JP6528399B2 - 細胞濃縮液の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、中空糸型分離膜が充填された中空糸膜モジュールを用いる細胞濃縮液の製造方法に関する。

細胞医療の分野では、生体から採取した細胞を直接、又は生体外で培養した後、患者に接種する方法が用いられている。これらの治療に用いる細胞は、治療に適した溶液に懸濁され、又は適切な濃度に調整され移植される。しかしながら、生体から細胞を採取した場合、治療に十分な細胞濃度でないことがあり、また、生体から採取した細胞を体外でさらに培養した場合、組織由来の夾雑物や培地成分などを含んでいることが多い。したがって、生体から採取又は培養した細胞を治療に用いるためには、夾雑物や培地成分を取り除き、治療に適した溶液などに懸濁された状態とし（洗浄）、治療に適した細胞濃度に濃縮される必要がある。

前記目的を解決するため、遠心分離を用いた濃縮、洗浄操作が知られている。例えば、ヒト組織から再生細胞を分離して濃縮するために遠心分離を用いる方法が開示されている（特許文献１）。しかし、このように遠心分離を用いる方法は、装置が大型になること、細胞に負荷がかかること、及びコストが増大することにより利用できる施設が限定されてしまうことが懸念される。さらに遠心分離により細胞を沈殿させた後の細胞懸濁液の上清を、細胞の洗浄のために取り除く際に、細胞が大気に開放される可能性があり、汚染等の問題が挙げられる。

これに対して、コンパクトで簡便な装置である中空糸型分離膜を用いた細胞懸濁液の分離、ろ過方法が提案されている（特許文献２）。中空糸型分離膜を用いて細胞医療用途の細胞懸濁液を濃縮する際には、細胞へのダメージを軽減するために短時間で濃縮処理を行うことが必要であり、さらに夾雑物や培地成分の分子量が大きいことから、中空糸型分離膜の孔径を大きくした方がよいと考えられる。

本件出願人も、中空糸型分離膜を用いる細胞濃縮液の製造方法として、例えば、細胞懸濁液を受け入れるための細胞懸濁液入口と、該細胞成分を実質上含まない液体を排出するための濾液出口と、細胞懸濁液を排出するための細胞懸濁液出口と、前記細胞懸濁液入口と細胞懸濁液出口の間に配置された分画分子量が１０００ｋＤ以下の中空糸型分離膜を備え、内圧ろ過方式である細胞懸濁液処理器を用いることを特徴とする細胞懸濁液の濃縮方法（特許文献３）、中空糸型分離膜の総断面積、中空糸型分離膜の内側膜面積、中空糸型分離膜の内側を流れる線速度および濾液出口より排出される初期ろ過流量を所定の範囲に調整する細胞濃縮液の製造方法などを提案している（特許文献４）。

特表２００７−５２４３９６号公報 特許第２９２８９１３号公報 特開２０１２−２１０１８７号公報 国際公開第２０１４／０３４４５６号

しかしながら、中空糸膜モジュールを用いて細胞濃縮液を実際に製造する場合、洗浄工程において、細胞懸濁液から洗浄液とともに除去される夾雑物や培地成分が、細胞濃縮における濾液量および導入される洗浄液量から予測される理論値通りに除去できておらず、その結果、夾雑物や培地成分を十分に取り除くには、多量の洗浄液と長い処理時間が必要であったため、効率の点でいまだ改善の余地があった。また、製造した細胞濃縮液中に培地成分が残存していると、そのままでは治療用途などに使用することができず、また、再度精製すると細胞の生存率を損なう可能性があった。

以上の改善点を鑑みて、本発明の目的は、上記中空糸膜モジュールを用いた細胞濃縮液の製造方法における問題点を解決することを課題とする。具体的には、洗浄工程において、細胞懸濁液に含まれる夾雑物および培地成分の除去効率を向上し、不純物の含有量が極めて低い細胞濃縮液を製造する方法を提要することにある。さらに、本発明は、濃縮工程において、線速度を２段階に設定することで、細胞回収率と操作性が向上する細胞濃縮液の製造する方法を提要することにある。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、洗浄工程において中空糸膜の外側に濾過された夾雑物および培地成分を含む濾液が中空糸膜モジュールから排出される際、前記濾液が中空糸膜モジュール内でしばらく滞留している間に、夾雑物や培地成分が拡散によって中空糸膜の内側へ再び戻ってしまう現象が生じていることを初めて突き止めた。そこで、さらに研究を重ねた結果、濃縮工程で用いていた濾液排出口の位置を、洗浄工程の前に所定の位置に切り替えることで、続く洗浄工程において夾雑物および培地成分を含む濾液を速やかに外部に排出させて、夾雑物および培地成分が中空糸膜の内側へ戻ることを防ぐことに成功した。
さらに、濃縮工程における線速度を２段階に設定することで、プライミングの操作を行わずに細胞濃縮液を製造することができ、また濃縮工程に要する処理時間を短縮しつつ細胞回収率の高い細胞濃縮液を得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）導入口、導出口及び濾液排出口を備え、中空糸型分離膜が充填された中空糸膜モジュールを用いる細胞濃縮液の製造方法であって、
細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された濾液排出口から排出しながら細胞懸濁液を濃縮する工程、
前記濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替える工程、及び
洗浄液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記濾液排出口から排出しながら細胞を洗浄した後、細胞濃縮液を回収する工程
を含み、
前記細胞懸濁液を濃縮する工程において、２段階の線速度で濃縮し、前記２段階の線速度において、１段階目の線速度ａ（ｃｍ／分）と２段階目の線速度ｂ（ｃｍ／分)がａ＜ｂの関係を満たし、前記１段階目の線速度ａが３５〜３００ｃｍ／分であり、２段階目の線速度ｂが３７０〜１１００ｃｍ／分であることを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。
（２）前記中空糸膜モジュールにおいて濾液排出口を２箇所設け、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口の位置を、中空糸膜モジュールの下側末端から前記濾液排出口のいずれか一方までの距離ｘが中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬと比べてＬ／２≧ｘとなる位置に調整する前記（１）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（３）前記中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬ（ｃｍ)、２箇所の濾液排出口間の距離ｙ(ｃｍ)との比率がＬ：ｙ＝３：１〜１０：９である前記（２）に記載の細胞濃縮液の製造方法。
（４）前記中空糸膜モジュールの向きを変えることで前記濾液排出口の位置を切り替える前記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（５）前記１段階目の線速度ａ（ｃｍ／分）と２段階目の線速度ｂ(ｃｍ／分)の比率が、ａ：ｂ＝１：１．２〜１：３２である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（６）細胞懸濁液を濃縮する工程の前に、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された前記濾液排出口から排気しながら、プライミング液を前記中空糸膜モジュール内に送液する工程を含む、前記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（７）前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の孔径が０．１μｍ以上である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。
（８）前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の内径が３００〜１０００μｍである前記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞濃縮液の製造方法。

