JP6511685B2 - 新規組換えファクターc、その製造法、およびエンドトキシンの測定法 - Google Patents
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Description
[1]
ファクターCの活性を有する、カブトガニのファクターC。
[1.1.1]
シアル酸を有する、前記ファクターC。
[1.1.2]
(α−2,3)結合の末端シアル酸を有する、前記ファクターC。
[1.1.3]
天然ファクターCに比べて(α−2,3)結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターC。
[1.1.4]
Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターCに比べて(α−2,3)結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターC。
[1.1.5]
Maackia amurensis Agglutininでレクチンブロットした際に、天然ファクターCに比べて高い反応性を示す、前記ファクターC。
[1.1.6]
Maackia amurensis Agglutininでレクチンブロットした際に、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターCに比べて高い反応性を示す、前記ファクターC。
[1.2.1]
21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、10%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.2]
21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、20%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.3]
52mMの炭酸水素ナトリウムの存在下で、25%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.4]
52mMの炭酸水素ナトリウムの存在下で、35%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.5]
214mMの塩化ナトリウムの存在下で、25%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.6]
214mMの塩化ナトリウムの存在下で、35%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.7]
16mMの硫酸マグネシウムの存在下で、15%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.8]
16mMの硫酸マグネシウムの存在下で、25%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.9]
2.5mMの塩化カルシウムの存在下で、35%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.10]
2.5mMの塩化カルシウムの存在下で、45%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.11]
21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.12]
52mMの炭酸水素ナトリウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.13]
214mMの塩化ナトリウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.14]
16mMの硫酸マグネシウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.2.15]
2.5mMの塩化カルシウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[1.3.1]
下記(A)、(B)、(C)、または(D)に示すタンパク質である、前記ファクターC:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質;
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。
[1.3.2]
下記(A)、または(B)に示すタンパク質である、前記ファクターC:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。
[1.4]
組換えタンパク質である、前記ファクターC。
[1.5.1]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が115kDa〜140kDaである、前記ファクターC。
[1.5.2]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が115kDa〜130kDaである、前記ファクターC。
[1.5.3]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が120kDa〜130kDaである、前記ファクターC。
[1.5.4]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が120kDa〜128kDaである、前記ファクターC。
[1.5.5]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±5kDaである、前記ファクターC。
[1.5.6]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が128kDa±2kDaである、前記ファクターC。
[1.5.7]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±2kDaである、前記ファクターC。
[1.5.8]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が126kDa±2kDaである、前記ファクターC。
[1.5.9]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±1kDaである、前記ファクターC。
[1.6]
水溶性である、前記ファクターC。
[1.7]
ファクターCを含む培養上清である、前記ファクターC。
[1.8]
下記(1)〜(3)に示す性質を有する、前記ファクターC:
(1)ファクターCの活性を有する;
(2)非還元SDS−PAGEで測定される分子量が115kDa〜130kDaである;および
(3)21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、10%以上の残存活性を示す。
[2]
カブトガニのファクターCを製造する方法であって、哺乳類細胞を宿主細胞として用いてカブトガニのファクターCを発現することを含む、方法。
[2.1.1]
前記哺乳類細胞が、COS−1以外の哺乳類細胞である、前記方法。
[2.1.2]
