least one test antibody that specifically binds to a test substance, a reference antibody and (B) preparing the immobilized membrane sheet which is immobilized at different positions from each other, (b) allowing the blocking solution to permeate the immobilized membrane sheet, and (c) And drying the impregnated membrane sheet. In the method of the present invention, the penetration direction of the blocking solution in the penetration treatment step (b) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end. Such features can suppress the occurrence of false positives in immunochromatography.
「ブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される」とは、浸透処理工程において、少なくともブロッキング溶液がリファレンス抗体側からテスト抗体側に浸透する（つまり、逆流する）ことを回避するような操作が行われることを意味し、それが達成される限り、いかなる手段を用いてもよい。 “The penetration direction of the blocking solution is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end” means that at least the blocking solution is tested from the reference antibody side in the permeation treatment step. It means that an operation is performed to avoid penetration (ie, back flow) to the antibody side, and any means may be used as long as it is achieved.
本発明における「イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシート」は、捕捉抗体を固相化でき、かつ、毛細管現象により試料検体溶液を吸収し流動させることができるものであれば、特に限定されるものではない。例えば、メンブランシートの素材としては、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ポリエチレン、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、またはこれらの混合繊維からなる人工ポリマーなどが挙げられる。これらの中でも、ニトロセルロース、ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合繊維からなる人工ポリマーが好ましく、ニトロセルロースが特に好ましい。 The “membrane sheet constituting the test strip for immunochromatography” in the present invention is not particularly limited as long as it can immobilize the capture antibody and can absorb and flow the sample analyte solution by capillary action. It is not a thing. For example, the material of the membrane sheet is nitrocellulose, cellulose acetate, PVDF (polyvinylidene fluoride), polyethylene, nylon, polyether sulfone, polyvinyl alcohol, polyester, glass fiber, polyolefin, cellulose, or an artificial mixture of these fibers. Polymer etc. are mentioned. Among these, an artificial polymer comprising nitrocellulose, a mixed fiber of nitrocellulose and cellulose acetate is preferable, and nitrocellulose is particularly preferable.
本発明における「ブロッキング」とは、イムノクロマトグラフィーにおける標識抗体のメンブランシート上への非特異的な吸着を防止するために、タンパク質および／またはポリマーの水溶液を用いてメンブランシートをコーティングすることをいう。ここで使用されるタンパク質としては、ゼラチン、カゼイン、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、スキムミルク等が挙げられる。使用されるポリマーとしては、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）等が挙げられる。これらのうち、カゼイン、ＢＳＡ、スキムミルクが好ましく、スキムミルクが特に好ましい。 In the present invention, "blocking" refers to coating a membrane sheet with an aqueous solution of a protein and / or a polymer in order to prevent nonspecific adsorption of a labeled antibody on the membrane sheet in immunochromatography. Examples of proteins used here include gelatin, casein, BSA (bovine serum albumin), skimmed milk and the like. As a polymer to be used, PVP (polyvinyl pyrrolidone), PVA (polyvinyl alcohol), etc. may be mentioned. Of these, casein, BSA and skimmed milk are preferred, and skimmed milk is particularly preferred.
本発明における「被検物質」とは、イムノクロマトグラフィー用キットにおいて検出の対象となる物質をいい、例えば、抗体、抗原、核酸、生理活性物質、細菌、ウイルス、ペプチド、治療薬剤（血中薬剤）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。なお、抗体も被検物質となり得る。「抗体」としては、抗原に対する抗体、抗体に対する抗体などが挙げられるが、特に限定されるものではない。「抗原」としては、核酸、生理活性物質、細菌、ウイルス、ペプチドなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。 The "test substance" in the present invention refers to a substance to be detected in an immunochromatographic kit, such as an antibody, an antigen, a nucleic acid, a physiologically active substance, bacteria, a virus, a peptide, a therapeutic drug (blood drug) And the like, but is not particularly limited. An antibody can also be a test substance. Examples of the "antibody" include, but are not limited to, an antibody against an antigen, an antibody against an antibody and the like. Examples of the "antigen" include nucleic acids, physiologically active substances, bacteria, viruses, peptides and the like, but are not particularly limited.
本発明における「被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシート」は、当業者に公知の方法により製造することができる。例えば、固相化処理されたメンブランシートは、「ラテラルフローテストストリップ開発ガイド」（日本ミリポア、２００２年）に記載された手法に従って製造することができる。 The “immobilized membrane sheet on which at least one test antibody that specifically binds to the test substance and the reference antibody are immobilized at different positions in the present invention” is known to those skilled in the art. It can be produced by known methods. For example, the immobilized sheet can be produced according to the method described in "Lateral Flow Test Strip Development Guide" (Nippon Millipore, 2002).
本発明における浸透処理されたメンブランシートの乾燥は、当業者に公知の方法によって行うことができる。乾燥方法には、凍結乾燥によるもの、オーブンによる加熱乾燥によるもの等が挙げられるが、凍結乾燥によるものが好ましい。乾燥工程における温度、時間等の条件については、乾燥させるメンブレンの性状、保水量、面積（重量）、状態に応じて、適宜決定することができる。 Drying of the osmotically treated membrane sheet in the present invention can be carried out by methods known to those skilled in the art. The drying method includes lyophilization, heat drying in an oven, and the like, but lyophilization is preferable. The conditions such as temperature and time in the drying step can be appropriately determined in accordance with the properties, water holding amount, area (weight) and state of the membrane to be dried.
本発明の好ましい実施態様においては、浸透処理工程（ｂ）は、固相化処理されたメンブランシートのテスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬させて、ブロッキング溶液をリファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行うことができる。かかる操作は、そのように作動するものである限りいかなる具体的手法によって行ってもよいが、例えば、当該メンブランシートのテスト抗体側末端を下に向け、リファレンス抗体側を把持して懸垂し、その下方に、開放容器にブロッキング溶液を満たしたものを設置し、当該メンブランシートの下端の２〜１０ｍｍ、好ましくは３〜８ｍｍ、さらに好ましくは４〜６ｍｍを当該ブロッキング溶液中に浸漬することにより、行うことができる。当該メンブランシートのブロッキング溶液における浸透状態はメンブランシートの湿潤状態により目視で確認することができ、ブロッキング溶液がメンブランシートの上端（リファレンス抗体側末端）まで浸透したら、かかる操作を終了させることが望ましい。 In a preferred embodiment of the present invention, the permeation treatment step (b) is carried out by immersing the test antibody side end of the immobilized membrane sheet in the blocking solution to permeate the blocking solution to the reference antibody side end. It can be carried out. Such an operation may be performed by any specific method as long as it operates in such a manner, for example, with the test antibody side end of the membrane sheet facing downward, the reference antibody side is gripped and suspended, In the lower part, an open container filled with a blocking solution is placed, and 2 to 10 mm, preferably 3 to 8 mm, more preferably 4 to 6 mm of the lower end of the membrane sheet is immersed in the blocking solution. be able to. The permeation state of the membrane sheet in the blocking solution can be visually confirmed by the wet state of the membrane sheet, and it is desirable to terminate such operation when the blocking solution has penetrated to the upper end (reference antibody side end) of the membrane sheet.