本発明の細胞濃縮液の製造方法によれば、細胞濃縮後に、中空糸膜モジュールの濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替えてから、洗浄を行うことで、濾液中の夾雑物や培地成分が中空糸膜の内側へ戻ることなく、速やかに中空糸膜モジュールから排出できるため、少ない洗浄液量で、しかも短時間で効率よく細胞の洗浄および濃縮を行うことができる。前記洗浄後に得られる細胞濃縮液は、夾雑物や培地成分などの不純物の含有量が顕著に低減されているため、治療用途として提供することができる。さらに、濃縮工程における線速度を２段階に設定することでプライミングの操作を省略でき、短時間で細胞回収率の高い細胞濃縮液を得ることができる。

本発明で用いる中空糸膜モジュールの実施形態の一例を示す概略図である。 図１（ａ）に示す中空糸膜モジュール１の概略図である。 図１（ａ）に示す中空糸膜モジュール１を用いた細胞濃縮方法の実施形態の一例を示す概略図である。 図１（ｂ）に示す中空糸膜モジュール１’を用いた細胞濃縮方法の実施形態の一例を示す概略図である。 図１（ｂ）に示す中空糸膜モジュール１’を用いた細胞濃縮方法において、濾液排出口の位置を切り替えた実施形態の一例を示す概略図である。

以下に、本発明について説明する。

本発明の細胞濃縮方法は、導入口、導出口及び濾液排出口を備え、中空糸型分離膜が充填された中空糸膜モジュールを用いる細胞濃縮液の製造方法である。

本発明で用いる中空糸膜モジュールは、導入口、導出口及び濾液排出口を有する容器に中空糸膜が充填されたタイプのものである。前記中空糸膜モジュールでは、前記導入口または導出口から中空糸膜の内側に細胞懸濁液が導入される。細胞懸濁液は、中空糸膜の内側の空間を満たしながら、中空糸膜壁に設けられた微細孔を通過して中空糸膜の外側に夾雑物や培地成分を含む濾液が排出され、この濾液は濾液排出口を介して中空糸膜モジュールから排出される。一方、中空糸膜の内側にある濃縮された細胞懸濁液は前記導出口または導入口を介して中空糸膜モジュールから排出される。

前記中空糸膜モジュールとしては、前記構成を有するものであればよく特に限定はないが、例えば、図１（ａ）に示す中空糸膜モジュール１が挙げられる。中空糸膜モジュール１を構成する容器は、胴部２とその両側の頭部３Ａ、３Ｂからなり、上方側にある頭部３Ａ付近には濾液排出口５ａ、下方側にある頭部３Ｂ付近には濾液排出口５ｂが備えられている。
頭部３Ａには導入口６、頭部３Ｂには導出口７がそれぞれ設けられている。導入口６および導出口７は、中空糸膜の内側に細胞懸濁液が出入りする出入口のことであり、どちらから導入、導出させても良い。さらに、細胞懸濁液のみならず、洗浄液およびプライミング液についても同様である。なお、図１〜４では、中空糸膜モジュール１、１’の垂直方向上側の口を導入口６、垂直方向下側の口を導出口７として説明する。

前記胴部２の内部には、装填された中空糸膜の束８と、頭部３Ａの内部に設けられた中空糸膜の束８を胴部２内部に固定するとともに中空糸膜の開口端９を形成している樹脂層部１０、更に頭部３Ｂの内部に設けられたこれと同等の構造を有している。この樹脂層部１０および開口端９は、頭部３Ａ（或いは頭部３Ｂ）に被冠された構造となっており、導入口６、導出口７と濾液排出口５ａ、５ｂが中空糸膜を構成する壁材により隔てられ、連続しない構造となっている。

また、別の態様の中空糸膜モジュールとしては、図１（ｂ）に示すように、濾液排出口５ａのみを有する（濾液排出口５ｂがない）中空糸膜モジュール１’が挙げられる。

なお、図１（ａ）、１（ｂ）に示す中空糸膜モジュール１、１’は、各部分を容器の胴部２、頭部３Ａ、頭部３Ｂというように区別しているが、これは便宜的なものである。設計上、容器の胴部２と頭部３Ａおよび頭部３Ｂが別々のパーツから形成されている場合でも、導入口６と導出口７が中空糸膜を構成する壁材で隔てられることなく連続しており、更に導入口６および導出口７と濾液排出口５ａ、５ｂとが中空糸膜を構成する壁材により隔てられている構造を備えていれば、各種構造をとることが可能である。

