JP6530086B2 - トロンビンの調製のための方法 - Google Patents
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Description
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
c.の評価がBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される、方法が提供される。
d.プロトロンビン吸着を可能にする条件下で好適なBaSO4とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、
e.溶出緩衝液を使用して、BaSO4吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
f.溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む方法が、提供される。
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.プロトロンビンの供給源から所与のBaSO4試薬へのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
c.の評価がBaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される、方法が提供される。
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される。いくつかの実施形態において、c.の評価は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を正常な哺乳類血漿の凝血促進活性と比較することにより行われる。
a.所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.所与のBaSO4試薬によってプロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、所与のBaSO4試薬のサンプルとプロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、トロンビンを調製するためのプロセスでプロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の凝血促進活性以下であることによって示される。いくつかの実施形態において、c.の評価は、BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を正常な哺乳類血漿の凝血促進活性と比較することにより行われる。
材料
表1で以下に示されるようなBaSO4試薬が準備された。
シュウ酸塩添加ブタ血液を氷上で供給した。この血液を、5,000g(5440rpm)の相対遠心力(rcf)及び4℃の温度で15分間にわたって遠心分離した。血漿を含む上清を採取し、アリコート(300〜500mL)に分割し、必要とされるまで−30℃で凍結保存した。
表1に列挙された所与のBaSO4試薬のサンプルにプロトロンビンの供給源として実施例1で上述したSD血漿を接触させた。
(i)BaSO4(1%w/v)試薬のサンプルをSD血漿の単位に添加した。
(ii)SD血漿/BaSO4試薬混合物を、磁気攪拌器を使用して25℃で2時間にわたって攪拌し(pH7.4〜8.6)、BaSO4試薬によってSD血漿中のプロトロンビンを吸着させた。
(iii)混合物を、5,000g(5,440rpm)にて、4℃で15分間にわたって遠心分離した。
(iv)上清及び沈降物(BaSO4吸着プロトロンビンを含む)を分離し、各沈降物を必要とされるまで−80℃で別個に保存した。
(v)使用する前に、沈降物を室温(20〜25℃)で15分間にわたって解凍した。
(vi)沈降物を、BaSO4:洗浄緩衝液(w/w)の比1:1.4で洗浄緩衝液(78mM NaCl pH6.9〜7.1)中に再懸濁させ、チューブローラーを使用して室温にて15分間にわたって混合した。
(vii)次に、洗浄緩衝液中の沈降物を5,000g(5,440rpm)にて、4℃で15分間にわたって遠心分離し、上清を採取し、必要とされるまで−80℃で保存した。この工程を2回繰り返した(すなわち、合計3回の洗浄を行った)。
(viii)洗浄工程の後に、洗浄した沈降物(BaSO4吸着プロトロンビンを含む)を、BaSO4:溶出緩衝液(w/w)の比1:1.4で溶出緩衝液(3%クエン酸ナトリウムpH6.3〜6.7)中に再懸濁させ、チューブローラーを使用して15分間にわたって混合した。
(ix)次いで、沈降物/溶出緩衝液を、5,000g(5,440rpm)にて、4℃で15分間にわたって遠心分離した。プロトロンビンを含む溶出液を氷上に定置した清潔な容器の中に採取し、この溶出工程を4回繰り返した(すなわち、合計5回の溶出サイクルを実行した)。
(x)5回の溶出サイクルから得た溶出液(脱着されたプロトロンビンを含む)を単一の溶出液中に混ぜ合わせ、0.2μmのPVDFフィルタによって濾過し、NAPTT又はウエスタンブロットで試験されるまで清潔な容器内に−80℃で保存した。
ブタ血漿から凍結プロトロンビン吸着BaSO4の実規模サンプルを調製した。
ウエスタンブロットアッセイ用のローディング容量を計算するために、及び残留の非結合タンパク質及びその他の汚染物質が洗浄工程(vi及びvii)によって除去されたことを確認するために、ビウレット法を使用して、実施例2及び3で上述のように得られたそれぞれの溶出液(表1の6種のBaSO4試薬のうちの1種に対応するそれぞれの溶出液)中の総タンパク質測定を実行した。
基本的にPh.Eur.(2.6.22)に記載されるように非活性化部分トロンボプラスチン時間(NAPTT)アッセイを使用して、ブタSD血漿から調製された8種(実施例2にある6種及び実施例3にある2種)の溶出液の1種ずつの凝血促進活性を評価した。簡潔にかつ当業者に周知のように、NAPTTアッセイは、リン脂質(ウサギ脳セファリン)及びカルシウムイオン(CaCl2のままで)を、試験された溶出液又は吸着されたBaSO4吸着プロトロンビンサンプル、及び正常なヒト血漿コントロール[Unicalibrator calibration Plasma for Coagulation Tests 00625](本来プロトロンビンを含む)に同時に添加することを含み、カルシウムイオンは、プロトロンビンのトロンビンへの変換によって試験サンプル中で凝固を開始する。トロンビンは、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリンへの変換によって凝塊形成を引き起こす。凝固時間を、凝固計(ST ART4 Stago machine)を使用して測定する。