本発明の好ましい実施態様においては、浸透処理工程（ｂ）は、固相化処理されたメンブランシートのテスト抗体側末端をブロッキング溶液に浸漬し、かつ、リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液をリファレンス抗体側末端まで浸透させる操作によって行うことができる。かかる操作は、そのように作動するものである限りいかなる具体的手法によって行ってもよいが、例えば、当該メンブランシートのテスト抗体側末端を下に向け、リファレンス抗体側を吸水性素材の間に把持して懸垂し、その下方に、開放容器にブロッキング溶液を満たしたものを設置し、当該メンブランシートの下端の２〜１０ｍｍ、好ましくは３〜８ｍｍ、さらに好ましくは４〜６ｍｍを当該ブロッキング溶液中に浸漬することにより、行うことができる。当該メンブランシートのブロッキング溶液における浸透状態はメンブランシートの湿潤状態により目視で確認することができ、ブロッキング溶液がメンブランシートの上端（リファレンス抗体側末端）まで浸透し、さらに、当該ブロッキング溶液が一定量吸水性素材に吸収されるのを目視にて確認した後、かかる操作を終了させることが望ましい。 In a preferred embodiment of the present invention, the permeation treatment step (b) is carried out by immersing the test antibody side end of the solid phase-treated membrane sheet in a blocking solution and bringing the reference antibody side end into contact with the water absorbent material. Then, the blocking solution can be penetrated to the reference antibody side end. Such an operation may be performed by any specific method as long as it operates in such a manner, for example, the test antibody side end of the membrane sheet is directed downward and the reference antibody side is held between the water absorbent materials. The lower end of the membrane sheet is placed 2 to 10 mm, preferably 3 to 8 mm, more preferably 4 to 6 mm in the blocking solution. It can be carried out by immersion. The permeation state of the membrane sheet in the blocking solution can be visually confirmed by the wet state of the membrane sheet, and the blocking solution penetrates to the upper end (reference antibody side end) of the membrane sheet, and the blocking solution absorbs a certain amount of water. It is desirable to terminate such an operation after visually confirming absorption by the sex material.
本発明の好ましい実施態様においては、浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、該浸透処理されたメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる吸収工程（Ａ）を行うことができる。この場合、吸収工程（Ａ）におけるブロッキング溶液の吸収方向は、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される。さらに、吸収工程（Ａ）では、前記浸透処理されたメンブランシートの前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、ブロッキング溶液が浸透したメンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる操作を行うことが好ましい。これらの操作は、そのように作動するものである限りいかなる具体的手法によって行ってもよいが、例えば、当該メンブランシートのリファレンス抗体末端を下に向け、リファレンス抗体側末端を吸水性素材に１０秒〜６０分間、好ましくは２０秒〜４０分間、より好ましくは３０秒〜２０分間、より好ましくは４０秒〜１０分間、より好ましくは５０秒〜５分間、さらにより好ましくは１分間接触させて（好ましくは押しつけて）、ブロッキング溶液を吸収する（好ましくは当該メンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる、さらに好ましくは当該メンブランシート上の余分なブロッキング溶液をふるい落とす）ことにより、行うことができる。特定の理論に拘泥するものではないが、後述する実施例１においてリファレンス抗体側末端を吸水性素材に３０分間接触させると、「偽陽性なし」ではあるもののわずかながら染色ラインが出現してしまうのは、メンブランシート中の余分な溶液が吸収紙に排出されたのち、長時間その状態が維持されることで、メンブランシートの乾燥が進み、ブロッキング溶液を含んだ吸収紙から乾燥したメンブランシートへの吸い上げが生じたこと、それによりブロッキング溶液が逆方向に展開（逆流）してリファレンス抗体が逆方向に移動したことによるものと考えられる。このため、リファレンス抗体側末端の吸水性素材への接触は、メンブランシートが乾燥する前に終了させることが好ましく、メンブレンシートの性状、保水量、面積（重量）、状態によって異なるが、メンブレンシート上の水滴の存在状態等を目視観察することにより、適宜決定することができる。 In a preferred embodiment of the present invention, after the permeation treatment step (b), the permeation treated membrane sheet is brought into contact with a water absorbent material to absorb excess blocking solution on the permeation treated membrane sheet. Absorption step (A) can be performed. In this case, the absorption direction of the blocking solution in the absorption step (A) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end. Furthermore, in the absorption step (A), the reference antibody side end of the permeation-treated membrane sheet is brought into contact with the water-absorbent material to perform an operation to absorb excess blocking solution on the membrane sheet into which the blocking solution has permeated. Is preferred. These operations may be performed by any specific method as long as they operate in such a manner, for example, with the reference antibody end of the membrane sheet facing downward and the reference antibody side end being a water absorbent material for 10 seconds Contact (preferably 60 seconds, preferably 20 seconds to 40 minutes, more preferably 30 seconds to 20 minutes, more preferably 40 seconds to 10 minutes, more preferably 50 seconds to 5 minutes, even more preferably 1 minute Can be carried out by absorbing the blocking solution (preferably by absorbing the excess blocking solution on the membrane sheet, more preferably by screening out the excess blocking solution on the membrane sheet). Although not bound by a specific theory, when the reference antibody side end is brought into contact with the water absorbent material for 30 minutes in Example 1 described later, a slight staining line appears although it is “false positive”. After the excess solution in the membrane sheet is discharged to the absorbent paper, the condition is maintained for a long time, and the drying of the membrane sheet proceeds, and the absorbent paper containing the blocking solution is dried to the dried membrane sheet. It is considered that wicking occurred, whereby the blocking solution developed in the reverse direction (reflux) and the reference antibody moved in the reverse direction. For this reason, it is preferable to terminate the contact of the reference antibody side end with the water-absorbent material before the membrane sheet is dried, which varies depending on the properties of the membrane sheet, the amount of water retention, area (weight) and condition. It can determine suitably by visually observing the existence state etc. of a water droplet.
本発明のさらに好ましい実施態様においては、浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含む操作をおこなうことができる。ここで、洗浄溶液とは、ブロッキング溶液の成分が過剰にメンブランシート上に残留することにより、テスト抗体、被検物質および標識抗体の免疫複合体の形成を阻害することを防止するため（つまり、感度が低下することを防止するため）に、ブロッキング溶液の成分の残留量を低減化させる役割がある。洗浄溶液の組成やその濃度はブロッキング溶液のそれらと異なっていることが好ましい。 In a further preferred embodiment of the present invention, after the permeation treatment step (b), an operation further comprising a washing step of washing the permeation treated membrane sheet with a washing solution can be performed. Here, the washing solution is to prevent the formation of an immune complex of the test antibody, the test substance and the labeled antibody by the excess of the components of the blocking solution remaining on the membrane sheet (ie, The role of reducing the residual amount of the components of the blocking solution is to prevent the decrease in sensitivity. The composition of the washing solution and its concentration are preferably different from those of the blocking solution.
