JP6566350B2

JP6566350B2 - Method for examining scoliosis based on single nucleotide polymorphism in the short arm 22.2 region of chromosome 9

Info

Publication number: JP6566350B2
Application number: JP2015099417A
Authority: JP
Inventors: 志郎池川
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2019-08-28
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: JP2016214091A

Description

本発明は側弯症の発症リスクや発症の有無を判定するための検査方法及び該検査方法に用いられる試薬に関する。また、側弯症の予防薬又は治療薬をスクリーニングする方法に関する。 The present invention relates to a test method for determining the risk of developing scoliosis and the presence or absence of onset, and a reagent used in the test method. The present invention also relates to a method for screening a preventive or therapeutic agent for scoliosis.

側弯症は、脊椎が左右方向に弯曲した病態をいう。側弯症の内、その病因が明らかでないものを特発性側弯症と呼び、側弯症の８０〜９０％を占める。 Scoliosis refers to a condition in which the spine is bent in the left-right direction. Scoliosis whose etiology is not clear is called idiopathic scoliosis and accounts for 80 to 90% of scoliosis.

側弯症は、通学年代の児童に多く発症し、特に、女子に多く発症する。１０歳から骨格が成熟するまでの児童において、側弯の指標であるコブ角（Cobb angle）で少なくとも１０°の弯曲を示し、且つ、その病因が明らかでないものを思春期特発性側弯症（Adolescent idiopathic scoliosis；ＡＩＳ）と定義する。ＡＩＳの発症頻度は、通学年代の児童
の内、日本で２％、世界では２〜３％であり、日本では毎年１万人程度が発症している。 Scoliosis occurs more frequently in school-aged children, especially in girls. Adolescent idiopathic scoliosis (Adolescent) shows a curvature of at least 10 ° at the Cobb angle, which is an index of scoliosis, and the etiology is not clear in children from the age of 10 until the skeleton matures. idiopathic scoliosis (AIS). The incidence of AIS is 2% in school-aged children in Japan and 2-3% in the world, and about 10,000 people develop each year in Japan.

側弯症の診断は主にＸ線検査により行われるが、Ｘ線検査は発症前や発症初期における側弯症の診断には有効でない。また、特発性側弯症の治療は、対症療法により行われるのみで、病因が明らかでない以上、原因療法は行われていない。よって、側弯症の発症前診断（リスク診断）や早期診断を可能にし、また、原因治療を可能にするため、側弯症と関連する遺伝子や一塩基多型（ＳＮＰｓ）の同定が望まれている。 Although scoliosis is diagnosed mainly by X-ray examination, X-ray examination is not effective for diagnosing scoliosis before onset or early onset. Moreover, the treatment of idiopathic scoliosis is performed only by symptomatic therapy, and no causal therapy is performed as long as the etiology is not clear. Therefore, identification of genes and single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with scoliosis is desired in order to enable prediagnosis diagnosis (risk diagnosis) and early diagnosis of scoliosis and to enable causal treatment. .

ゲノムワイド連鎖解析（genome-wide linkage analysis）によりＡＩＳの病因となる多くの遺伝子座が見出されており、ＡＩＳは複雑な遺伝的素因に基づくと考えられている（非特許文献１、２）。また、候補遺伝子解析によりＡＩＳ感受性遺伝子が報告されているが（非特許文献３〜９）、いずれの遺伝子についても別の人種を被験者とした場合にＡＩＳとの関連の再現性が得られていない（非特許文献１０、１１）。 Many loci causing AIS have been found by genome-wide linkage analysis, and AIS is considered to be based on a complex genetic predisposition (Non-Patent Documents 1 and 2). . In addition, although AIS susceptibility genes have been reported by candidate gene analysis (Non-Patent Documents 3 to 9), reproducibility related to AIS has been obtained for any gene when different races are used as subjects. None (Non-Patent Documents 10 and 11).

さらに、近年、伝達不平衡解析（Transmission Disequilibrium Test；ＴＤＴ）法に基づくゲノムワイド関連解析（Genome-wide association study；ＧＷＡＳ）によって、Ａ
ＩＳと関連する遺伝子の候補が報告された（非特許文献１２）。しかしながら、それらは、多重検定補正後のケース−コントロール関連解析においてはＡＩＳとの関連の再現性が得られていない。 Furthermore, in recent years, a genome-wide association study (GWAS) based on the Transmission Disequilibrium Test (TDT) method has been used.
Gene candidates associated with IS have been reported (Non-patent Document 12). However, they are not reproducible in relation to AIS in case-control association analysis after multiple test correction.

一方、近年、ＧＷＡＳによって、第１０染色体長腕２４．３１領域（10q24.31領域）に存在するＳＮＰｓが、日本人集団および中国人集団において、ゲノムワイド水準を満たしてＡＩＳと関連することが見出された（特許文献１、非特許文献１３、１４）。また、同様にＧＷＡＳによって、第６染色体長腕２４．１領域（6q24.1領域）に存在するＳＮＰｓが、日本人集団において、ＡＩＳと関連することが示唆された（特許文献２）。 On the other hand, in recent years, GWAS has seen that SNPs present in the long arm 24.31 region (10q24.31 region) are related to AIS in the Japanese and Chinese populations at a genome-wide level. (Patent Document 1, Non-Patent Documents 13 and 14). Similarly, GWAS suggested that SNPs present in the chromosome 6 long arm 24.1 region (6q24.1 region) are associated with AIS in the Japanese population (Patent Document 2).

