KR890002070B1 - 트롬빈의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

트롬빈의 제조방법

본 발명은 지혈제로 탁월한 효능을 가지는 트롬빈 제조방법에 관한 것이다.

외상이나, 수술시, 혈우병 또는 기타 출혈시 혈액의 손실방지는 대단히 중요한 문제이다.

혈관밖에서 노출된 혈액이 응고하는 과정은 매우 복잡한 기작(Clotting mechanism)을 통하여 일어난다. 이 기작에는 여러 단백질 요소들이 효소나 조효소로 작용하며, 그 외에 Ca⁺⁺이온, 인지질, 트롬보프라스틴 등이 필요한 것으로 알려져 있으며, 이러한 기작의 최종 단계로 프로트롬빈에서 일부 펩타이드가 분리되어 트롬빈의 만들어지는 과정이며, 바로 이 트롬빈이 피속에 녹아있고 단백질로서는 가장 많은 피브리노겐에 작용하여 피브리노겐의 C-말단부위의 일부 펩타이드를 떼어내어 피브린 단일체를 만드는데 이것이 생성되자마자 정전기적인 인력에 의하여 사슬처럼 연결되어 피브린크로트(clot)를 형성하여 혈액을 응고시켜 지혈시키는 것이다.

현재 사용되는 지혈제로는 여러 종류의 제제가 있으나, 그 중 좋은 제제는 트롬빈 제제이다. 트롬빈 제제는 오래전부터 사용되어 왔으나, 그 제조공정이 대단히 복잡하고 제조원가가 높아서 널리 사용되고 있지 않다.

예를들면, 미국특허 제2,398,077호에서는 소의 혈액에 포타슘옥사레이트용액을 가하여 혈구등을 제거하고 원심분리하여 얻어진 혈장에 증류수를 약 10배량 가하고, 초산으로 pH를 5.2-5.4로 조절하고 원심분리하여 얻어진 수산화 혈장을 수산화마그네슘을 가하고 여기에 물을 가하고 가압 용기에 넣은 후 가압하에서 탄산가스를 가하여 프로트롬빈을 얻고, 이를 투석하여 마그네슘 이온을 제거하고 pH를 5.3로 조절하여 프로트롬빈 용액에 칼슘염을 가하여 앤티트롬빈이 제거된 활성화 트롬빈 용액을 얻고 여기에 물과 혼화성인 유기용매를 가하여 얻어진 침전을 물에 용해하고 얻어진 상증액에 유기용매를 가하고 진공 건조시켜서 트롬빈을 얻고 있다.

그러나, 이 방법은 수십 단계의 공정을 가쳐야 하며, 더구나, 이러한 복잡한 과정을 거쳐서도 순수한 트롬빈을 얻기가 어려웠으며, 그 수율도 극히 낮아서, 트롬빈 제품을 대량으로 얻을 수 없었다.

본 발명자는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 오랜 연구를 행한 결과 소의 수산화 혈장에 황산바륨을 가하여, 흡착시키고 구연산소다로 용출시키면 간편한 조작으로 고순도 및 고수율로 트롬빈을 생산할 수 있는 눌라운 사실을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 트롬빈 제제를 제조하는 신규의 개량된 제조방법에 관한 것이다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같습니다.

1단계, 소의 혈액에서 혈장의 분리:소의 혈액이 혈관밖으로 노출되면 즉시 인트린식 패스웨이(Intrinsic Pathway)에 의한 응고 기작이 시작되며, 따라서 프로트롬빈이 트롬빈으로 바뀌면서 혈액이 응고된 덩어리가 생기게 된다. 소의 혈액을 죽은 소에서 받아내는 즉시 킬레이트화제인 수산나트륨 용액과 섞어 주어야 한다. 죽은지 1 분 내지 2분내의 소에서 혈액을 받아 혈액 9부피에 1부피의 비(V/V)로 2.5% 수산나트륨 용액과 잘 섞어준다. 이때 용기를 스테인레스 용기를 사용하고 혈액을 받으면서 서서히 저어주어 수산나트륨 용액와 충분히 섞이게 하는 것이 좋다. 수산염 처리된 혈액을 연속원심분리기를 이용하여 혈구세포를 제거하고 혈장을 얻는다. 이때 전체 피부피의 반 정도가 혈장으로 얻어진다.