本発明のさらに好ましい実施態様においては、洗浄工程は、浸透処理されたメンブランシートの全体を洗浄溶液に浸漬することにより行われる。かかる操作の浸漬時間および洗浄液量とメンブランシートの重量（面積）との比は、メンブレンシートの性状、保水量、面積（重量）、状態によって異なるが、上述の免疫複合体の形成阻害の程度をみながら適宜決定することができる。 In a further preferred embodiment of the present invention, the washing step is carried out by immersing the whole of the osmotically treated membrane sheet in the washing solution. The immersion time of this operation and the ratio of the amount of washing solution to the weight (area) of the membrane sheet depend on the properties of the membrane sheet, the amount of water retention, the area (weight) and the condition, but the degree of inhibition of the formation of the above-mentioned immune complex It can be determined appropriately while
本発明のさらに好ましい実施態様においては、洗浄工程は、浸透処理されたメンブランシートのテスト抗体側末端を洗浄溶液に浸漬し、かつ、リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、洗浄溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させ、さらに、得られたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、洗浄溶液が浸透したメンブランシート上の余分な洗浄溶液を吸収させること（吸収工程（Ｂ））により行われる。この場合、吸収工程（Ｂ）における洗浄溶液の吸収方向は、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される。これらの操作は、そのように作動するものである限りいかなる具体的手法によって行ってもよいが、例えば、(i)当該メンブランシートのテスト抗体側末端を下に向け、リファレンス抗体側を吸水性素材の間に把持して懸垂し、その下方に開放容器に洗浄溶液を満たしたものを設置し、当該メンブランシートの下端の２〜１０ｍｍ、好ましくは３〜８ｍｍ、さらに好ましくは４〜６ｍｍを洗浄溶液中に浸漬し、その後、(ii)当該メンブランシートのリファレンス抗体末端を下に向け、リファレンス抗体側末端を吸水性素材に１０秒〜６０分間、好ましくは２０秒〜４０分間、より好ましくは３０秒〜２０分間、より好ましくは４０秒〜１０分間、より好ましくは５０秒〜５分間、さらにより好ましくは１分間接触させて（好ましくは押しつけて）、ブロッキング溶液を吸収する（好ましくは当該メンブランシート上の余分なブロッキング溶液を吸収させる、さらに好ましくは当該メンブランシート上の余分なブロッキング溶液をふるい落とす）ことにより、行うことができる。そして、(i)の操作時間は、メンブレンシートの性状、保水量、面積（重量）、状態によって異なるが、同様の操作を行うブロッキング溶液の浸透処理工程における浸透速度を勘案して適宜決定することができる。また、(ii)の操作時間は、メンブレンシートの性状、保水量、面積（重量）、状態、さらには、(i)の操作による洗浄溶液の浸透状況によって異なるが、メンブレンシート上の水滴の存在状態等を目視観察することにより適宜決定することができる。 In a further preferred embodiment of the present invention, the washing step is carried out by immersing the test antibody side end of the permeation-treated membrane sheet in the washing solution and bringing the reference antibody side end into contact with the water absorbent material to wash the washing solution. Permeating to the reference antibody side end, and bringing the obtained membrane sheet into contact with a water-absorbent material to absorb excess washing solution on the membrane sheet impregnated with washing solution (absorbing step (B)) It is done by In this case, the absorption direction of the washing solution in the absorption step (B) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end toward the reference antibody side end. Although these operations may be performed by any specific method as long as they operate as such, for example, (i) the test antibody side end of the membrane sheet is directed downward and the reference antibody side is a water absorbent material Hold the suspension between them, place an open container filled with the washing solution under it, and wash the washing solution with 2-10 mm, preferably 3-8 mm, more preferably 4-6 mm of the lower end of the membrane sheet Soak in water, and then (ii) turn the reference antibody end of the membrane sheet downward, and place the reference antibody side end on the water-absorbent material for 10 seconds to 60 minutes, preferably 20 seconds to 40 minutes, more preferably 30 seconds 20 minutes, more preferably 40 seconds to 10 minutes, more preferably 50 seconds to 5 minutes, still more preferably 1 minute (preferably by pressing) It can be carried out by absorbing the blocking solution (preferably absorbing the excess blocking solution on the membrane sheet, more preferably screening out the excess blocking solution on the membrane sheet). And although the operation time of (i) changes with the property of a membrane sheet, a water retention amount, an area (weight), and a state, it considers suitably in consideration of the penetration speed in the penetration treatment process of blocking solution performing the same operation. Can. The operation time of (ii) depends on the properties of the membrane sheet, the amount of water retention, the area (weight), the state, and the penetration of the washing solution by the operation of (i), but the presence of water droplets on the membrane sheet It can determine suitably by visually observing a state etc.
本発明の別の態様によれば、イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートを製造する方法が提供され、該方法は、（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とを、メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化する抗体固相化工程、ならびに（ｂ）本発明のメンブランシートをブロッキングする方法により該メンブランシートをブロッキングする工程を含む。かかる方法における各操作については、上述した通りである。 According to another aspect of the present invention, there is provided a method of producing a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, which comprises: (a) at least one test antibody that specifically binds to a test substance And immobilizing the reference antibody at different positions on the membrane sheet, and (b) blocking the membrane sheet by the method of blocking the membrane sheet of the present invention. Each operation in this method is as described above.
本発明の別の態様によれば、上述のメンブランシートを製造する方法により製造される、メンブランシートが提供される。 According to another aspect of the present invention, there is provided a membrane sheet produced by the method of producing a membrane sheet described above.
さらに、一般に、メンブランシート上に固相化された抗体の一部は、ブロッキング工程や洗浄工程などを行う間に遊離して他の位置に付着することがあるが、本発明によって得られるメンブランシートでは、遊離したリファレンス抗体が、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置からリファレンス抗体側末端までの間の方により多く付着している、という特徴が見られる。従って、本発明の別の態様によれば、イムノクロマトグラフィー用試験片を構成するメンブランシートであって、被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、このメンブランシート上の互いに異なる位置に固相化されており、遊離したリファレンス抗体が、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端とは反対側の末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）の方により多く付着しているメンブランシートが提供される。「遊離したリファレンス抗体が、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端とは反対側の末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）の方により多く付着している」とは、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）に付着しているリファレンス抗体の総量と比較して、リファレンス抗体が固相化されている位置からテスト抗体側末端とは反対側の末端までの間（ただし、リファレンス抗体が固相化されている位置は除く）に付着しているリファレンス抗体の総量の方が大きいことを意味する。このようなメンブランシートは、上述のメンブランシートのブロッキング方法、または上述のメンブランシートの製造方法により、製造することができる。 Furthermore, in general, a part of the antibody immobilized on the membrane sheet may be released during the blocking step, the washing step, etc. to be attached to other positions, but the membrane sheet obtained by the present invention In the case where the released reference antibody is compared with from the position where the reference antibody is immobilized to the test antibody side end, it is from the position where the reference antibody is immobilized to the reference antibody side end There is a characteristic that more adheres to people. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, wherein at least one test antibody that specifically binds to a test substance, and a reference antibody are the membrane. The immobilized reference antibody is immobilized at different positions on the sheet, and the released reference antibody is from the position where the reference antibody is immobilized to the test antibody side end (however, the reference antibody is immobilized) Compared to the position where the reference antibody is immobilized, from the position where the reference antibody is immobilized to the end opposite to the test antibody side end (with the exception of the position where the reference antibody is immobilized) A membrane sheet with more adhesion is provided. “The reference antibody is fixed compared to the distance between the position where the reference antibody is immobilized and the end where the reference antibody is immobilized (except where the reference antibody is immobilized). The phrase “the more attached from the position where it is formed to the end opposite to the test antibody side end (but excluding the position where the reference antibody is immobilized)” means that the reference antibody Compared to the total amount of the reference antibody attached between the position where the antibody is immobilized and the end of the test antibody (except for the position where the reference antibody is immobilized), the reference antibody is fixed A reference attached from the position where it is made to the end opposite to the test antibody side end (except where the reference antibody is immobilized) It means that the larger of the total amount of the scan antibody. Such a membrane sheet can be manufactured by the above-mentioned membrane sheet blocking method or the above-mentioned membrane sheet manufacturing method.
本発明の別の態様によれば、上述のメンブランシートを含んでなるイムノクロマトグラフィー用試験片、および該イムノクロマトグラフィー用試験片を含んでなるイムノクロマトグラフィー用試験キットが提供される。これらは、上述のメンブランシートを用いて、当業者であれば適宜調製することができる。 According to another aspect of the present invention, there is provided an immunochromatographic test strip comprising the above-mentioned membrane sheet, and an immunochromatographic test kit comprising the immunochromatographic test strip. Those skilled in the art can appropriately prepare these using the above-mentioned membrane sheet.