前記中空糸膜モジュールにおいて濾液排出口の数としては単数でも、２個でもよく、特に限定はないが、濾液排出口を２箇所設ける場合には、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口の位置を、中空糸膜モジュールの下側末端から前記濾液排出口のいずれか一方までの距離ｘが中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬと比べてＬ／２≧ｘとなる位置に調整することで、濾液中の夾雑物や培地成分が排出されるまでの滞留可能な容積を小さくすることができる。
例えば、図２に示す中空糸膜モジュール１においては、濾液排出口５ａ、５ｂが設けられており、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口として、垂直方向下側の前記濾液排出口５ｂを用いる。この場合、「中空糸膜モジュールの下側末端から濾液排出口までの距離ｘ」とは、前記中空糸膜モジュール１内の導出口７の下方末端から濾液排出口５ｂの中心までの距離をいう。
ｘは中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬと比べてＬ／２≧ｘとなる位置に調整されていれば特に限定されないが、具体的なｘの値として、４〜２５ｃｍが好ましく、４〜２０ｃｍがより好ましく、４〜１０ｃｍがさらに好ましい。

「中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬ」とは、前記中空糸膜モジュール１内の導出口７の下方末端から導入口６の上方末端までの距離をいう。
Ｌの値は特に限定はないが、具体的には１５〜５０ｃｍであることが好ましく、２０〜４０ｃｍであることがより好ましい。

また、前記中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬ（ｃｍ)、２箇所の濾液排出口間の距離ｙ(ｃｍ)との比率をＬ：ｙ＝３：１〜１０：９の範囲に調整することで、濾液排出口を切り替えることによる洗浄効果が発揮しやすくすることができる。前記比率は、Ｌ：ｙ＝３：１〜３：２の範囲に調整することがより好ましい。
前記２箇所の濾液排出口間の距離ｙとは、例えば、図２に示す中空糸膜モジュール１において、垂直方向上側の濾液排出口５ａの中心から下側の濾液排出口５ｂの中心までの距離をいう。
前記ｙの値は５〜４５ｃｍであることが好ましく、１５〜４５ｃｍであることがより好ましい。

前記中空糸膜モジュールは、細胞への細菌の混入を防ぐ観点から、滅菌したものでもよい。滅菌方法は、特に限定されず、γ線滅菌、電子線滅菌、ＥＯＧ滅菌、高圧蒸気滅菌などの医療用具の滅菌に汎用されている滅菌方法を好適に用いることができる。

中空糸膜モジュールの容器の素材として、アクリロニトリルブタジエンスチレンターポリマー等のアクリロニトリルポリマー；ポリテトラフルオロエチレン、ポリクロロトリフルオロエチレン、テトラフルオロエチレンとヘキサフルオロプロピレンのコポリマー、ポリ塩化ビニル等のハロゲン化ポリマー；ポリアミド、ポリイミド、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロリドアクリルコポリマー、アクリロニトリル、ブタジエンスチレン、ポリスチレン、ポリメチルペンテン等を使用できる。特に耐滅菌性を有する素材、具体的にはポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン等が好ましい。

中空糸膜を固定する樹脂層部の素材としては、ポリウレタン樹脂、エポキシ樹脂、およびシリコン樹脂など一般的な接着材料が好ましく用いることができる。

前記中空糸膜モジュールには、中空糸膜を１０〜１０００本程度束ねたものを容器内に充填していることが好ましい。なお、本発明において、中空糸膜の配置は、直線状になっていても、撓んでいても、らせん状になっていてもよく、導入口と導出口の間に中空糸膜の両端が保持されていれば特に形状は限定されない。
なお、細胞濃縮を行う際の中空糸膜は鉛直方向に配置されていても、水平方向に配置されていても、斜め方向に配置されていてもよいが、濾液排出口の切り替えることによる洗浄効果が発揮しやすい観点から、中空糸膜が鉛直方向に配置している方がより好ましい。

本発明に用いられる中空糸膜の樹脂材料は、材料の安全性、安定性などの点から合成高分子材料が好ましく用いることができる。この中でも、ポリスルホン系又はセルロース系の親水性の高分子材料がより好ましく用いることができる。さらに、ポリエーテルスルホン、セルロースエステルが材料の安全性、安定性、入手のしやすさから最も好適に用いることができる。

また、中空糸膜の壁に設けられた孔の孔径は０．１μｍ以上１．５μｍ以下が好ましい。前記孔径が０．１μｍ未満であると、細胞懸濁液の濃縮時に不要な蛋白質などの夾雑物を効率的に除去できないため好ましくない。一方、前記孔径が１．５μｍを超えると細胞の大きさに近い孔径の孔が中空糸膜に存在するため、細胞懸濁液を濃縮する工程において孔への詰まりが生じ、細胞回収率が大きく低下する可能性があるため好ましくない。
前記孔径は、１．５μｍ以下が好ましく、１．２μｍ以下がより好ましく、１．０μｍ以下がさらに好ましい。
前記孔径は、中空糸膜の平均孔径を指し、一般的にパームポロメーターにより測定、算出される。

本発明でいう細胞としては、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、脂肪由来間質幹細胞、多能性成体幹細胞、骨髄ストローマ細胞、造血幹細胞等の多分化能を有する生体幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、キラーＴ細胞（細胞障害性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、制御性Ｔ細胞などのリンパ球系の細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、顆粒球、赤血球、血小板、神経細胞、筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、心筋細胞などの体細胞、遺伝子の導入や分化などの処理を行った細胞、腫瘍細胞、内皮細胞、胎児細胞などの希少細胞が例示される。

