JP2006087435A - 新規ポリペプチド及びそれをコードするdna - Google Patents
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Abstract
【解決手段】真菌の細胞壁の(1→3)−β−D−グルカンと強い親和性を有するカブトガニ・アメボサイト由来の(1→3)−β−Dグルカン感受性因子のaサブユニットのDNA及びアミノ酸配列を提供する。該ペプチドは、真菌の臨床診断、抗真菌剤と結合させた抗菌剤、あるいは真菌の除去剤として有用である。
【選択図】なし
Description
一方、このライセートは、真菌や酵母菌の細胞壁に存在する(1→3)−β−D−グルカンにも10−8〜10−9gのオーダーで反応し、ゲル化を引き起こすことが知られている(第1図参照)。この(1→3)−β−D−グルカンと相互作用し、ゲル化反応を開始させる因子として、G因子が存在する。G因子は他の因子と同様にセリンプロテアーゼ前駆体であり、72kDaのa subunit (サブユニット) と37kDa のb subunit(サブユニット) が非共有結合で結ばれた糖タンパク質であることが明らかにされている(1991年第64回日本生化学会にて発表) 。
また、G因子のaサブユニットには(1→3)−β−D−グルカンに特異的な結合部位が、さらにbサブユニットにはセリンプロテアーゼ領域が存在し、(1→3)−β−D−グルカンがaサブユニットに結合するとG因子が活性化されセリンプロテアーゼの機能を発現するものと考えられている。しかし、G因子の全構造は、まだ明らかにされていない。
中村隆範他、日本細菌学雑誌、38、781-803 (1983) T.Muta et al (1991) J.Biol. Chem.,266,6554-6561 T.Muta et al(1991) J.Biol.Chem.,265,22426-22433 T.Miyata et al(1986) J. Biochem.,100,213-220
本発明の課題は、G因子の(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチド及びそれをコードするDNAを提供することにある。
また、本発明の課題は、G因子のaサブユニットのポリペプチド及びそれをコードするDNAを提供することにある。
さらに、本発明の課題は、aサブユニットを含むG因子のポリペプチド及びそれをコードするDNAを提供することである。
また、本発明は、次のアミノ酸配列またはそれと相同性を有する配列で示されるポリペプチドをコードする一本鎖のDNA又は該DNAと相補的なDNAとからなる二本鎖のDNAおよび該アミノ酸配列で示されるポリペプチドに関する。
SerHisGluProLysTrpGlnLeuValTrpSerAspGluPheThrAsnGly
IleSerSerAspTrpGluPheGluMetGlyAsnGlyLeuAsnGlyTrpGly
AsnAsnGluLeuGlnTyrTyrArgArgGluAsnAlaGlnValGluGlyGly
LysLeuValIleThrAlaLysArgGluAspTyrAspGlyPheLysTyrThr
SerAlaArgLeuLysThrGlnPheAspLysSerTrpLysTyrGlyLysIle
GluAlaLysMetAlaIleProSerPheArgGlyValTrpValMetPheTrp
MetSerGlyAspAsnThrAsnTyrValArgTrpProSerSerGlyGluIle
AspPheIleGluHisArgAsnThrAsnAsnGluLysValArgGlyThrIle
HisTrpSerThrProAspGlyAlaHisAlaHisHisAsnArgGluSerAsn
ThrAsnGlyIleAspTyrHisIleTyrSerValGluTrpAsnSerSerIle
ValLysTrpPheValAsnGlyAsnGlnTyrPheGluValLysIleGlnGly
GlyValAsnGlyLysSerAlaPheArgAsnLysValPheValIleLeuAsn
MetAlaIleGlyGlyAsnTrpProGlyPheAspValAlaAspGluAlaPhe
ProAlaLysMetTyrIleAspTyrValArgValTyrGlnAspAlaSerThr
SerSerProValGlyAspThrSerLeuAspGlyTyrTyrPheValGlnAsn
ArgHisSerGluLeuTyrLeuAspValThrAspAlaSerAsnGluAspGly
AlaPheLeuGlnGlnTrpSerTyrSerGlyAsnGluAsnGlnGlnPheAsp
PheGluHisLeuGluAsnAsnValTyrLysIleThrAsnLysLysSerGly
LysSerLeuAspValTyrAsnPheGlyThrGluAsnGlyValArgIleGln
