JP6493902B2 - Spinal ligament ossification test method and test reagent - Google Patents
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Description
本発明は、脊椎靭帯骨化症の発症リスクを検査する方法並びにその検査用試薬に関する。 The present invention relates to a method for examining the onset risk of vertebral ligament ossification and a reagent for the examination.
脊椎靭帯骨化症は、本来骨形成の起こらない軟部組織である脊椎の靭帯に骨化が認められる異所性骨形成の一つである。脊椎のどの靭帯が骨化したかにより、後縦靭帯骨化症、黄色靭帯骨化症、前縦靭帯骨化症等に分類される。脊椎靭帯骨化症の中でも、後縦靭帯骨化症と黄色靭帯骨化症は、特定疾患医療費助成制度の対象となっている難病である。後縦靭帯骨化症は、黄色靭帯骨化症及び／又は前縦靭帯骨化症との合併例が多く、また、糖尿病や肥満患者において発生頻度が高いことが知られている。 Spinal ligament ossification is one of ectopic bone formations where ossification is observed in the ligaments of the spine, which is a soft tissue that does not naturally form bone. Depending on which ligament of the spine has been ossified, it is classified into posterior longitudinal ligament ossification, yellow ligament ossification, anterior longitudinal ligament ossification, and the like. Among the spinal ligament ossification diseases, posterior longitudinal ligament ossification disease and yellow ligament ossification disease are intractable diseases that are covered by the medical expenses subsidy program for specific diseases. There are many cases of posterior longitudinal ligament ossification with yellow ligament ossification and / or anterior longitudinal ligament ossification, and it is known that the incidence is high in diabetic and obese patients.
脊椎の靭帯が骨化し増大することにより、当該靭帯に隣接する脊髄や脊髄から分枝する神経根が圧迫され、神経障害、例えば、下肢の痛みやしびれ等の知覚障害や、手指の運動困難や排尿・排便困難等の運動障害が引き起こされる。また、罹患患者が転倒したり転落したりすると、そうした外力により四肢麻痺となる恐れがある。よって、罹患患者は、重症化予防のために、日常生活において注意が必要である。 As the ligaments of the spine ossify and increase, the spinal cord adjacent to the ligament and the nerve root branching from the spinal cord are compressed, and neuropathy, for example, sensory disturbances such as pain and numbness of the lower limbs, difficulty in movement of fingers, Movement disorders such as urination and difficulty in defecation are caused. In addition, if an affected patient falls or falls, there is a risk of limb paralysis due to such external force. Thus, affected patients need to be careful in their daily lives to prevent their severity.
しかし、靭帯に骨化があっても、骨化が急速に大きくなることは少ないため、すぐに症状が現れるわけではない。また、骨化巣が増大し脊髄を圧迫していても無症状な場合もある。例え無症状であっても、靭帯に骨化がある場合には、上記のような外力により四肢麻痺となる恐れがある。よって、靭帯の骨化を認識して日常生活において注意を払うためには、症状がない場合であっても、靭帯の骨化を定期的に検査する必要がある。 However, even if there is ossification in the ligament, the symptom does not appear immediately because the ossification rarely increases rapidly. Also, there may be no symptoms even if the ossification site increases and the spinal cord is compressed. Even if asymptomatic, if there is ossification in the ligament, there is a risk of limb paralysis due to the above external force. Therefore, in order to recognize the ossification of the ligament and pay attention in daily life, it is necessary to periodically check the ossification of the ligament even if there is no symptom.
脊椎靭帯骨化症の診断は、エックス線撮影検査により行われるが、放射線被爆を心配する患者は多い。また、妊婦にはエックス線撮影検査を適用できない。そして、エックス線撮影検査は、そのような設備を有する医療機関でしか検査を行うことができないため、どの病院でも簡便に行うことが出来る検査であるとはいえない。そのため、脊椎靭帯骨化症の診断を、被爆の心配がなく、また、特別な設備を必要とせずに簡便に行うことが望まれていた。 Diagnosis of spinal ligament ossification is done by X-ray examination, but many patients are concerned about radiation exposure. In addition, X-ray examination cannot be applied to pregnant women. And since X-ray imaging inspection can be performed only at a medical institution having such facilities, it cannot be said that it is an inspection that can be easily performed at any hospital. For this reason, it has been desired that the diagnosis of ossification of the vertebral ligament can be easily performed without worrying about exposure and without requiring special equipment.
これまで、脊椎靭帯骨化症は、遺伝的要因が寄与していることが示唆されている。そして、罹患同胞対連鎖解析および候補遺伝子関連解析により、脊椎靭帯骨化症感受性に連鎖する遺伝子や遺伝子座が、これまでに報告されている（非特許文献１〜３）。しかし、再現解析では、様々な集団でこれらの関連を再現することができていない（非特許文献４、５）。また、高密度一塩基多型を用いるゲノムワイド関連解析（genome-wide linkage analysis；ＧＷＡＳ）は、脊椎靭帯骨化症に関して未だ報告されていない。 So far, it has been suggested that genetic factors contribute to ossification of the spinal ligament. And genes and loci linked to vertebral ligament ossification susceptibility have been reported so far by affected sib-pair linkage analysis and candidate gene association analysis (Non-Patent Documents 1 to 3). However, in the reproduction analysis, these associations cannot be reproduced in various groups (Non-Patent Documents 4 and 5). In addition, genome-wide linkage analysis (GWAS) using high-density single nucleotide polymorphism has not yet been reported for vertebral ligament ossification.
以上の通り、脊椎靭帯骨化症感受性遺伝子に関する知見は存在するものの、ゲノムワイド水準で脊椎靭帯骨化症との関連が認められた遺伝子や一塩基多型（SNPs）は報告されていない。 As described above, although there is knowledge about vertebral ligament ossification disease susceptibility genes, genes and single nucleotide polymorphisms (SNPs) that have been found to be related to vertebral ligament ossification on a genome-wide level have not been reported.
本発明は、脊椎靭帯骨化症の発症リスクを正確に検査する方法、並びに該方法に用いられる検査用試薬を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for accurately examining the onset risk of vertebral ligament ossification, and a test reagent used in the method.
