KR102030364B1 - 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 결핍 세포주로부터 제조된 인공항원제시세포 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 결핍 세포주로부터 제조된 인공항원제시세포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 생산된 HLA-A,-B,-C 결핍 세포주에서 도입된 HLA 클래스 I 및 보조자극분자군의 항원제시능력과 T 세포 자극능력을 포함하는 새로운 인공항원제시세포와, 이를 이용한 면역치료제, 종양, 병원체 감염, 자가면역질환 치료적 용도를 제공한다.

Description

멀티플렉스 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 HLA 결핍 세포주로부터 제조된 인공항원제시세포 및 이의 용도{Artificial antigen presentation cell derived from HLA deficient cell lines by using multiplex CRISPR-Cas9 system, and use thereof}
본 발명은 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 생산된 HLA-A,-B,-C 결핍 세포주에서 도입된 HLA 클래스 I 및 보조자극분자군의 항원제시능력과 T 세포 자극능력을 포함하는 새로운 인공항원제시세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간 백혈구 항원(HLA)은 인간의 주 조직적합성 복합체로서 가장 중요한 면역학적 분자이다. 이것의 주된 두 가지 세트는 CD8+T 세포에 항원을 제시하는 HLA 클래스 I(HLA-A,-B,-C)과 CD4+T 세포에 항원을 제시하는 HLA 클래스 II(HLA-DR,-DP,-DQ)로 이루어진다. HLA 분자에서 높은 수준의 다형성능이 밝혀졌는데, 이는 유니크한 펩타이드를 제시하거나 동종반응성 면역반응을 일으킬 수 있게 한다. 또한, HLA 대립유전자들의 불일치는 기관이식 시 이식거부를 일으키거나 조혈모세포이식 시 이식편대숙주질환을 일으킬 수 있다.
이식과 세포치료의 많은 제한점을 극복하기 위해, HLA 발현을 조정하기 위한 많은 연구들이 이루어져 왔다. HLA의 조정은 백혈병 세포주와 γ-선으로 돌연변이를 유발하고 체세포 혼성화를 시킨 림포블라스토이드 세포주(LCL)를 이용하여 연구되어 왔다. 이러한 HLA 결핍 세포주들은 특정 HLA 분자의 구조와 기능에 대한 확실한 연구와 효율적인 적응세포치료를 위한 인공항원제시세포의 기반 세포로써 이용되어 왔다. 특히 인공항원제시세포는 초파리, 마우스, 그리고 인간 백혈병 세포주에 HLA와 보조자극분자들의 유전자를 전달하므로 발전되어 왔다.
유전적 조절 기술들이 발전함에 따라 HLA 조절에 대해 많은 연구가 보고되었다. 숏 헤어핀 RNA(shRNA)를 이용하여 Jurkat, T 세포, HeLa, B-LCL, 293T 세포, 조혈모세포, 인간 배아줄기세포주, 인간 제대혈 유래 내피세포 등 다양한 세포들에서 HLA 발현을 낮게 조절하였다. 이러한 보고들에선 특정 HLA 대립유전자를 표적하거나 HLA 클래스 I 분자의 이종이량체인 베타-2-마이크로글로블린을 표적하므로 HLA 사일런싱을 증명하였다. 그리고 그들은 각각 동종 이식 거부의 우회, 세포치료, 혈소판 수혈 관리 등에 대한 활용을 제안하였다. loxP/Cre 시스템 역시 HLA 음성 배아줄기세포주를 위한 B2M 제거에 이용되었다.
최근에는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFNs), CRISPR/Cas9 시스템 등 유전자 편집 도구를 이용한 HLA 조정이 보고되고 있다. 특히 CRISPR/Cas9 시스템은 다중 유전자 편집에 적합한 유전자 편집 기술이다. 게다가, CRISPR/Cas9 시스템은 다중 가이드 RNAs(gRNAs)를 이용하여 큰 결실을 유도할 수 있다. ZFN는 HLA-A 유전자를 제거하는데 사용되었다. 그리고 CRISPR/Cas9 시스템은 B2M 유전자를 제거하는데 사용되었고, HLA 클래스 II 발현을 조절하기 위해 클래스 II 트렌스엑티베이터(CllTA)를 제거하였다.
본 발명은 HEK 293T 세포에 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 HLA 클래스 I 유전자들의 엑손 2와 엑손 3 사이의 큰 결실을 유도하여, HLA 클래스 I 유전자를 완전히 제거하고, 이 HLA 클래스 I 결핍-293T 세포주에 단일 HLA 유전자와 보조자극분자군의 유전자를 전이하여 인공항원제시세포로 활용할 수 있는지를 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
Bodmer, W. F. J Clin Pathol 40, 948-958 (1987) Neefjes, J. et al. Nat Rev Immunol 11, 823-836, doi:10.1038/nri3084 (2011) Shimizu, Y. & DeMars, R. J Immunol 142, 3320-3328 (1989) Sander, J. D. & Joung, J. K. Nat Biotechnol 32, 347-355, doi:10.1038/nbt.2842 (2014)
본 발명의 목적은 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 HLA 결핍 세포주를 확립하고, HLA 유전자 및 보조자극분자군을 도입하여 인공항원제시세포로 사용하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인공항원제시세포의 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HLA(human leukocyte antigen)-A, -B 및 C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 분자; 및 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70을 포함하는 보조자극분자군(costimulatory molecule group)를 발현하고, HLA(human leukocyte antigen) 결핍 293T 세포주에서 유래한, 인공항원제시세포(Artificial antigen presentation cell)를 제공한다.
본 발명은 또한 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포를 포함하는 면역치료제를 제공한다.
본 발명은 또한 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 예방용 백신을 제공한다.
본 발명은 또한 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약학적 유효량의 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포를 함유하는 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포와, CD4+T 세포, CD8+T 세포 또는 γδT 세포 중 어느 하나의 T 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 세포 독성 T 세포의 인 비트로 증식 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 세포주에서 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 HLA-A,-B,-C 유전자를 유전체 상에서 완전히 제거하여 HLA 클래스 I 결핍 세포주를 확립하고, 특정 HLA 및 다양한 보조자극분자들을 발현시켜 항원제시능력과 T 세포자극능력을 가진 인공항원제시세포를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 HLA 클래스 I 결핍 HEK 293T 세포주 확립의 도식적 요약도를 나타낸다.