イムノクロマトグラフィーの基本的な原理、構成、調製方法および使用方法等については、「ラテラルフローテストストリップ開発ガイド」（日本ミリポア、２００２年）に詳しく記載されている。 The basic principle, configuration, preparation method and use method of immunochromatography, etc. are described in detail in "Lateral Flow Test Strip Development Guide" (Japan Millipore, 2002).
本発明について、実施例を用いて詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in detail using examples, but the present invention is not limited to these examples.
１．調製例
以下の手法を用いて、着色粒子標識抗体、コンジュケートパッドおよび抗体固相化メンブランシートを調製した。
1. Preparation Example The colored particle-labeled antibody, conjugate pad and antibody-immobilized membrane sheet were prepared using the following procedure.
（１）着色粒子標識抗体の調製
青色カルボキシルラテックス粒子（ポリスチレン、粒径４００ｎｍ）の１０（ｗ/ｖ）％水分散液３０μＬと５０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２７０μＬを混合し、次にＥＤＣ（水溶性カルボジイミド）を最終濃度１％になるように添加し室温で３時間活性化した。その後、遠心分離し、洗浄した後、１ｍｇ／ｍＬに濃度調整したマウス抗インフルエンザウイルスＡ型抗体１００μＬを添加し、室温で一晩反応させた。次に遠心分離し、洗浄した後、１０（ｗ/ｖ）％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブロッキングした。次に遠心分離し、１０（ｗ/ｖ）％スクロース、１（ｗ/ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液１０ｍＬ中に懸濁した後、超音波分散装置にかけ、青色粒子標識抗Ａ型抗体分散液を得た。
(1) Preparation of colored particle-labeled antibody 30 μL of a 10 (w / v)% aqueous dispersion of blue carboxyl latex particles (polystyrene, particle size 400 nm) and 270 μL of 50 mM MES buffer (pH 6.0) are mixed. Water soluble carbodiimide) was added to a final concentration of 1% and activated at room temperature for 3 hours. Then, after centrifuging and washing, 100 μL of mouse anti-influenza virus type A antibody adjusted to a concentration of 1 mg / mL was added, and reacted overnight at room temperature. Next, it was centrifuged, washed and blocked with a 10 (w / v)% BSA / PBS solution. Next, it is centrifuged and suspended in 10 mL of a PBS solution containing 10 (w / v)% sucrose and 1 (w / v)% BSA, and then subjected to an ultrasonic dispersion device to disperse blue particle-labeled anti-A antibody I got
赤色カルボキシルラテックス粒子（ポリスチレン、粒径４００ｎｍ）の１０（ｗ/ｖ）％水分散液３０μＬと５０ｍＭＭＥＳ緩衝液(ｐＨ６．０)２７０μＬを混合し、次にＥＤＣ（水溶性カルボジイミド）を最終濃度１％になるように添加し室温で３時間活性化した。その後、遠心分離し、洗浄した後、１ｍｇ／ｍＬに濃度調整したマウス抗インフルエンザウイルスＢ型抗体１００μＬを添加し、室温で一晩反応させた。次に遠心分離し、洗浄した後、１０（ｗ/ｖ）％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液でブロッキングした。次に遠心分離し、１０（ｗ/ｖ）％スクロース、１（ｗ/ｖ）％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液１０ｍＬ中に懸濁した後、超音波分散装置にかけ、赤色粒子標識抗Ｂ型抗体分散液を得た。 30 μL of a 10 (w / v)% aqueous dispersion of red carboxyl latex particles (polystyrene, particle size 400 nm) and 270 μL of 50 mM MES buffer (pH 6.0) are mixed, followed by EDC (water-soluble carbodiimide) to a final concentration of 1% The mixture was then activated at room temperature for 3 hours. Then, after centrifuging and washing, 100 μL of mouse anti-influenza virus type B antibody adjusted to a concentration of 1 mg / mL was added and allowed to react overnight at room temperature. Next, it was centrifuged, washed and blocked with a 10 (w / v)% BSA / PBS solution. Next, it is centrifuged and suspended in 10 mL of a PBS solution containing 10 (w / v)% sucrose and 1 (w / v)% BSA, and then subjected to an ultrasonic dispersion device to disperse red particle-labeled anti-B type antibody I got
（２）コンジュゲートパッドの調製
青色粒子標識抗Ａ型抗体分散液と赤色粒子標識抗Ｂ型抗体分散液を混合することで着色粒子混合分散液を得た。網の上に並べたガラス不織布パッド（メルクミリポア社）に、着色粒子混合分散液を４５μＬ／ｃｍの割合で塗布し、均一に塗り広げた後、オーブンで一晩乾燥し、コンジュゲートパッドを得た。
(2) Preparation of Conjugate Pad A colored particle mixed dispersion was obtained by mixing the blue particle-labeled anti-A type antibody dispersion and the red particle-labeled anti-B type antibody dispersion. The colored particle mixture dispersion is applied at a rate of 45 μL / cm to a glass non-woven pad (Merck Millipore) arranged on a net, spread evenly, and dried overnight in an oven to obtain a conjugate pad. The
（３）抗体固相化メンブランシートの調製
ニトロセルロースメンブランシート（メルクミリポア社、縦3.0cm、横45cm）に、リン酸緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに濃度調整した上記の着色粒子標識抗インフルエンザＡ型抗体とはエピトープが異なるマウス抗インフルエンザウイルスＡ型抗体、リン酸緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに濃度調整した上記の着色粒子標識抗インフルエンザＢ型抗体とはエピトープが異なるマウス抗インフルエンザウイルスＢ型抗体、およびリン酸緩衝液で１．０ｍｇ／ｍＬに調整したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を幅１ｍｍのライン状に塗布した。マウス抗インフルエンザウイルスＡ型抗体を塗布したラインをＡライン、マウス抗インフルエンザウイルスＢ型抗体を塗布したラインをＢライン、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を塗布したラインをＲ（リファレンス）ラインとした。塗布する位置はメンブランシートの下端（上流側）から１１ｍｍの位置にＡライン、１４．５ｍｍの位置にＢライン、１８．０ｍｍの位置にＲラインが来るように設定した。塗布は、イムノクロマトグラフィー用ディスペンサーＸＹＺ３０５０（バイオドット社）を用い、１μＬ／ｃｍとなるように設定した。ライン塗布後のニトロセルロースメンブランシートを３０℃で一晩乾燥した。
(3) Preparation of antibody-immobilized membrane sheet The above-mentioned colored particle-labeled anti-influenza in which the concentration was adjusted to 1.0 mg / mL with phosphate buffer on a nitrocellulose membrane sheet (Merck Millipore, 3.0 cm by 45 cm). Mouse anti-influenza virus type A antibody whose epitope is different from type A antibody, mouse anti-influenza virus B whose epitope is different from the above-mentioned colored particle labeled anti-influenza type B antibody adjusted to a concentration of 1.0 mg / mL with phosphate buffer Type antibody and goat anti-mouse IgG antibody adjusted to 1.0 mg / mL with phosphate buffer were applied in a line of 1 mm in width. The line coated with mouse anti-influenza virus type A antibody was A line, the line coated with mouse anti-influenza virus type B antibody was B line, and the line coated with goat anti-mouse IgG antibody was R (reference) line. The application position was set so that the A line was located 11 mm from the lower end (upstream side) of the membrane sheet, the B line was located 14.5 mm, and the R line was located 18.0 mm. The application was set to 1 μL / cm using an immunochromatographic dispenser XYZ3050 (Biodot Inc.). The nitrocellulose membrane sheet after line coating was dried at 30 ° C. overnight.