本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第２０染色体短腕１２領域（２０ｐ１２．３）、第８染色体長腕２３領域（８ｑ２３．１）、第１２染色体短腕１１領域（１２ｐ１１．２２）、第１２染色体短腕１２領域（１２ｐ１２．２）、第８染色体長腕２３領域（８ｑ２３．３）、及び第６染色体短腕２１領域（６ｐ２１．１）に存在する一塩基多型（SNP）が、脊椎靭帯骨化症と関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより、脊椎靭帯骨化症の発症リスクを正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies for solving the above-mentioned problems, the present inventors have found that the chromosome 20 short arm 12 region (20p12.3), the chromosome 8 long arm 23 region (8q23.1), and the chromosome 12 short arm 11 region. (12p11.22), Chromosome 12 short arm 12 region (12p12.2), Chromosome 8 long arm 23 region (8q23.3), and Chromosome 6 short arm 21 region (6p21.1) Polymorphism (SNP) was identified to be associated with vertebral ligament ossification. And by examining these polymorphisms, it discovered that the onset risk of the vertebral ligament ossification was able to be implemented correctly, and came to complete this invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被検者に由来する１つまたは２種以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて被検者の脊椎靭帯骨化症の発症リスクを検査する方法であって、
該一塩基多型が、配列番号１〜６から選ばれる塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、又は該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、方法。
［２］前記一塩基多型が、下記（１）から（６）より選択される１つまたは２種以上であり、当該塩基の種類がリスクアレルである場合には発症リスクが高く、非リスクアレルである場合には発症リスクが低いと判定する工程を含む、［１］に記載の方法。
（１）配列番号１に示す塩基配列における第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（２）配列番号２に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレル）又はA（非リスクアレル）
（３）配列番号３に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（４）配列番号４に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がA（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）
（５）配列番号５に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレル）又はA（非リスクアレル）
（６）配列番号６に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がC（リスクアレル）又はT（非リスクアレル）
［３］前記脊椎靭帯骨化症が、後縦靭帯骨化症である、［１］又は［２］に記載の方法。［４］被検者に由来する１つまたは２種以上の一塩基多型を分析可能なポリヌクレオチドを含む、脊椎靭帯骨化症検査用試薬であって、
該一塩基多型が、配列番号１〜６から選ばれる塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、又は該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、試薬。
［５］前記ポリヌクレオチドが、下記（１）から（６）より選択される１つまたは２種以上の一塩基多型のリスクアレルを検出可能なポリヌクレオチドである、［４］に記載の試薬。
（１）配列番号１に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（２）配列番号２に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレ
ル）又はA（非リスクアレル）
（３）配列番号３に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（４）配列番号４に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がA（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）
（５）配列番号５に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレル）又はA（非リスクアレル）
（６）配列番号６に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がC（リスクアレル）又はT（非リスクアレル）
［６］前記脊椎靭帯骨化症が、後縦靭帯骨化症である、［４］又は［５］に記載の試薬。［７］さらに、前記一塩基多型の非リスクアレルを検出可能なポリヌクレオチドを含む、［４］〜［６］のいずれか一に記載の試薬。
［８］前記ポリヌクレオチドが、前記塩基配列における前記一塩基多型を含む連続した１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、［４］〜［７］のいずれか一に記載の試薬。
［９］前記ポリヌクレオチドが、前記一塩基多型を含む領域を増幅することのできるプライマーである、［４］〜［７］のいずれか一に記載の試薬。
［１０］配列番号１〜６から選ばれる塩基配列において、塩基番号第１０１番目の塩基を含む連続した１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する、脊椎靭帯骨化症検査用プローブ。
［１１］配列番号１〜６から選ばれる塩基配列において、塩基番号第１０１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる、脊椎靭帯骨化症検査用プライマー。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method of analyzing one or more single nucleotide polymorphisms derived from a subject and examining the risk of developing vertebral ossification of the subject based on the analysis result,
The single nucleotide polymorphism is a single nucleotide polymorphism in a base corresponding to the base number 101 in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 6, or a base in a linkage disequilibrium relationship with the base .
[2] When the single nucleotide polymorphism is one or more selected from the following (1) to (6) and the type of the base is a risk allele, the risk of onset is high and non-risk The method according to [1], comprising a step of determining that the risk of onset is low in the case of an allele.
(1) The base corresponding to the 101st base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(2) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(3) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(4) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is A (risk allele) or G (non-risk allele)
(5) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(6) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is C (risk allele) or T (non-risk allele)
[3] The method according to [1] or [2], wherein the vertebral ligament ossification is posterior longitudinal ligament ossification. [4] A spinal ligament ossification test reagent comprising a polynucleotide capable of analyzing one or more single nucleotide polymorphisms derived from a subject,
The single nucleotide polymorphism is a single nucleotide polymorphism in a base corresponding to the base number 101 in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 6, or a base in linkage disequilibrium with the base .
[5] The reagent according to [4], wherein the polynucleotide is a polynucleotide capable of detecting a risk allele of one or more single nucleotide polymorphisms selected from the following (1) to (6): .
(1) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(2) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(3) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(4) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is A (risk allele) or G (non-risk allele)
(5) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(6) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is C (risk allele) or T (non-risk allele)
[6] The reagent according to [4] or [5], wherein the vertebral ligament ossification is posterior longitudinal ligament ossification. [7] The reagent according to any one of [4] to [6], further comprising a polynucleotide capable of detecting the non-risk allele of the single nucleotide polymorphism.
[8] The reagent according to any one of [4] to [7], wherein the polynucleotide has a continuous sequence of 10 bases or more including the single nucleotide polymorphism in the base sequence, or a complementary sequence thereof.
[9] The reagent according to any one of [4] to [7], wherein the polynucleotide is a primer capable of amplifying a region containing the single nucleotide polymorphism.
[10] A probe for testing ossification of the vertebral ligament having a sequence of 10 bases or more including the 101st base of the base number in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 6 or a complementary sequence thereof.
[11] A primer for vertebral ligament ossification examination, which can amplify a region containing the base at the 101st base number in a base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 6.
本発明によれば、脊椎靭帯骨化症の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。したがって、本発明は脊椎靭帯骨化症の重症化予防や早期治療に貢献するものである。 According to the present invention, the onset risk (morbidity risk) of vertebral ligament ossification can be accurately and easily predicted. Therefore, the present invention contributes to prevention and early treatment of vertebral ligament ossification.
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第２０染色体短腕１２領域（２０ｐ１２．３）、第８染色体長腕２３領域（８ｑ２３．１）、第１２染色体短腕１１領域（１２ｐ１１．２２）、第１２染色体短腕１２領域（１２ｐ１２．２）、第８染色体長腕２３領域（８ｑ２３．３）、及び第６染色体短腕２１領域（６ｐ２１．１）に存在するSNPを分析し、該分析結果に基づいて脊椎靭帯骨化症を検査することを特徴とする、脊椎靭帯骨化症の発症リスクの判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは脊椎靭帯骨化症の発症リスクの検査
を含む。本発明の方法においては、SNPの分析結果を、脊椎靭帯骨化症の発症リスクと関連付ける。
<1> Method of the Present Invention The method of the present invention comprises the human chromosome 20 short arm 12 region (20p12.3), chromosome 8 long arm 23 region (8q23.1), chromosome 12 short arm 11 region (12p11). .22), chromosome 12 short arm 12 region (12p12.2), chromosome 8 long arm 23 region (8q23.3), and chromosome 6 short arm 21 region (6p21.1) were analyzed for SNPs. A method of determining the risk of developing vertebral ligament ossification characterized by examining ossification of the vertebral ligament based on the analysis result. That is, in the present invention, “inspection” includes an inspection of the onset risk of vertebral ligament ossification. In the method of the present invention, the analysis result of SNP is associated with the risk of developing vertebral ligament ossification.
脊椎靭帯骨化症には、脊椎骨周囲の靭帯に骨化変性のある疾患であれば、いずれも含まれる。脊椎骨周囲の靭帯としては、例えば、前縦靭帯、後縦靭帯、黄色靭帯、棘突起間靭帯、及び棘突起上靭帯等が挙げられる。本発明の方法は、特に、特定疾患医療費助成制度の対象となっており、他疾患との合併例も多い後縦靭帯骨化症に好適に用いられる。 The vertebral ligament ossification includes any disease having ossification in the ligament around the vertebra. Examples of the ligament around the vertebra include an anterior longitudinal ligament, a posterior longitudinal ligament, a yellow ligament, an interspinous ligament, and an epispinous ligament. The method of the present invention is particularly suitable for the ossification of the posterior longitudinal ligament, which is a target of the medical expenses subsidy program for specific diseases and has many cases of complications with other diseases.
本発明の方法は、いずれの人種の被検者に対しても用いることができるが、特に、日本人等のアジア人の被検者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、いずれの性別の被検者に対しても用いることができる。 Although the method of the present invention can be used for subjects of any race, it can be suitably used for Asian subjects such as Japanese. In addition, the method of the present invention can be used for subjects of any gender.
また、首筋、肩甲骨周辺、指先又は下肢の痛みやしびれ、脱力等の症状がみられる被験者はもちろん、それらの具体的な症状がみられない被験者に対しても、健康診断等の目的で検査をすることが好ましい。これは、骨化巣があっても無症状な場合があり、そのような場合であっても転倒等による重症化の危険性をはらんでいることから、初発症状がみられる前から骨化を検査することが、日常生活における重症化予防に繋がるからである。 In addition to subjects with symptoms such as pain in the neck, around the scapula, fingertips or legs, numbness, weakness, etc. It is preferable to This may be asymptomatic even if there are ossification fossils, and even in such cases, there is a risk of serious injury due to falls, etc., so ossification before the first symptom is seen This is because inspecting the test leads to prevention of serious illness in daily life.