2단계, 바륨설페이트에의 흡착과 용출:1단계에서 얻은 혈장에 1ℓ당 25-40g의 BaSo₄를 천천히 가하면서 저어준다. BaSo₄를 가한 후 모타가 장치된 교반기를 이용하여 서서히 저어준다. 이때 온도는 4℃ 하에서 실시하고 거품이 생기는 것은 피하는 것이 좋다. 이때 BaSo₄에는 프롬트롬빈, 인자 VII, 인자 IX, 인자 X가 흡착하게 되고 그 이외의 단백질등은 BaSo₄에 흡착치 못한다. 이렇게 얻은 BaSo₄혼탄액을 일정 시간 저어준 후 수시간 냉소에서 방치하여 여러 단백질이 흡착된 BaSo₄를 가라 앉힌다. 이렇게 얻은 BaSo₄침전에 0.45% NaCl(W/v)이 포함된 구연산나트륨 용액을 최종농도 1mM되도록 넣어 저어주면서 혼탁시키고 BaSo₄침전을 세척한다. 그 후 연속 원심분리기를 이용하여 BaSo₄침전을 회수하고 위에서 언급한 세척을 2-3회 반복한다. 세척된 BaSo₄에서 다시 모아 100mM 구연산나트륨을 가하여 적당한 시간동안 BaSo₄가 현탁된 상태에서 저어준다. 이렇게 되면, BaSo₄에 부착되어 있던 단백질이 용액중으로 용출되며, 이때 프로트롬빈도 함께 용액중으로 용출된다. 이 현탁액을 원심분리하여 프로트롬빈등이 용출된 용액을 회수한다. 이때 BaSo₄가 환전히 제거되어야 한다.

3단계, 프로트롬빈의 트롬빈으로 활성화:2단계에서 얻은 용액내에 있는 높은 농도의 구연산 이온을 투석이나 울트라필트레이션(Ultrafiltration)을 이용하여 10^-3M 이하로 낮춘다. 이렇게 구연산 이온 농도를 줄인 용출용액에 pH 7.2가 되도록 20mM Tris 용액(150mM NaCl과 20mM CaCl₂가 함유된)으로 바꾼후 소의 뇌에서 분리한 트롬보프라스틴을 가하여 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시킨다. 이때 온도가 높을수록 활성화에 유리하나 단백질이 안정을 위해 낮은 온도에서 장시간 모타가 부착된 교반기에서 방치한다.

4단계, 트롬빈의 황산암모늄으로 분획화:3단계에서 프로트롬빈에서 트롬빈으로의 활성화가 끝난 용액에서 침전등을 원심분리를 이용하여 제거한다. 제거된 용액에 잘게 부순(NH₄)₂SO₄를 40% 포화도까지 서서히 저어주면서 가한 후 적당시간동안 냉소에서 방치한다. 방치된 용액을 원심분리하여 침전을 제거하고 얻은 용액에 다시 (NH₄)₂SO₄를 75% 포화도에 이르도록 가하고 다시 방치한 후 침전을 원심분리하여 회수한다. 회수된 침전을 50mM 글라이신과 20mM CaCl₂용액에 녹인 후 투석막을 이용하여 투석한다. 이렇게 얻은 용액에 글라이신과 CaCl₂를 적량 가하여 단백질과 염등으 비율을 맞춘다.

5단계, 멸균 및 동결건조:위의 용액을 높이가 낮고 바닥이 넓으며 바닥 표면이 반사할 수 있는 접시나 그릇에 담고 살균 U.V 등 하에서 30분간 조사한다. 이때 담겨있는 용액의 깊이는 1cm 정도면 좋다. 그 후 퍼머롤(Phermerol^R:염화벤조토늄)을 소량의 증류수에 녹여 고온, 고압 멸균한 후 일정비율(단백질:Phermerol=100:1)를 잘 섞어준 후 미리 멸균된 바이알에 적당량을 Unit씩 트롬빈 용액을 나눠 담은 후 무균 조건에서 동결건조한다.