表1中の6つのBaSO4試薬のそれぞれに関して上記工程(i)〜(ii)を繰り返す。
ウエスタンブロット解析
BaSO4試薬A及びB1(表1)を使用した溶出液(実施例3)のウエスタンブロット解析を図1に示す。
1−MWラダー
2−ヒトプロトロンビン標準
3−BaSO4試薬Aを使用して得られた実規模溶出液
4−BaSO4試薬B1を使用して得られた実規模溶出液
5−ヒトプレトロンビン2標準
6−ヒトαトロンビン標準
1−MWラダー
2−ヒトプロトロンビン標準
3−BaSO4試薬Aを使用して得られた溶出液
4−BaSO4試薬B1を使用して得られた溶出液
5−BaSO4試薬B2を使用して得られた溶出液
6−ヒトαトロンビン標準
1−MWラダー
2−ヒトプロトロンビン標準
3−BaSO4試薬Aを使用して得られた溶出液
4−BaSO4試薬B2を使用して得られた溶出液
5−BaSO4試薬D2を使用して得られた溶出液
6−BaSO4試薬D1を使用して得られた溶出液
7−BaSO4試薬Cを使用して得られた溶出液
8−ヒトプレトロンビン2標準
9−ヒトαトロンビン標準
BaSO4A及びB1(以下で定義)から溶出されたプロトロンビンを次のように活性化した。
(1) プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
a.前記所与のBaSO4試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンの調製に使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。
(2) プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、実施態様1に記載の工程「a」〜「c」を含み、
d.プロトロンビン吸着を可能にする条件下で前記好適なBaSO4とプロトロンビンの供給源とを接触させることと、
e.溶出緩衝液を使用して、前記BaSO4吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
f.前記溶出した画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を更に含む、方法。
(3) プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法であって、
a.前記所与のBaSO4試薬及びプロトロンビンの供給源を準備することと、
b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われるとき、トロンビンを調製するためのプロセスにおいてプロトロンビン吸着剤として使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。
(4) 凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、実施態様1〜3のいずれかに記載の方法。
(5) 前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、実施態様4に記載の方法。
(7) 前記凝固アッセイが、NAPTTアッセイ、APTTアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、実施態様6に記載の方法。
(8) 前記プロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、実施態様1〜7のいずれかに記載の方法。
(9) 前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、実施態様8に記載の方法。
(10) 前記プロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、実施態様1〜9のいずれかに記載の方法。
(12) 前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、pH7.4〜8.6を含む、実施態様1〜11のいずれかに記載の方法。
(13) 前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させることが、約1%(w/v)のBaSO4試薬を前記プロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、実施態様9〜12のいずれかに記載の方法。
(14) 前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することが、前記BaSO4試薬に吸着される間の前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、実施態様1〜13のいずれかに記載の方法。
(15) 「b」の後かつ「c」の前に、前記BaSO4試薬から前記BaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、
前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、実施態様1〜13のいずれかに記載の方法。
(17) 前記キレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、実施態様16に記載の方法。
(18) 前記クエン酸ナトリウムの濃度が、約3%(w/v)〜約4.4%(w/v)である、実施態様17に記載の方法。
(19) 前記プロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、実施態様1〜18のいずれかに記載の方法。
(20) 1つを超えるBaSO4試薬を評価するとき、好適なBaSO4試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、実施態様1〜19のいずれかに記載の方法。