第２０染色体短腕１２領域（２０ｐ１２．３）に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs2423294を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。当該SNPを含む配列情報は、GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等より入手可能である。 Examples of SNPs present in the short arm 12 region of chromosome 20 (20p12.3) include human SNP ID number: rs2423294. Here, the rs number indicates the registration number of the dbSNP database (http // www.ncbi.nlm.nih.gov / projects / SNP /) of National Center for Biotechnology Information. Sequence information including the SNP can be obtained from GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) and the like.
rs2423294は、GenBank Accession No. NT_011387.8の7759768番目の塩基におけるSNPである。また、この多型は、配列番号１で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるチミン（T）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がT（リスクアレル）である場合には脊椎靭帯骨化症の発症リスクが高いと判定できる。 rs2423294 is an SNP at the 7759768th base of GenBank Accession No. NT_011387.8. This polymorphism means a polymorphism of thymine (T) / cytosine (C) at the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and this base is T (risk allele). ), It can be determined that the risk of developing ossification of the vertebral ligament is high.
第８染色体長腕２３領域（８ｑ２３．１）に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs374810を挙げることができる。rs374810は、GenBank Accession No. NT_008046.16の22369578番目の塩基におけるSNPである。
この多型は、配列番号２で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるグアニン（G）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がG（リスクアレル）である場合には脊椎靭帯骨化症の発症リスクが高いと判定できる。
Examples of SNPs present in the chromosome 8 long arm 23 region (8q23.1) include human SNP ID number: rs374810. rs374810 is an SNP at the 22369578th base of GenBank Accession No. NT_008046.16.
This polymorphism means a guanine (G) / adenine (A) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and this base is G (risk allele). In some cases, it can be determined that the risk of developing ossification of the vertebral ligament is high.
TC
第１２染色体短腕１１領域（１２ｐ１１．２２）に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs1979679を挙げることができる。rs1979679は、GenBank Accession No. NT_009714.17の21166639番目の塩基におけるSNPである。
この多型は、配列番号３で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるチミン（T）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がT（リスクアレル）である場合には脊椎靭帯骨化症の発症リスクが高いと判定できる。
TC
Examples of SNPs present in the chromosome 12 short arm 11 region (12p11.22) include the human SNP ID number: rs1979679. rs1979679 is an SNP at the 21166639th base of GenBank Accession No. NT_009714.17.
This polymorphism means a thymine (T) / cytosine (C) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and this base is T (risk allele). In some cases, it can be determined that the risk of developing ossification of the vertebral ligament is high.
第１２染色体短腕１２領域（１２ｐ１２．２）に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs11045000を挙げることができる。rs11045000は、GenBank Accession No. NT_009714.17の12944270番目の塩基におけるSNPである。
この多型は、配列番号４で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるアデニン（A）／グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がA（リスクアレル）である場合には脊椎靭帯骨化症の発症リスクが高いと判定できる。
Examples of SNPs present in the chromosome 12 short arm 12 region (12p12.2) include human SNP ID number: rs11045000. rs11045000 is an SNP at the 12944270th base of GenBank Accession No. NT_009714.17.
This polymorphism means an adenine (A) / guanine (G) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, and this base is A (risk allele). In some cases, it can be determined that the risk of developing ossification of the vertebral ligament is high.
第８染色体長腕２３領域（８ｑ２３．３）に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs13279799を挙げることができる。rs13279799は、GenBank Accession No. NT_008046.16の30815156番目の塩基におけるSNPである。
この多型は、配列番号５で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるグアニン（G）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がG（リスクアレル）である場合には脊椎靭帯骨化症の発症リスクが高いと判定できる。
Examples of SNPs present in the chromosome 8 long arm 23 region (8q23.3) include human SNP ID number: rs13279799. rs13279799 is an SNP at the 30815156th base of GenBank Accession No. NT_008046.16.
This polymorphism means a guanine (G) / adenine (A) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, and this base is G (risk allele). In some cases, it can be determined that the risk of developing ossification of the vertebral ligament is high.
第６染色体短腕２１領域（６ｐ２１．１）に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs927485を挙げることができる。rs927485は、GenBank Accession No. NT_007592.15の44478139番目の塩基におけるSNPである。
この多型は、配列番号６で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるシトシン（C）／チミン（T）の多型を意味し、この塩基がC（リスクアレル）である場合には脊椎靭帯骨化症の発症リスクが高いと判定できる。
Examples of SNPs present in the chromosome 6 short arm 21 region (6p21.1) include human SNP ID number: rs927485. rs927485 is an SNP at the 44478139th base of GenBank Accession No. NT_007592.15.
This polymorphism means a cytosine (C) / thymine (T) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, and this base is C (risk allele). In some cases, it can be determined that the risk of developing ossification of the vertebral ligament is high.
配列番号１：２０ｐ１２．３上のrs2423294のSNPを含む塩基配列
配列番号２：８ｑ２３．１上のrs374810のSNPを含む塩基配列
配列番号３：１２ｐ１１．２２上のrs1979679のSNPを含む塩基配列
配列番号４：１２ｐ１２．２上のrs11045000のSNPを含む塩基配列
配列番号５：８ｑ２３．３上のrs13279799のSNPを含む塩基配列
配列番号６：６ｐ２１．１上のrs927485のSNPを含む塩基配列
SEQ ID NO: 1: nucleotide sequence containing rs2423294 SNP on 20p12.3 SEQ ID NO: 2: nucleotide sequence containing rs374810 SNP on 8q23.1 SEQ ID NO: 3: nucleotide sequence containing rs1979679 SNP on 12p11.22 4: base sequence containing SRS of rs11045000 on 12p12.2 SEQ ID NO: 5: base sequence containing SNP of rs13279799 on 8q23.3 SEQ ID NO: 6: base sequence containing SNP of rs927485 on p21.1
本発明においては、上記SNPに相当する塩基を解析する。「上記SNPに相当する塩基」とは、上記配列がSNP以外の位置で個体差等により若干変化していても、その前後配列に鑑みれば、当該SNPであると認定できる塩基を意味する。 In the present invention, a base corresponding to the SNP is analyzed. The “base corresponding to the SNP” means a base that can be recognized as the SNP in view of the sequence before and after the sequence even if the sequence is slightly changed due to individual differences at positions other than the SNP.
また、本発明において解析するSNPは、上記６つのものに限定されず、上記のSNPと連鎖不平衡にあるSNPを分析してもよい。ここで「上記のSNPと連鎖不平衡にあるSNP」とは、上記のSNPとｒ2（連鎖不平衡係数）＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たすSNPをいう。また、上記のSNPと連鎖不平衡にあるSNPは、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。もしくは、３０人程度から採取したＤＮＡの塩基配列を解析し、連鎖不平衡にあるSNPを探索することにより同定してもよい。 In addition, the SNPs analyzed in the present invention are not limited to the above six, and SNPs that are in linkage disequilibrium with the above SNPs may be analyzed. Here, “SNP in linkage disequilibrium with the above SNP” means that the above SNP and r 2 (link disequilibrium coefficient)> 0.5, preferably r 2 > 0.8, more preferably r 2 > 0. SNP that satisfies the relationship of .9. Moreover, SNPs in linkage disequilibrium with the above SNPs can be identified using, for example, the HapMap database (http://www.hapmap.org/index.html.ja). Or you may identify by analyzing the base sequence of DNA extract | collected from about 30 persons, and searching for SNP in a linkage disequilibrium.
上記SNPの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記基準に基づいて脊椎靭帯骨化症と関連付けることにより、脊椎靭帯骨化症を検査することができる。なお、いずれのSNPも、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のどちらを解析してもよい。 By examining the type of the SNP base and associating the obtained result with vertebral ligament ossification based on the above criteria, vertebral ligament ossification can be examined. In addition, any SNP may analyze either the sense strand or the antisense strand of the double-stranded DNA.