GlnTrpSerTyrGlyGlyAlaArgAsnGlnGlnPheThrValGlnSerVal
GlyAspGlyTyrTyrLysIleIleProArgGlySerGlyLysIleValGlu
ValAlaAspPheSerLysAspAlaGlyGlyLysIleGlnGlnTrpSerAsp
AsnAsnGlnLeuSerGlyGlnTrpLysLeuIleLysSerLysSerTyrSer
LysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeuGlu
AspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGluGly
AlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyrArg
IleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeuAsp
LeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThrGly
GlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSerGly
ThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsnTrp
IleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArgArg
AsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluValGln
LeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspLys
GluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlySer
TyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSer
LeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIleProSer
ThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnValAsp
LeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsnIle
AsnTrpIleArgIleThrLysVal
現在までに4種のカブトガニが知られているが、その4種において、アメボサイトの成分であるコアギュローゲンの機能発現に必要な構造部分は互いに非常に類似している(73〜99%)。このことより、本発明のポリペプチドも4種のカブトガニ間でアミノ酸配列がコアギュローゲンの場合と同程度に類似していることが予測される。
すなわち、ポリペプチド間に相同性がある場合、アミノ酸配列は同一ではないにもかかわらず、その類似のアミノ酸配列により、同一あるいは類似した機能を発現する。したがって、上記に示されたアミノ酸配列そのものだけでなく、それと相同性を有するアミノ酸配列も本発明に包含されることは当業者にも容易に理解されるところである。
まずG因子は、カブトガニ血球抽出液より種々のカラムクロマトグラフィーの操作、例えばデキストラン硫酸−セファロース CL-6B(Dextran sulfate-Sepharose CL-6B)およびコンカナバリンA−セファロース 4B(Con A-Sepharose 4B)によるアフィニティークロマトグラフィー、さらにセファクリル(Sephacryl) S-200HR によるゲル濾過クロマトグラフィーにより精製することができる(T.Morita etal(1981)FEBS Lett.,129(2),318-321、特公平3-399 号公報)。さらに、G因子を構成するaサブユニットおよびbサブユニットは、G因子を変性剤(界面活性剤等)により変性し、分子篩を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分画することにより得ることができる。各々のサブユニットの部分アミノ酸配列は、それぞれのサブユニットを還元・アルキル化後、酵素消化することにより得られるペプチド断片のアミノ酸配列をペプチドシークエンサー等を用いて決定することにより得ることができる。また、カブトガニ血球より単離した poly(A)+ RNAより作製したcDNAライブラリーから前述した各々のサブユニットの部分アミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドまたは各々のサブユニットに対する抗体等を用いることによりそれぞれのサブユニットをコードするcDNAを単離し、それらの塩基配列をダイデオキシチェインターミネーション法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74,5463-5467 (1977) Sanger, F. et al.) 等により決定することができる。また、このように決定された塩基配列と上記部分アミノ酸配列を基に各サブユニットのアミノ酸配列を決定することができる。