前記哺乳類細胞が、霊長類およびげっ歯類からなる群より選択される哺乳動物の細胞である、前記方法。
[2.1.3]
前記哺乳類細胞が、霊長類の細胞である、前記方法。
[2.1.4]
前記哺乳類細胞が、げっ歯類の細胞である、前記方法。
[2.1.5]
前記哺乳類細胞が、サルを除く霊長類およびげっ歯類からなる群より選択される哺乳動物の細胞である、前記方法。
[2.1.6]
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスターの細胞またはヒトの細胞である、前記方法。
[2.1.7]
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスターの細胞である、前記方法。
[2.1.8]
前記哺乳類細胞が、ヒトの細胞である、前記方法。
[2.1.9]
前記哺乳類細胞が、CHOまたはHEKである、前記方法。
[2.1.10]
前記哺乳類細胞が、CHOである、前記方法。
[2.1.11]
前記哺乳類細胞が、HEKである、前記方法。
[2.1.12]
前記哺乳類細胞が、CHO DG44またはHEK293である、前記方法。
[2.1.13]
前記哺乳類細胞が、CHO DG44である、前記方法。
[2.1.14]
前記哺乳類細胞が、HEK293である、前記方法。
[2.2.1]
前記ファクターCが下記(A)、(B)、(C)、または(D)に示すタンパク質である、前記方法:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質;
(C)配列番号4に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(D)配列番号4に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。
[2.2.2]
前記ファクターCが下記(A)または(B)に示すタンパク質である、前記方法:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。
[3]
前記方法により製造され得る、カブトガニのファクターC。
[3.1]
ファクターCの活性を有する、前記ファクターC。
[3.2.1]
シアル酸を有する、前記ファクターC。
[3.2.2]
(α−2,3)結合の末端シアル酸を有する、前記ファクターC。
[3.2.3]
天然ファクターCに比べて(α−2,3)結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターC。
[3.2.4]
Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターCに比べて(α−2,3)結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターC。
[3.2.5]
Maackia amurensis Agglutininでレクチンブロットした際、天然ファクターCに比べて高い反応性を示す、前記ファクターC。
[3.2.6]
Maackia amurensis Agglutininでレクチンブロットした際、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターCに比べて高い反応性を示す、前記ファクターC。
[3.3.1]
21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、10%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.2]
21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、20%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.3]
52mMの炭酸水素ナトリウムの存在下で、25%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.4]
52mMの炭酸水素ナトリウムの存在下で、35%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.5]
214mMの塩化ナトリウムの存在下で、25%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.6]
214mMの塩化ナトリウムの存在下で、35%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.7]
16mMの硫酸マグネシウムの存在下で、15%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.8]
16mMの硫酸マグネシウムの存在下で、25%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.9]
2.5mMの塩化カルシウムの存在下で、35%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.10]
2.5mMの塩化カルシウムの存在下で、45%以上の残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.11]
21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.12]
52mMの炭酸水素ナトリウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.13]
214mMの塩化ナトリウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.14]
16mMの硫酸マグネシウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.3.15]
2.5mMの塩化カルシウムの存在下で、Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターC、および/または、天然ファクターCよりも高い残存活性を示す、前記ファクターC。
[3.4]
組換えタンパク質である、前記ファクターC。
[3.5.1]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が115kDa〜140kDaである、前記ファクターC。
[3.5.2]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が115kDa〜130kDaである、前記ファクターC。
[3.5.3]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が120kDa〜130kDaである、前記ファクターC。
[3.5.4]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が120kDa〜128kDaである、前記ファクターC。
[3.5.5]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±5kDaである、前記ファクターC。
[3.5.6]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が128kDa±2kDaである、前記ファクターC。