上記SNPは単独で解析されてもよいし、上記SNPの少なくとも１つを含む複数のSNPsをまとめてハプロタイプ解析してもよい。または、上記SNPの少なくとも１つと、脊椎靭帯骨化症との関連が示唆されているSNPs（非特許文献１〜３等）や、当該示唆されているSNPsと連鎖不平衡にあるSNPsとを組み合わせて解析してもよい。検査の精度を向上するために、脊椎靭帯骨化症と関連する複数のSNPsをまとめて解析することが好ましい。 The SNP may be analyzed alone, or a plurality of SNPs including at least one of the SNPs may be collected and subjected to haplotype analysis. Or a combination of at least one of the above SNPs and SNPs that have been suggested to be associated with vertebral ligament ossification (Non-patent Documents 1 to 3, etc.) and SNPs that are in linkage disequilibrium with the suggested SNPs May be analyzed. In order to improve the accuracy of the examination, it is preferable to collectively analyze a plurality of SNPs related to vertebral ligament ossification.
SNPの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されない。例えば、血液、尿等の体液、口腔粘膜等の細胞、毛髪等の体毛、及び爪などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離したものを用いて解析することが好ましい。 The sample used for SNP analysis is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA. Examples include body fluids such as blood and urine, cells such as oral mucosa, body hair such as hair, and nails. Although these samples can be used directly for the analysis of SNP, it is preferable to analyze them using chromosomal DNA isolated from these samples by a conventional method.
SNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、こ
れらに限定されない。
Analysis of SNP can be performed by an ordinary gene polymorphism analysis method. Examples include, but are not limited to, sequence analysis, PCR, hybridization, invader method and the like.
シークエンス解析は、通常の方法により行うことができる。具体的には、SNPから数十塩基５’側に離れた位置にプライマーを設定し、そのプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当するSNPがどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、ＰＣＲなどによって、あらかじめSNP部位を含む断片を増幅しておくことが好ましい。 Sequence analysis can be performed by a normal method. Specifically, a primer is set at a position several tens of bases 5 'away from the SNP, a sequencing reaction is performed using the primer, and based on the analysis results, which type of base the corresponding SNP is. Can be determined. In addition, it is preferable to amplify the fragment containing the SNP site in advance by PCR or the like before the sequencing reaction.
また、SNPの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、プライマーの３’末端が各SNPの位置となるように、プライマーを設計する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）などによっても増幅の有無を調べることができる。 SNP analysis can be performed by examining the presence or absence of amplification by PCR. For example, the primer is designed so that the 3 'end of the primer is positioned at each SNP. PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined depending on the presence or absence of the amplification product. Further, the presence or absence of amplification is also examined by the LAMP method (Japanese Patent No. 3313358), NASBA method (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification; Japanese Patent No. 2844386), ICAN method (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-233379), etc. Can do.
また、SNP部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによって、どのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のSNPを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 It is also possible to amplify a DNA fragment containing an SNP site and determine which type of polymorphism is based on the difference in mobility in electrophoresis of the amplified product. An example of such a method is a PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method (Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146.). Specifically, first, DNA containing the target SNP is amplified, and the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA. Next, the dissociated single-stranded DNA is separated on a non-denaturing gel, and the type of polymorphism can be determined by the difference in mobility of the separated single-stranded DNA on the gel.
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 Furthermore, when a base showing polymorphism is included in the restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method). In this case, first, the DNA sample is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments can then be separated and the type of polymorphism determined by the size of the detected DNA fragment.
他に、DNAチップ等によりハイブリダイゼーションの有無を調べることによって、多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによって、SNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。 In addition, the type of polymorphism can be analyzed by examining the presence or absence of hybridization using a DNA chip or the like. That is, by preparing a probe corresponding to each base and investigating which probe hybridizes, it is possible to examine which base the SNP is.
また、DNA三重鎖構造を特異的に認識して切断するクリベース、インベーダーと呼ばれる遺伝子多型を認識するプローブ、及び、蛍光シグナルを発生するよう設計されたプローブを使用するインベーダー法により、多型解析をしてもよい。 In addition, polybase analysis is performed by an invader method that uses a DNA base that specifically recognizes and cleaves a DNA triplex structure, a probe that recognizes a gene polymorphism called invader, and a probe designed to generate a fluorescent signal. You may do.
本発明の方法の具体的態様の一例としては、まず上記SNPに相当する塩基を解析し、被検者の塩基の種類を決定する。次に、当該塩基の種類がリスクアレルである場合には発症リスクが高く、非リスクアレルである場合には発症リスクが低いと判定し、検査結果として医師等に情報を提供することができる。発症リスクの判定は、被験者の塩基の種類がリスクアレルであるか非リスクアレルであるか機械的に振り分けるものである。従って、本発明の方法に基づく発症リスクの判定及びその情報の提供は、医師等による専門的な判断は要さない。
提供された検査結果に基づき、必要に応じて医師等が被験者に対して処置を行う。たとえば、後縦靭帯骨化症(OPLL)の発症リスクが高いとの判定結果が出た被験者に対しては、検査後定期的に脊椎のX線撮影やCT撮影のようなより詳細な検査を行い、発症の有無を確認することができる。一方、OPLL発症リスクが低いとの判定結果が出た被験者に対しては、受診・検査の頻度、回数を減じることができる。このように、本発明の方法を行うこと
により、受診の回数や検査の方法を適切に設定し、OPLL患者やその疑いのある患者、医療従事者等の医学的、経済的負担、労力を軽減することができる。
As an example of a specific embodiment of the method of the present invention, first, a base corresponding to the above SNP is analyzed to determine the type of the subject's base. Next, when the type of the base is a risk allele, the onset risk is high, and when it is a non-risk allele, it is determined that the onset risk is low, and information can be provided as a test result to a doctor or the like. The onset risk is determined based on whether the subject's base type is a risk allele or a non-risk allele. Therefore, determination of the onset risk based on the method of the present invention and provision of information thereof do not require professional judgment by a doctor or the like.
Based on the test results provided, a doctor or the like treats the subject as necessary. For example, for subjects who have been judged to have a high risk of developing posterior longitudinal ligament ossification (OPLL), more detailed examinations such as X-rays of the spine and CT scans are regularly performed after the examination. Can be performed to confirm the onset. On the other hand, the frequency and frequency of medical examinations / tests can be reduced for subjects who have been judged to have a low risk of developing OPLL. Thus, by performing the method of the present invention, the number of medical examinations and the method of examination are appropriately set, and the medical and economic burden and labor of OPLL patients, suspected patients, medical workers, etc. are reduced. can do.
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明は、上記SNP部位のリスクアレルを検出可能なポリヌクレオチドを含む、脊椎靭帯骨化症を検査するための検査試薬を提供する。当該ポリヌクレオチドとしては、プライマーやプローブなどが含まれるが、それらに限定されない。また、１つのSNPを検出可能なポリヌクレオチドを、単独で検査試薬に含めてもよいし、当該ポリヌクレオチドを複数含めてもよい。検査の精度を向上するために、複数のポリヌクレオチドにより複数のSNPを検査することが好ましい。
さらに、非リスクアレルを検出可能なポリヌクレオチドを含めてもよい。
<2> Reagent for test | inspection of this invention This invention provides the test reagent for test | inspecting the vertebral ligament ossification including the polynucleotide which can detect the risk allele of the said SNP site | part. Such polynucleotides include, but are not limited to, primers and probes. In addition, a polynucleotide capable of detecting one SNP may be included alone in the test reagent, or a plurality of such polynucleotides may be included. In order to improve the accuracy of the test, it is preferable to test a plurality of SNPs using a plurality of polynucleotides.
Furthermore, a polynucleotide capable of detecting a non-risk allele may be included.
上記プローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜６から選ばれる塩基配列の１０１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する連続した１０塩基以上の長さのプローブや、当該１０１番目の塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する連続した１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。
プローブの長さは、好ましくは１０〜５０塩基であり、より好ましくは１５〜３５塩基であり、さらに好ましくは２０〜３５塩基である。
Examples of the probe include a probe that includes the SNP site and can determine the type of base at the SNP site based on the presence or absence of hybridization. Specifically, a sequence containing the 101st base of the base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 6, or a probe having a length of 10 or more consecutive bases having a complementary sequence thereof, or a linkage not linked to the 101st base. Examples thereof include a probe having a length of 10 bases or more having a sequence containing bases in an equilibrium relationship or a complementary sequence thereof.