また、細胞懸濁液は、前記細胞を含む懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などの生体組織を酵素処理や破砕処理や抽出処理や分解処理や超音波処理などをした後の懸濁液、血液や骨髄液を密度勾配遠心処理や濾過処理や酵素処理や分解処理や超音波処理などの前処理をして調製された細胞懸濁液等が例示される。
また、前記に例示した細胞を生体外で培養した後の細胞懸濁液を使用することができる。細胞を生体外で培養するときの培養液の例としては、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等が挙げられる。また、サイトカイン、抗体やペプチドなどの刺激因子を添加した培養液も使用できる。

以下に、本発明の各工程を詳しく説明する。

（濃縮工程）
本発明の細胞濃縮液の製造方法は、まず、細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュールの導入口または導出口から送液し、濾液を前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された濾液排出口から排出しながら細胞懸濁液を濃縮する。

本工程では、前記中空糸膜モジュールを、細胞懸濁液から濾過される濾液用の濾液排出口が垂直方向上側にあるように配置する。このように濾液排出口を垂直方向上側に配置することで、前記濾液排出口にかかる濾液の圧力が、垂直方向下側に配置した場合に比べて低減されるために、濃縮時に中空糸膜の内腔を流れる細胞による中空糸膜の目詰まりを抑えて効率のよい細胞濃縮を行うことができる。
例えば、図１（ａ）、１（ｂ）に示す中空糸膜モジュール１、１’では、垂直方向上側にある濾液排出口５ａが本工程で用いる濾液排出口になる。

また、本工程の実施形態としては、例えば、図３に示すように、中空糸膜モジュール１の導入口６と、貯留容器１２を含む回路１１を介して導出口７とを接続し、中空糸膜モジュール１の導出口７から排出された細胞懸濁液を、再び中空糸膜モジュール１内の中空糸膜の内側に流入させ、細胞懸濁液中の液体を中空糸膜の孔から排出させることで、細胞懸濁液中の細胞成分がさらに濃縮されるように構成することが挙げられる。このように細胞懸濁液を循環させて濃縮を繰り返すことにより、所望の細胞濃度にまで濃縮された細胞懸濁液が生成されることになる。

細胞懸濁液については、前記回路１１に接続された貯留容器１２に貯留する。濃縮開始時には、細胞懸濁液が充填された貯留容器１２を回路１１に接続し、次いで、前記貯留容器１２と中空糸膜モジュール１との間の回路１１にあるポンプ１４ａを駆動させて、中空糸膜モジュール１の導入口６または導出口７から所定量の細胞懸濁液を導入する。前記ポンプ１４ａの位置としては、図３に示すように、中空糸膜モジュール１の頭部３にある導入口６と貯留容器１２との間の回路１１または図示しないが、ヘッダー部４の導出口７と貯留容器１２との間の回路１１のいずれかに設置されていればよい。

前記中空糸膜モジュール１の垂直方向上側にある濾液排出口５ａおよび垂直方向下側にある濾液排出口５ｂにはチューブが接続され、それぞれのチューブどうしが合流して廃液容器１５に接続される。濾液排出口５ａの出口側にはバルブ１３ａ、濾液排出口５ｂの出口側にはバルブ１３ｂが設置されて濾液の流れの調整ができるようになっている。また、前記合流後のチューブにはポンプ１４ｂが設けられていてもよい。

前記中空糸膜モジュール１の中空糸膜８から排出された濾液については、垂直方向上側にある濾液排出口５ａからポンプ１４ｂを駆動して廃液容器１５に排出する。
この場合、下側にある濾液排出口５ｂから濾液が排出されないように、前記濾液排出口５ｂの出口付近にあるバルブ１３ｂを閉じておく。

本工程の細胞懸濁液の濃縮率は、前記中空糸膜モジュール１の導出口７または導入口６から回路１１を介して貯留容器１２に戻った細胞懸濁液の容量を測定したり、貯留容器１２内の細胞懸濁液をサンプリングして細胞濃度を測定したりすればよい。

前記中空糸膜モジュール１の導出口７と貯留容器１２との間の回路１１には分岐部１６が設けられており、前記分岐部１６にはチューブを介して回収容器１７が接続されている。また、前記分岐部１６と前記貯留容器１２との間の回路１１にはバルブ１３ｃ、前記分岐部１６と回収容器１７との間のチューブにはバルブ１３ｄが設けて回路１１での細胞懸濁液などの流れを調整することを可能にしている。

また、本工程の別の実施形態としては、図４に示すように、中空糸膜モジュール１’を用いた形態が挙げられる。図４に示す態様では、垂直方向下側の濾液排出口５ｂを備えていないため、図３に示す中空糸膜モジュール１のように前記バルブ１３ｂを閉じる操作が不要であるが、この操作以外は、図３に示す中空糸膜モジュール１と基本的に同じ操作を行えばよい。

また、本工程において、前記中空糸膜モジュールに導入するときの細胞懸濁液の線速度は、一定であってもよいが、前記線速度を２段階に変えて濃縮を行うことで、プライミング操作を省略でき、操作時間を短縮しつつ細胞回収率を向上させることができる。

前記２段階の線速度としては、１段階目の線速度ａ（ｃｍ／分）と２段階目の線速度ｂ（ｃｍ／分)をａ＜ｂの関係を満たすように調整することで、１段階目をプライミングの目的で実施し、中空糸膜内を細胞懸濁液で満たすことができるため全ての中空糸膜を有効に使用できる。その後２段階目で線速度を速くすることにより、濃縮時間を短縮しながら、効率よく細胞懸濁液を濃縮できるため好ましい。
中でも、１段階目で中空糸膜内の空気を膜外に十分に押し出し、２段階目で効率よく濃縮するという観点から、前記１段階目の線速度ａ（ｃｍ／分）と２段階目の線速度ｂ(ｃｍ／分)の比率をａ：ｂ＝１：１．２〜１：３２の範囲に調整することが好ましく、ａ：ｂ＝１：１０〜１：２０の範囲に調整することがより好ましい。
このように２段階の線速度で濃縮を行う場合、１段階目については効率よく中空糸膜内の空気を膜外に押し出すことができ、２段階目については細胞へのダメージを極力低減させ、かつ短時間で細胞回収率の高い細胞濃縮液を製造する観点から、前記１段階目の線速度ａが３５〜３００ｃｍ／分の範囲、２段階目の線速度ｂが３７０〜１１００ｃｍ／分の範囲で調整すればよく、線速度ｂについては３９０〜５９０ｃｍ／分の範囲に調整することがより好ましい。