[3.5.7]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±2kDaである、前記ファクターC。
[3.5.8]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が126kDa±2kDaである、前記ファクターC。
[3.5.9]
非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±1kDaである、前記ファクターC。
[3.6]
水溶性である、前記ファクターC。
[3.7]
ファクターCを含む培養上清である、前記ファクターC。
[4]
前記ファクターCを含む、エンドトキシン測定剤。
[4.1]
さらに、カブトガニのファクターBおよびカブトガニのプロクロッティングエンザイムを含む、前記測定剤。
[4.2]
前記ファクターBが下記(E)または(F)に示すタンパク質であり、前記プロクロッティングエンザイムが下記(G)または(H)に示すタンパク質である、前記測定剤:
(E)配列番号6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(F)配列番号6に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターBの活性を有するタンパク質;
(G)配列番号8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(H)配列番号8に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質。
[5]
前記測定剤を含む、エンドトキシン測定用キット。
[6]
前記測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシンを測定する方法。
[6.1.1]
前記被験試料が、イオンを含有する、前記方法。
[6.1.2]
前記被験試料が、カチオンを含有する、前記方法。
[6.1.3]
前記被験試料が、金属イオンを含有する、前記方法。
[6.1.4]
前記被験試料が、アルカリ金属イオンまたはアルカリ土類金属イオンを含有する、前記方法。
[6.1.5]
前記被験試料が、アルカリ金属イオンを含有する、前記方法。
[6.1.6]
前記被験試料が、アルカリ土類金属イオンを含有する、前記方法。
[6.2.1]
前記被験試料が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびマグネシウムイオンからなる群より選択される1種またはそれ以上のイオンを含有する、前記方法。
[6.2.2]
前記被験試料が、ナトリウムイオンを含有する、前記方法。
[6.2.3]
前記被験試料が、カリウムイオンを含有する、前記方法。
[6.2.4]
前記被験試料が、カルシウムイオンを含有する、前記方法。
[6.2.5]
前記被験試料が、マグネシウムイオンを含有する、前記方法。
[6.3.1]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、1mM以上となるような量である、前記方法。
[6.3.2]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、2mM以上となるような量である、前記方法。
[6.3.3]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、5mM以上となるような量である、前記方法。
[6.3.4]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、10mM以上となるような量である、前記方法。
[6.3.5]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、20mM以上となるような量である、前記方法。
[6.3.6]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、50mM以上となるような量である、前記方法。
[6.3.7]
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、100mM以上となるような量である、前記方法。
[6.4]
前記被験試料が、注射剤である、前記方法。
[6.5.1]
前記被験試料が、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、イオタラム酸ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムからなる群より選択される1種またはそれ以上の塩を含有する、前記方法。
[6.5.2]
前記被験試料が、塩化ナトリウムを含有する、前記方法。
[6.5.3]
前記被験試料が、硫酸マグネシウムを含有する、前記方法。
[6.5.4]
前記被験試料が、炭酸水素ナトリウムを含有する、前記方法。
[6.5.5]
前記被験試料が、クエン酸ナトリウムを含有する、前記方法。
[6.5.6]
前記被験試料が、塩化カルシウムを含有する、前記方法。
[6.5.7]
前記被験試料が、塩化カリウムを含有する、前記方法。
[6.5.8]
前記被験試料が、イオタラム酸ナトリウムを含有する、前記方法。
[6.5.9]
前記被験試料が、エデト酸カルシウム二ナトリウムを含有する、前記方法。
[6.5.10]
前記被験試料が、リン酸二水素ナトリウムを含有する、前記方法。
[6.6.1]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、1mM以上となるような量である、前記方法。
[6.6.2]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、2mM以上となるような量である、前記方法。
[6.6.3]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、5mM以上となるような量である、前記方法。
[6.6.4]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、10mM以上となるような量である、前記方法。
[6.6.5]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、20mM以上となるような量である、前記方法。
[6.6.6]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、50mM以上となるような量である、前記方法。
[6.6.7]
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、100mM以上となるような量である、前記方法。
[6.7]
カスケード反応の進行を検出するための基質を反応系に添加する工程を含む、前記方法。
[6.8]
さらに、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含む、前記方法。
本発明のファクターCは、カブトガニ由来のファクターCである。本発明のファクターCは、組換えタンパク質である。「組換えタンパク質」とは、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し異種発現させることにより得られたタンパク質をいう。本発明のファクターCは、ファクターCの活性を有する。