The length of the probe is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 35 bases, and further preferably 20 to 35 bases.
上記プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜６から選ばれる塩基配列の１０１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該１０１番目の塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜５０塩基がより好ましく、１５〜３５塩基がさらに好ましく、２０〜３５塩基が特に好ましい。 Examples of the primer include a primer that can be used for PCR for amplifying the SNP site, or a primer that can be used for sequence analysis (sequencing) of the SNP site. Specifically, a primer that can amplify or sequence the region containing the 101st base of the base sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 6 or a linkage disequilibrium relationship with the 101st base. Examples include primers that can amplify or sequence a region containing a certain base. The length of such a primer is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 50 bases, further preferably 15 to 35 bases, and particularly preferably 20 to 35 bases.
上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。 As a primer for sequencing the SNP site, a primer having a 5′-side region of the base, preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3′-side region of the base, preferably 30 to 100 bases downstream A primer having a sequence complementary to this region is exemplified. As a primer used to determine polymorphism based on the presence or absence of amplification by PCR, it has a sequence containing the base, a primer containing the base on the 3 ′ side, a complementary sequence of the sequence containing the base, Examples include a primer containing a base complementary to the above base on the 3 ′ side.
なお、本発明の検査用試薬は、これらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬、蛍光色素などを含むものであってもよい。 The test reagent of the present invention may contain PCR polymerase, buffer, hybridization reagent, fluorescent dye and the like in addition to these primers and probes.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
１．実験方法
＜オンライン方法＞
対象となる後縦靭帯骨化症の患者は、脊柱のエックス線撮影検査に基づいて、参加病院の経験を積んだ脊椎外科医によって診断された。患者の頸椎における後縦靭帯の異所的骨形成が調べられた。２つよりも多くの脊椎分節の後縦靭帯骨化を有する日本人の患者（総計１，６６０人）が、本試験に含まれた。対照用に、バイオバンク・ジャパンプロジェク
ト（Nakamura, Y. The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-697 (2007)）における後縦靭帯骨化症と無関係の疾患を有する対象に由来するゲノムワイドスクリーニングデータを使用した。全ての個体が本試験に参加する書面によるインフォームド・コンセントを提出した。この研究プロジェクトは理化学研究所（ＲＩＫＥＮ）横浜研究所の倫理委員会によって承認された。
1. Experimental method <Online method>
The subject posterior longitudinal ligament ossification was diagnosed by a spinal surgeon with experience from participating hospitals based on x-ray examination of the spine. Ectopic bone formation of the posterior longitudinal ligament in the patient's cervical spine was examined. Japanese patients (total 1,660) with posterior longitudinal ligament ossification of more than two spinal segments were included in the study. For control purposes, genomes derived from subjects with a disease unrelated to posterior longitudinal ligament ossification in the Biobank Japan Project (Clin Adv Hematol Oncol 5, 696-697 (2007)) Wide screening data was used. All individuals submitted written informed consent to participate in the study. This research project was approved by the ethics committee of RIKEN Yokohama Institute.
＜遺伝子型解析および精度管理＞
ゲノムＤＮＡは、常法にて末梢血白血球から抽出された。ＧＷＡＳは、イルミナ・ヒト・オムニエクスプレス・エクソーム・ビーズチップ（Illumina HumanOmniExpressExome BeadChip）を使用して、症例試料の遺伝子型を解析した。対照試料の遺伝子型は、イルミナ・ヒト・オムニエクスプレス・ビーズチップ（Illumina HumanOmniExpress BeadChip）とイルミナ・ヒト・エクソーム・ビーズチップ（Illumina HumanExome BeadChip）を使用して解析した。
<Genotype analysis and quality control>
Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocytes by a conventional method. GWAS analyzed the genotype of the case samples using an Illumina HumanOmniExpressExome BeadChip. The genotype of the control sample was analyzed using an Illumina HumanOmniExpress BeadChip and an Illumina HumanExome BeadChip.
０．９９未満のコールレートを有するSNPs、ハーディー・ワインベルグ平衡より逸脱するSNPs（対照においてＰ＜１ｘ１０−６）、Ｘ染色体上のSNPs、および非多型性SNPsを排除する標準的なSNP精度管理の後に、総計で６１６，４９６個のSNPsを、さらなる解析のために使用した。試料精度管理については、アイデンティティ・バイ・ステート法を用いて、各試料について潜在的関連性を評価し、少なくとも第二級の関連性を除去した。 Standard SNP accuracy that excludes SNPs with call rates less than 0.99, SNPs that deviate from Hardy-Weinberg equilibrium (P <1 × 10 −6 in the control), SNPs on the X chromosome, and non-polymorphic SNPs After management, a total of 616,496 SNPs were used for further analysis. For sample quality control, identity-by-state methods were used to assess potential relevance for each sample and remove at least secondary relevance.
本試験の集団階層化を検討するために、基準としてのＨａｐＭａｐデータに由来する、ヨーロッパ人（ＣＥＵ）、アフリカ人（ＹＲＩ）、日本人（ＪＰＴ）、および中国漢族（ＣＨＢ）を含む４つの基準集団を用いる主成分分析（ＰＣＡ；Price, A.L. et al. Nat Genet 38, 904-909 (2006)）を実施した。 Four criteria, including European (CEU), African (YRI), Japanese (JPT), and Chinese Han (CHB), derived from HapMap data as criteria, to examine population stratification in this study Principal component analysis using populations (PCA; Price, AL et al. Nat Genet 38, 904-909 (2006)) was performed.
ＪＰＴ／ＣＨＢクラスターに属さない外れ値を有する人を特定するために、上位２つの関連主成分（固有ベクトル）を用いて散布図をプロットした。その後、集団の下位構造をさらに評価するために、症例被検者と対照被検者の遺伝子型の情報のみを使用するＰＣＡ分析を実施した。 In order to identify persons with outliers not belonging to the JPT / CHB cluster, a scatter plot was plotted using the top two related principal components (eigenvectors). Thereafter, in order to further evaluate the substructure of the population, PCA analysis using only genotype information of case and control subjects was performed.
予想されたＰ値に対する観察されたＰ値、および試験対象の潜在的な集団階層化を評価するために、計算された拡張係数値（λ値）を用いて、分位数‐分位数（Ｑ‐Ｑ）プロットを構築した。 To evaluate the observed P value relative to the expected P value and the potential population stratification of the test subject, the quantile-quantile ( A QQ plot was constructed.
ＰＣＡの実施後、以降の解析は、主要な日本人（本土）クラスター内の１，１１２人の症例被検者と６，８１０人の対照を選択して行った。 After the PCA, subsequent analysis was performed by selecting 1,112 case subjects and 6,810 controls in the main Japanese (mainland) cluster.
再現解析では、多重ＰＣＲベース・インベーダーアッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、５４８人の後縦靭帯骨化症の患者の遺伝子型を解析した。また、再現解析における対照として、バイオバンク・ジャパンに登録された後縦靭帯骨化症を有しない６，４６９人を動員した。 In the reproducible analysis, the genotypes of 548 posterior longitudinal ligament ossification patients were analyzed using a multiplex PCR-based invader assay (Third Wave Technologies). In addition, as a control in the reproducibility analysis, 6,469 people who had no posterior longitudinal ligament ossification registered in Biobank Japan were mobilized.
＜統計解析＞
ＧＷＡＳおよび再現解析では、自由度１のコクラン・アーミテージの傾向検定を用いて各SNPの関連を評価した。２×２アレル頻度表から、オッズ比とそれらの信頼区間を計算した。マンテル・ヘンツェル法により、ＧＷＡＳと再現解析のデータを結合し、そして、ブレスロウ・デイ検定（Breslow, N.E. & Day, N.E. IARC Sci Publ, 1-406 (1987)）を用いて、試験間の不均一性を調べた。局所的関連プロットはローカスズーム（ＬｏｃｕｓＺｏｏｍ；Pruim, R.J. et al. Bioinformatics 26, 2336-2337 (2010)）を用いて作成された。
<Statistical analysis>
In GWAS and reproducibility analyses, the association of each SNP was evaluated using the Cochrane Armitage trend test with one degree of freedom. From the 2 × 2 allele frequency table, the odds ratios and their confidence intervals were calculated. Combining GWAS and reproducibility data by the Mantel-Henzel method and using the Breslow Day test (Breslow, NE & Day, NE IARC Sci Publ, 1-406 (1987)) I examined the sex. Local association plots were generated using locus zoom (LocusZoom; Pruim, RJ et al. Bioinformatics 26, 2336-2337 (2010)).