다음에 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

[실시예]

1. 소의 혈액에서 혈장의 분리:신선한 소의 혈액 90ℓ에 2.5% 수산화나트륨 10ℓ를 가하고 잘 교반한다. RPM 5000에서 원심분리하여 혈구세포를 제거하고 혈장 약 50ℓ를 얻는다.

2. 바륨설페이트에 의한 흡착과 용출:제1단계에서 얻어진 혈장에 바륨설페이트 2kg을 가하고 30분간 자기교반기로 서서히 교반하여 현탁액을 얻는다.

이 현탁액을 4℃에서 하룻밤 방치한 다음 상증액을 제거한다. 상증액을 제거한 바륨설페이트에 0.45%의 염화나트륨을 함유하는 구연산나트륨 용액을 가하여 구연산나트륨의 양이 1mM되도록 하여 pH를 7.2로 조절한 다음 30분간 서서히 교반하고 RPM 2000에서 연속 원심분리하여 바륨설페이트 케이크를 얻는다.

바륨설페이트 케이크를 0.45%의 염화나트륨을 함유하는 1mM 구연산나트륨 용액으로 2회 세척한다.

얻어진 바륨설페이트 케이트에 0.1M 구연산나트륨을 전체 혈장의 약 1/20량(V/V)을 가하여 pH를 5.8로 조절한 후 자기 교반기로 30분간 교반하여 현탁액을 얻는다.

2000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 상증액을 수집하고 상기 조작을 2회 반복하여 용출액을 얻고 상기 상증액과 합한다.

3. 프로트롬빈의 트롬빈으로 활성화:2단계에서 얻어진 용액내에 잔존하는 구연산 이온을 투석이나 울트라필트레이션을 행하여 구연산 이온의 농도를 10^-3M 이하로 낮춘 후, 투석액을 약 2ℓ로 농축한다. 이 농축액에 1M 트리스-HCl(pH7.2) 40ml, 1M CaCl₂·40ml 및 6M NaCl 50ml를 가하고 소의 뇌에서 추출한 트롬보프라스틴을 소량 가하고 서서히 교반한다. 4℃에서 15시간 배양하여 프로트롬빈을 트롬빈을 활성화시킨다.

4. 트롬빈의 활산암모늄으로 분획화:3단계에서 얻어진 활성화 트롬빈 용액을 4℃에서 8000rpm으로 원심분리하여 침전물을 제거하고 여기에 황산암모늄 490g을 천천히 가하고 4℃에서 2시간 자기 교반기로 서서히 교반하여 방치한다.

침전을 5000rpm으로 30분간 원심분리하여 얻고 다시 여액에 황산암모늄 550g을 가하고 5시간 교반한 후 8000rpm으로 30분간 원심분리하여 침전을 얻는다. 침전을 합하고 10mM CaCl₂를 함유하는 50mM 글라이신 200ml에 용해시킨다.(pH 7.2).

이 액을 증류수 25배량으로 투석한 후, 투석을 3회 반복한다. 투석 후 얻어진 용액을 글라이신과 CaCl₂를 적당량 가하여 염비율을 2:1(W/W)로 조절한다.

5. 멸균 및 동결 건조:4단계에서 얻어진 용액을 바닦면이 넓고 표면이 반사할 수 있는 용기에 넣고 UV 등으로 30분간 조사한다.

여기서 퍼머롤(염화벤조토늄)을 넣고 (단백질 100mg당 1mg) 121℃에서 15psi 압력으로 15분간 멸균한 후 바이알에 충진한 후 동결건조시켜서 제품을 제조한다.

Claims (1)

1. 소의 혈액에 수산화나트륨을 가하여 분리한 혈장에 황산바륨을 가하여 프로트롬빈을 흡착시킨 후 구연산나트륨으로 용출시키고 여기에 소의 뇌에서 추출한 트롬보프라스틴을 가하여 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시킨 다음 황산암모늄으로 분획화하여 트롬빈을 제조하는 방법.