도 2는 표적 특이 PCR과 전기영동을 이용한 단일세포 클론들의 돌연변이 빈도분석결과(n=188)로, A는 표적 특이 PCR과 전기영동을 이용한 각 클론의 유전형 분석 결과(굵은 화살표는 야생형 293T 대조군의 PCR 산물, 점선 화살표는 설계한 가이드 RNA에 의한 엑손 2와 3 사이에 예상된 삭제된 PCR 산물), B는 총 클론에 대한 각 HLA 클래스 I 유전자 부위의 돌연변이 분포이다(full length: 야생형 293T 산물 크기와 유사한 것; deletion: 야생형 293T 산물 크기보다 짧은 것; insertion: 야생형 293T 산물 크기보다 긴 것; unamplified: 밴드가 없거나 비특이적인 다중밴드인 것. 상기 데이터는 HLA 클래스 I 대립 유전자위치(locus)에 따라 백분율로 변환함).
도 3은 클론들의 유전형, 발현도 및 서열 분석 결과를 나타내고, A는 단일세포 클론들의 수를 DCP의 위치와 유전형에 따라서 분류한 결과이고, B는 개별 클론에서의 유전형과 HLA 클래스 I의 발현도의 상관관계이고(동형 클론들만을 선별하고 HLA 클래스 I 대립유전자의 DCP 수에 따라 분류함. t-test를 통해 야생형 군과 각 돌연변이 군 간의 유의성을 분석함, ***: p<0.0001), C는 선별된 HLA 클래스 I 결핍 클론(25, 41, 45)의 생거 시퀀싱 결과이다(N: 표적 gRNA 서열, 역삼각형: 절단 부위, 점: 제거된 서열).
도 4는 렌티바이러스 형질도입 및 ELISPOT 분석을 이용한 HLA 클래스 I 결핍 세포주에서 HLA 클래스 I 분자의 제거 및 복원에 대한 기능적 검사 결과를 나타내고, A는 4종류의 HLA 클래스 I 분자(HLA-A*02:01, A*02:06, B*07:02, B*40:06)가 도입된 null-293T(H1E-45) 세포주와 야생형 293T 세포에서 HLA 클래스 I 분자의 발현을 분석한 유동세포 분석법 결과이고, B는 개별적인 HLA 일치 기증자들의 CMV pp65 전체 항원에 대한 면역반응결과이다(n=8).
도 5는 HLA-A*02:01-293T(H1E-45)-Cos 자극에 의한 MART-1 특이 세포독성 T 세포의 생산 결과를 나타내고(n=3), A는 A*02:01-293T(H1E-45)-Cos 세포주에서 HLA-A*02:01, CD32와 보조자극분자들(CD80, CD83, CD137L, CD54, 및 CD70)의 발현을 분석한 유동세포 분석법 결과이고, B는 0, 13, 19일째 5×104의 개별적인 MART-1 특이 세포독성 T 세포의 IFN-γ 스팟 수(펩타이드 자극 없이)이고, C는 0, 13, 19일째 5×104의 개별적인 MART-1 특이 세포독성 T 세포에 대하여 펩타이드가 없는 웰(w/o)과 있는 웰(w/p)의 ELISPOT 플레이트 사진도이다.
도 6a는 293T 세포를 기반으로 한 인공항원제시세포의 HLA 및 보조자극분자의 발현도 측정 결과이고[293T-Cos(+CD54): CD80, CD32, CD83, CD137L 및 CD54를 발현하는 인공항원제시세포, 293T-Cos(+CD54, +CD70): CD80, CD32, CD83, CD137L, CD54 및 CD70을 발현하는 인공항원제시세포], 도 6b는 null-293T(H1E-45) 세포주를 기반으로 한 인공항원제시세포의 HLA 및 보조자극분자의 발현도 측정 결과이다.
도 7은 293T-Cos(+CD54 +CD70) 자극에 의한 pp65 특이 세포독성 T 세포의 생산 결과를 나타내며(n=1), A는 0, 7, 13일째 pp65 특이 세포독성 T 세포의 증식, B는 13일째 pp65 특이 세포독성 T 세포에서 pp65495 사량체 염색 결과, C는 13일째 1×105, 5×104, 1×104의 pp65 특이 세포독성 T 세포에 대하여 펩타이드가 없는 웰(w/o)과 있는 웰(w/p)의 ELISPOT 플레이트 사진도이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 HLA(human leukocyte antigen)-A, -B 및 C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 분자; 및 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70을 포함하는 보조자극분자군(costimulatory molecule group)를 발현하고, HLA(human leukocyte antigen) 결핍 293T 세포주에서 유래한, 인공항원제시세포(Artificial antigen presentation cell)에 관한 것이다.
본 발명은 기존의 항원제시세포, 예컨대 수지상세포가 사람 말초혈액세포에서 소량 존재하고, 임상 적용을 위해 다량의 세포를 얻기 어려운 단점을 해소하기 대안으로 자기조직 유래의 항원제시세포의 기능을 수행하면서, 항원 특이적인 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있도록 제작된 HLA 분자 및 보조자극분자군을 발현하는 인공항원제시세포를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서, 용어 "인공항원제시세포(artificial antigen presenting cell, 또는 aAPC)"는 인공적으로 제작된 항원제시세포를 의미하며, 면역분자를 발현하도록 개질된 비면역세포이다. MHC 클래스 I 또는 II(MHC I 또는 II) 분자를 단독으로 또는 다른 부속분자(보조자극분자 및/또는 접착 분자)와 함께 발현하는 aAPC는 생체 내에서 종양세포 또는 섬유아세포 세포주와 같은 쉽게 배양될 수 있는 T 세포 활성화 세포의 다양한 측면을 연구하는데 사용된다. 본 발명의 목적상, HLA 클래스 I 및 II 분자를 발현하지 않는 세포에 HLA 분자와 보조자극분자군을 코딩하는 핵산이 주입된 세포를 의미한다. 바람직하게는, CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLA-A, -B 또는 C 유전자가 유전체 상에서 제거된 HLA 결핍 293T 세포주에 HLA 분자; 및 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70을 포함하는 보조자극분자군을 코딩하는 핵산이 주입된 세포를 의미하나, 이로써 제한되는 것은 아니다.
용어, "보조자극분자(costimulatory molecule)"는 항원제시세포의 표면에 발현된 수용체-리간드 쌍과 T 세포 간의 상호작용에 참여하는 물질로, 사이토카인 유전자 발현과 증식 유도를 위해서는 휴지기 T 세포에 2 이상의 신호가 필요하며, 한 가지 신호는 특이성을 부여하는 신호로 MHC/펩타이드 복합체와 TCR/CD3 복합체의 상호작용에 의해 생성되며, 두 번째 신호는 항원 비특이적이고, "보조자극성" 신호라 한다. 이 신호는 대식세포 및 수지상세포 등 골수 유래 보조 세포에 의해 제공되는 활성으로 알려져 있다. 보조자극분자는 정상적인 생리 조건하에서 필요한 보조자극 신호를 매개하여 CD8+T 세포의 완전한 활성화를 수행한다. 본 발명에서는 이러한 보조자극분자로 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70의 조합을 사용한다.