＜インピュテーション（imputation）＞
ｍｉｎｉｍａｃを用いてＧＷＡＳ内での遺伝子型のインピュテーションを実施した。基準集団として１０００人ゲノムプロジェクト（ハプロタイプの相を特定したＪＰＴ、ＣＨＢおよび中国南部漢族（ＣＨＳ）のデータ、２０１２年、３月；1000 Genomes Project Consortium et al. Nature 467, 1061-1073 (2010)）に由来する個体を使用した。１％未満のマイナーアレル頻度および低精度のインピュテーション（ＲＳＱ＜０．９）を有するSNPsは、排除された。関連解析は、ｍａｃｈ２ｄａｔによって遺伝子量について実施した。
<Imputation>
The genotype imputation in GWAS was performed using minimac. 1000 Genome Project as Reference Population (JPT, CHB and Southern China Han (CHS) data specifying haplotype phase, March 2012; 1000 Genomes Project Consortium et al. Nature 467, 1061-1073 (2010)) Individuals derived from were used. SNPs with minor allele frequencies of less than 1% and low precision imputation (RSQ <0.9) were excluded. Association analysis was performed on gene dosage by mach2dat.
２．ＧＷＡＳ
後縦靭帯骨化症感受性遺伝子を同定するために、１，１３０人の後縦靭帯骨化症の個体と、７，１３５人の対照からなる日本人の集団において、オンライン方法によりＧＷＡＳを実施した。
2. GWAS
To identify the posterior longitudinal ligament ossification susceptibility gene, GWAS was performed by online method in 1,130 posterior longitudinal ligament ossification individuals and a Japanese population consisting of 7,135 controls. .
SNP遺伝子型解析データ（オンライン方法）の精度管理フィルター処理の後に、６１６，４９６個の常染色体性SNPsを、コクラン・アーミテージの傾向検定によって関連について調査した。主成分分析（ＰＣＡ）による集団階層化解析によって、本試験における全ての個体が東アジア人であることが示された。 After quality control filtering of SNP genotyping data (online method), 616,496 autosomal SNPs were investigated for association by Cochrane Armitage trend test. A population stratification analysis by principal component analysis (PCA) showed that all individuals in this study were East Asian.
しかし、本試験における後縦靭帯骨化症の症例被検者と対照についての遺伝子型情報のみを用いてＰＣＡ分析を実施すると、主要な日本人クラスター（本土クラスター；Yamaguchi-Kabata, Y. et al. Am J Hum Genet 83, 445-456 (2008)）から分離される小集団の試料が存在した。 However, when PCA analysis was performed using only genotype information on the subjects and controls of posterior longitudinal ligament ossification in this study, the major Japanese clusters (mainland clusters; Yamaguchi-Kabata, Y. et al There was a small population of samples isolated from Am J Hum Genet 83, 445-456 (2008)).
そのため、当該分離される小集団を除く、１，１１２人の後縦靭帯骨化症の症例被検者と６，８１０人の対照からなる主要な日本人クラスターに由来する試料を使用して、分位数‐分位数（Ｑ‐Ｑ）プロットを作成し、ゲノム拡張係数（genomic inflation factor）（λＧＣ）が１．０１であることを見出した。このことは、集団の階層化により、偽陽性関連が生じる可能性が低かったことを示している。 Therefore, using samples derived from a major Japanese cluster consisting of 1,112 posterior longitudinal ligament ossification case subjects and 6,810 controls, excluding the separated small population, A quantile-quantile (QQ) plot was created and found to have a genomic inflation factor (λGC) of 1.01. This indicates that the stratification of the population was unlikely to cause a false positive association.
８ｐ１１．２１、８ｑ２３．１、８ｑ２３．３、１２ｐ１２．２、１２ｐ１１．２２、および２０ｐ１２．３の６か所の染色体領域内の２６個のSNPsが、Ｐ＜５×１０−８というゲノムワイド有意性閾値に達した（図１）。さらに、後縦靭帯骨化症との示唆的な関連（Ｐ＜５×１０−７）を示す追加の２か所の遺伝子座（６ｐ２１．２および１８ｑ２３）を発見した（図１）。 26 SNPs in 6 chromosomal regions of 8p11.21, 8q23.1, 8q23.3, 12p12.2, 12p11.22 and 20p12.3 are genome-wide significant with P <5 × 10 −8 The sex threshold was reached (Figure 1). In addition, two additional loci (6p21.2 and 18q23) were found that showed a suggestive association with posterior longitudinal ligament ossification (P <5 × 10 −7 ) (FIG. 1).
さらなる感受性遺伝子座を調査するため、インピュテーション処理されたSNPsに対する全ゲノム関連の結果を得た。上述した後縦靭帯骨化症との関連が示された計８か所の遺伝子座における８９５個のSNPsが、Ｐ＜５×１０−７で関連することを見出した。他の遺伝子座を発見することはなかった。 In order to investigate further susceptibility loci, genome-wide results for imputed SNPs were obtained. It was found that 895 SNPs at a total of 8 loci that were associated with ossification of the posterior longitudinal ligament described above were related at P <5 × 10 −7 . No other locus was found.
３．再現解析
後縦靭帯骨化症との関連が示された上記８か所の遺伝子座における関連を確定するために、各遺伝子座で最小のＰ値を有するSNPsを、再現解析のために選択した。５４８人の日本人の後縦靭帯骨化症患者および６，４６９人の日本人の対照からなる独立した集団の遺伝子型を解析した。その結果、ボンフェローニ補正の後でも、８個のSNPsのうちの５個について、Ｐ＜６．２５×１０−３（０．０５／８）で有意な関連を見出した（表１）。
3. Reproducibility analysis To determine the association at the above 8 loci that were associated with posterior longitudinal ligament ossification, SNPs with the lowest P value at each locus were selected for reproducibility analysis. . The genotype of an independent population consisting of 548 Japanese posterior longitudinal ligament ossification patients and 6,469 Japanese controls was analyzed. As a result, even after Bonferroni correction, a significant association was found with P <6.25 × 10 −3 (0.05 / 8) for 5 out of 8 SNPs (Table 1).
ＧＷＡＳと再現解析の結果をまとめると、６個のSNPsがＰ＜５×１０−８というゲノムワイド有意性閾値に達した（表１）。これらの６個のSNPsのブレスロウ・デイ検定により、試験間の有意な不均一性の不在（Ｐ＞０．０５）が証明された。 Summarizing the results of GWAS and reproducibility analysis, 6 SNPs reached the genome-wide significance threshold of P <5 × 10 −8 (Table 1). The Breslow Day test of these 6 SNPs demonstrated the absence of significant heterogeneity (P> 0.05) between trials.
次に、ＧＷＡＳデータを用いて、これらの６か所の遺伝子座にある関連性が高いSNPsを調整する条件的分析（conditional analysis）を実施した。それらの６か所の遺伝子座には独立したシグナルは存在しなかった。 Next, conditional analysis was performed using GWAS data to adjust for highly relevant SNPs at these six loci. There were no independent signals at these six loci.