第９染色体短腕２２．２領域（9p22.2領域）に存在するＢＮＣ2 (basonuclin-2)遺伝子は、Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガープロテインのグループに属する、高度に保存されている蛋白質をコードすることが知られている。ＢＮＣ２は核スペックルにおいて濃縮しており、ｍＲＮＡの核プロセシングにおける機能を有することが示唆されている（非特許文献１５）。しかし、ＢＮＣ2遺伝子と側弯症との関連は知られていない。 It is known that the BNC2 (basonuclin-2) gene located in the short arm 22.2 region of chromosome 9 (9p22.2 region) encodes a highly conserved protein belonging to the group of C2H2 zinc finger proteins. ing. BNC2 is concentrated in nuclear speckles, suggesting that it has a function in mRNA nuclear processing (Non-patent Document 15). However, the association between the BNC2 gene and scoliosis is not known.

特開２０１３−０４２６７３号公報JP 2013-042673 A 特開２０１４−１３２８７５号公報JP 2014-132875 A

Wise, C.A. et al., Curr. Genomics 9, 51-59 (2008).Wise, C.A. et al., Curr. Genomics 9, 51-59 (2008). Raggio, C. L. et al., J. Orthop. Res. 27, 1366-1372 (2009).Raggio, C. L. et al., J. Orthop. Res. 27, 1366-1372 (2009). Wu, J. et al., Spine 31, 1131-1136 (2006).Wu, J. et al., Spine 31, 1131-1136 (2006). Zhang, H.Q. et al., Spine 34, 760-764 (2009).Zhang, H.Q. et al., Spine 34, 760-764 (2009). Chen, Z. et al., Eur. J. Hum. Genet. 17, 525-532 (2009).Chen, Z. et al., Eur. J. Hum. Genet. 17, 525-532 (2009). Qiu, X. S. et al., Spine 32, 1748-1753 (2007).Qiu, X. S. et al., Spine 32, 1748-1753 (2007). Wang, H. et al., Spine 33, 2199-2203 (2008).Wang, H. et al., Spine 33, 2199-2203 (2008). Inoue, M. et al., Stud. Health Technol. Inform. 91, 90-96 (2002).Inoue, M. et al., Stud. Health Technol. Inform. 91, 90-96 (2002). Yeung, H.Y. et al., Stud. Health Technol. Inform. 123, 18-24 (2006).Yeung, H.Y. et al., Stud. Health Technol. Inform. 123, 18-24 (2006). Takahashi, Y. et al., J. Orthop. Res. 29, 834-837 (2011).Takahashi, Y. et al., J. Orthop. Res. 29, 834-837 (2011). Takahashi, Y. et al., J. Orthop. Res. 29, 1055-1058 (2011).Takahashi, Y. et al., J. Orthop. Res. 29, 1055-1058 (2011). Sharma, S. et al., Hum Mol Genet. 20, 1456-1466 (2011).Sharma, S. et al., Hum Mol Genet. 20, 1456-1466 (2011). Takahashi, Y. et al., Nat. Genet. 43, 1237-1240 (2011).Takahashi, Y. et al., Nat. Genet. 43, 1237-1240 (2011). Fan, YH. et al., J. Hum. Genet. 57, 244-246 (2012).Fan, YH. Et al., J. Hum. Genet. 57, 244-246 (2012). Nature reviews. Molecular cell biology 4, 605-612 (2003).Nature reviews. Molecular cell biology 4, 605-612 (2003).

本発明は、側弯症の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法、及び該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。本発明はまた、側弯症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 It is an object of the present invention to provide a method for accurately examining the risk of developing scoliosis and the presence or absence of onset, and a test reagent used in the method. Another object of the present invention is to provide a screening method for a prophylactic or therapeutic drug for scoliosis.

本発明者らは上記課題の解決のために鋭意検討した結果、第９染色体短腕２２．２領域（9p22.2領域）に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）が思春期特発性側弯症（ＡＩＳ）と関連することを同定した。そして、これらの多型を調べることにより側弯症の発症リスクや発症の推定を正確に実施できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、BNC2遺伝子を過剰発現する胚の多くは側弯症を示すことから、BNC2遺伝子の発現を抑制する物質が側弯症の予防薬や治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a single nucleotide polymorphism (SNP) present in the chromosome 9 short arm 22.2 region (9p22.2 region) is adolescent idiopathic scoliosis ( AIS) was identified. And by investigating these polymorphisms, it discovered that the onset risk and onset estimation of scoliosis could be implemented correctly, and came to complete this invention. Furthermore, since many embryos that overexpress the BNC2 gene exhibit scoliosis, it has been found that a substance that suppresses the expression of the BNC2 gene is useful as a prophylactic or therapeutic agent for scoliosis, and the present invention is completed. It came.

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］第９染色体短腕２２．２領域のBNC2遺伝子内に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする、側弯症の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
［２］前記側弯症が、思春期特発性側弯症である、［１］に記載の方法。
［３］前記一塩基多型が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型が、配列番号１４に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、配列番号１５に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、または配列番号１６に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基である、［３］に記載の方法。
［５］配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０１番目の塩基を含む１０塩基以
上の配列、又はその相補配列を有する側弯症検査用プローブ。
［６］配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる側弯症検査用プライマー。
［７］BNC2遺伝子またはBNC2遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、BNC2遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を低下させる物質を選択する工程を含む、側弯症の予防薬又は治療薬をスクリーニングする方法。
［８］BNC2遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、側弯症の検査方法。 That is, the present invention includes the following aspects.
[1] A risk of developing scoliosis characterized by analyzing a single nucleotide polymorphism present in the BNC2 gene of the short arm 22.2 region of chromosome 9 and examining scoliosis based on the analysis result; // Method for determining presence or absence of onset.
[2] The method according to [1], wherein the scoliosis is adolescent idiopathic scoliosis.
[3] The single nucleotide polymorphism is a single nucleotide polymorphism in a base corresponding to the base number 101 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a base in linkage disequilibrium with the base. [1] or [2].
[4] The single nucleotide polymorphism in the base in a linkage disequilibrium relationship with the base is a base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 14 and a base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 The method according to [3], which is a base corresponding to the 101st base or a base corresponding to the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
[5] A scoliosis test probe having a sequence of 10 bases or more including the base at the base number 101 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof.
[6] A scoliosis test primer capable of amplifying a region containing the base at position 101 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
[7] A step of adding a drug candidate substance to a cell that expresses a BNC2 gene or a reporter gene linked to a promoter of the BNC2 gene, a step of measuring the expression level of the BNC2 gene or the reporter gene, and a substance that decreases the expression level A method for screening for a prophylactic or therapeutic agent for scoliosis, which comprises the step of:
[8] A method for examining scoliosis, comprising measuring the expression level of mRNA or protein of BNC2 gene.