상기 인공항원제시세포는 CRISPR-Cas9 시스템을 통해 HLA-A, -B, 및 -C 각각의 엑손 2와 3 사이를 결실시켜 HLA 유전자가 유전체 상에서 완전히 제거한 HLA 결핍 293T 세포주를 확립하고, 상기 세포주에 도입하고자 하는 HLA 분자와 보조자극분자군을 코딩하는 핵산을 삽입시켜 제조할 수 있다.
상기의 RNA 유전자 가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas9는 표적 넉-아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 표적팅한다.
상기 HLA 결핍 293T 세포주 확립을 위해 HLA-A, -B, 또는 -C 유전자의 엑손 2 및 3의 표적 서열을 포함하는 sgRNA를 발현하는 플라스미드; 및 Cas9 단백질을 발현하는 플라스미드를 293T 세포에 형질주입하고, 상기 표적 서열을 포함하는 sgRNA에 의해 표적 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성하며, Cas9 단백질에 의한 표적 DNA의 절단을 통해 HLA-A, -B 또는 -C의 엑손 2와 3 사이가 결실될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 각 HLA 클래스 I 대립유전자의 엑손 2와 엑손 3 사이에 큰 결실을 유도하기 위해 6개의 gRNA-Cas9 플라스미드(AE2, AE3, BE2, BE3, CE2 및 CE3)를 야생형 293T 세포에 동시 형질감염시키고, 형질감염 6일 후, Moflo FACS 솔터와 HLA 클래스 I 단클론 항체를 이용하여 HLA 클래스 I 음성세포들을 선별하고 96-웰 플레이트에 단일세포로 분주한다. 단일세포로 분주하고 2~3주 후, 단일세포 클론을 확립하고 배양한다(n=188). 유전형을 분석하기 위해 각각의 특이적인 정방향(F-), 역방향(R-) 프라이머를 이용하여 PCR과 전기영동을 시행한다. 그리고 유전체 서열을 분석하기 위해 선별된 클론들에서 생거 시퀀싱을 시행한다. 유동세포 분석과 HLA 클래스 I 단클론 항체를 이용하여 HLA 클래스 I 발현을 확인함으로써 HLA 클래스 I 결핍 세포주를 확립할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "절단"은 뉴클레오티드 분자의 공유결합 백본의 파손(breakage)을 의미한다.
상기 가이드 RNA(sgRNA)는 HLA-A, -B 또는 -C 유전자의 표적 서열을 포함하고 있어 세포 내로 전달된 후 전사를 통해 발현되어 HLA-A, -B 또는 -C 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있으며 Cas9 단백질을 HLA-A, -B 또는 -C 유전자로 가져오는 RNA이다. 따라서, 상기 가이드 RNA는 HLA-A, -B 또는 -C 유전자의 표적 서열; 및 표적과 무관한 불변 서열(non-variable sequence)로 이루어진 가이드 RNA 스캐폴드를 포함한다.
상기 HLA-A, -B 또는 -C 유전자의 표적 서열은 가이드 RNA가 표적 유전자를 인식할 수 있게 하는 서열을 의미하며, 숙주 세포의 종류, 표적 유전자의 종류 또는 삽입 부위에 따라 적당한 변형이 가해질 수 있다.
상기 가이드 RNA 스캐폴드는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA (single-chain guide RNA, sgRNA)일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA(dual RNA)일 수 있다. 만약 상기 가이드 RNA 스캐폴드가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA 스캐폴드라도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
바람직하게는, 단일-사슬 가이드 RNA일 수 있다.
상기 터미네이터는 가이드 RNA를 코딩하는 DNA의 전사를 종결하기 위해 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 말단에 연결되는 것으로, 프로모터에 맞게 당업자의 적정 선택 수준에서 채택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, RNA Polymerase III terminator 또는 -TTTTTT- 서열일 수 있다.
상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas9 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Cas9 단백질이 세포 내로 전달될 경우, 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌(poly-arginine) 도메인 또는 HIV로부터 유래한 TAT 단백질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 발현하는 벡터, 즉, Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 벡터의 형태로 트랜스펙션을 통해 전달될 수 있다. 상기 Cas9 단백질 코딩 핵산은 CMV 또는 CAG와 같은 프로모터 하에서 Cas9 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 같은 벡터의 형태일 수 있다.
상기 sgRNA를 발현하는 플라스미드 및 Cas9 단백질을 발현하는 플라스미드의 전달은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 트랜스펙션 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 확립된 HLA 결핍 293T 세포주는 공지의 형질전환 기술을 이용하여 T 세포를 자극할 수 있는 인공항원제시세포의 기반세포로 사용될 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명의 인공항원제시세포는 HLA 결핍 293T 세포주에 발현하고자 하는 HLA 분자; 및 보조자극분자를 형질전환시켜 제조될 수 있다. 바람직하게는, HLA 분자 및 보조자극분자군, CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70를 코딩하는 핵산을 도입할 수 있다.
상기 HLA 분자 및 보조자극분자를 코딩하는 핵산은 가장 광의적인 의미로 사용되며, 단일가닥(ss) DNA, 이중가닥(ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA 등을 포괄한다. 바람직하게는 이중가닥 DNA이다.
바람직하게는, 상기 HLA는 사람 유래의 핵산 서열일 수 있다.
상기 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 HLA 분자 또는 보조자극분자를 코딩하는 핵산으로 DNA를 선택하는 경우 발현 벡터에 삽입된 형태로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 상술한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 명세서에서, "인공항원제시세포를 어떤 물질로 감작(感作)시킨다"는 것은, 인공항원제시세포를 그 물질과 반응시키는 것을 말하며, 바람직하게는, 상기 물질을 인공항원제시세포의 표면상에 직접적, 또는 간접적으로 제시시키는 것을 말한다. 본 명세서에서, 상기 물질은 항원을 의미하며, "외래 항원"은 세포 자체가 보유하지 않은 항원으로, 이러한 항원을 세포 내로 전달 내지는 접촉을 통해 감작될 수 있다. 상기 전달은 펄스(pulse) 에너지에 의한 전기천공, 트랜스펙션 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 접촉은 항원과 인공항원제시세포를 일정시간 배양하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "항원"은 당업계에서 잘 공지되어 있으며, 항체에 결합할 수 있는 모든 분자뿐만 아니라 에피토프, MHC 분자에 결합할 수 있는 항원의 펩타이드 단편, 및 면역원을 포함한다. 본 발명에서는 항원으로 종양 항원, 병원체 항원 또는 자가-항체(정상 또는 질환성) 등을 사용하나, 이에 제한하는 것은 아니다.