以上の方法によって、配列番号1で示されるG因子のaサブユニットであるポリペプチドをコードするDNA(AGC ・・・・・・GTG;塩基番号114〜2075)およびそれに対応するアミノ酸配列(Ser ・・・・Val;アミノ酸番号1〜654)を明らかにした。
また、G因子のaサブユニットは、そのアミノ酸配列よりドメイン構造を有していることを明らかにした。
すなわち、aサブユニットのアミノ末端側(Pro ・・・・Ala;アミノ酸番号4〜236)にはβ−1,3−グルカナーゼのカルボキシル末端側の配列と類似した配列をもつグルカナーゼドメインが存在した(第2図)。一方、カルボキシル末端側には 126個のアミノ酸から構成される繰り返し構造(Ser ・・・・Ile;アミノ酸番号391〜516及び Ser・・・・Val ;アミノ酸番号529〜654)が存在し、またこの配列はキシラナーゼZのアミノ末端側の配列と類似していた(第3図)。さらに、これらのグルカナーゼドメインとキシラナーゼドメインとの間には”QQWS(Gln-Gln-Trp-Ser)”モチーフを含み、さらにキシラナーゼAの配列と類似した配列が三回繰り返して存在した(Leu ・・・・ Leu;アミノ酸番号247〜293、Glu ・・・・Val;アミノ酸番号294〜340及びGly ・・・・Ser;アミノ酸番号341〜387)(第4図)。
なお、第2図〜第4図においては各アミノ酸を1文字表記で表わした。
本発明では、これらのペプチドをコードするDNAを含む組換えDNAベクターを調製し、これを宿主に組み込み、培養あるいは飼育する、いわゆる遺伝子工学的手法によって、これらのペプチドを産生採取することができる。
以下、本発明の具体的実施例を説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
(1)血球抽出液の調製
カブトガニ(Tachypleus tridentatus) の血球 113gに0.02Mトリス−塩酸緩衝液, pH8.0 (50mM 塩化ナトリウム含有)400mlを加え、高速ホモジナイザー (商品名、ヒスコトロン、日本精密工業(株))で3分間ホモジナイズした後、8000rpm 、30分間遠心し、上清を得た。さらに、遠心の際に生じた沈澱物に同一緩衝液300 mlを加え、前記操作と同様、ホモジナイズと遠心を行い再び上清を得た。この沈澱物に同一緩衝液を加えて遠心し、上清を回収する操作を、さらに2回繰り返し、遠心操作で得られた全ての上清を集め、1250mlの血球抽出液を得た。
(2)血球抽出液からのG因子の精製方法
a. デキストラン硫酸−セファロース CL-6Bカラムクロマトグラフィー
前記抽出液1250mlを、あらかじめ抽出用緩衝液で平衡化したデキストラン硫酸−セファロース CL-6Bカラム(5X17.8cm)(調製法は特公平3-399 号公報の調製例2参照)に添加し、充分に同緩衝液で洗浄した後、0.02Mトリス−塩酸緩衝液,pH8.0 (0.15M塩化ナトリウム含有) でカラムに吸着した余分なタンパク質を洗い流した。次いで、0.02Mトリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.25M塩化ナトリウム含有) でカラムに吸着したタンパク質を溶出し、G因子画分を得た。
b. コンカナバリンA−セファロース 4Bカラムクロマトグラフィー
前記のG因子画分を、あらかじめ0.02M トリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.25M塩化ナトリウム含有)で平衡化したCon A-Sepharose4Bカラム(ファルマシアバイオテク(株))(2X16cm)に添加し、平衡化緩衝液で充分に洗浄した後、0.02M トリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.5M塩化ナトリウム含有) で再度カラムを充分に洗浄した。洗浄後、0.02M トリス−塩酸緩衝液,pH8.0(0.5M塩化ナトリウム、0.5Mメチル−α−D−グルコシド含有)でカラムに吸着したタンパク質を溶出し、G因子画分を得た。
c.セファクリル S-200 HRカラムクロマトグラフィー
前記のG因子画分を限外濾過により濃縮した後、あらかじめ0.05M リン酸ナトリウム緩衝液,pH6.5 で平衡化したSephacrylS-200HR カラム(ファルマシアバイオテク(株)) (2.7X98cm)に添加し、同緩衝液でタンパク質を溶出した。このクロマトグラフィーで最後に溶出され、280 nmの波長でわずかな吸収しか示さないタンパク質の画分を集めた。このようにして得られたタンパク質をG因子の最終精製標品とした。最終的に 113gの血球より、牛血清アルブミン換算で約 300μgのG因子を得た。