本発明によれば、これまで予測が困難であった側弯症の発症リスク（罹患リスク）を正確かつ簡便に予測することができる。また、側弯症の発症を正確かつ簡便に判定することができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、側弯症の治療薬または予防薬を得ることができる。したがって、本発明は側弯症の予防や早期治療に貢献するものである。 According to the present invention, it is possible to accurately and easily predict the risk of developing scoliosis (morbidity risk) that has been difficult to predict. Moreover, the onset of scoliosis can be determined accurately and simply. Moreover, according to the screening method of the present invention, a therapeutic or prophylactic agent for scoliosis can be obtained. Therefore, the present invention contributes to prevention and early treatment of scoliosis.

9p22上のBNC2部位の領域内関連プロットを示す図。LocusZoomソフトウェアを使用して、思春期特発性側弯症とSNPとの関連の-log₁₀（P値）が、SNPが存在する染色体の位置（NCBI Build 37）にプロットされている。推定組み換え率は1000ゲノムプロジェクトEAS遺伝子型データに基づいている。最も高い関連を示すシグナルを有するSNPはrs3904778であり、その他のSNPはrs3904778との連鎖不平衡(r²)に従って色づけされている。最も有意な関連を示すSNPは、BNC2のイントロン３に存在する。The figure which shows the related plot in the area | region of BNC2 site | part on 9p22. Using LocusZoom software, the -log ₁₀ (P value) association between adolescent idiopathic scoliosis and SNP is plotted at the position of the chromosome where the SNP is located (NCBI Build 37). Estimated recombination rates are based on 1000 Genome Project EAS genotype data. The SNP with the highest association signal is rs3904778, and the other SNPs are colored according to linkage disequilibrium (r ² ) with rs3904778. The SNP showing the most significant association is in intron 3 of BNC2. 様々なヒト組織におけるBNC2mRNAの発現を示す図。子宮、脊髄、骨および軟骨にBNC2の高発現が見られた。The figure which shows the expression of BNC2mRNA in various human tissues. High expression of BNC2 was found in the uterus, spinal cord, bone and cartilage. In vitroにおけるrs10738445機能のアレルによる差異の解析を示す図。（ａ）rs10738445構築物とpGL3プロモーターベクター（−）の転写エンハンサー活性を示すグラフ。非リスクアレルを含む構築物（N）と比較して、リスクアレルを含む構築物（R）は約1.3倍高いルシフェラーゼ活性を示した。アスタリスク：P値＜0.01（ｔ検定）。（ｂ）電気泳動の移動度シフトアッセイの結果を示す図（写真）。未ラベルプローブがコンペティターとして使用された。抗YY1抗体の添加によりリスクアレルに特異的なバンド（矢印）とスーパーシフト（矢尻）が消失した。（ｃ）YY１発現ベクターの有無によるrs10738445構築物の転写エンハンサー活性を示すグラフ。ルシフェラーゼ活性は、Nを含む構築物よりもRを含む構築物においてより高かった。YY1の添加はRとNの両方の場合においてルシフェラーゼ活性を増加させた。The figure which shows the analysis of the difference by the allele of rs10738445 function in vitro. (A) A graph showing the transcription enhancer activity of the rs10738445 construct and the pGL3 promoter vector (−). Compared to the construct containing the non-risk allele (N), the construct containing the risk allele (R) showed about 1.3 times higher luciferase activity. Asterisk: P value <0.01 (t test). (B) The figure (photograph) which shows the result of the mobility shift assay of electrophoresis. An unlabeled probe was used as a competitor. By adding anti-YY1 antibody, the band (arrow) and supershift (arrowhead) specific to the risk allele disappeared. (C) Graph showing the transcription enhancer activity of the rs10738445 construct with and without the YY1 expression vector. Luciferase activity was higher in the construct containing R than in the construct containing N. Addition of YY1 increased luciferase activity in both R and N cases. ゼブラフィッシュ胚におけるBNC2の過剰発現の影響を示す図。（ａ）ＥＧＦＰ（コントロール）とBNC2を過剰発現している胚（受精後24時間）の写真。導入遺伝子はtol2仲介遺伝子組み換えによって安定に発現された。ユビキタスな導入遺伝子発現は、コントロールの初代（founder）胚（左）において緑色蛍光色素によって確認された。BNC2トランスジェニック胚は、顕著な脊柱変形と深刻な体節奇形を示した。スケールバーは1mmを示す。（ｂ）ＥＧＦＰ（コントロール）とBNC2を過剰発現している胚の発生上の表現型を定量化したグラフを示す。「lethal」は受精後２４〜２８時間の間に死亡した胚の数の割合を示し、「abnormal somite」は側弯症を含む異常に変形した体節を有する胚の数の割合を示し、「normal」は体節において明らかな異常がない胚の数の割合を示す。（ｃ）漸増する投与量でBNC2mRNAを注入されたゼブラフィッシュ胚（受精後２４時間）を示す写真。4枚の写真は左から右に向かって、１０、５０、１００および２００ｐｇのBNC2mRNAが、それぞれ注入された胚を示す。mRNAの注入は、側弯症および深刻な体節奇形を投与量依存的に引き起こした。矢尻は、最も高濃度（２００ｐｇ）でmRNAが注入された胚における色素形成の遅滞を示す。スケールバーは50ｍｍを示す。（ｄ）BNC2mRNAを注入した胚の発生上の表現型を定量化したグラフを示す。受精後２４〜２８時間の間の胚が、（ｂ）と同様に形態学的に評価された。The figure which shows the influence of overexpression of BNC2 in a zebrafish embryo. (A) A photograph of an embryo overexpressing EGFP (control) and BNC2 (24 hours after fertilization). The transgene was stably expressed by tol2-mediated genetic recombination. Ubiquitous transgene expression was confirmed by green fluorescent dye in control founder embryos (left). BNC2 transgenic embryos showed marked spinal deformity and severe segmental malformations. The scale bar indicates 1 mm. (B) A graph quantifying the developmental phenotype of embryos overexpressing EGFP (control) and BNC2. “Lethal” indicates the percentage of embryos that died between 24 and 28 hours after fertilization, “abnormal somite” indicates the percentage of embryos with abnormally deformed somites including scoliosis, “normal” "" Indicates the percentage of embryos with no apparent abnormalities in the somites. (C) Photograph showing zebrafish embryos (24 hours after fertilization) injected with BNC2 mRNA at increasing doses. The four pictures show embryos injected with 10, 50, 100 and 200 pg of BNC2 mRNA, respectively, from left to right. Infusion of mRNA caused scoliosis and severe segmental malformations in a dose-dependent manner. Arrowheads show a delay in pigmentation in embryos injected with mRNA at the highest concentration (200 pg). The scale bar indicates 50 mm. (D) A graph quantifying the developmental phenotype of embryos injected with BNC2 mRNA. Embryos between 24 and 28 hours after fertilization were evaluated morphologically as in (b).

＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第９染色体短腕２２．２領域（9p22.2領域）に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする、側弯症の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは側弯症の発症リスクの検査及び側弯症の発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、ＳＮＰの分析結果を、側弯症の発症リスクおよび／または発症の有無と関連付ける。本発明の方法においては、ＳＮＰを検査する試料を検査対象者から得る工程をさらに含めても良い。 <1> Method of the Present Invention The method of the present invention analyzes a single nucleotide polymorphism (SNP) present in human chromosome 9 short arm 22.2 region (9p22.2 region), and based on the analysis result. A method for determining the risk of onset of scoliosis and / or the presence or absence of onset, characterized by examining scoliosis. That is, in the present invention, the “test” includes a test for the risk of developing scoliosis and a test for the presence or absence of scoliosis. In the method of the present invention, the analysis result of SNP is associated with the risk of developing scoliosis and / or the presence or absence of the onset. In the method of this invention, you may further include the process of obtaining the sample which test | inspects SNP from a test subject.

本発明における側弯症としては、特に限定されないが、例えば、従来病因が特定されていない特発性側弯症の検査に好適に用いられる。側弯症は、先天性、若年性、思春期性、成人性等、いずれの時期に発症するものであってもよいが、思春期性側弯症であるのが好ましく、思春期特発性側弯症（ＡＩＳ）であるのがより好ましい。 The scoliosis in the present invention is not particularly limited, but for example, it is suitably used for the examination of idiopathic scoliosis for which the etiology has not been specified. Scoliosis may occur at any time, such as congenital, juvenile, adolescent, adult, etc., but is preferably adolescent scoliosis, and adolescent idiopathic scoliosis ( AIS) is more preferred.

本発明の方法は、いずれの人種の被験者に対しても用いることができる。本発明の方法は、例えば、日本人や中国人等のアジア人の被験者や白人の被験者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、いずれの性別の被験者に対しても用いることができるが、特に、女性被験者に対して好適に用いることができる。 The method of the present invention can be used for subjects of any race. The method of the present invention can be suitably used for Asian subjects such as Japanese and Chinese and white subjects, for example. Moreover, although the method of this invention can be used with respect to the test subject of any sex, it can be used suitably especially with respect to a female test subject.

9p22.2領域に存在する具体的なＳＮＰとしては、ヒトrs3904778を挙げることができる
。ここで、rs番号は、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。rs3904778は、9p22.2領域のBNC2遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置する。よって、特に、当該
連鎖不平衡ブロックに存在するＳＮＰ、例えばBNC2遺伝子上に存在するＳＮＰを解析することによって、側弯症を検査することができる。BNC2遺伝子としては、具体的には、GenBank Accession No. NC_000009.11の16409501〜16870786の領域が挙げられる。 As a specific SNP existing in the 9p22.2 region, human rs3904778 can be mentioned. Here, the rs number indicates the registration number of the dbSNP database (http // www.ncbi.nlm.nih.gov / projects / SNP /) of National Center for Biotechnology Information. rs3904778 is located in a linkage disequilibrium block containing the BNC2 gene of the 9p22.2 region. Therefore, in particular, scoliosis can be examined by analyzing SNPs present in the linkage disequilibrium block, for example, SNPs present on the BNC2 gene. Specific examples of the BNC2 gene include the 16409501 to 16870786 region of GenBank Accession No. NC_000009.11.

rs3904778はGenBank Accession No. NC_000009.11の16681993番目の塩基におけるシト
シン（Ｃ）／グアニン（Ｇ）の多型を意味し、この塩基が表６のReverse配列においてＧ
である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高い（表２及び４）。たとえば、この塩基がＣである場合と比べて、この塩基がＧである場合は、側弯症の可能性または発症リスクが１．１５−１．２７倍高い（表３）。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＣ＞ＣＣの順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、側弯症の治療を行うことが考えられる。 rs3904778 means a polymorphism of cytosine (C) / guanine (G) in the 16681993 position base of GenBank Accession No. NC — 000009.11, and this base is a G in the Reverse sequence of Table 6.
, There is a high probability or risk of developing scoliosis (Tables 2 and 4). For example, when this base is G, the likelihood or risk of developing scoliosis is 1.15 to 1.27 times higher than when this base is C (Table 3). Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, the possibility of scoliosis or the risk of onset is high in the order of GG>GC> CC. Therefore, it is conceivable to treat scoliosis for a subject whose base is G.