상기 종양 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen, TAA)으로 종양과 관련 있는 항원을 의미한다. 잘 알려져 있는 TAA의 예로 오브알부민(Ovalalbumin), 서바이빈(survivin), gp75, gp1OO, MDM2, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, 티로시나제, 텔로머라제, her-2/neu, α-1 페토단백질(fetoprotein), G250, NY-ESO-1 등을 포함한다. MHC 분자에 결합하는 TAA의 일부 펩타이드 단편의 서열은 Ova257(SIINFEKL), tyrosinase-related protein 1455(Trp1455; TAPDNLGYA), Trp2180(SVYDFFVWL), 및 gp10025(gp10025; EGSRNQDWL), MAGE 1 노나펩타이드(EADPTGHSY), MART-APL 펩타이드(LAGIGILTV), 천연 펩타이드(AAGIGILTV) 또는 PSA-1 펩타이드(FLTPKKLQCV)등을 포함한다. 추가적인 종양 관련 펩타이드 및 항원의 서열은 당업자들에게 공지되어 있다.
상기 종양 항원과 관련된 종양의 예로, 고형암, 액형 종양(liquid tumor), 혈액 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 고환암, 방광암, 난소암, 경부암, 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 신경모세포종(neuroblastoma), 신경교모세포종(glioblastoma), 망막모세포종, 백혈병, 골수종, 림프종, 간암, 선암, 육종, 악성 종양(carcinoma), 모세포종(blastoma) 등이 있다.
상기 병원체 항원은 질환을 초래하는 유기체 또는 바이러스뿐만 아니라 이들의 약독화된 유도체를 의미한다. 용어 병원체는 질환의 발생에 관여하는 임의의 바이러스 또는 유기체, 및 그의 약독화된 유도체를 의미한다. 이러한 병원체로는 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및 바이러스 병원체, 예컨대 헬리코박터, 예컨대 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 균(Salmonella sp.), 시겔라 균(Shigella sp.), 엔터로박터 균(Enterobacter sp.), 캄필로박터 균(Campylobacter sp.), 다양한 마이코박테리아, 예컨대 마이코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라 균(Brucella sp.), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 스타필로코커스 균(Staphylococcus sp.), 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스 균(Streptococcus sp.), 클로스트리디움 균(Clostridum sp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 플라스모디움 균(Plasmodium sp.), 레쉬마니아 균(Leishmania sp.), 트리파노조마 균(Trypanosoma sp.), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), C 형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 사이토메갈로바이러스(CMV), HTLV, 헤르페스 바이러스(예, 1형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 2형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 코로나바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엡스타인-바 바이러스), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스 또는 루벨라 바이러스 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
상기 자가-항체는 항핵항체, 항γ글로불린 항체, 자기혈구성분에 대한 항체 또는 자기장기에 대한 항체 등이 있으나 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 자가-항체를 외래 항원으로 사용하는 경우, CD4 T 세포 백신은 강력한 항종양 면역을 유도할 수 있어, 정상조직에서 발현된 자가-항원에 대한 잠재적 면역 내성을 극복하는데 효과적일 수 있다.
본 발명의 항원에 감작된 인공항원제시세포는 항원 특이적인 CD8+T 세포의 증식을 유도하며, CD8+T 세포를 직접적으로 자극하거나, HLA 결핍 293T 세포주와 인공항원제시세포를 공동 배양한 후 세척한 뒤 항원을 처리하면 인공항원제시세포에서 발현된 보조자극분자와 HLA가 HLA 결핍 293T 세포주로 전달되고, 이러한 HLA 결핍 293T 세포주는 CD8+T 세포를 자극할 수 있어 다른 세포에 표면 물질을 전달함으로써 간접적으로 CD8+T 세포를 자극할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이러한 인공항원제시세포의 CD8+T 세포 자극은 수지상세포의 수준과 유사하다.
본 발명의 인공항원제시세포는 보조자극분자를 과발현하면서, 외래 항원에 감작되어 항원특이 T 세포 반응을 향상시키므로, 외래 항원의 종류에 따라 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 치료에 효과적이다.
따라서, 본 발명은 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포를 포함하는 면역치료제를 제공한다.
본 발명에 따른 면역치료제는 면역 반응을 증가시키거나, 특정 질병, 감염 또는 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 면역 반응의 일부를 선택적으로 상승시킬 수 있다.
이를 기반으로, 본 발명은 상기 인공항원제시세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 예방용 백신 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
예컨대, 상기 종양의 예로, 신장 세포 종양 흑색종 만성 림프성 백혈병 유방암, 폐암 전립선암, 난소암 또는 대장암 등이 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
바람직한, 병원체 감염으로 HIV, HCV 등이 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
바람직한, 자가면역질환으로, 전신성 홍반 낭창증 또는 루퍼스(Systemic lupus erythematosus: SLE), 류마티스성 관절염(Rheumatoid arthritis: RA), 류마티스열(Rheumatoid fever) 등이 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 백신은 일회 투여함으로써 수행되는 면역화 방법과 연속 투여함으로써 수행되는 면역화 방법을 모두 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단적 또는 치료적 용도에 적합한 조성물을 이루는 활성성분 및 활성 또는 무활성 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충화된 염수 용액, 인간 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함하는 단백질 부형제와 같이, T 세포와 혼용가능한 임의의 약학적 담체를 포함한다. 담체, 안정화제 및 보강제의 예는, Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18th Ed.(Mack Publ. Co., Easton (1995)) 및 the "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (2004)를 참조한다. 용어 "담체"는 완충액 또는 pH 조정제를 포함할 수 있으며, 전형적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액으로는 시트르산의 염, 아스코르브산의 염, 글루콘산의 염, 카본산의 염, 타르타르산의 염, 숙신산의 염, 아세트산의 염 또는 프탈산의 염 등의 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 추가적인 담체로, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머 당), 덱스트레이트(예, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-쿼드러셔(quadrature), -사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 항산화제, 항-대전제, 계면활성제(예, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80" 등의 폴리소르베이트), 지질(예, 인지질, 지방산), 스테로이드(예, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예, EDTA) 등의 폴리머성 부형제/첨가제를 포함한다. 빙결 방지제 또는 강하제도 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 적정 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 종양내, 동맥내(관절에서), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 결절내(intranodal) 및 피하 경로와 같은 비경구 투여에 적합한 제형과 담체는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장으로 만들어 줄 용질, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 정맥내 또는 복강 투여가 바람직한 방법이다. 개체에게 투여된 세포의 투여량은 시간의 경과에 따라 개체에서 목적하는 유익한 치료적 반응을 달성하기에 유효한 양, 또는 암세포의 성장 억제에 유효한 양 또는 감염의 억제에 유효한 양이다. 예컨대, 주입 전에 개체로부터 혈액시료를 수득한 후 보관하여 후속적인 분석 및 비교에 사용하는 방식으로 실시될 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 104 내지 106 및 전형적으로 1×108 내지 1×1010개의 세포를 70 kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 본 발명의 세포를 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번에 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 인공항원제시세포는 세포독성제, 뉴클레오타이드 유사체 및 생물학적 반응 변형제를 포함하는 공지된 통상의 치료법을 사용하여 다른 특정 증상에 대한 치료를 보충할 수 있다. 유사하게, 생물학적 반응 변형제는 본 발명의 인공항원제시세포에 의한 치료에 선택적으로 추가될 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적 유효량의 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포를 함유하는 약학적 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 기술하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 치료용 조성물을 투여할 수 있는 대상체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 인간, 돼지, 고릴라, 원숭이, 개, 고양이, 생쥐 등의 포유동물일 수 있다.