(1)G因子のaサブユニットとbサブユニットの分離
G因子のaサブユニットとbサブユニットのcDNAクローニングを行うために必要なG因子のa、bサブユニットの部分アミノ酸配列を明らかにするため、まずG因子のaサブユニットとbサブユニットを分離した。前記1で得られたG因子を脱塩と濃縮とを兼ねて、メタノールとクロロホルムを用いて沈澱させた後(Methods in Enzymology vol.182, p78-79, (1990)) 、2%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)溶液に溶解し、100 ℃で5分間加熱した。この加熱した試料を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.0 (0.1%SDSを含む)を移動相として用いた、二本を連結したTSKgel G3000SWによるゲル濾過に付すことにより、G因子のa、bサブユニットを分離した。
(2)G因子のaサブユニットの酵素消化
前記2(1)で得られたG因子のaサブユニットの画分に終濃度で17.4%(W/V)になるようにトリクロロ酢酸(TCA)を加えてG因子のaサブユニットを沈澱させた。Paul Matsudaira の方法 (A Practical Guide to Protein and Peptide Purifica-tion for Microsequencing, p42-43 ,1989, Academic Press,Inc.発行)に従い、沈澱させたG因子のaサブユニットを0.4M重炭酸アンモニウム(8M尿素を含む)に溶解し、ヨードアセトアミドを用いて還元アルキル化を行い、次いで水を加えて尿素濃度を4Mに希釈した後、酵素−基質重量比1:60のリシルエンドペプチダーゼ(lysyl endopeptidase,和光純薬工業(株)) を加え37℃で20時間酵素消化した。この消化物をあらかじめ0.06%(V/V) トリフルオロ酢酸で平衡化したμBondasphere 5μC8-300Å(2.1X150mm) (ウォーターズ社) に添加し、充分にカラムを洗浄した後、5分後に0%(V/V)、65分後に24%(V/V) 、125分後に56%(V/V) 、135分後に80%(V/V) までアセトニトリル濃度を連続的に上昇させた直線的濃度勾配法を用いて、 0.2ml/min の流速で吸着したタンパク質を溶出した。この際溶出される各ペプチドは210nm の紫外部吸収でモニターし、全て分取した。
(3)部分アミノ酸配列の決定
得られた各ペプチドのアミノ酸配列を気相シークエンサー477A(アプライド バイオシステムズ ジャパン(株))を用いて決定した。この結果を第1表に示す。
第1表の決定したアミノ酸配列の中から、2種のアミノ酸配列A:-Glu-Asp-Tyr-Asp-Gly-Phe- 、B:-Trp-Val-Met-Phe-Trp-Met- を利用して、A をセンスに、B をアンチセンスに逆翻訳し、さらに 5′末端側に制限酵素認識配列とDNA の保護のための2塩基を付けた以下に示す様なそれぞれ25個と26個のオリゴヌクレオチドの混合物をDNAシンセサイザー380A(アプライド バイオシステムズ ジャパン(株))を用いて合成した。
G因子はカブトガニ血球より精製されることから、 poly(A)+ RNA はカブトガニ血球より単離した。
(1)全RNAの調製
カブトガニ血球11.8gよりAGPC法 (実験医学Vol.9, p1937〜1940を参照) を用いて、全RNA 約11mgを分離した。
(2) poly(A)+ RNA の調製
分離した全RNA のうち約2mg の全RNA よりOligotex-dT 30 Superキット(日本ロシュ(株))を用いて poly(A)+ RNA を単離した。さらに、一度単離した poly(A)+ RNA は、より純度を高めるために、同様の操作をもう一度繰り返した。このように2度のOligotex-dT 30 Superキットの操作により、2 mgの全RNA から34.5μgの高純度の poly(A)+ RNA を得た。
(1)cDNAの合成
前記4で得た poly(A)+ RNA 34.5μgのうち 5μgの poly(A) + RNA からアマシャム社のcDNA synthesisキットを利用し、cDNAを合成した。
(2)cDNAライブラリーの作製
(1)で合成したcDNAからアマシャム社のcDNAクローニングシステムλgt10アダプター法を利用し、カブトガニ血球cDNAライブラリーを作製した。