なお、rs3904778について、ＳＮＰ塩基及びその前後１００ｂｐの領域を含む合計２０
１ｂｐの長さの配列を、配列番号１に示した。配列番号１における１０１番目の塩基が多型を有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高いと判定する。 For rs3904778, a total of 20 including the SNP base and the region of 100 bp before and after that.
The 1 bp long sequence is shown in SEQ ID NO: 1. When the 101st base in SEQ ID NO: 1 has a polymorphism and this base is C (risk allele), it is determined that the possibility of scoliosis or the risk of onset is high.

本発明においては、上記塩基に相当する塩基を解析する。「上記塩基に相当する塩基」とは、上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がＳＮＰ以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。 In the present invention, a base corresponding to the above base is analyzed. The “base corresponding to the above base” means the corresponding base in the above region. That is, “analyzing the base corresponding to the base” includes analyzing the base in the region even if the sequence is slightly changed at a position other than the SNP due to a difference in race. .

また、本発明において解析する塩基は上記のものに限定されず、上記の塩基と連鎖不平
衡にある塩基の多型を分析してもよい。ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基とｒ²＞０．５、好ましくはｒ²＞０．８、さらに好ましくはｒ²＞０．９
の関係を満たす塩基をいう。ｒ²は連鎖不平衡係数である。また上記の塩基と連鎖不平衡
にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等
を用いて同定することができる。もしくは、複数人（通常は２０〜４０人程度）から採取したＤＮＡをシークエンサーにて配列解析し、連鎖不平衡にあるＳＮＰを探索することにより同定することもできる。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、遺伝子型を考慮して解析した場合は、リスクアレルのホモ接合体＞リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体＞非リスクアレルのホモ接合体の順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。 In addition, the base to be analyzed in the present invention is not limited to the above, and a polymorphism of a base in linkage disequilibrium with the above base may be analyzed. Here, the “base in linkage disequilibrium with the above-mentioned base” means that the above-mentioned base and r ² > 0.5, preferably r ² > 0.8, more preferably r ² > 0.9.
A base that satisfies the above relationship. r ² is a linkage disequilibrium coefficient. In addition, a base in linkage disequilibrium with the above base can be identified using, for example, the HapMap database (http://www.hapmap.org/index.html.ja). Alternatively, DNA collected from a plurality of people (usually about 20 to 40 people) can be identified by sequence analysis using a sequencer and searching for SNPs in linkage disequilibrium. Bases that are in linkage disequilibrium with the above bases, when analyzed in consideration of genotype, are homozygous for risk allele> heterozygote for risk allele and non-risk allele> In order, there is a high probability or risk of scoliosis.

rs3904778と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs3850444、rs2383002、rs10738445が挙げられる（表４）。 Specific examples of bases in linkage disequilibrium with rs3904778 include rs3850444, rs2383002, and rs10738445 (Table 4).

rs3850444はGenBank Accession No. NC_000009.11の16681762番目の塩基におけるグア
ニン（Ｇ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基が表６のForward配列においてＧ
である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高い（表４）。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＧＧ＞ＧＣ＞ＣＣの順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＧである被験者には、側弯症の治療を行うことが考えられる。 rs3850444 means a polymorphism of guanine (G) / cytosine (C) at the 16681762 base of GenBank Accession No. NC — 000009.11, and this base is G in the forward sequence of Table 6.
, There is a high risk or risk of developing scoliosis (Table 4). Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, the possibility of scoliosis or the risk of onset is high in the order of GG>GC> CC. Therefore, it is conceivable to treat scoliosis for a subject whose base is G.

なお、rs3850444について、ＳＮＰ塩基及びその前後１００ｂｐの領域を含む合計２０
１ｂｐの長さの配列を、配列番号１４に示した。配列番号１４における１０１番目の塩基が多型を有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高いと判定する。 For rs3850444, a total of 20 including the SNP base and the region of 100 bp before and after that.
The sequence of 1 bp length is shown in SEQ ID NO: 14. When the 101st base in SEQ ID NO: 14 has a polymorphism and this base is C (risk allele), it is determined that the possibility of scoliosis or the risk of onset is high.

rs2383002はGenBank Accession No. NC_000009.11の16687187番目の塩基におけるシト
シン（Ｃ）／チミン（Ｔ）の多型を意味し、この塩基が表６のReverse配列においてＣで
ある場合は側弯症の可能性または発症リスクが高い（表４）。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＣＣ＞ＣＴ＞ＴＴの順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＣである被験者には、側弯症の治療を行うことが考えられる。 rs2383002 means a polymorphism of cytosine (C) / thymine (T) at the 16687187th base of GenBank Accession No. NC_000009.11. If this base is C in the reverse sequence of Table 6, there is a possibility of scoliosis Or the risk of onset is high (Table 4). Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, the possibility of scoliosis or onset risk is high in the order of CC>CT> TT. Therefore, it is conceivable that a subject whose base is C is treated for scoliosis.