상기 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 종류는 상술한 바와 같다.
본 발명은 또한 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 상기 인공항원제시세포와, CD4+T 세포, CD8+T 세포 또는 γδT 세포 중 어느 하나의 T 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 세포 독성 T 세포의 인 비트로 증식 방법을 제공한다.
본 발명의 인공항원제시세포는 CD4+T 세포, CD8+T 세포 또는 γδT 세포와 공동-배양 시 상기 T 세포들을 증식할 수 있다. 또한, 항원에 의해 감작된 인공항원제시세포로 상기 T 세포를 자극하는 경우 항원 특이적 세포독성 T 세포를 생산할 수 있다.
인공항원제시세포의 CD4+T 세포, CD8+T 세포 또는 γδT 세포 자극 또는 공동-배양은 면역 자극 리간드의 부재 하에서 인터루킨-2(IL-2)이 포함된 세포 배양 배지에서 수행된다.
상기 세포 배양 배지는 동물 세포 배양용 안전 배지일 수 있다. 예컨대, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 IL-2는 20 내지 100 IU/mL의 농도로 첨가될 수 있다.
인공항원제시세포를 이용한 자극은 4일 내지 10일 동안 수행될 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 배양 조건은 CO2 배양기에서, 5 내지 15%의 이산화탄소의 통기량으로 35 내지 37℃에서 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주-기반 인공항원제시세포의 제조
HLA 결핍 293T 세포주를 확립하고 이를 기반으로 하여 HLA 및 다양한 보조자극분자를 발현하는 인공항원제시세포를 제조하였다.
(세포 배양)
HEK 293T 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. T2 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.
(유동세포 분석)
표적 세포를 암실에서 실온 30분 동안 다음과 같이 형광으로 표지된 항-인간 항체로 염색하였다: CD80-BV605(L307.4, BD Bioscience), CD32-APC(FLI8.26, BD Bioscience), CD83-PerCP-CY5.5(HB15e, Biolegend), CD137L-PE(5F4, Biolegend), CD54-Pacific Blue(HCD54, Biolegend), CD70-FITC(Ki-24, BD Bioscience), HLA-ABC-APC(G46-2.6, BD Bioscience) 또는 HLA-ABC-PE(W6/32, Biolegend), HLA-A0201-PE(BB7.2, Biolegend), CD3-FITC(OKT3, Biolegend), CD8-PerCP-CY5.5(RPA-T8, Biolegend), MART 26-35 Tetramer-PE(A*02:01 ELAGIGILTV, Proimmune), CD45RO-PE-Cy7(UCHL1, Biolegend), CCR7-APC-Cy7(G043H7, Biolegend), CD62L-APC(DREG-26, BD Bioscience), CD56-BV421(NCAM16.2, BD Bioscience). 염색된 세포는 FACS Canto나 Fortessa(BD Bioscience)를 이용해 형광 발현 정도를 측정하여 분석하였다.
(gRNA 설계 및 구성)
각각 HLA-A 엑손 2(AE2: GAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGG), A 엑손 3(AE3: GAAGGAGACGCTGCAGCGCACGG), B 엑손 2(BE2: GCTGTCGAACCTCACGAACTGGG), B 엑손 3(BE3: GAGCATGTACGGCTGCGACGTGG), C 엑손 2(CE2: GACACAGAAGTACAAGCGCCAGG), 및 C 엑손 3(CE3: CCAGAGGATGTCTGGCTGCGACC)을 표적으로 하는 총 6개의 gRNA는 pSpCas9 BB-2A-GFP 또는 Puro all-in-one 플라스미드에 암호화되어있고, 이는 Genscript(PX458, PX459)로부터 얻었다.
(다중 유전자 편집을 위한 형질 주입)
HEK 293T 세포를 항생제가 없는 DMEM을 이용해 2×106/10mL로 깔았다. 24시간 후, 293T 세포에 각 HLA-A,-B,-C를 표적으로 하는 6개의 gRNA가 암호화된 all-in-one 플라스미드를 Lipofectamine(Invitrogen)을 이용하여 동시 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, 세포에 대해 유동세포 분석법을 수행하였다. 형질주입 6일 후, HLA-A,-B,-C 음성세포를 분리하고 단일세포 클론을 확립하였다.
(FACS 분리와 단일세포 클로닝)
HLA-A,-B,-C 결핍 세포주를 확립하기 위해, 6개의 플라스미드가 동시 형질주입된 세포들을 거둬 Rinsing solution(Miltenyi Biotec)과 HLA-ABC-APC Ab(G46-2.6, BD Bioscience)로 30분간 상온에서 염색하였다. 살아있고, GFP 음성이며, HLA-ABC 음성 293T 세포를 Moflo XDP cell sorters(Beckman)를 이용해 분리하고 단일 세포로 96-웰 플레이트에 분주하였다. 개별적인 HLA 발현 세포 또는 보조자극분자 발현 세포를 위하여, 각 분자들이 형질도입된 세포를 HLA-ABC-PE Ab(W6/32, Biolegend) 또는 CD83-PerCP-CY5.5 Ab(HB15e, Biolegend)로 염색하였다. 그리고 각 양성세포를 Moflo XDP cell sorters(Beckman)를 이용해 분리하고 단일 세포로 96- 플레이트에 분주하였다. 분리 2~3주 후, 단일세포 클론이 확립되었다.