前記4(2)で得られた poly(A)+ RNA を鋳型とし、さらに前記3で合成したオリゴヌクレオチドを用いて、PCR 法(Saiki,R.K. et al, Science, 239,487-491,1988)を行いG因子のaサブユニットの一部をコードするcDNAフラグメントを増幅した。このcDNAフラグメントをマルチプライム-DNAラベリングキット (日本ジーン(株))を利用して[ α−32P]dCTP でラベルしたものをプローブとして、前記5.(2)で作製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、長さが最も長い約2,400bp のインサートcDNAを含む二つのポジティブクローンを得た。これらのクローンのインサートcDNAは、5'末端側と3'末端側の長さが数塩基異なることを除けば、全く同一であった。また両者の塩基配列を決定し、それらを複合した塩基配列は、開始コドンと poly(A)+ tailを含み、2,408bpの大きさを示した。
上記6.で得られたインサートcDNAをpUC118ベクター及びpBluescript II SK ベクターに組み込んだ。pUC118ベクター及びpBluescript II SK ベクターにクローニングしたcDNAの全塩基配列を決定するために、cDNA断片上の制限酵素認識部位ならびにキロ−シークエンスデレーションキット(宝酒造(株))を用いたデレーションによるサブクローニングを行った。上記方法により作製したクローン中のcDNAの塩基配列を螢光ラベルしたヌクレオチドプライマーを使用したDNA シークエンサー370A(アプライド バイオシステムズ ジャパン(株))(Smith, L. M. et al(1986) Nature 321, 674-679)を用いて決定した。
このように決定したG因子のaサブユニットのcDNAの塩基配列、ならびにそれより明らかにされたアミノ酸配列を配列番号1の配列表に示した。このアミノ酸配列中に、2(3)で決定した部分アミノ酸配列(第1表)が全て含まれており、今回塩基配列を決定したインサートcDNAはG因子のaサブユニットを確かにコードしていた。
上記で得られたクローンからG因子のaサブユニットをコードする遺伝子の全部あるいは一部を超音波処理、制限酵素処理またはこの技術分野において知られた他の方法により切り出し、適当なベクターに組み込む。ベクターとしては宿主微生物体内あるいは細胞内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み替え用として構築されたもの、つまり適当なプロモーター、SD配列、翻訳開始コドンATG、あるいはさらに適当な構造遺伝子を含むようなものが適している。この構築したベクターを適当な宿主生物または細胞に移入することに、より形質転換体を得ることができる。宿主としては、種々の大腸菌株、種々の酵母菌株、ハツカネズミ、ラット、チャイニーズハムスター等の動物の卵母細胞(CHO)のような動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動植物昆虫宿主等である。このようにして得られた形質転換体を栄養培地で培養することにより、あるいは栄養食で飼育することにより多量のG因子またはそのサブユニット(以下、G因子等という)を安定して生産することができる。形質転換体の培養あるいは飼育条件は、G因子等を生産する範囲で適宜変更可能であるが、用いた宿主が生育し、この技術分野において一般に知られている条件を用いるとよい。培養物中のあるいは飼育物中のG因子等は、菌体あるいは細胞を含む培養液あるいは個体を適当な機械的な方法で破砕した抽出液をそのまま採取し、利用することもできる。しかし、一般には常法に従って、G因子等が培養液中あるいは抽出液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などによりG因子等含有溶液と菌体、細胞あるいは個体の破砕破片とを分離した後に利用される。G因子等が菌体内、細胞内あるいは個体の臓器膜内に存在する場合には、得られた培養物あるいは破片を濾過または遠心分離などの手段により、菌体、細胞あるいは破片を採取し、次いでこの物を機械的方法または超音波処理またはリゾチーム等の酵素的方法またはEDTA等のキレート剤および/または界面活性剤を添加してG因子等を可溶化して分離採取する。このようにして得られたG因子等含有溶液からのG因子等の単離は、通常知られているタンパク質の精製方法に従うことにより可能である。
この際、G因子等をキメラポリペプチドとして発現していれば、他方のタンパク質の性質を利用して容易に単離することが可能である。例えば他方のタンパク質のある物との親和性を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより容易に単離することが可能である。
実際にG因子aサブユニットは、次のような方法で発現できる。