ＧＷＡＳと再現解析のデータを結合したメタ解析において、最も関連性が高いSNPであるｒｓ２４２３２９４（Ｐ複合＝１．１×１０−１３）は、２０ｐ１２．３上のＨＡＯ１の３’隣接領域に位置する（図２ａ）。ＨＡＯ１は主に肝臓と膵臓において発現し、そして、ヒドロキシ酸オキシダーゼをコードし、その酵素は２‐ヒドロキシ酸を酸化する。この領域は、我々が以前に報告した後縦靭帯骨化症の示唆的な連鎖ピーク（非特許文献５）に含まれている。この領域内に、関連についてゲノムワイド有意性閾値（Ｐ＜５×１０−８）に達する８０個のインピュテーション処理されたSNPsを同定した。７１個の関連性が高いSNPs（Ｐ＜１×１０−９）は、ＨＡＯ１の３’隣接領域に位置した（図２ａ）。 In the meta-analysis combining GWAS and reproducibility data, the most relevant SNP, rs242423 (P complex = 1.1 × 10 −13 ), is located in the 3 ′ adjacent region of HAO1 on 20p12.3 (Figure 2a). HAO1 is expressed primarily in the liver and pancreas and encodes hydroxy acid oxidase, which oxidizes 2-hydroxy acid. This region is included in the suggestive linkage peak of posterior longitudinal ligament ossification previously reported by us (Non-Patent Document 5). Within this region, 80 imputed SNPs were identified that reached a genome-wide significance threshold (P <5 × 10 −8 ) for association. Seventy-one highly relevant SNPs (P <1 × 10 −9 ) were located in the 3 ′ adjacent region of HAO1 (FIG. 2a).
８ｑ２３．１における疾患関連領域は、３個の遺伝子、ＲＳＰＯ２、ＥＩＦ３ＥおよびＥＭＣ２を含む（図２ｂ）。これらの３個の遺伝子の機能に関して現在入手できる情報から、ＲＳＰＯ２は後縦靭帯骨化症の発病における最も可能性が高い候補である。ＲＳＰＯ２（Ｒ‐スポンジン２）は、古典的Ｗｎｔ／β‐カテニンシグナル伝達を介したβ‐カテニン活性化に関わるＲ‐スポンジンファミリー（Kim, K.A. et al. Cell Cycle 5, 23-26
(2006)）の分泌タンパク質のメンバーをコードし、そのシグナル伝達は骨芽細胞形成に不可欠である（Monroe, D.G., McGee-Lawrence, M.E., Oursler, M.J. & Westendorf, J.J. Gene 492, 1-18(2012)）。ＲＳＰＯ２の発現の低下が骨関節炎骨芽細胞で報告されており、そして、骨芽細胞のＷｎｔ依存性石灰化がＲＳＰＯ２によって促進される（参照文献１４）。
The disease-related region in 8q23.1 contains three genes, RSPO2, EIF3E and EMC2 (FIG. 2b). From the information currently available regarding the function of these three genes, RSPO2 is the most likely candidate in the pathogenesis of posterior longitudinal ligament ossification. RSPO2 (R-spondin 2) is an R-spondin family involved in β-catenin activation via classical Wnt / β-catenin signaling (Kim, KA et al. Cell Cycle 5, 23-26).
(2006)), and its signal transduction is essential for osteoblast formation (Monroe, DG, McGee-Lawrence, ME, Oursler, MJ & Westendorf, JJ Gene 492, 1-18 ( 2012)). Reduced expression of RSPO2 has been reported in osteoarthritic osteoblasts, and Wnt-dependent calcification of osteoblasts is promoted by RSPO2 (Ref. 14).
ＥＩＦ３Ｅは、真核生物翻訳開始因子３（ｅＩＦ‐３）複合体の構成要素をコードし、その複合体はタンパク質合成の開始におけるいくつかのステップで必要とされる。ｅＩＦ‐３複合体は、４３Ｓ前開始複合体へのｍＲＮＡの動員、およびＡＵＧ認識のためのｍＲＮＡの走査を促進する（Chaudhuri, J., Chowdhury, D. & Maitra, U. J Biol Chem 274,
17975-17980 (1999)）。
EIF3E encodes a component of the eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF-3) complex, which is required for several steps in the initiation of protein synthesis. The eIF-3 complex facilitates the recruitment of mRNA to the 43S pre-initiation complex and the scanning of the mRNA for AUG recognition (Chaudhuri, J., Chowdhury, D. & Maitra, U. J Biol Chem 274,
17975-17980 (1999)).
ＥＭＣ２は、ＥＲ膜タンパク質複合体の構成要素をコードする（Christianson, J.C. et al. Nat Cell Biol 14, 93-105 (2012)）。しかし、その細胞機能は不明である。 EMC2 encodes a component of the ER membrane protein complex (Christianson, J.C. et al. Nat Cell Biol 14, 93-105 (2012)). However, its cellular function is unknown.
染色体１２ｐ１１．２２領域は、ＣＣＤＣ９１を含み（図２ｃ）、ＣＣＤＣ９１はトランスゴルジネットワークに関与するタンパク質をコードする。特に、その疾患関連領域は、ＰＴＨＬＨ遺伝子に隣接して位置し、ＰＴＨＬＨ遺伝子は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）ファミリーのメンバーをコードする。ＰＴＨは、その受容体であるＰＴＨ１Ｒを介して軟骨の骨化を調節し、その軟骨の骨化は後縦靭帯骨化症の進行と関連が有る（Sato, R. et al. J Neurosurg Spine 7, 174-183 (2007)）。 The chromosome 12p11.22 region contains CCDC91 (FIG. 2c), which encodes a protein involved in the trans-Golgi network. In particular, the disease associated region is located adjacent to the PTHHL gene, which encodes a member of the parathyroid hormone (PTH) family. PTH regulates cartilage ossification through its receptor PTH1R, which is associated with the progression of posterior longitudinal ligament ossification (Sato, R. et al. J Neurosurg Spine 7 , 174-183 (2007)).
１２ｐ１２．２遺伝子座における関連SNPsは、ＬＯＣ１００５０６３９３内に存在し（図２ｄ）、それは巨大遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）であると予測されている。ＬＯＣ１００５０６３９３は３つのエクソンからなり、そして、既知のオルソロガスな転写物に対する類似性を持たない推定上の新規遺伝子である。 Related SNPs at the 12p12.2 locus are present in LOC100506393 (FIG. 2d), which is predicted to be a large intergenic noncoding RNA (lincRNA). LOC100506393 consists of three exons and is a putative novel gene that has no similarity to known orthologous transcripts.
８ｑ２３．３における疾患関連領域は、ＬＩＮＣ００５３６とＥＩＦ３Ｈの間にある遺伝子砂漠領域に位置する（図２ｅ）。ＬＩＮＣ００５３６はｌｉｎｃＲＮＡに属する。ＥＩＦ３ＨもｅＩＦ‐３複合体の構成要素をコードする。 The disease-related region in 8q23.3 is located in the gene desert region between LINC00536 and EIF3H (FIG. 2e). LINC00536 belongs to lincRNA. EIF3H also encodes a component of the eIF-3 complex.
６つの後縦靭帯骨化症遺伝子座のうちの２つがｅＩＦ‐３複合体中のタンパク質をコードする遺伝子を有するという事実より、この経路の異常が、後縦靭帯骨化症の発病にとって重要であり得ると示唆される。 This pathway abnormality is important for the pathogenesis of posterior longitudinal ligament ossification due to the fact that two of the six posterior longitudinal ligament ossification loci have genes encoding proteins in the eIF-3 complex. It is suggested that it is possible.
６ｐ２１．１における疾患関連領域も、ＣＤＣ５Ｌ、ＭＩＲ４６４２とＳＵＰＴ３Ｈの
間にある遺伝子砂漠に位置する（図２ｆ）。ＣＤＣ５Ｌ遺伝子がコードする細胞***周期５様（cell division cycle 5-like）タンパク質は、細胞周期のＧ２／Ｍ進行の正の調節因子である（Zhang, N., Kaur, R., Akhter, S. & Legerski, R.J. EMBO Rep 10, 1029-1035(2009)）。ＣＤＣ５Ｌは推定上のＥ３ユビキチンリガーゼ複合体の中核構成要素としても見いだされた。この複合体は酵母からヒトまでメッセンジャーＲＮＡ前駆体のスプライシングに役割を有することが示されている（Ajuh, P. et al. EMBO J 19, 6569-6581(2000)）。
The disease-related region at 6p21.1 is also located in the gene desert between CDC5L, MIR4642 and SUPT3H (FIG. 2f). The cell division cycle 5-like protein encoded by the CDC5L gene is a positive regulator of G2 / M progression in the cell cycle (Zhang, N., Kaur, R., Akhter, S. & Legerski, RJ EMBO Rep 10, 1029-1035 (2009)). CDC5L was also found as a core component of the putative E3 ubiquitin ligase complex. This complex has been shown to have a role in splicing messenger RNA precursors from yeast to human (Ajuh, P. et al. EMBO J 19, 6569-6581 (2000)).