なお、rs2383002について、ＳＮＰ塩基及びその前後１００ｂｐの領域を含む合計２０
１ｂｐの長さの配列を、配列番号１５に示した。配列番号１５における１０１番目の塩基が多型を有し、この塩基がＣ（リスクアレル）である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高いと判定する。 For rs2383002, a total of 20 including the SNP base and the region of 100 bp before and after that.
The sequence of 1 bp length is shown in SEQ ID NO: 15. When the 101st base in SEQ ID NO: 15 has a polymorphism and this base is C (risk allele), it is determined that the possibility or risk of developing scoliosis is high.

rs10738445はGenBank Accession No. NC_000009.11の16680138番目の塩基におけるアデニン（Ａ）／シトシン（Ｃ）の多型を意味し、この塩基が表６のReverse配列においてＡ
である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高い（表４）。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、ＡＡ＞ＡＣ＞ＣＣの順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がＡである被験者には、側弯症の治療を行うことが考えられる。 rs10738445 means a polymorphism of adenine (A) / cytosine (C) at the 16680138th base of GenBank Accession No. NC — 000009.11, and this base is A in the Reverse sequence of Table 6.
, There is a high risk or risk of developing scoliosis (Table 4). Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, the possibility of scoliosis or the risk of onset is high in the order of AA>AC> CC. Therefore, it is conceivable that a subject whose base is A is treated for scoliosis.

なお、rs10738445について、ＳＮＰ塩基及びその前後１００ｂｐの領域を含む合計２０１ｂｐの長さの配列を、配列番号１６に示した。配列番号１６における１０１番目の塩基が多型を有し、この塩基がＡ（リスクアレル）である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高いと判定する。 Regarding rs10738445, a sequence having a total length of 201 bp including the SNP base and a region of 100 bp before and after that is shown in SEQ ID NO: 16. When the 101st base in SEQ ID NO: 16 has a polymorphism and this base is A (risk allele), it is determined that the possibility or risk of developing scoliosis is high.

上記ＳＮＰの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて側弯症と関連付けることにより、側弯症を検査することができる。上記ＳＮＰは単独で解析されてもよいし、上記ＳＮＰの少なくとも１つを含む複数のＳＮＰｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記ＳＮＰの複数をまとめて解析してもよいし、上記Ｓ
ＮＰの少なくとも１つと、側弯症と関連する既知のＳＮＰｓ（非特許文献１３等）や当該既知のＳＮＰｓと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。たとえば、rs3904778と、rs11190870、rs625039、rs11598564（特許文献１）、およびrs6570507（特許文献２）の１つ以上とを組み合わせることが挙げられる。側弯症と関連する複数のＳＮＰｓをまとめて解析すれば、側弯症の検査の精度が向上する。なお、いずれのＳＮＰも、二本鎖ＤＮＡのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、BNC2遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。 Scoliosis can be examined by examining the types of the SNP bases and associating the obtained results with scoliosis based on the above criteria. The SNP may be analyzed alone, or a plurality of SNPs including at least one of the SNPs may be collectively analyzed (haplotype analysis). For example, a plurality of the SNPs may be analyzed together, or the S
You may analyze combining at least 1 NP and the known SNPs (nonpatent literature 13 etc.) relevant to scoliosis, and the SNPs which are in the linkage disequilibrium with the said known SNPs. For example, combining rs3904778 with one or more of rs11190870, rs625039, rs11598564 (patent document 1), and rs6570507 (patent document 2) can be mentioned. If a plurality of SNPs related to scoliosis are analyzed together, the accuracy of the scoliosis test is improved. Any SNP may analyze either strand of the double-stranded DNA. For example, for the sequence of the BNC2 gene, the sense strand may be analyzed, or the antisense strand may be analyzed.

ＳＮＰの解析に用いる試料は、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されない。ＳＮＰの解析に用いる試料としては、例えば、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。ＳＮＰの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。 The sample used for SNP analysis is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA. Examples of the sample used for SNP analysis include body fluids such as blood, urine, and cerebrospinal fluid, cells such as the cervix and oral mucosa, and body hairs such as hair. Although these samples can be used directly for the analysis of SNP, it is preferable to isolate chromosomal DNA from these samples by a conventional method and analyze it.

ＳＮＰの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。 The analysis of SNP can be performed by a normal gene polymorphism analysis method. Examples include, but are not limited to, sequence analysis, PCR, hybridization, invader method and the like.

シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、そ
の解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめＳＮＰ部位を含む断片をＰＣＲなどによって増幅しておくことが好ましい。 Sequence analysis can be performed by an ordinary method. Specifically, a sequence reaction is performed using a primer set at a position of several tens of bases on the 5 ′ side of a base showing polymorphism, and the type of base at the corresponding position is determined from the analysis result. can do. In addition, it is preferable to amplify the fragment containing the SNP site in advance by PCR or the like before the sequencing reaction.

また、ＳＮＰの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２
３３３７９号公報）、ＳｍａｒｔＡｍｐ法（特許第３８９７８０５号明細書）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。 SNP analysis can be performed by examining the presence or absence of amplification by PCR. For example, a primer having a sequence corresponding to a region containing a base showing a polymorphism and having a 3 ′ end corresponding to each polymorph is prepared. PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined depending on the presence or absence of the amplification product. Further, the LAMP method (Japanese Patent No. 3313358), NASBA method (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification; Japanese Patent No. 2844386), ICAN method (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-2).
33379), the SmartAmp method (Japanese Patent No. 3897805), and the like can also be examined. In addition, a single-strand amplification method may be used.

また、ＳＮＰ部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 It is also possible to amplify a DNA fragment containing a SNP site and determine which type of polymorphism is based on the mobility of the amplified product in electrophoresis. An example of such a method is a PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method (Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146.). Specifically, first, DNA containing the target SNP is amplified, and the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA. Next, the dissociated single-stranded DNA is separated on a non-denaturing gel, and the type of polymorphism can be determined by the difference in mobility of the separated single-stranded DNA on the gel.

さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 Furthermore, when a base showing polymorphism is included in the restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method). In this case, first, the DNA sample is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments can then be separated and the type of polymorphism determined by the size of the detected DNA fragment.