5’−AGCCACGAACCAAAGTGGCA−3’の配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、さらに5’末端をリン酸化する。次いでこのオリゴヌクレオチドをG因子のaサブユニットをコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドより調製した一本鎖DNAとハイブリダイズし、Klenow fragment などのDNAポリメラーゼによる伸長反応を行い、この際生じる一本鎖部分を Mung bean nucleaseなどのDNAヌクレアーゼで切断し、二本鎖DNAとする。この二本鎖DNAをSph I制限酵素で切断し、この際生じる接着末端はT4 DNAポリメラーゼあるいはKlenow fragmentあるいはBluntingキットにより平滑化する。この二本鎖DNAをあらかじめNco I制限酵素で切断し、この際生じる接着末端はT4 DNAポリメラーゼあるいはKlenow fragmentあるいはBluntingキットにより平滑化したpTV118N(アンピシリン耐性遺伝子を含む)に組み込んだ。このプラスミドをE.coli JM109あるいはE.coli MV1184に導入し、形質転換体を得る。この際、必要な形質転換体はプラスミドの性質を利用した一般的な方法で選択することができる。すなわち、アンピシリンを含むLBプレート(5−ブロモ−4−クロロ−3−3インドリル−β−D−ガラクトシド(X−gal)/イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)をあらかじめ塗布したもの)上で培養し、目的のプラスミドの導入された白色コロニーを拾い上げて選択する。さらに正しい配列をもつプラスミドは、5’−AAACAGACCATGAGCCACGAACCA−3’の合成オリゴヌクレオチドをプローブとしてスクリーニングして得ることができる。さらにRV−Nプライマー(宝酒造(株))をシークエンシングプライマーとして用いたDNAシークエンシングにより正しくプラスミドが構築されたことをさらに確認することができる。正しい配列をもつプラスミドが導入されたE.coli JM109あるいはMV1184を100μg/ml アンピシリンと1mM IPTGを含む3%Nutrient broth(日水製薬(株))にて30℃、24時間培養する。この培養上清あるいは菌体抽出液より、一般的に用いられている方法によりG因子のaサブユニットを精製する。このとき抗体あるいはG因子のaサブユニットに親和性をもつリガンドなどを用いたアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、より簡単に精製することが可能である。
(1)G因子bサブユニットの単離
実施例1の2.(1)でG因子をaサブユニットとbサブユニットに分離することにより、bサブユニットも同様に得た。
(2)G因子のbサブユニットの酵素消化
前記(1)で得られたG因子のbサブユニットから実施例1の2.(2)と同じ方法でペプチド断片を得た。
(3)部分アミノ酸配列の決定
得られた各ペプチドのアミノ酸配列を実施例1の2.(3)と同様に決定した。この結果を第2表に示す。
決定したアミノ酸配列の中から、2種のアミノ酸配列C:-Asn-Glu-Gln-Cys-(Asn)-Lys、D:-Met-Tyr-Gln-Asn-Pro-Thr-の配列を利用して、CをセンスにDをアンチセンスに逆翻訳し、実施例1の3.と同様の方法で以下に示す様なそれぞれ25個のオリゴヌクレオチドC’およびD’の混合物を合成した。前記C中-(Asn)- は、Asnと推定したことを示す。
実施例1の4.(2)で得られた poly(A)+ RNA を鋳型とし、
さらに前記2で合成したオリゴヌクレオチドを用いて、以下実施例1の6.と同様の方法で実験を行い、1,979bpのcDNAを含むポジティブクローンを得た。このクローンのインサートcDNAの塩基配列を解析したところ、前記1.(2)で得られたG因子のbサブユニット由来のペプチドのアミノ酸配列に相当する塩基配列を含んでおり、さらに poly A付加シグナルが存在し、またその大きさからこのクローンは全長のcDNAであると思われる。
G因子のbサブユニットのcDNAの塩基配列は、実施例1の7.と同様の方法で決定した。このように検討した結果、明らかになったG因子のbサブユニットのcDNAの塩基配列ならびにそれより明らかにされたG因子のbサブユニットのアミノ酸配列を配列番号2の配列表に示した。
このアミノ酸配列中に実施例2の1(3)で決定した部分アミノ酸配列(表2)が全て含まれていることから、今回塩基配列を決定したインサートcDNAはG因子のbサブユニットを確かにコードしていた。
実施例2で採取したポリペプチドをコードするcDNAを含む組み換えDNAベクターを複製可能な宿主微生物、適当な動物細胞、昆虫あるいは昆虫細胞に移入した後、ベクターのマーカーと(1→3)−β−D−グルカン結合能とを指標としてスクリーニングして取得した、該組み換えDNAベクターを保持する微生物、動物細胞、昆虫あるいは昆虫細胞を培養あるいは飼育し、本発明のポリペプチドを採取することができる。
その結果、この配列中に(1→3)−β−D−グルカン結合部位の配列が含まれており、これらのcDNAを用いて遺伝子工学的手法によりその結合部位に相当するポリペプチドを得ることができる。得られるポリペプチドは、次の種々の効果を示す。
(1)近年、免疫不全患者の増加、高齢化に伴って、カンジダ、