ＣＤＣ５Ｌ遺伝子のイントロン１４内に位置するＭＩＲ４６４２は、その標的遺伝子と機能が未知であるマイクロＲＮＡをコードする。ＳＵＰＴ３Ｈは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される多数の遺伝子の転写に必要とされる出芽酵母の転写因子であるＳｐｔ３のヒトホモログをコードする（Yu, J., Madison, J.M., Mundlos, S., Winston, F. & Olsen, B.R. Genomics 53, 90-96 (1998)）。特に、その疾患関連領域は、骨芽細胞の分化と骨格の形態形成に必須である転写因子をコードするＲＵＮＸ２（Ziros, P.G. et al. J Biol Chem 277, 23934-23941(2002)）の約７６０ｋｂ上流に位置する。Ｒｕｎｘ２は、骨芽細胞に対するＰＴＨの抗アポトーシス作用を仲介する。その作用が骨芽細胞の数を増加させ、そして、強力に骨を形成させることになる（Bellido, T. et al. J Biol Chem 278, 50259-50272 (2003)）。 MIR4642 located within intron 14 of the CDC5L gene encodes a microRNA whose target gene and function are unknown. SUPT3H encodes a human homologue of Spt3, a budding yeast transcription factor required for transcription of a number of genes transcribed by RNA polymerase II (Yu, J., Madison, JM, Mundlos, S., Winston, F. & Olsen, BR Genomics 53, 90-96 (1998)). In particular, the disease-related region is about 760 kb of RUNX2 (Ziros, PG et al. J Biol Chem 277, 23934-23941 (2002)), which encodes a transcription factor essential for osteoblast differentiation and skeletal morphogenesis. Located upstream. Runx2 mediates the anti-apoptotic effect of PTH on osteoblasts. Its action increases the number of osteoblasts and leads to strong bone formation (Bellido, T. et al. J Biol Chem 278, 50259-50272 (2003)).
後縦靭帯骨化症遺伝子座の機能の基礎を理解するために、リンパ芽球様細胞株の解析から得られた公開されて利用可能な全ての発現量的形質遺伝子座データ（Ｇｅｎｅｖａｒ；Yang, T.P. et al. Bioinformatics 26,2474-2476 (2010)）を調査した。しかし、遺伝子型と遺伝子発現の間に有意な関連の証拠はなかった（複数の試験に対する調整の後でＰ＞０．０５）。 To understand the functional basis of the posterior longitudinal ligament ossification locus, all publicly available expression trait loci data (Genevar; Yang, obtained from analysis of lymphoblastoid cell lines) TP et al. Bioinformatics 26,2474-2476 (2010)) was investigated. However, there was no evidence of a significant association between genotype and gene expression (P> 0.05 after adjustment for multiple studies).
後縦靭帯骨化症関連遺伝子座における遺伝子間の関係を調査するために、ＧＲＡＩＬ（Raychaudhuri, S. et al. PLoS Genet 5, e1000534 (2009)）を用いることによって、経路分析を行った。有意なゲノムワイド関連が有る６か所の領域をクエリー領域として使用し、それにより１２個のユニークな遺伝子を分析することになった。分析の結果、翻訳開始のメンバーについて、ＥＩＦ３Ｅ（ｒｓ３７４８１０；Ｐ＝０．０２０）とＥＩＦ３Ｈ（ｒｓ１３２７９７９９；Ｐ＝０．０２１）の関連（Ｐ＜０．０５）を発見した。 Pathway analysis was performed by using GRAIL (Raychaudhuri, S. et al. PLoS Genet 5, e1000534 (2009)) to investigate the relationship between genes at the posterior longitudinal ligament ossification-related locus. Six regions with significant genome-wide associations were used as query regions, thereby analyzing 12 unique genes. As a result of analysis, an association (P <0.05) between EIF3E (rs374810; P = 0.020) and EIF3H (rs132279799; P = 0.021) was found for the translation initiation member.
まとめると、日本人集団におけるＧＷＡＳおよび再現解析により、脊椎靭帯骨化症に対する６つの感受性遺伝子座を同定した。これら６つの感受性遺伝子座に存在するSNPsは、脊椎靭帯骨化症の検査に有用である。また、この結果は、脊椎靭帯骨化症の基礎を成すいくつかの経路の存在を示唆する。これらの経路は、骨芽細胞形成（ＲＳＰＯ２、ＰＴＨＬＨおよびＲＵＮＸ２）、ならびにｍＲＮＡの転写、スプライシングおよび翻訳の制御（ＥＩＦ３Ｅ、ＥＩＦ３Ｈ、ＣＤＣ５ＬおよびＳＵＰＴ３Ｈ）を含み得る。 In summary, six susceptibility loci for vertebral ligament ossification were identified by GWAS and reproduction analysis in the Japanese population. SNPs present at these six susceptibility loci are useful for examination of vertebral ligament ossification. The results also suggest the existence of several pathways that underlie vertebral ligament ossification. These pathways may include osteoblast formation (RSPO2, PTHLH and RUNX2) and regulation of mRNA transcription, splicing and translation (EIF3E, EIF3H, CDC5L and SUPT3H).
以上の通り、全ゲノムレベルでのケース−コントロール（Case-Control）関連解析により、ゲノムワイド水準を満たして脊椎靭帯骨化症と関連する領域が見出された。当該領域に存在するSNPsは、脊椎靭帯骨化症の検査に有用であり、脊椎靭帯骨化症の予防および／または治療に貢献するものである。 As described above, a case-control (Case-Control) -related analysis at the genome level has found a region related to vertebral ligament ossification that meets the genome-wide level. SNPs present in this region are useful for examination of vertebral ligament ossification and contribute to prevention and / or treatment of vertebral ligament ossification.
Claims (9)
（１）配列番号１に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（２）配列番号２に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレル）又はA（非リスクアレル）
（３）配列番号３に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（４）配列番号４に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がA（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）
（５）配列番号５に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレル）又はA（非リスクアレル）
（６）配列番号６に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がC（リスクアレル）又はT（非リスクアレル） One or more single nucleotide polymorphisms selected from the following (1) to (6) derived from the subject are analyzed, and the type of the base is a risk allele based on the analysis result A method of examining the risk of developing vertebral ligament ossification in a subject by determining that the risk of onset is high in the case of non-risk allele in the case, and that the risk of onset is low .
(1) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(2) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(3) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(4) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is A (risk allele) or G (non-risk allele)
(5) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(6) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is C (risk allele) or T (non-risk allele)
（２）配列番号２に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレ
ル）又はA（非リスクアレル）
（３）配列番号３に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がT（リスクアレル）又はC（非リスクアレル）
（４）配列番号４に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がA（リスクアレル）又はG（非リスクアレル）
（５）配列番号５に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がG（リスクアレル）又はA（非リスクアレル）
（６）配列番号６に示す塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基がC（リスクアレル）又はT（非リスクアレル） Reagent for vertebral ligament ossification disease, comprising a polynucleotide capable of analyzing a risk allele of one or more single nucleotide polymorphisms selected from the following (1) to (6) derived from a subject . (1) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(2) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is G (risk allele)
Or A (non-risk allele)
(3) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is T (risk allele) or C (non-risk allele)
(4) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is A (risk allele) or G (non-risk allele)
(5) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is G (risk allele) or A (non-risk allele)
(6) The base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 is C (risk allele) or T (non-risk allele)
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