(단일세포 PCR, 전기영동 및 생거 시퀀싱)
분리 2~3주 후, HLA-A,-B,-C 음성 단일세포 클론이 확립되고 6-웰 플레이트에 배양하였다(n=188). TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)를 제조업체의 지침에 따라 사용해 각 1×105~106 클론에서 클론 유전체 DNA를 분리하였다. 그리고 HLA-A,-B,-C 엑손 2와 3에 특이적인 프라이머와 실험실 내 프로토콜을 이용하여 표적부위를 증폭하였다. PCR 산물은 예상된 큰 결실 클론들을 선별하기 위해 2% 아가로스 젤, SYBR Green 및 100bp ladder(Bioneer)를 이용해 전기영동하여 분석하였다. 최종적으로, 선별된 클론들의 PCR 산물을 같은 프라이머를 사용해 생거 시퀀싱(Cosmo genetech)으로 분석하였다.
(렌티바이러스 생산 및 형질도입)
각 분자들(HLA-A*02:01, A*02:06, B*07:02, B*40:06, CD80-T2A-CD32, CD83-T2A-CD137L, CD54, 및 CD70)이 암호화된 렌티바이러스 생산을 위해 293T 세포를 T75-플라스크에 5×106/10mL로 깔았다. 24시간 후, 10 ㎍ 클로닝된 pCDH plasmid(SBI)와 렌티바이러스 페키징 플라스미드(5 ㎍ psPAX2 및 5 ㎍ pMD2G)를 Lipofectamine(Invitrogen)을 이용하여 293T 세포에 동시 형질주입하였다. 형질주입 48시간 후, 상등액을 거둬 0.45 μM 필터를 이용해 여과하였다. 각 렌티바이러스의 형질도입을 위해, 5×105/mL 293T 세포를 6-웰 플레이트에 깔았다. 24시간 후, 500㎕ 렌티바이러스 상등액과 8 ㎍/mL 폴리브렌(polybrene)을 293T 세포에 처리하였다. 형질도입 48시간 후, 세포를 배양하고 유동세포 분석법을 수행하였다. 형질도입 6일 후, 양성세포를 분리하고 클론을 확립하였다.
(CD8+T 세포의 분리)
Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech) 밀도 구배 원심 분리 및 저온 냉동하여 단핵구를 분리하였다. 밀도 분리 후, CD8+T 세포를 MACS System(Miltenyi Biotec)를 이용해 제조업체의 지침에 따라 분리하였다. 분리된 CD8+T 세포는 ELISPOT 분석과 항원특이 세포독성 T 세포 생산에 이용되었다.
(Enzyme-linked immunospot assay)
IFN-γ를 분비하는 세포를 측정하기 위해, ELISPOT 분석을 BD ELISPOT 분석 키트를 이용해 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 개별적인 HLA 기능적 실험을 위해, 개별적인 HLA 일치 건강한 기증자(1×106 cells)로부터 분리한 CD8+T 세포를 완성된 RPMI로 연속적으로 희석하여 각 농도조건에 맞는 곳으로 100 ㎕씩 옮기고, 200 ㎕ piggy-bac-pp65 whole Ag-GFP 벡터(SBI)가 형질주입된 표적세포 또는 형질주입이 안 된 표적세포(1×105 cells)를 첨가하였다. 1×105 CD8+T 세포/웰 조건을 이중으로 진행하였다. IFN-γ 스팟 수는 AID-ELISPOT-Reader(AID)를 이용하여 측정하였다. 항원특이 CTLs의 기능적 실험을 위해, MART-1 특이 CTLs(2.5×105 cells) 또는 pp65 특이 CTLs(2.5×105 cells)를 완성된 RPMI에 연속적으로 희석하고 125 ㎕씩 각 농도 조건에 맞는 곳으로 옮기고, 250 ㎕ MART-126-35 펩타이드(ELAGIGILTV) 또는 pp65495 펩타이드(NLVPMVATV) 펄스 처리하지 않거나 펄스 처리된 T2 세포(2.5×104 cells)를 첨가하였다. IFN-γ 스팟 수는 AID-ELISPOT-Reader(AID)를 이용하여 측정하였다.
(항원특이 세포독성 T 세포 생산)
MART-126-35 펩타이드(ELAGIGILTV)가 펄스된 A*02:01-293T(H1E-45)-Cos 세포를 이용하여 MART-1 특이 세포독성 T 세포(CTLs)를 만들었다. pp65495 펩타이드(NLVPMVATV)가 펄스된 293T-Cos(+CD54, +CD70) 세포를 이용하여 pp65 특이 세포독성 T 세포(CTLs)를 만들었다. CTLs은 조사된 자극 세포와 함께 10 U/mL IL-2(Proleukin) 및 10 ng/mL IL-15로 6~7일 마다 배양하였다. 간단히 말해, A*02:01 건강한 기증자로부터 정제된 CD8+T 세포를 반응기 세포로 사용하였고, 조사된(10,000 cGy), MART-126-35 펩타이드 펄스 A*02:01-293T(H1E-45)-Cos 또는 pp65495 펩타이드(NLVPMVATV)가 펄스된 293T-Cos(+CD54, +CD70) 세포를 자극세포로 사용하여 자극세포 : 반응기 비율이 1 : 20(첫 번째) 및 1:10(두 번째 및 세 번째)로 자극하였다. 1차 자극 후, CTL을 거둬, 트리판 블루를 사용하여 생존력을 평가하였다. 2차 및 3차 자극 후, CTL을 거둬, 계수하고, 그의 기능적 용량을 분석하였다.
<실시예 2> HLA 클래스 I 음성세포 클론의 확립
HEK(human embryonic kidney) 293T 세포를 본 발명의 시도에 적합한 모델로 선정하였다. 293T 세포주는 높은 형질주입 효율과 동형의 HLA 클래스 I(A*02:01, B*07:02, 및 C*07:02) 종류를 가진다는 이점이 있다. HLA 클래스 I 분자의 완벽한 제거를 위해, 각 HLA-A,-B,-C 유전자들의 엑손 2와 3을 표적으로 하는 gRNA와 Cas9을 암호화하고 있는 6개의 플라스미드를 사용하였다(도 1). 이 6개의 플라스미드를 293T 세포에 동시 형질주입하였다. 형질주입 6일 후, HLA 클래스 I 분자 특이적인 항체(HLA-ABC-APC, G46-2.6, BD Bioscience)를 염색하여, 가장 낮게 발현하는 세포들을 분리하여 6-웰 플레이트 또는 8개의 96-웰 플레이트에 단일세포로 깔았다(도 1). 6-웰 플레이트에 배양한 세포를 10일째, HLA 클래스 I 음성세포군은 42.7%였다(도 1). 소팅 후 2~3주 후, 총 768 웰에서 188개의 클론(24.5%)을 배양하여 HLA 클래스 I 유전자 변이와 발현을 분석하였다.