アスペルギルス等のように通常病原性の弱い二次病原体による日和見真菌感染が目立って増加している。しかし特に真菌による内臓等の深在性真菌症は一部の特殊な病型を除いては侵襲的な手段によらない限り臨床診断が困難であり、そのため剖検後初めて診断されることが多い(微生物学辞典、1989年、技報堂)。
上記深在性真菌症の診断は、該(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドまたは(1→3)−β−D−グルカンを放射性同位元素、酵素、螢光物質、発光物質などの標識物質を用いてラベル化したものを用いてリガンドーレセプター・アッセイ法によって(1→3)−β−D−グルカンを測定することによって行うことができる。また、該ポリペプチドをマイクロプレート、試験管、ビーズなどの固相に結合して(1→3)−β−D−グルカンを特異的に捕捉して検出する方法等の測定法によることもできる。このような測定法より体液中の真菌由来の(1→3)−β−D−グルカンを特異的に測定し、深在性真菌症の診断を簡便かつ迅速に行うことができる。
(2)また、(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドに抗真菌剤を結合させた医薬は病巣に強い親和性を有し、(1→3)−β−D−グルカンが細胞壁に存在する病巣の真菌を特異的に殺菌する新たな選択的抗真菌剤となりうる。
(3)さらに、近年の遺伝子操作技術の発達に伴い、目的タンパク質を発現する際に目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターの宿主として、酵母菌が繁用されている。これは、糖タンパク質の生産が可能で、細菌と同じく大量培養が可能であるためである。しかし、問題点として、生産物中に極微量の(1→3)−β−D−グルカンを構成成分として持つ酵母菌の残渣が含まれることが多く、その定量及び除去が必要となる。この場合に、(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドを支持体に結合したアフィニティー担体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、特異的に酵母菌の残渣の除去、あるいは定量を行うことができ、また除去後の生産物に酵母菌菌体成分が存在しないことの確認も、(1)に述べたような(1→3)−β−D−グルカン結合部位を含むポリペプチドを用いた定量法を行うことによって、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いた場合に比べてより簡便で特異性の高い確認が可能となる。
Claims (1)
- 次のアミノ酸配列で示されるキシラナーゼドメインであるポリペプチド(配列表1のアミノ酸番号391−654)を用いる(1→3)−β−D−グルカンの測定方法。
SerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheAspSerSerLysValGlnLeu
GluAspThrSerAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAspAsnGlu
GlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGlyAsnTyr
ArgIleGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeuSerLeu
AspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspValProSerThr
GlyGlyTrpGlnLysTrpThrThrIleSerHisThrValAsnValAspSer
GlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnArgAlaSerTrpAsnIleAsn
TrpIleLysIleThrLysIleProGluGlnSerAsnLeuAsnGlnGlyArg
ArgAsnSerLysLeuIleGlnAlaGluSerTyrPheSerTyrSerGluVal
GlnLeuGluAspThrLeuAspValGlyGlyGlyLysAsnValLysCysAsp
LysGluGlyAlaTrpMetAlaTyrLysAspIleAspPheProSerSerGly
SerTyrArgValGluTyrArgValAlaSerGluArgAlaGlyGlyLysLeu
SerLeuAspLeuAsnAlaGlySerIleValLeuGlyMetLeuAspIlePro
SerThrGlyGlyLeuGlnLysTrpThrThrIleSerHisIleValAsnVal
AspLeuGlyThrTyrAsnLeuGlyIleTyrValGlnLysAlaSerTrpAsn
IleAsnTrpIleArgIleThrLysVal
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