前記線速度とは中空糸膜モジュール内の中空糸内腔断面を単位時間あたりに通過する細胞懸濁液量で、細胞懸濁液の中空糸膜モジュールへの流入速度（流速）を細胞懸濁液処理器内の中空糸内腔の全断面積で除して算出することができる。

また、本工程における濾過速度、中空糸膜面積などの他の濃縮条件については特に限定はない。

本工程の終了は、例えば、細胞懸濁液から排出された濾液の量が所定の量に到達したことを確認すること、貯留容器１２内の細胞懸濁液をサンプリングして細胞濃度を測定することなどで判断すればよい。具体的には、濃縮された細胞懸濁液の中空糸膜モジュールへの流入を停止することで本工程を終了すればよい。

（切り替え工程）
本発明では、前記濃縮工程後に、前記濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替える。このように濾液排出口の位置を切り替えることで、後述の洗浄工程を行った際に、中空糸膜モジュール内に残っている夾雑物や培地成分を含む濾液を速やかに中空糸膜モジュールの外部に排出することができる。

前記のように濾液排出口を切り替える実施形態としては、例えば、図３に示す形態が挙げられる。図３に示す形態では、中空糸膜モジュール１の垂直方向上側に設けた濾液排出口５ａと垂直方向下側に設けた濾液排出口５ｂのそれぞれ出口側にあるバルブ１３ａ、１３ｂを開閉することで切り替えを行う。すなわち、濃縮工程時には前記バルブ１３ｂを閉じて、垂直方向上側の濾液排出口５ａから濾液を排出し、続く切り替え工程時に前記バルブ１３ａを閉じて、かわりに前記バルブ１３ｂを開き、垂直方向下側の濾液排出口５ｂから濾液を排出することで、濾液排出口を切り替える。なお、前記濾液排出口５ａ、５ｂの開閉は、バルブ以外の公知の手法で行ってもよい。

また、濾液排出口を切り替える他の実施形態としては、例えば、図５に示す形態が挙げられる。図５に示す形態は、図４に示す形態で濃縮を行った後の形態であり、図４に示す中空糸膜モジュール１’を回路１１から外して、上下の向きを変えて、再度回路１１に接続している。このため、濾液排出口５ａの位置が図４では垂直方向上側から、図５では垂直方向下側に切り替えられている。同時に、導入口６と導出口７の位置も上下で反転している。

また、他の実施形態としては、一つの濾液排出口をスライドさせることで位置を切り替えてもよい。このような中空糸膜モジュールとしては、図示しないが、例えば、濾液排出口の位置を中空糸膜モジュールの長軸方向にスライドして変動できるように構成した中空糸膜モジュールが挙げられる。この態様の中空糸膜モジュールでは、図４、５に示すように、中空糸膜モジュール１’を回路１１から取り外すことなく切り替えを行うことができる。前記スライドの機構としては、中空糸膜モジュールから濾液が排出できるのであればよく、特に限定はない。

（洗浄・回収工程）
本発明では、前記切り替え工程後に、洗浄液を前記導入口または導出口から送液し、濾液を前記濾液排出口から排出しながら細胞を洗浄した後、細胞濃縮液を前記導出口から回収する。

本工程では、洗浄液を中空糸膜モジュールに導入することで、中空糸膜モジュールおよび前記導入口と導出口とを接続する回路内にある濃縮された細胞懸濁液に含まれる夾雑物および培地成分を濾液として中空糸膜の外側に排出する。そして、前記切り替え工程によって、中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替えられた濾液排出口から、前記濾液が速やかに排出されることで、前記濾液中の夾雑物および培地成分が再度中空糸膜の内側へ移動することを防ぐことができるために、洗浄・濃縮を効率よく行うことができ、不純物の含有量が極めて低い細胞濃縮液を得ることができる。

例えば、図３に示す実施形態では、貯留容器１２に、洗浄液を充填した溶液バッグを接続し（図示せず）、洗浄液を貯留容器１２に導入する。次いで、ポンプ１４ａを駆動して、洗浄液を導入口６または導出口７から中空糸膜モジュール１に導入する。中空糸膜の外側に排出された濾液についてはポンプ１４ｂを駆動して垂直方向下側にある濾液排出口５ｂから廃液容器１５に排出する。また、生成された細胞濃縮液は、回路１１を介して貯留容器１２に戻す。
前記洗浄・濃縮を続けながら、貯留容器１２内にある細胞濃縮液をサンプリングして夾雑物および培養成分の濃度が所定量以下になったことを確認して、前記の洗浄を終了する。
次に、前記分岐部１６と貯留容器１２との間のバルブ１３ｃを閉じ、分岐部１６と回収容器１７との間のバルブ１３ｄを開き、再度、ポンプ１４ａを駆動して、細胞濃縮液を回収容器１７に導入して回収する。