２．実施例
（１）抗体固相化メンブランシートのブロッキング液の浸透処理および洗浄処理
調製例（３）で調製された抗体固相化メンブランシートを、以下の表１に記載された操作に従い、ブロッキングの浸透処理を行い、その後洗浄処理を行った（実施例１〜１６および比較例１〜３）。
2. Example
(1) Permeabilization treatment of blocking solution of antibody-immobilized membrane sheet and washing treatment The antibody-immobilized membrane sheet prepared in Preparation Example (3) was subjected to blocking permeation treatment according to the procedure described in Table 1 below. , And then subjected to washing treatment (Examples 1 to 16 and Comparative Examples 1 to 3).
表１に記載された各操作の詳細は以下の通りである。 The details of each operation described in Table 1 are as follows.
工程１−ａ：ブロッキング溶液の吸い上げのみ
ブロッキング溶液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝８．０、１．０（ｗ／ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．０（ｗ／ｖ）％スクロース、０．１０（ｗ/ｖ）％スキムミルク、１０.０ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．０９０（ｗ／ｖ）％アジ化ナトリウム）で充たした容器に対して、メンブランシートの下端（テスト抗体側）から５ｍｍだけ液面下に浸し、ブロッキング溶液がメンブランシートの上端（リファレンス抗体側）にくるまで吸い上げた。
Step 1-a: Only sucking up of blocking solution Blocking solution (100 mM Tris-HCl pH = 8.0, 1.0 (w / v)% Triton X-100, 1.0 (w / v)% sucrose, 0.10 5 mm from the lower end (the test antibody side) of the membrane sheet against a container filled with (w / v)% skimmed milk, 10.0 mM EDTA-2Na, 0.090 (w / v) sodium azide The lower part was soaked and sucked up until the blocking solution was at the upper end (reference antibody side) of the membrane sheet.
工程１−ｂ：ブロッキング溶液を吸い上げながら水切り
メンブランシートの上端（リファレンス抗体側）全体に吸収紙（大王製紙社製キッチンペーパー超吸収キッチンタオル）を接触させながら、ブロッキング溶液で充たした容器に対して、メンブランシートの下端（テスト抗体側）から５ｍｍだけ液面下に浸し、ブロッキング溶液を吸い上げた。
Step 1-b: For a container filled with blocking solution while contacting the entire upper end (reference antibody side) of the drained membrane sheet with absorbent paper (kitchen paper super absorbent kitchen towel manufactured by Daio Paper) while sucking up the blocking solution Soak the blocking solution by immersing 5 mm below the liquid surface from the lower end of the membrane sheet (the test antibody side).
工程１−c：ブロッキング溶液への浸漬
メンブランシート全体を、ブロッキング溶液で充たした容器の中に浸漬させた。
Step 1-c: Immersion in Blocking Solution The whole membrane sheet was immersed in a container filled with blocking solution.
工程１−ｄ：順方向の水切り（１分）
吸収紙を敷き、ブロッキング溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端（リファレンス抗体側）を１分間押し付けて、浸潤したブロッキング溶液を吸収させた。
Step 1-d: Forward drainage (1 minute)
The absorbent paper was spread, the membrane sheet in which the blocking solution was infiltrated was turned upside down, and the upper end (reference antibody side) was pressed against the spread absorbent paper for 1 minute to absorb the infiltrating blocking solution.
工程１−ｅ：順方向の水切り（３０分）
吸収紙を敷き、ブロッキング溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端（リファレンス抗体側）を３０分間押し付けて、浸潤したブロッキング溶液を吸収させた。
Step 1-e: Forward drainage (30 minutes)
The absorbent paper was spread, the membrane sheet in which the blocking solution was infiltrated was turned upside down, and the upper end (reference antibody side) was pressed against the spread absorbent paper for 30 minutes to absorb the infiltrating blocking solution.
工程１−ｆ：逆方向の水切り
吸収紙を敷き、ブロッキング溶液が浸潤したメンブランシートの下端（テスト抗体側）を１分間押し付けて、浸潤したブロッキング溶液を吸収させた。
Step 1-f: A reverse direction drainage paper was laid, and the lower end (test antibody side) of the membrane sheet in which the blocking solution was infiltrated was pressed for 1 minute to absorb the infiltrating blocking solution.
工程２−ａ：洗浄溶液の吸い上げのみ
洗浄溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ＝７．０、０．０１（ｗ／ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．０（ｗ／ｖ）％スクロース）で充たした容器に対して、メンブランシートの下端（テスト抗体側）から５ｍｍだけ液面下に浸し、洗浄溶液がメンブランシートの上端（リファレンス抗体側）にくるまで吸い上げた。
Step 2-a: Soaking only of washing solution Filled with washing solution (20 mM Tris-HCl pH = 7.0, 0.01 (w / v)% Triton X-100, 1.0 (w / v)% sucrose) The container was immersed 5 mm below the liquid surface from the lower end (test antibody side) of the membrane sheet, and was sucked up until the washing solution came to the upper end (reference antibody side) of the membrane sheet.
工程２−ｂ：洗浄溶液を吸い上げながら水切り
メンブランシートの上端（リファレンス抗体側）全体に吸収紙（大王製紙社製キッチンペーパー超吸収キッチンタオル）を接触させながら、洗浄溶液で充たした容器に対して、メンブランシートの下端（テスト抗体側）から５ｍｍだけ液面下に浸し、洗浄溶液を吸い上げた。
Step 2-b: With a container filled with the washing solution while contacting the entire upper end (reference antibody side) of the drained membrane sheet with absorbent paper (kitchen paper super absorbent kitchen towel manufactured by Daio Paper Co., Ltd.) while sucking up the washing solution The substrate was immersed 5 mm below the liquid surface from the lower end (the test antibody side) of the membrane sheet to suck up the washing solution.
工程２−c：洗浄溶液への浸漬
メンブランシート全体を、洗浄溶液で充たした容器の中に浸漬させた。
Step 2-c: Immersion in Cleaning Solution The whole membrane sheet was immersed in a container filled with the cleaning solution.
工程２−ｄ：順方向の水切り（１分）
吸収紙を敷き、洗浄溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端（リファレンス抗体側）を１分間押し付けて、浸潤した洗浄溶液を吸収させた。
Step 2-d: Forward drainage (1 minute)
The absorbent paper was spread, the membrane sheet in which the washing solution was infiltrated was turned upside down, and the upper end (reference antibody side) was pressed against the spread absorbent paper for 1 minute to absorb the soaked washing solution.
工程２−ｅ：順方向の水切り（３０分）
吸収紙を敷き、洗浄溶液が浸潤したメンブランシートを逆さまにして、敷いた吸収紙に上端（リファレンス抗体側）を３０分間押し付けて、浸潤した洗浄溶液を吸収させた。
Step 2-e: Forward drainage (30 minutes)
The absorbent paper was spread, the membrane sheet in which the washing solution was infiltrated was turned upside down, and the upper end (reference antibody side) was pressed against the spread absorbent paper for 30 minutes to absorb the soaked washing solution.
工程２−ｆ：逆方向の水切り
吸収紙を敷き、洗浄溶液が浸潤したメンブランシートの下端（テスト抗体側）を１分間押し付けて、浸潤した洗浄溶液を吸収させた。
Step 2-f: A reverse direction drainage paper was laid, and the lower end (test antibody side) of the membrane sheet infiltrated with the washing solution was pressed for 1 minute to absorb the soaked washing solution.
工程３：乾燥
工程１のいずれかの操作および工程２のいずれかの操作により得られたメンブランシートを、凍結真空乾燥機を用いて一晩乾燥させた。
Step 3: Drying The membrane sheet obtained by any operation of step 1 and any operation of step 2 was dried overnight using a freeze vacuum dryer.