本発明のファクターCは、例えば、哺乳類細胞を宿主細胞として用いて発現させることにより製造できる。すなわち、本発明は、哺乳類細胞を宿主細胞として用いてカブトガニのファクターCを発現することを含む、カブトガニのファクターCを製造する方法、を提供する。同方法を、「本発明の製造法」ともいう。本発明の製造法により製造され得るファクターCは、本発明のファクターCの一態様である。
本発明のファクターCは、エンドトキシンの測定に利用できる。すなわち、本発明は、本発明のファクターCを含むエンドトキシン測定剤を提供する。同エンドトキシン測定剤を、「本発明のエンドトキシン測定剤」ともいう。本発明のエンドトキシン測定剤は、エンドトキシンの測定態様に応じて、さらに、ファクターC以外の因子を含んでいてもよい。
ウイルス法に用いるウイルスは、昆虫細胞に感染し各因子を発現させることができる限り特に制限されず、昆虫細胞でのタンパク質の発現に通常用いられるものを好適に利用できる。そのようなウイルスとしては、バキュロウイルス(Baculovirus)が挙げられる。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス(Nucleopolyhedrovirus;NPV)が好ましい。NPVとしては、AcNPV(Autographa californica NPV)、BmNPV(Bombyx mori NPV)が挙げられる。NPVとしては、AcNPVが好ましい。
各因子をコードする遺伝子を昆虫細胞の染色体上に組み込むことで、各因子を安定に発現する安定発現細胞株が得られる。安定発現細胞株の構築手法は、特に制限されず、常法により行うことができる。例えば、pIZ-V5(Life Technologies Corporation)を用いて、マニュアルに従って安定発現細胞株を構築することができる。
本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合することにより、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にはカスケード反応が進行する。カスケード反応の進行を測定することにより、被験試料中のエンドトキシンを測定することができる。すなわち、本発明は、本発明のエンドトキシン測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシンを測定する方法を提供する。同方法を、「本発明のエンドトキシン測定法」ともいう。
(A)本発明のファクターCを反応系に添加する工程。
(B)本発明のファクターBを反応系に添加する工程。
(C)本発明のプロクロッティングエンザイムを反応系に添加する工程。
(A)本発明のファクターCと被験試料とを混合する工程。
(B)本発明のファクターBと、工程Aの混合後のファクターCとを混合する工程。
(C)本発明のプロクロッティングエンザイムと、工程Bの混合後のファクターBとを混合する工程。
(D)カスケード反応の進行を測定する工程。
(1)昆虫細胞(Sf9)によるファクターCの発現
本項では、昆虫細胞であるSf9を宿主細胞として用いて、以下の手順により、ファクターCを調製した。
本項では、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株であるCHO DG44を宿主細胞として用いて、以下の手順により、ファクターCを調製した。
本項では、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であるHEK293を宿主細胞として用いて、以下の手順により、ファクターCを調製した。
日本産カブトガニTachypleus tridentatusの血球細胞抽出液から、ファクターBとファクターCを含む画分を、デキストランサルフェート樹脂によるカラムクロマトグラフィー(Takanori Nakamura, et al., Eur. J. Biochem. 154: 511-521 (1986))により得た。この画分5 mLを、Sepharose CL6Bゲル(GEヘルスケア)を充填したカラム(φ2.2 cmx 97cm)を用いてゲルろ過に供した。ゲルろ過は、公知の手法(Jeak Ling Ding and Bow Ho, US5,712,144; Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156)とほぼ同一の条件で行った。流速は15 mL/時間とし、溶媒には154 mM NaCl、1 mM EDTA、5% DMSOを含む50 mM Trisバッファー(pH8.0)を使用した。
日本産カブトガニTachypleus tridentatusのファクターBをコードするDNAを、昆虫細胞用の発現ベクターであるpIZ-V5(Life Technologies Corporation)のEcoRVとMluI認識部位の間に挿入し、ファクターB発現プラスミドを作製した。同DNAの塩基配列を配列番号9に、同DNAにコードされるファクターBのアミノ酸配列を配列番号6に示す。なお、配列番号9に示す塩基配列は、昆虫細胞での発現に最適化された塩基配列である。
上記で調製した4種類のファクターCタンパク質について、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により分子量を比較した。
上記で調製した4種類のファクターCのそれぞれを、他の因子と組み合わせて、以下の手順で活性測定を行った。活性測定のスキームを図4に示す。
エンドトキシンは強力な免疫反応誘起物質であるため、エンドトキシンに汚染された注射剤を体内に入れた場合には、重大な副作用が起こる。そのため、注射剤の製造においては、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬を用いたエンドトキシン試験を行い、エンドトキシン汚染がないことを確認するよう、各国薬局方で義務付けられている。
ファクターCタンパク質は、非還元状態では1本鎖(Full)で存在し、還元状態ではH鎖とL鎖の2本に解離することが知られている。抗ファクターCモノクローナル抗体(2C12抗体)は、FullとH鎖を認識することが報告されている(Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481(1992))。そこで、L鎖中に存在するペプチド抗原を作製し、常法によりウサギに免疫して、L鎖とFullを認識するポリクローナル抗体(FCL抗体)を製造した(図10)。
上記「1.ファクターCタンパク質の調製」の「(4)天然ファクターC(Tachypleus tridentatus)の調製」に記述した方法に準じて、哺乳類細胞(CHO DG44、HEK293)と昆虫細胞(Sf9)の培養上清から3種類の組換えファクターCタンパク質を精製した。方法の概要としては、培養上清(100〜300mL)をデキストランサルフェート樹脂によるカラムクロマトグラフィーにかけ、組換えファクターCを含む溶出画分を更にゲルろ過で分離した。各組換えファクターCタンパク質が精製されたことは、SDS-PAGEとCBB染色、2C12抗体を用いたウエスタンブロット法、および活性測定により確認した。