<실시예 3> HLA 클래스 I 음성세포 클론에 대한 유전적 분석 및 유동세포 분석
유도된 돌연변이를 검출하기 위해, 각 HLA 클래스 I 유전자의 엑손 2와 3에 gRNA 표적 부위를 포함한 특정 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다(도 1). PCR 산물의 크기가 대조군 세포의 크기와 비교하여 변화할 때, PCR 산물이 보다 짧은(결실), 길어진(삽입) 또는 증폭되지 않은 산물들을 검출 가능한 변화(DCP)로 명명하였다. PCR 산물이 단일 밴드로 검출될 때, 동질 접합체 또는 이중 밴드로 검출될 때, 이형 접합체로 간주되었다(도 2A). 결실 및 삽입 돌연변이의 유전자 빈도는 각각 HLA-A에서 31.4%와 2.1%, HLA-B에서 37.0% 와 6.4%, HLA-C에서 16.8% 와 0.5%였다(도 2B). 증폭되지 않은 산물은 동형의 결실로 PCR에 영향을 주는 더 큰 결실로 추정된다. 증폭되지 않은 유전자 빈도는 HLA-A에서 18.1%, HLA-B에서 16.0%, HLA-C에서 1.6%였다(도 2B). PCR 산물의 크기가 동일하거나 유사할 때, 돌연변이가 없거나, 치환 또는 작은 삽입 또는 결실을 포함하는 것으로 간주하였다. 이러한 결과는 HLA-B, HLA-A 및 HLA-C의 돌연변이가 순서대로 빈번하게 발생함을 입증했다. 각 HLA 클래스 I 유전자 위치의 돌연변이 빈도는 각 HLA 클래스 I 유전자 위치에 대한 gRNA 표적화의 효율을 나타낼 수 있다.
배양된 188개 클론에서, 50개 클론(26.6%)은 3개의 HLA 클래스 I 위치 어디에서도 DCP가 보이지 않았다. 17개 클론(9.0%)은 오직 HLA-A에서만 DCP가 보였고, 32개 클론(17.0%)은 오직 HLA-B에서만, 그리고 2개 클론(1.1%)은 오직 HLA-C에서만 DCP가 보였다. HLA-A와 B 위치에서 둘 다 DCP가 있는 것은 41개 클론(21.8%)이고, HLA-B와 C 위치에 둘 다 있는 것은 5개 클론(2.7%), 그리고 HLA-A와 C 부위 둘 다 있는 것은 7개 클론이었다(3.7%). 34개 클론의 모든 HLA 클래스 I 위치에서 20개의 동형 DCP(10.6%)와, 14개의 이형 DCP(7.5%)가 보였다(도 3A).
동형 접합체 클론에서 HLA 클래스 I 유전자 위치의 DCP 분포에 따라 HLA 클래스 I 발현을 분석하였다(도 3B). 염색되지 않은 HEK 293T 세포에서 가장 높은 강도 수준을 HLA 클래스 I 발현의 분기점으로 사용된 경우, 야생형 HEK 293T 세포의 94.0%가 HLA 클래스 I 발현의 양성으로 결정되었다. 평균 양성비는 DCP가 없는 군에서 56.2%, 1개 있는 군에서 38.6%, 2개 있는 군에서 6.4%, 그리고 3개 있는 군에서 3.2%였다(도 3B). DCP가 없는 군에서 대조군보다 더 낮은 HLA 클래스 I 발현은 단일 gRNA 효과에 의한 작은 삽입 또는 결실의 존재를 암시한다. 이러한 결과는 DCP 대립 형질의 수에 따라 HLA 클래스 I 발현이 감소함을 보여 주었다(도 3B).
HLA-A, -B, -C 결핍 293T 세포주의 선별을 위해 HLA-A, -B 및 -C 유전자에서 예측된 결실이 일어난 3개의 동형 접합체 클론에서 뉴클레오타이드 서열을 확인하였다(도 3C). 3개의 모든 클론은 각각의 표적화 된 HLA 클래스 I 유전자 위치에서 예상되는 2개의 절단 부위에 가까운 영역 사이의 큰 결실을 보였다. 다음 실험에서는 AAPC의 개발을 위해 클론 45(null-293T (H1E-45))를 사용했다.
<실시예 4> HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주에 전달된 단일 HLA 클래스 I 유전자에 의한 항원 제시
null-293T(H1E-45)에서 단일 HLA 클래스 I 대립 유전자에 제한된 항원제시와 자연적 항원 처리를 입증하기 위해 null-293T(H1E-45) 세포주에 HLA-A*02:01, A*02:06, B*07:02, 또는 B*40:06 형질도입 후 6일째에 HLA 클래스 I 양성세포를 분류하였다. A*02:01-, A*02:06-, B*07:02-, 그리고 B*40:06-293T(H1E-45) 세포는 유동세포 분석법으로 95% 이상의 HLA 클래스 I을 나타내었다(도 4A). 그 후 CMV pp65 전체 항원을 발현하는 플라스미드는 야생형 293T, null-, A*02:01-, A*02:06-, B*07:02- 및 B*40:06-293T(H1E-45) 세포에 형질도입되었다. IFN-γ enzyme-linked immunospot(ELISPOT) 분석은 HLA 일치 기증자의 CD8+T 세포에서 수행되었다.
HLA-A*02:01 일치 HD1과 HD2로부터 나온 CD8+T 세포에서, IFN-γ 스팟이 각각 야생형 293T에서 73.5개와 173개, A*02:01-293T(H1E-45)에서 56.5개와 114개가 나타났다(도 4B). HLA-A*02:06 일치 HD3과 HD4로부터 나온 CD8+T 세포에서, 스팟이 각각 A*02:06-293T(H1E-45)에서 22개와 181.5개 나타났다(도 4B). HLA-B*07:02 일치 H51과 HD6로부터 나온 CD8+T 세포에서, IFN-γ 스팟이 각각 야생형 293T에서 84개와 304.5개, B*07:02-293T(H1E-45)에서 85개와 314개가 나타났다(도 4B). HLA-B*40:06 일치 HD3과 HD4로부터 나온 CD8+T 세포에서, 스팟이 각각 B*40:06-293T(H1E-45)에서 54.5개와 49.5개 나타났다(도 4B). 모든 기증자에서 불일치하는 군에서는 0~25.5개의 스팟이 나타났고, null-293T(H1E-45) 군에서는 0~0.5개의 스팟이 나타났다(도 4B). 또한, HD3를 제외한 모든 기증자에서 각 일치군에서 양성 범위의 스팟이 나타났다(도 4B). 이 IFN-γ ELISPOT 데이터는 각 그룹의 일치하는 특이적 면역 반응에 대해 명확한 결과를 보여주었다(도 4B).