（２）テストプレートの組み立て
支持材となるバッキングシート(Adhesives Research，Inc)に対して、実施例（１）により調製されたメンブランシートを貼り合わせた後、同じく作製したコンジュゲートパッドを当該メンブランシートと数ミリ重なり合うように貼り合わせた。さらに、展開方向の上流側には、サンプルパッドとして、コンジュゲートパッドに数ミリ重なるようにしてガラス不織布(メルクミリポア社)を貼り合わせた。そして、当該メンブランシートの下流側には、過剰な試薬を受け止めるための吸収パッド(メルクミリポア社)を当該メンブランシートと数ミリ重なるように配置した後、４ｍｍ幅に裁断してイムノクロマトグラフィー用試験片を得た。イムノクロマトグラフィー用試験片をハウジングに収納しテストプレートを作製した。
(2) Assembly of Test Plate After bonding the membrane sheet prepared in Example (1) to a backing sheet (Adhesives Research, Inc.) to be a supporting material, a conjugate pad prepared in the same manner is used as the membrane sheet. And it was pasted so as to overlap several millimeters. Furthermore, a glass non-woven fabric (Merck Millipore) was laminated on the upstream side in the spreading direction as a sample pad so as to overlap the conjugate pad by several millimeters. Then, on the downstream side of the membrane sheet, an absorbent pad (Merck Millipore) for receiving an excess reagent is disposed so as to overlap with the membrane sheet several millimeters, and then cut to a width of 4 mm for a test strip for immunochromatography I got The immunochromatographic test strip was housed in a housing to prepare a test plate.
（３）Ｂ型陽性時の偽陽性確認試験
実施例１〜１６および比較例１〜３の操作により得られた各イムノクロマトグラフィー用試験片を収納した各テストプレートを用いて、Ｂ型ウイルス抗原が試料中に存在する条件下（Ｂ型陽性試料）でＡライン上にラインが出現しＡ型への偽陽性を示すかを確認した。
(3) False Positive Confirmation Test when Type B Positive When using the test plates containing the test pieces for immunochromatography obtained by the procedures of Examples 1 to 16 and Comparative Examples 1 to 3, the type B virus antigen is It was confirmed whether a line appeared on the A line under the conditions (type B positive sample) present in the sample and showed a false positive to the type A.
力価が１０４．０〜１０６．５［ＴＣＩＤ５０（Median tissue culture infectious dose）／０．１ｍＬ］となるインフルエンザＢ型ウイルス培養上清を用意した。抽出液（１５０ｍＭリン酸緩衝液、０．５（ｗ/ｖ）％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１（ｗ/ｖ）％ＢＳＡ、０．０９（ｗ/ｖ）％アジ化ナトリウム）で２５倍に希釈した後、テストプレートの検体滴下部に５０μＬ滴下し反応させた。滴下から１０分後、検出部分であるＡライン上の様子を目視観察した。 Titer were prepared 10 4.0 ~10 6.5 [TCID 50 ( Median tissue culture infectious dose) /0.1mL] to become influenza type B virus culture supernatant. Extract solution (150 mM phosphate buffer, 0.5 (w / v)% Triton X-100, 0.1 (w / v)% BSA, 0.09 (w / v)% sodium azide) 25 times After dilution, 50 μL was dropped and reacted in the sample dropping portion of the test plate. Ten minutes after the dropping, the appearance on the A line, which is a detection portion, was visually observed.
以下に、偽陽性目視観察の具体的な評価基準を示す：
−：Ａライン上にラインが認められない；
±：Ａライン上にラインが認められるか否か、はっきりしない；
＋：Ａライン上にわずかに染色ラインが認められるものの、その色度や鮮明度が低いため真の陽性ラインと区別がつく；
＋＋：Ａライン上に染色ラインがはっきりと認められ、真の陽性ラインと区別がつかない；本明細書においては、＋＋を偽陽性あり（不合格）、−〜＋は偽陽性なし（合格）とする。
Below are the specific criteria for false positive visual observation:
−: No line is observed on the A line;
±: It is unclear whether a line is observed on the A line;
+: Although a slight staining line is observed on the A line, it is distinguishable from a true positive line because of its low chromaticity and sharpness;
++: A staining line is clearly recognized on the A line and indistinguishable from a true positive line; in the present specification, ++ is false positive (fail),-to + is no false positive (pass) I assume.
その結果、実施例１〜１６において、偽陽性目視観察の評価結果は−〜＋であり、全て偽陽性なし（合格）となった。その一方、比較例１〜３においては、偽陽性目視観察の評価結果は全て偽陽性あり（不合格）となった。 As a result, in Examples 1 to 16, the evaluation results of the false positive visual observation were-to +, and all resulted in no false positive (pass). On the other hand, in Comparative Examples 1 to 3, the evaluation results of the false positive visual observation were all false positive (failed).
（４）黄変確認試験
実施例１〜１６および比較例１〜３の操作により得られた各イムノクロマトグラフィー用試験片を用いて黄変の目視観察を行った。以下に、黄変目視観察の具体的な評価基準を示す：
−：イムノクロマトグラフィー用試験片が黄変していない；
＋：イムノクロマトグラフィー用試験片が黄変している；本明細書においては、＋を黄変あり（不合格）、−を黄変なし（合格）とする。
(4) Yellowing Confirmation Test The visual observation of yellowing was performed using the test pieces for immunochromatography obtained by the procedures of Examples 1 to 16 and Comparative Examples 1 to 3. The following shows the specific evaluation criteria for yellowing visual observation:
-: The immunochromatographic test strip has not turned yellow;
+: The test strip for immunochromatography is yellowing; in this specification, + is yellowing (rejected) and − is non-yellowing (passed).
その結果、実施例１、３、５、６および９〜１６において、黄変目視観察の評価結果は黄変なし（合格）となった。その一方、実施例２、４、７および８においては、黄変目視観察の評価結果は黄変あり（不合格）となった。 As a result, in Examples 1, 3, 5, 6 and 9 to 16, the evaluation result of the yellowing visual observation was no yellowing (pass). On the other hand, in Examples 2, 4, 7 and 8, the evaluation results of the yellowing visual observation were yellowing (failed).
（５）考察
実施例１と比較例３、実施例６と比較例２、並びに実施例１５と比較例１の比較から、調製例（３）で調製された抗体固相化メンブランシートを、いきなりブロッキング溶液へ浸漬（１−ｃ）するよりも、ブロッキング溶液の吸い上げのみ（１−ａ）またはブロッキング溶液を吸い上げながら水切り（１−ｂ）をする方が偽陽性の出現を抑制できることがわかった。また、実施例９と実施例１６との比較から、ブロッキング溶液を吸い上げ（１−ａ）とブロッキング溶液への浸漬（１−ｃ）を行ったメンブランシートを逆方向に水切り（１−ｆ）した場合は、偽陽性なしではあるものの、Ａライン上にわずかながらラインが認められ、逆方向の水切りはそれをしなかった場合と比較して偽陽性の出現を促進させる傾向にあることがわかった。以上により、ブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御することが、偽陽性の出現を抑制することに寄与しているものと考えられた。
(5) Discussion From the comparison between Example 1 and Comparative Example 3, Example 6 and Comparative Example 2, and Example 15 and Comparative Example 1, the antibody-immobilized membrane sheet prepared in Preparation Example (3) was It was found that false positives can be suppressed more by immersing only the blocking solution (1-a) or immersing the blocking solution while draining (1-b) rather than dipping (1-c) in the blocking solution. Also, from the comparison between Example 9 and Example 16, the blocking solution was siphoned off (1-a) and the membrane sheet subjected to immersion in the blocking solution (1-c) was drained (1-f) in the reverse direction. It has been found that if there is no false positive, but a slight line is seen on the A line, the reverse drainage tends to promote the emergence of false positives compared to if it were not done . As described above, controlling that the penetration direction of the blocking solution is forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody end contributes to the suppression of the occurrence of false positives. it was thought.