4種類の精製ファクターCタンパク質について、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により改めて分子量を比較した。
本実施例で組換えファクターCを発現する際に使用した遺伝子は全てTachypleus tridentatus由来の配列で、末端にタグが付加されないように発現プラスミドを設計している。このため、本実施例で得られた4種類のファクターCの翻訳アミノ酸配列は同一と考えられる。更に、組換えファクターC(HEK、Sf9)のN末端アミノ酸の部分配列を決定した所、文献報告にあるTachypleus tridentatusの天然ファクターCの配列と同一であることが確認された(データ示さず)。
タンパク質のN型糖鎖修飾において、哺乳類細胞では、タンパク質のアスパラギン残基上で段階的に糖が付加され、最終的に末端にシアル酸を含む「コンプレックス(COMPLEX)型」の糖鎖が生成する。一方、昆虫細胞では、多くの場合シアル酸は付加されず、末端がマンノースの「パウチマンノース(PAUCIMANNOSE)型」の糖鎖が生成する(Robert L. Harrison and Donald L. Jarvis, Methods in Molecular Biology 338:341-356(2007))。4種類の精製ファクターCタンパク質のN型糖鎖の差を確認する目的で、末端シアル酸特異的レクチン(Maackia amurensis Agglutinin (MAM)、Sambucus sieboldiana Agglutinin (SSA))等の各種レクチンを用いてレクチンブロットを行った。
配列番号1:日本産カブトガニのファクターC遺伝子のDNA配列
配列番号2:日本産カブトガニのファクターCのアミノ酸配列
配列番号3:東南アジア産(シンガポール産)カブトガニのファクターC遺伝子のDNA配列
配列番号4:東南アジア産(シンガポール産)カブトガニのファクターCのアミノ酸配列
配列番号5:日本産カブトガニのファクターB遺伝子のDNA配列
配列番号6:日本産カブトガニのファクターBのアミノ酸配列
配列番号7:日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイム遺伝子のDNA配列
配列番号8:日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列
配列番号9:昆虫細胞での発現にコドンを最適化した、日本産カブトガニのファクターB遺伝子のDNA配列
配列番号10:ペプチド配列
Claims (23)
- CHO DG44細胞を宿主細胞として用いて得られ、ファクターCの活性を有し、下記(A)または(B)に示すタンパク質である、
カブトガニのファクターC組換えタンパク質:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。 - (α−2,3)結合の末端シアル酸を有する、請求項1に記載のファクターC組換えタンパク質。
- 天然ファクターCに比べて(α−2,3)結合の末端シアル酸を多く有する、請求項2に記載のファクターC組換えタンパク質。
- Sf9を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターCに比べて(α−2,3)結合の末端シアル酸を多く有する、請求項2または3に記載のファクターC組換えタンパク質。
- 21mMのクエン酸ナトリウムの存在下で、10%以上の残存活性を示す、請求項1〜4のいずれか1項に記載のファクターC組換えタンパク質。
- 非還元SDS−PAGEで測定される分子量が115kDa〜140kDaである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のファクターC組換えタンパク質。
- 非還元SDS−PAGEで測定される分子量が127kDa±5kDaである、請求項6に記載のファクターC組換えタンパク質。
- 水溶性である、請求項1〜7のいずれか1項に記載のファクターC組換えタンパク質。
- カブトガニのファクターC組換えタンパク質を製造する方法であって、CHO DG44細胞を宿主細胞として用いて、下記(A)または(B)に示すカブトガニのファクター
C組換えタンパク質を発現することを含む、方法:
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2に示すアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ファクターCの活性を有するタンパク質。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載のファクターC組換えタンパク質を含む、エンドトキシン測定剤。
- さらに、カブトガニのファクターBおよびカブトガニのプロクロッティングエンザイムを含む、請求項10に記載の測定剤。
- 前記ファクターBが下記(E)または(F)に示すタンパク質であり、前記プロクロッティングエンザイムが下記(G)または(H)に示すタンパク質である、請求項11に記載の測定剤:
(E)配列番号6に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(F)配列番号6に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターBの活性を有するタンパク質;
(G)配列番号8に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(H)配列番号8に示すアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質。 - 請求項10〜12のいずれか1項に記載の測定剤を含む、エンドトキシン測定用キット。
- 請求項10〜13のいずれか1項に記載の測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシンを測定する方法。
- 前記被験試料が、イオンを含有する、請求項14に記載の方法。
- 前記被験試料が、カチオンを含有する、請求項14に記載の方法。
- 前記被験試料が、金属イオンを含有する、請求項14に記載の方法。
- 前記被験試料が、アルカリ金属イオンまたはアルカリ土類金属イオンを含有する、請求項14に記載の方法。
- 前記被験試料が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびマグネシウムイオンからなる群より選択される1種またはそれ以上のイオンを含有する、請求項14に記載の方法。
- 前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、1mM以上となるような量である、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記被験試料が、注射剤である、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
- カスケード反応の進行を検出するための基質を反応系に添加する工程を含む、請求項1
4〜21のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含む、請求項14〜22のいずれか1項に記載の方法。
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