また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってＳＮＰがいずれの塩基であるかを調べることもできる。 It is also possible to analyze the type of polymorphism by examining the presence or absence of hybridization. That is, a probe corresponding to each base is prepared, and it is also possible to examine which base the SNP is by examining which probe hybridizes.

このようにしてＳＮＰがいずれの塩基であるかを決定することで、側弯症を検査するためのデータを得ることができる。
本発明の方法により判定された結果は、必要に応じて医師等に提供される。結果を提供された医師等は、身体診察、X線検査、CT検査等の必要な検査を行った上で、発症のリス
クを診断することができる。医師等がＡＩＳの発症リスクが高いと診断した場合には、装具やギプスの装着や牽引等の治療を施すことができる。また、リスクが低いと診断した場合には、患者に取って負担が大きいこれらの治療を回避することができる。 By determining which base the SNP is in this way, data for examining scoliosis can be obtained.
The result determined by the method of the present invention is provided to a doctor or the like as necessary. Doctors who are provided with the results can diagnose the risk of onset after conducting necessary examinations such as physical examination, X-ray examination, and CT examination. When a doctor or the like diagnoses that the risk of developing AIS is high, treatment such as wearing or pulling a brace or cast can be performed. In addition, when it is diagnosed that the risk is low, it is possible to avoid these treatments which are burdensome for the patient.

＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、側弯症を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記ＳＮＰ部位を含み、ハイブリダイズの有無によってＳＮＰ部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１に示す塩基配列の１０１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。なお、「当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基」及びその前後の領域の塩基配列は、例えば、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）から取得できる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。 <2> Test reagent of the present invention The present invention also provides test reagents such as primers and probes for testing scoliosis. Examples of such a probe include a probe that includes the SNP site and can determine the type of base at the SNP site based on the presence or absence of hybridization. Specifically, a sequence containing the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a probe having a length of 10 bases or more having its complementary sequence, or a base in a linkage disequilibrium relationship with the base Examples thereof include a probe having a length of 10 bases or more having a sequence or a complementary sequence thereof. The nucleotide sequences of “bases in linkage disequilibrium with the base” and the regions before and after the base are, for example, the dbSNP database (http // www.ncbi.nlm.nih.gov / projects) of National Center for Biotechnology Information. / SNP /). The length of the probe is preferably 15 to 35 bases, more preferably 20 to 35 bases.

また、プライマーとしては、上記ＳＮＰ部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記ＳＮＰ部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１に示す塩基配列の１０１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。 Examples of the primer include a primer that can be used for PCR for amplifying the SNP site, or a primer that can be used for sequence analysis (sequencing) of the SNP site. Specifically, a primer that can amplify or sequence the region containing the 101st base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a region containing a base that is in linkage disequilibrium with the base Examples include primers that can be amplified or sequenced. The length of such a primer is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 35 bases, and even more preferably 20 to 35 bases.

上記ＳＮＰ部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。 As a primer for sequencing the SNP site, a primer having a sequence 5 ′ side of the base, preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3 ′ side region of the base, preferably 30 to 100 bases downstream A primer having a sequence complementary to this region is exemplified. As a primer used to determine polymorphism based on the presence or absence of amplification by PCR, it has a sequence containing the base, a primer containing the base on the 3 ′ side, a complementary sequence of the sequence containing the base, Examples include a primer containing a base complementary to the above base on the 3 ′ side.

なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。 The test reagent of the present invention may contain PCR polymerase, buffer, hybridization reagent, etc. in addition to these primers and probes.

＜３＞側弯症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法
本発明においては、後述のとおり、BNC2遺伝子を過剰発現する胚の多くは側弯症を示し、いくつかは重篤な体節奇形となることが示された。したがって、BNC2の発現を低下させる活性を指標にして薬剤をスクリーニングすることにより、側弯症の予防薬又は治療薬となりうる物質を得ることができる。 <3> Screening method for preventive or therapeutic agent for scoliosis In the present invention, as described later, many embryos that overexpress the BNC2 gene show scoliosis, and some become severe segmental malformations. It has been shown. Therefore, a substance that can be used as a prophylactic or therapeutic drug for scoliosis can be obtained by screening a drug using the activity of reducing the expression of BNC2 as an index.

すなわち、本発明のスクリーニング方法としては、BNC2遺伝子またはBNC2遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、BNC2遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を低下させる物質を選択する工程を含む、側弯症の予防薬又は治療薬のスクリーニング方法が挙げられる。 That is, the screening method of the present invention includes a step of adding a drug candidate substance to a cell expressing a reporter gene linked to a BNC2 gene or a promoter of the BNC2 gene, a step of measuring the expression level of the BNC2 gene or the reporter gene, and A screening method for a prophylactic or therapeutic drug for scoliosis, which includes a step of selecting a substance that reduces the expression level.

例えば、医薬候補物質の存在下において、BNC2遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量が医薬候補物質非存在下と比べて抑制される場合に、当該医薬候補物質を側弯症の予防薬又は治療薬の候補物質として選択することができる。 For example, in the presence of a drug candidate substance, when the expression level of the BNC2 gene or reporter gene is suppressed compared to that in the absence of the drug candidate substance, the drug candidate substance is a candidate substance for a prophylactic or therapeutic drug for scoliosis Can be selected.

BNC2遺伝子を発現する細胞としては、マウスの卵巣、子宮および脳等の細胞、ゼブラフィッシュの卵巣、知覚神経節、後脳および眼等の細胞、ヒトの子宮、脊髄および軟骨等の細胞を用いることができる。 BNC2 gene-expressing cells include mouse ovary, uterus and brain cells, zebrafish ovary, sensory ganglia, hindbrain and eye cells, human uterus, spinal cord and cartilage cells. Can do.