また、図５に示す実施形態でも、図３に示す実施形態と同様に洗浄・回収操作を行う。すなわち、貯留容器１２に、洗浄液を充填した溶液バッグを接続し（図示せず）、洗浄液を貯留容器１２に導入した後、ポンプ１４ａを駆動して洗浄液を、導入口６または導出口７から中空糸膜モジュール１に導入する。中空糸膜の外側に排出された濾液については垂直方向下側にある濾液排出口５ａからポンプ１４ｂを駆動して廃液容器１５に排出する。また、生成された細胞濃縮液は、回路１１を介して貯留容器１２に戻す。
前記洗浄・濃縮を続けながら、貯留容器１２内にある細胞濃縮液をサンプリングして夾雑物および培養成分の濃度が所定量以下になったことを確認して、前記の洗浄を終了する。
次に、前記分岐部１６と貯留容器１２との間のバルブ１３ｃを閉じ、分岐部１６と回収容器１７との間のバルブ１３ｄを開き、再度、ポンプ１４ａを駆動して、細胞濃縮液を回収容器１７に導入して回収する。

本工程では、前記中空糸膜モジュールに導入するときの洗浄液の線速度は、前記濃縮工程における細胞懸濁液の線速度と同じであればよく、特に限定はない。
また、本工程の洗浄条件としては、前記線速度に調整できればよく、例えば、濾過速度、中空糸膜面積などの他の条件については特に限定はない。

前記洗浄液としては、回収目的の細胞を損傷したりしなければ特に限定はないが、生理食塩水、リンゲル液、細胞培養に用いる培地、リン酸緩衝液等の一般的な緩衝液が好ましい。

（プライミング工程）
また、本発明では、前記濃縮工程の前に、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された前記濾液排出口から排気しながら、プライミング液を前記導入口または導出口から送液してもよい。

本工程では、プライミング液が中空糸膜の内側に導入されることで押し出された空気が、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置した濾液排出口から速やかに排出されるため、プライミングを効率よく行うことができる。

前記プライミング液としては、生理食塩液、蒸留水、リンゲル液に代表される輸液や、無機塩、糖類、血清、タンパク質を含む液体、緩衝液、血漿、培地等が挙げられる。特に安全性の観点から生理食塩液や輸液を好適に用いることができる。また、血清、血漿、タンパク質を含む液体は、中空糸膜の表面をタンパク質でコーティングすることによって、細胞の中空糸膜への接着が抑制され、細胞回収率の向上が期待できることから、プライミング液として好適に用いることができる。プライミング液は１種類の液体である必要はなく、これらの群から２つ以上の液体を混合して使用することもできる。２つの液体を混合して使用する例としては、アルブミンを添加した生理食塩液や、血清を添加した培地といった組み合わせが挙げられる。

例えば、図３に示す実施形態では、貯留容器１２にプライミング液を導入し、ポンプ１４ａを駆動して、回路１１を介して導入口６または導出口７からプライミング液を中空糸膜モジュール１に導入する。中空糸膜モジュール１では垂直方向上側の濾液排出口５ａの出口側にあるバルブ１３ａを開けて、ここから排気を行えばよい。

また、図４に示す実施形態では、貯留容器１２にプライミング液を導入し、ポンプ１４ａを駆動して、回路１１を介して導入口６または導出口７からプライミング液を中空糸膜モジュール１に導入する。中空糸膜モジュール１では垂直方向上側の濾液排出口５ａの出口にあるバルブ１３ａを開けて、ここから排気を行えばよい。

以上のようにして得られる細胞濃縮液における細胞は、純度が９９％以上と非常に高くなっていることから、そのまま各種疾患の治療用途に提供することができる。
したがって、本発明は、前記製造方法で得られる細胞濃縮液をヒトや非ヒト動物に投与する各種疾患の治療方法に関する。
前記治療方法としては、細胞障害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞などの免疫細胞を使用したがんに対する免疫細胞療法、間葉系幹細胞などの多分化能を有する生体幹細胞を使用した、骨、関節、血管、臓器などの組織再生に対する細胞移植治療法、間葉系幹細胞を使用した移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）治療法が挙げられる。これらの治療に用いられる細胞は、iＰＳ細胞、ＥＳ細胞より誘導した細胞や、各種遺伝子を導入した細胞を使用することもできる。さらに、前記製造方法で得られる細胞濃縮液は、細胞濃縮液に新鮮な培地を加え、再び培養を行う培地交換の用途としても好適に使用することができる。

なお、本発明は、図１（ａ）、１（ｂ）、２に示す中空糸膜モジュールや図３、４、５に示した実施形態に限定されるものではなく、本発明の主旨に反しない範囲で各種変更することができる。

以下、実験結果を用いて本発明を説明する。

本実施例においては、細胞濃縮液中に含まれる蛋白質またはアルブミンまたはＩｇＧの総量を細胞懸濁液中に含まれる蛋白質またはアルブミンまたはＩｇＧの総量で除した値をパーセントで表示したもの、すなわち総蛋白除去率とアルブミン除去率とＩｇＧ除去率が９９％以上を維持できることを特徴とするが、これらの値が高いほど洗浄効率が優れていることを示す。細胞濃縮液中の総蛋白量は、蛋白濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定し、細胞懸濁液量（ｍＬ）との値の積で算出することができる。また、アルブミンおよびＩｇＧについても同様である。

ここでいう「細胞回収率」とは、回収容器に回収した細胞濃縮液中の細胞数を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞数で除した値をパーセントで表示したものであり、値が高いほど回収効率が優れていることを示す。細胞数は、細胞懸濁液を血球カウンター（シスメックス、Ｋ−４５００）により測定し、白血球分画の細胞濃度（個／ｍＬ）を本実施例での細胞濃度として算出し、細胞懸濁液量（ｍＬ）と細胞濃度（個／ｍＬ）の値の積で算出することができる。