Claims (19)
- プロトロンビンの吸着剤として所与のBaSO4試薬を使用してプロトロンビンの供給源からトロンビンを調製するための方法であって、
a.前記所与のBaSO4試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われ、トロンビンの調製に使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が前記正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示され、
更に、
d.プロトロンビン吸着を可能にする条件下で好適なBaSO 4 と前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO 4 吸着プロトロンビンを得ることと、
e.溶出緩衝液を使用して、前記BaSO 4 吸着プロトロンビンから、プロトロンビン含有画分を溶出することと、
f.前記溶出したプロトロンビン含有画分を、プロトロンビンのトロンビンへの変換を可能にする条件下におき、これによりトロンビンを得ることと、を含む、方法。 - プロトロンビンの供給源からのトロンビンの調製において、プロトロンビン吸着剤として使用するための所与のBaSO4試薬の適合性を評価するための方法であって、
a.前記所与のBaSO4試薬及び前記プロトロンビンの供給源を準備することと、
b.前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする条件下で、前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させて、これによりBaSO4吸着プロトロンビンを得ることと、
c.前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することと、を含み、
cの前記評価が前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性と正常な哺乳類血漿の凝血促進活性とを比較することにより行われ、トロンビンを調製するためのプロセスにおいて前記プロトロンビン吸着剤として使用するための前記所与のBaSO4試薬の適合性は、前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性が前記正常な哺乳類血漿の前記凝血促進活性以下であることによって示される、方法。 - 前記凝血促進活性を評価することが、凝血促進アッセイを実行することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記凝血促進アッセイが、機能アッセイを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記機能アッセイが、凝固アッセイである、請求項4に記載の方法。
- 前記凝固アッセイが、NAPTTアッセイ、APTTアッセイ、及びプロテアーゼ発色アッセイからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記プロトロンビンの供給源が、血漿、又は血漿画分からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血漿が、シュウ酸塩添加血漿を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記プロトロンビンの供給源が、哺乳類から採取された血漿を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳類が、ヒト、ウマ、ウシ、及びブタからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記所与のBaSO4試薬によって前記プロトロンビンの供給源からのプロトロンビンの吸着を可能にする前記条件が、pH7.4〜8.6を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所与のBaSO4試薬のサンプルと前記プロトロンビンの供給源とを接触させることが、1%(w/v)のBaSO4試薬を前記プロトロンビンの供給源である前記採取された血漿に追加することを含む、請求項9または10に記載の方法。
- 前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記BaSO4試薬に吸着される間の前記BaSO4吸着プロトロンビンの凝血促進活性を評価することである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 「b」の後かつ「c」の前に、前記BaSO4試薬から前記BaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかを溶出することを更に含み、
前記BaSO4吸着プロトロンビンの前記凝血促進活性を評価することが、前記溶出したBaSO4吸着プロトロンビンのうち少なくともいくらかの凝血促進活性を評価することである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。 - 前記BaSO4吸着プロトロンビンから前記プロトロンビン含有画分を溶出することが、6.3〜7.4のpHでのカルシウムキレート塩の使用を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記カルシウムキレート塩が、クエン酸ナトリウムを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記クエン酸ナトリウムの濃度が、3%(w/v)〜4.4%(w/v)である、請求項16に記載の方法。
- 前記プロトロンビンの供給源が、ブタ血漿を含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 1つを超えるBaSO4試薬を評価するとき、好適なBaSO4試薬が、プロトロンビンの吸着について選択される、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
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