次に、実施例１と実施例６の比較から、順方向の水切りを３０分間行った場合は、偽陽性なしではあるものの、Ａライン上にわずかながらラインが認められ、順方向の水切りを３０分間行うことは、順方向の水切りを１分間行うことと比較して、偽陽性の出現を促進させる傾向にあることがわかった。特定の理論に拘泥するものではないが、順方向で長時間の水切りをするとわずかながら染色ラインの出現を許してしまうのは、メンブランシート中の余分な溶液が吸収紙に排出されたのち、長時間その状態が維持されることで、メンブランシートの乾燥が進み、ブロッキング溶液を含んだ吸収紙から乾燥したメンブランシートへの吸い上げが生じ、そのためブロッキング溶液が逆方向に展開（逆流）したため、それによりリファレンス抗体が逆方向に移動することによるものと考えられる。 Next, according to a comparison between Example 1 and Example 6, when the forward draining was performed for 30 minutes, a slight line was recognized on the A line although there were no false positives, and the forward draining was It has been found that performing for minutes tends to promote the appearance of false positives as compared to performing a forward drain for 1 minute. While not being bound by a particular theory, it is only after passing excess solution in the membrane sheet to the absorbent paper that the appearance of the staining line is allowed a little if forward and long drainage is done. By maintaining the state for the time, the drying of the membrane sheet proceeds and wicking from the absorbent paper containing the blocking solution to the dried membrane sheet occurs, so that the blocking solution develops in a reverse direction (backflow). It is considered that the reference antibody is caused to move in the reverse direction.
さらに、実施例５と実施例２、７および８との比較から、洗浄溶液の吸い上げのみ（２−ａ）より洗浄溶液を吸い上げながら水切り（２−ｂ）する方が、さらに順方向の水切りを１分に抑える方が、黄変なしとなることがわかった。また、実施例１５と実施例４の比較から、洗浄溶液を吸い上げながら水切り（２−ｂ）するのみでは黄変ありとなるのに対し洗浄溶液へのメンブランシート全体の浸漬（２−ｃ）では黄変なしとなることがわかった。以上により、黄変の出現頻度を抑えることに寄与している操作としては、第１にメンブランシート全体を洗浄溶液に浸漬することが挙げられるが、仮に洗浄溶液を吸い上げる操作を行う場合は、洗浄溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御することが重要であると考えられた。 Further, from the comparison of Example 5 with Examples 2, 7 and 8, it is better to drain the washing solution while sucking it up (2-b) rather than only sucking up the washing solution (2-a), and the drainage in the forward direction will be further It turned out that the yellowing would be no if one minute was used. Also, from the comparison of Example 15 and Example 4, yellowing occurs when only draining (2-b) while sucking up the washing solution, while immersion of the entire membrane sheet in the washing solution (2-c) It turned out that it does not turn yellow. As described above, an operation contributing to suppressing the appearance frequency of yellowing includes first immersing the entire membrane sheet in the washing solution, but if temporarily carrying out an operation for sucking the washing solution, washing is carried out. It was considered important to control the penetration direction of the solution to be in the forward direction from the test antibody side end toward the reference antibody end.
以上により、特定の理論に拘泥するものではないが、本発明の作用機序は以下のようなものであると考えられる。 From the above, while not being bound by a particular theory, it is considered that the action mechanism of the present invention is as follows.
まず、従来の、浸透処理工程中のブロッキング溶液の流れをテスト抗体側からリファレンス抗体側へ向かう方向（つまり、順方向）に制御しないブロッキング方法では、浸透処理工程中にブロッキング溶液が逆流することで、試験実施時（テスト抗体が結合する抗原が試料中に存在する場合）に偽陽性が生じる場合があると考えられる。かかる偽陽性は以下の機序で発生すると考えられる（図１）。
(i)ブロッキング工程では、まずブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートに浸潤させ、最後の乾燥前には余分なブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートから吸い出す（水切りする）必要がある
(ii)この際にリファレンス抗体（本明細書ではＲ抗体と呼称することもある）が遊離するが（特開２０１５−２３２４６７号公報）、ブロッキング溶液が、テスト抗体側からリファレンス抗体側へ向かう方向と逆方向に流れていると遊離したＲ抗体がテスト抗体の一つであるＢ抗体が固相化されたＢライン、テスト抗体の一つであるＡ抗体が固相化されたＡラインの方向に流れることになる。
(iii)その過程でＲ抗体がＢ抗体を捕捉し、更にＡライン上まで展開すると、Ｂ抗体を捕捉したＲ抗体がＡ抗体も捕捉することでＡライン上に固着される。
(iv)ブロッキング溶液を浸透処理させる工程が終了し、そのまま抗体固相化メンブランシートを乾燥すると、Ａライン上に固着したＲ抗体（ここで、Ｒ抗体はＢ抗体を捕捉している）がそのまま残ることになる。
(v)その結果、Ｂ型抗原を含む試料を用いて試験を実施すると、Ａライン上にＲ抗体を介してＢ抗体が存在しているため、これがＢ型抗原および赤色粒子標識Ｂ型抗体の免疫複合体を形成し、Ａライン上に偽陽性が発生することになる。
First, in the conventional blocking method in which the flow of the blocking solution in the permeation treatment step is not controlled from the test antibody side toward the reference antibody side (that is, in the forward direction), the blocking solution flows backward during the permeation treatment step. It is believed that false positives may occur at the time the test is performed (if the antigen to which the test antibody binds is present in the sample). Such false positives are considered to occur by the following mechanism (FIG. 1).
(i) In the blocking step, it is necessary to first infiltrate the blocking solution on the antibody-immobilized membrane sheet, and before the final drying, it is necessary to remove (drain) the excess blocking solution from the antibody-immobilized membrane sheet
(ii) At this time, although the reference antibody (sometimes referred to as R antibody in this specification) is released (Japanese Patent Laid-Open No. 2015-223467), the blocking solution is directed from the test antibody side to the reference antibody side R is released in the reverse direction, and the R antibody released is the B-line on which the B antibody is one of the test antibodies. The direction of the A-line on which the A antibody is one of the test antibodies. Will flow to
(iii) In the process, when the R antibody captures the B antibody and further develops onto the A line, the R antibody capturing the B antibody also fixes the A antibody by capturing it also.
(iv) The step of permeabilizing the blocking solution is completed, and when the antibody-immobilized membrane sheet is dried as it is, the R antibody fixed on the A line (here, the R antibody captures the B antibody) remains as it is It will remain.
(v) As a result, when a test is performed using a sample containing a B-type antigen, a B-type antibody is present on the A-line via the R antibody, so this is a B-type antigen and a red particle-labeled B-type antibody. It forms an immune complex and a false positive will occur on the A line.