また、ここでいう「細胞生存比率」とは、回収容器に回収した細胞濃縮液中の細胞の生存率を、処理をする前の細胞懸濁液中の細胞の生存率で除した値をパーセントで表示したものであり、値が高いほど細胞に与えるダメージが少ないことを示す。細胞生存率は{細胞生存率（％）＝１００−死細胞率（％）}により算出される。
死細胞率（％）は、細胞濃度が１ｍＬあたり１０の６乗個になるよう調製した各細胞懸濁液１００μＬに対し、ｖｉａ−ｐｒｏｂｅ（日本ＢＤ社製、商品名：ＢＤ Ｖｉａ−Ｐｒｏｂｅ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１０μＬ加え１０分間室温暗所で静置させた後、フローサイトメーター（日本ＢＤ社製、商品名：ＦＡＣＳＣａｎｔｏ）に取り込み、ｖｉａ−ｐｒｏｂｅの陽性率（％）として測定することができる。

実施例に使用する細胞懸濁液には、培養したＪｕｒｋａｔ細胞を含有する細胞懸濁液（１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ１６４０培地）１５００ｍＬ、洗浄液には生理食塩液１０００ｍＬを使用した。
以下に実施例を示す。

（実施例１）
図３に示す態様の製造装置を用いた。すなわち、中空糸膜モジュール１の導入口６と導出口７に塩化ビニル製チューブをつなげ、導出口７側のチューブには流路の切り替えが可能な二股の分岐部１６を設けた。分岐部１６の一方の端部は回収容器１７と接続し、もう一方の端部は貯留容器１２に接続した。導入口６側のチューブも貯留容器１２に接続し、溶液が中空糸膜モジュール１およびチューブ内を循環できるように回路１１を形成した。前記回路１１のチューブにはポンプ１４ａを設置し、細胞懸濁液の流れが適当な流速に設定できるようにした。
また、前記分岐部１６と貯留容器１２との間には二方活栓１３ｃ、前記分岐部１６と回収容器１７との間には二方活栓１３ｄを設置して貯留容器１２または回収容器１７に細胞懸濁液の流路を切り替えられるようにした。
さらに、中空糸膜モジュール１の垂直方向上側の濾液排出口５ａ、垂直方向下側の濾液排出口５ｂにもそれぞれ二方活栓１３ａ、１３ｂを備えたチューブを取り付け、両方のチューブを合流させてポンプ１４ｂを取り付け、こちらは廃液容器１５に注ぐように設置した。なお、予め二方活栓１３ａを開き、二方活栓１３ｂを閉じて、濾液が垂直方向上側の濾液排出口５ａから排出されるようにしておいた。

ポンプ１４ａにより流速を４５０ｍＬ／分（線速度５８０ｃｍ／分）に調整しながら、貯留容器１２内の細胞懸濁液を導入口６から中空糸膜モジュール１内に通液した。細胞懸濁液を循環させながら、細胞懸濁液を貯留している貯留容器１２から全ての細胞懸濁液がなくなるまで濾過を行った（濃縮）。濾液は、前記濾液排出口５ａからポンプ１４ｂを駆動させて廃液容器１５に導入した。
前記濃縮工程終了後、二方活栓１３ａを閉じ、二方活栓１３ｂを開いて、中空糸膜モジュールの垂直方向下側の濾液排出口５ｂから濾液を排出できるように切り替えた。
次に、貯留容器１２内に生理食塩液を１０００ｍＬ入れ、同様に４５０ｍＬ／分（線速度５８０ｃｍ／分）の流速で導入口６から中空糸膜モジュール１内に通液し、希釈された細胞懸濁液を循環させながら濾過を行うことで細胞懸濁液の洗浄を行った。
貯留容器１２内の生理食塩液がなくなるまで濾過を行った後、回収容器１７に連結したチューブに流路を切り替えて、中空糸膜モジュール１および回路１１内の細胞濃縮液を７５ｍＬ／分の速さで押し出して回収容器１７に回収した。

中空糸膜モジュール１については，ポリエーテルスルホン製の中空糸型分離膜〔品名：ＭＦ０２０ ＴＹＰＥ−１、中空糸内径５７０μｍ、孔径０．２μｍ、東洋紡社製〕を３００本用いて作製した。
また、全長Ｌは２７ｃｍ、中空糸膜モジュール１端部からの濾液排出口５ｂの位置ｘは４ｃｍ、濾液排出口５ａ、５ｂ間の距離ｙは１８ｃｍであった。
作製した中空糸膜モジュール１の濾過面積は０．１２ｍ^２、中空糸型分離膜の総断面積は０．７７ｃｍ^２であった。
得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．８９％、アルブミン除去率は９９．８３％、ＩｇＧ除去率は９９．９６％であった。また、細胞回収率は８８％、生存比率は９７％であった。

（実施例２）
実験系、送液速度および中空糸膜モジュールについては実施例１と同様とした。上記濃縮工程終了後、濾液排出口５ａを濾液排出口５ｂに切り替える工程を実施し、洗浄を行った。このとき、中空糸膜モジュール１の全長Ｌは２７ｃｍであり、濾液排出口５ｂの位置ｘは１３ｃｍ、濾液排出口５ａ、５ｂ間の距離ｙは９ｃｍであった。
その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．８８％、アルブミン除去率は９９．５７％、ＩｇＧ除去率は９９．４３％であった。また、細胞回収率は８４％、生存比率は９３％であった。

（実施例３）
実験系、送液速度および中空糸膜モジュールについては実施例１と同様とした。上記濃縮工程終了後、濾液排出口５ａを濾液排出口５ｂに切り替える工程を実施し、洗浄を行った。このとき、中空糸膜モジュール１の全長Ｌは２７ｃｍ、濾液排出口５ｂの位置ｘは４ｃｍであり、Ｌ：ｙ＝３：２であった。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．８８％、アルブミン除去率は９９．８２％、ＩｇＧ除去率は９９．９６％であった。また、細胞回収率は８６％、生存比率は９３％であった。