상기 결과로부터, ELISPOT 데이터로부터 두 가지 결론을 도출하였다. 첫째, 상기 접근법은 HLA 클래스 I 분자를 제거하고 복원할 수 있으며, 표현형뿐만 아니라 기능도 제거할 수 있었다. 둘째, HLA 유형에 상관없이 자연적인 항원 처리 및 제시가 가능하게 복원할 수 있었다.
<실시예 5> HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주-기반 인공항원제시세포에 의한 시험관내 항원특이적 세포독성 T 세포 생성
항원 특이 세포독성 T 세포(CTLs)를 생성하기 위해, HLA-A*02:01, CD80, CD32, CD83, 4-1BBL, CD54, 그리고 CD70를 발현하는 A*02:01-293T(H1E-45)-Cos 세포주를 렌티바이러스의 형질도입과 양성세포 분리 및 단일세포 클로닝을 통하여 확립하였다(도 5A). 그 후, MART-126-35 펩타이드와 함께 6~7일 마다 총 3번 자극하여 0, 13, 19일째 면역반응을 측정하였다(도 5B 및 도 5C).
도 5B 및 도 5C에 나타난 바와 같이, 0, 13, 19일째 의미 있는 IFN-γ 스팟 수는 각각 HD9는 25개, 119개 그리고 146개, HD10은 19개, 207개, 그리고 365개, HD11은 8개, 201개, 그리고 431개였다(도 5B, C). 이 데이터는 CTL의 면역반응이 13일째에는 4.8~25.1배, 19일째에는 5.8~53.9배 증가한다는 것을 보여준다.
<실시예 6> 293T 세포-기반 인공항원제시세포의 HLA 및 보조자극분군의 발현도 및 시험관내 항원특이적 세포독성 T 세포 생성
HLA를 자연적으로 발현하는 293T 세포를 기반으로 CD80, CD32, CD83, 4-1BBL, CD54, 또는 CD70를 발현하는 293T-Cos(+CD54: CD80, CD32, CD83, CD137L 및 CD54를 발현하는 인공항원제시세포) 및 293T-Cos(+CD54 +CD70: CD80, CD32, CD83, CD137L, CD54 및 CD70을 발현하는 인공항원제시세포) 세포주를 렌티바이러스의 형질도입과 단일세포 클로닝을 통하여 확립하고, 실시예 5에서 제조된 HLA 클래스 I 결핍 293T 세포주-기반 인공항원제시세포와 함께 HLA 및 보조자극분자군의 발현도를 유동세포 분석법을 통해 측정하였다(도 6a 및 도 6b). 그 후, pp65495 펩타이드와 함께 6~7일 마다 총 3번 자극하여 0, 13, 19일째 면역반응을 측정하였다(도 7).
도 7에 나타난 바와 같이, 13일째 pp65 특이 세포독성 T 세포에서 2.89배의 세포증식을 보였고, pp65495 사량체 양성세포는 57.7%였다(도 7A 및 7B). 또한, ELISPOT 분석 결과에서는 1×105, 5×104, 1×104 조건 모두에서 측정하지 못 할 정도로의 강한 반응을 나타냈다(도 7C).
상기 결과로부터 null-293T(H1E-45) 세포주를 기반으로 한 인공항원제시세포가 항원특이 CTL을 자극할 수 있음을 알 수 있어, 이는 null-293T(H1E) 세포주가 새로운 인공항원제시세포의 기반 세포로 활용될 수 있음을 의미한다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Artificial antigen presentation cell derived from HLA deficient cell lines by using multiplex CRISPR-Cas9 system, and use thereof <130> P17U11C1703 <150> KR 10-2016-0163509 <151> 2016-12-02 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A exon 2 target sequence <400> 1 gagccagagg atggagccgc ggg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A exon 3 target sequence <400> 2 gaaggagacg ctgcagcgca cgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B exon 2 target sequence <400> 3 gctgtcgaac ctcacgaact ggg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-B exon 3 target sequence <400> 4 gagcatgtac ggctgcgacg tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-C exon 2 target sequence <400> 5 gacacagaag tacaagcgcc agg 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-C exon 3 target sequence <400> 6 ccagaggatg tctggctgcg acc 23 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MART-1 26-35 <400> 7 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pp65 495-503 <400> 8 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5

Claims (8)

  1. HLA-A, -B 및 C 결핍 293T 세포주에서 유래하고,
    HLA(human leukocyte antigen)-A, -B 및 C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 HLA 분자; 및 CD80, CD83, CD54, CD32, 4-1BBL 및 CD70로 구성된 보조자극분자군(costimulatory molecule group)를 발현하며,
    상기 HLA-A, -B 및 C 결핍 293T 세포주는 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLA-A, -B 및 C 유전자가 유전체 상에서 제거된 세포주로, 상기 CRISPR-Cas9 시스템의 single guide RNA(sgRNA)는
    HLA-A 엑손 2(SEQ ID NO: 1) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 2);
    HLA-B 엑손 2(SEQ ID NO: 3) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 4); 및
    HLA-C 엑손 2(SEQ ID NO: 5) 및 엑손 3(SEQ ID NO: 6)을 표적으로 하는 것인, 인공항원제시세포(Artificial antigen presentation cell).
  2. 제1항에 있어서,
    인공항원제시세포는 HLA-A, -B 및 C 결핍 293T 세포주에 HLA 분자 및 보조자극분자군을 코딩하는 핵산을 도입하여 제조되는, 인공항원제시세포.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서,
    핵산은 바이러스 벡터에 삽입되어 세포에 전달되는, 인공항원제시세포.
  5. 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 제1항의 인공항원제시세포를 포함하는 면역치료제.
  6. 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 제1항의 인공항원제시세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 예방용 백신.
  7. 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 제1항의 인공항원제시세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료용 조성물.
  8. 종양 항원, 병원체 항원 및 자가-항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항원이 감작된 제1항의 인공항원제시세포와, CD4+T 세포, CD8+T 세포 또는 γδT 세포 중 어느 하나의 T 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 T 세포의 인 비트로 증식 방법.
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