一方、本発明の方法では浸透処理工程中のブロッキング溶液の流れをテスト抗体側からリファレンス抗体側へ向かう方向（つまり、順方向）に保つことで、Ｒ抗体が遊離しても、Ｒ抗体が他の検出部分に固着することがなく、試験実施時に偽陽性が発生することを防いでいると考えられる。考えられる本発明の機序を以下に示す（図２）。
(i)浸透処理工程において、ブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートに浸潤させ、最後の乾燥前には余分なブロッキング溶液を抗体固相化メンブランシートから吸い出す（水切りする）際に、ブロッキング溶液が順方向だけに流れるようにする
(ii)この際にＲ抗体が遊離するが、ブロッキング溶液が順方向に流れているので、遊離したＲ抗体がＢライン、Ａラインの方向に流れない。
(iii)よって浸透処理工程が終了し、そのまま抗体固相化メンブランシートを乾燥しても、Ａライン上に固着するのはＡ抗体だけになる。
(iv)その結果、Ｂ型抗原を含む試料を用いて試験を実施すると、Ａライン上にはＡ抗体しかないため、偽陽性が発生しない。
On the other hand, in the method of the present invention, the flow of the blocking solution in the permeation treatment step is maintained in the direction from the test antibody side to the reference antibody side (that is, in the forward direction). It is thought that it does not stick to the detection part of (1) and prevents the generation of false positives at the time of the test. A possible mechanism of the present invention is shown below (Figure 2).
(i) In the permeation treatment step, the blocking solution is allowed to infiltrate into the antibody-immobilized membrane sheet, and before the final drying, when the excess blocking solution is sucked out (drained) from the antibody-immobilized membrane sheet, the blocking solution Make it flow only in the forward direction
(ii) At this time, the R antibody is released, but since the blocking solution is flowing in the forward direction, the released R antibody does not flow in the direction of the B line and the A line.
(iii) The permeation treatment step is thus completed, and even if the antibody-immobilized membrane sheet is dried as it is, only the A antibody is fixed on the A line.
(iv) As a result, when a test is performed using a sample containing a B-type antigen, false positives do not occur because there is only an A antibody on the A line.
Claims (8)
（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、
（ｂ）固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および
（ｃ）浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程
を含んでなり、
前記浸透処理工程（ｂ）におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御され、
前記浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含んでなり、
前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの全体を洗浄溶液に浸漬することによって行われる操作を含んでなるものである、方法。 A method of blocking a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, comprising:
(A) preparing an immobilized membrane sheet in which at least one test antibody that specifically binds to a test substance and a reference antibody are immobilized at different positions from each other;
(B) permeating treatment step of permeabilizing the blocking solution into the immobilized membrane sheet, and (c) drying step of drying the permeabilization membrane sheet,
The penetration direction of the blocking solution in the permeation treatment step (b) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end,
After the permeation treatment step (b), the method further comprises a washing step of washing the permeation treated membrane sheet with a washing solution,
A method, wherein the washing step comprises an operation performed by immersing the whole of the infiltration treated membrane sheet in a washing solution .
（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、(A) preparing an immobilized membrane sheet in which at least one test antibody that specifically binds to a test substance and a reference antibody are immobilized at different positions from each other;
（ｂ）固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および(B) permeation treatment step of permeabilizing the blocking solution into the immobilized membrane sheet, and
（ｃ）浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程(C) Drying process for drying the infiltrated membrane sheet
を含んでなり、Contains
前記浸透処理工程（ｂ）におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御され、The penetration direction of the blocking solution in the permeation treatment step (b) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end,
前記浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含んでなり、After the permeation treatment step (b), the method further comprises a washing step of washing the permeation treated membrane sheet with a washing solution,
前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端を洗浄溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、洗浄溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させることによって行われる操作を含んでなるものであり、 In the washing step, the test antibody side end of the permeation-treated membrane sheet is immersed in the washing solution, and the reference antibody side end is brought into contact with the water-absorbent material to extend the washing solution to the reference antibody side end Includes operations performed by infiltration,
ここで、前記洗浄工程の後に、得られたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、洗浄溶液が浸透したメンブランシート上の余分な洗浄溶液を吸収させる吸収工程（Ｂ）をさらに含んでなり、前記吸収工程（Ｂ）における洗浄溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、方法。Here, after the washing step, the method further includes an absorption step (B) of bringing the obtained membrane sheet into contact with the water absorbent material to absorb the excess washing solution on the membrane sheet into which the washing solution has permeated. The method, wherein the absorption direction of the washing solution in the absorption step (B) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end.
（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とが、互いに異なる位置に固相化されている固相化処理されたメンブランシートを用意する工程、(A) preparing an immobilized membrane sheet in which at least one test antibody that specifically binds to a test substance and a reference antibody are immobilized at different positions from each other;
（ｂ）固相化処理されたメンブランシートにブロッキング溶液を浸透させる浸透処理工程、および(B) permeation treatment step of permeabilizing the blocking solution into the immobilized membrane sheet, and
（ｃ）浸透処理されたメンブランシートを乾燥させる乾燥工程(C) Drying process for drying the infiltrated membrane sheet
を含んでなり、Contains
前記浸透処理工程（ｂ）におけるブロッキング溶液の浸透方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御され、The penetration direction of the blocking solution in the permeation treatment step (b) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end,
前記浸透処理工程（ｂ）の後に、該浸透処理されたメンブランシートを、洗浄溶液により洗浄する洗浄工程をさらに含んでなり、After the permeation treatment step (b), the method further comprises a washing step of washing the permeation treated membrane sheet with a washing solution,
(i)前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの全体を洗浄溶液に浸漬することによって行われる操作を含んでなるものであり、および(i) the washing step comprises an operation performed by immersing the whole of the infiltration-treated membrane sheet in a washing solution, and
(ii)前記洗浄工程が、前記浸透処理されたメンブランシートの前記テスト抗体側末端を洗浄溶液に浸漬し、かつ、前記リファレンス抗体側末端を吸水性素材に接触させて、洗浄溶液を前記リファレンス抗体側末端まで浸透させることによって行われる操作を含んでなるものであり、(ii) the washing step immerses the test antibody side end of the permeation-treated membrane sheet in a washing solution, and the reference antibody side end is brought into contact with a water-absorbent material to make the washing solution the reference antibody Includes operations performed by infiltrating to the side end,
ここで、前記洗浄工程の後に、得られたメンブランシートを、吸水性素材に接触させて、洗浄溶液が浸透したメンブランシート上の余分な洗浄溶液を吸収させる吸収工程（Ｂ）をさらに含んでなり、前記吸収工程（Ｂ）における洗浄溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、方法。Here, after the washing step, the method further includes an absorption step (B) of bringing the obtained membrane sheet into contact with the water absorbent material to absorb the excess washing solution on the membrane sheet into which the washing solution has permeated. The method, wherein the absorption direction of the washing solution in the absorption step (B) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end.
前記吸収工程（Ａ）におけるブロッキング溶液の吸収方向が、テスト抗体側末端からリファレンス抗体側末端へ向かう方向に対して順方向となるように制御される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 After the infiltration treatment step (b), the infiltration treated membrane sheet is brought into contact with a water absorbent material to further absorb the excess blocking solution on the infiltration treated membrane sheet (A). Contains
The absorption direction of the blocking solution in the absorption step (A) is controlled to be forward with respect to the direction from the test antibody side end to the reference antibody side end. Method described.
（ａ）被検物質に特異的に結合する少なくとも１種のテスト抗体と、リファレンス抗体とを、メンブランシート上の互いに異なる位置に固相化する抗体固相化工程、並びに
（ｂ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により、該メンブランシートをブロッキングする工程
を含んでなる、方法。 A method of producing a membrane sheet constituting a test strip for immunochromatography, comprising:
(A) an antibody immobilization step of immobilizing at least one type of test antibody that specifically binds to a test substance, and a reference antibody at different positions on the membrane sheet, and (b) claim 1 Blocking the membrane sheet by the method according to any one of the preceding claims.
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