（実施例４）
実験系および中空糸膜モジュールについては実施例３と同様とし、上記濃縮工程において、中空糸膜モジュール１の垂直方向上側の濾液排出口５ａの位置まで細胞懸濁液が満たされるまでの線速度をａ、細胞懸濁液を貯留している貯留容器１２から全ての細胞懸濁液がなくなるまでの線速度をｂとして、濃縮時の線速度を２段階に切り替えた。このときのａ：ｂ＝１：２６であった。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．８９％、アルブミン除去率は９９．９２％、ＩｇＧ除去率は９９．９７％であった。また、細胞回収率は８４％、生存比率は９８％であり、処理時間は１０分であった。

（実施例５）
実験系および中空糸膜モジュールについては実施例４と同様とし、ａ＝４０ｃｍ／分、ｂ＝５８０ｃｍ／分とした。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．９２％、アルブミン除去率は９９．９１％、ＩｇＧ除去率は９９．９８％であった。また、細胞回収率は８７％、生存比率は９３％であり、処理時間は１３分であった。

（実施例６）
実験系および中空糸膜モジュールについては実施例４と同様とし、ａ：ｂ＝１：３．５、ａ＝４０ｃｍ／分、ｂ＝１４０ｃｍ／分とした。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．９４％、アルブミン除去率は９９．９２％、ＩｇＧ除去率は９９．９６％であった。また、細胞回収率は７３％、生存比率は９５％であり、処理時間は３１分であった。

（比較例１）
実験系、送液速度および中空糸膜モジュールについては実施例１と同様とした。上記濃縮工程終了後、濾液排出口の位置を切り替えずに洗浄工程でも垂直方向上側の濾液排出口５ａから濾液を排出した。このとき、中空糸膜モジュール１の全長Ｌは２７ｃｍであり、濾液排出口の位置ｘは２２ｃｍであった。また、Ｌ：ｙ＝２７：０であった。その結果、得られた細胞濃縮液での総蛋白除去率は９９．８４％、アルブミン除去率は９９．１４％、ＩｇＧ除去率は９８．８１％であった。また、細胞回収率は
８７％、生存比率は９４％であった。処理時間は１３分であった。

実施例１〜６では、濃縮後に濾液排出口を垂直方向上側から下側に切り替えているため、切り替えを行っていない比較例１と比べて、得られる細胞濃縮液の総蛋白除去率、アルブミン除去率、ＩｇＧ除去率がより優れていること、特に、実施例１〜６では、アルブミン除去率が９９．５７％以上、およびＩｇＧ除去率が９９．４３％以上となっており、不純物の含有量が顕著に低減された、非常に純度の高い細胞濃縮液が製造されていることがわかる。

また、実施例５では、濃縮工程における１段目の線速度を４０ｃｍ／分、２段目の線速度を５８０ｃｍ／分とすることで、実施例６のように２段目の線速度１４０ｃｍ／分とすることに比べて、短時間で細胞回収率を有意に高くできることがわかる。

１.中空糸膜モジュール
２．胴部
３Ａ、３Ｂ．頭部
５ａ、５ｂ．濾液排出口
６．導入口
７．導出口
８．中空糸膜の束
９．開口端
１０．樹脂層部
１１．回路
１２．貯留容器
１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ．バルブ
１４ａ、１４ｂ．ポンプ
１５．廃液容器
１６．分岐部
１７．回収容器

Claims (8)

1. 導入口、導出口及び濾液排出口を備え、中空糸型分離膜が充填された中空糸膜モジュールを用いる細胞濃縮液の製造方法であって、
   細胞懸濁液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された濾液排出口から排出しながら細胞懸濁液を濃縮する工程、
   前記濾液排出口の位置を前記中空糸膜モジュールの垂直方向下側に切り替える工程、及び
   洗浄液を前記中空糸膜モジュール内に送液し、濾液を前記濾液排出口から排出しながら細胞を洗浄した後、細胞濃縮液を回収する工程
   を含み、
   前記細胞懸濁液を濃縮する工程において、２段階の線速度で濃縮し、前記２段階の線速度において、１段階目の線速度ａ（ｃｍ／分）と２段階目の線速度ｂ（ｃｍ／分)がａ＜ｂの関係を満たし、前記１段階目の線速度ａが３５〜３００ｃｍ／分であり、２段階目の線速度ｂが３７０〜１１００ｃｍ／分であることを特徴とする細胞濃縮液の製造方法。
2. 前記中空糸膜モジュールにおいて濾液排出口を２箇所設け、洗浄液を含む濾液用の濾液排出口の位置を、中空糸膜モジュールの下側末端から前記濾液排出口のいずれか一方までの距離ｘが中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬと比べてＬ／２≧ｘとなる位置に調整する請求項１に記載の細胞濃縮液の製造方法。
3. 前記中空糸膜モジュールの垂直方向の長さＬ（ｃｍ)、２箇所の濾液排出口間の距離ｙ(ｃｍ)との比率がＬ：ｙ＝３：１〜１０：９である請求項２に記載の細胞濃縮液の製造方法。
4. 前記中空糸膜モジュールの向きを変えることで前記濾液排出口の位置を切り替える請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
5. 前記１段階目の線速度ａ（ｃｍ／分）と２段階目の線速度ｂ(ｃｍ／分)の比率が、ａ：ｂ＝１：１．２〜１：３２である請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
6. 細胞懸濁液を濃縮する工程の前に、前記中空糸膜モジュールの垂直方向上側に配置された前記濾液排出口から排気しながら、プライミング液を前記中空糸膜モジュール内に送液する工程を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
7. 前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の孔径が０．１μｍ以上である請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
8. 前記中空糸膜モジュールに充填された中空糸型分離膜の内径が３００〜１０００μｍである請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞濃縮液の製造方法。
   

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