BNC2遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、BNC2遺伝子のプロモーターとしては、転写開始点の上流約２ｋｂｐを含む領域が好ましく、上流約５ｋｂｐを含む領域がより好ましい。プロモーターの配列情報はGenBank Accession No. NC_000009.11などより入手できる。 When a reporter gene linked to a BNC2 gene promoter is used, the BNC2 gene promoter is preferably a region containing about 2 kbp upstream of the transcription start site, and more preferably a region containing about 5 kbp upstream. The sequence information of the promoter can be obtained from GenBank Accession No. NC_000009.11.

レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが例示できる。これらのレポーター遺伝子をBNC2遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入するために用いられるプラスミドに組み込み、リポフェクションなどの通常の方法にて細胞にトランスフェクションする。 Examples of reporter genes include luciferase gene, GFP gene, chloramphenicol acetyltransferase gene and the like. These reporter genes are linked to the promoter of the BNC2 gene, incorporated into a plasmid used for introducing the gene into mammalian cells, and transfected into cells by a conventional method such as lipofection.

上記のようなBNC2遺伝子を発現する細胞、又はレポーター遺伝子が導入された細胞に医薬候補物質を添加し、BNC2遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する。 A drug candidate substance is added to a cell expressing the BNC2 gene as described above or a cell into which the reporter gene has been introduced, and the expression level of the BNC2 gene or the reporter gene is measured.

医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドや核酸であってもよい。スクリーニングには個々の候補物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。候補物質の中から、BNC2遺伝子又はレポーター遺伝子の発現量を（非添加時と比べて）低下させるものを選択することにより、側弯症の予防薬又は治療薬となりうる物質を得ることができる。 There is no restriction | limiting in particular as a pharmaceutical candidate substance, For example, a low molecular synthetic compound may be sufficient and the compound contained in a natural product may be sufficient. Further, it may be a peptide or a nucleic acid. Although individual candidate substances may be used for screening, a compound library containing these substances may be used. By selecting a candidate substance that lowers the expression level of the BNC2 gene or reporter gene (compared to when it is not added), a substance that can be a prophylactic or therapeutic drug for scoliosis can be obtained.

BNC2遺伝子の発現量はＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡ、Western blotting、In situ hybridization、免疫組織染色などの方法により測定すること
ができる。レポーター遺伝子の発現量はレポーター遺伝子の種類にもよるが、蛍光強度や発光強度、放射能強度などによって測定することができる。 The expression level of the BNC2 gene can be measured by methods such as RT-PCR, quantitative PCR, Northern blot, ELISA, Western blotting, In situ hybridization, and immunohistochemical staining. Although the expression level of the reporter gene depends on the type of reporter gene, it can be measured by fluorescence intensity, luminescence intensity, radioactivity intensity, and the like.

＜４＞BNC2遺伝子の発現量に基づく検査方法
本発明はまた、BNC2遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、側弯症の検査方法（検査データを得る方法）を提供する。BNC2遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量が健常人などの対照と比べて増加している場合、側弯症に罹患している、または側弯症の危険性が高いと判定することができる。本発明の検査方法においては、発現量を測定する試料を検査対象者から得る工程をさらに含めてもよい。 <4> Testing Method Based on BNC2 Gene Expression Level The present invention also provides a scoliosis testing method (a method for obtaining test data), which includes a step of measuring the expression level of BNC2 gene mRNA or protein. When the expression level of mRNA or protein of the BNC2 gene is increased compared to a control such as a healthy person, it can be determined that the patient is suffering from scoliosis or has a high risk of scoliosis. In the test | inspection method of this invention, you may further include the process of obtaining the sample which measures expression level from a test subject.

BNC2遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、マイクロアレイ法などで調べることができる。また、BNC2遺伝子産物の発現量はＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどで調べることができる。抗体は市販の抗体を用いることもできるし、BNC2蛋白質のアミノ酸配列（例えば配列番号１８）の一部を抗原として作製された抗体を用いることもできる。BNC2のコード領域の塩基配列としては配列番号１７が例示され、この配列等を利用して発現解析用プライマーやプローブなどを設計または取得することができる。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーとしては、例えば、配列番号１２および１３のプライマーセットが例示される。
検査に用いる試料としては、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。 The expression level of the BNC2 gene can be examined by RT-PCR, Northern blot, microarray method and the like. Further, the expression level of the BNC2 gene product can be examined by ELISA, Western blot, or the like. As the antibody, a commercially available antibody can be used, and an antibody prepared by using a part of the amino acid sequence of the BNC2 protein (for example, SEQ ID NO: 18) as an antigen can also be used. SEQ ID NO: 17 is exemplified as the base sequence of the coding region of BNC2, and primers or probes for expression analysis can be designed or obtained using this sequence or the like. As a primer of RT-PCR, the primer set of sequence number 12 and 13 is illustrated, for example.
Samples used for the test include body fluids such as blood, urine, and cerebrospinal fluid, cells such as the cervix and oral mucosa, and body hairs such as hair.

また、本発明においては、BNC2遺伝子の発現量を、側弯症治療薬の存在下と非存在下とで比較し、側弯症治療薬の効果を判定することもできる。例えば、BNC2遺伝子を過剰発現する細胞などに側弯症治療薬を添加し、BNC2遺伝子の発現誘導が側弯症治療薬非添加時と比べて抑制されていれば、当該治療薬の効果はあると判定でき、また、抑制率が高いほど当該治療薬の効果は高いと判定することができる。 In the present invention, the expression level of the BNC2 gene can be compared between the presence and absence of a scoliosis drug and the effect of the scoliosis drug can be determined. For example, if a scoliosis drug is added to cells that overexpress the BNC2 gene, and the induction of BNC2 gene expression is suppressed compared to when no scoliosis drug is added, the drug is judged to be effective. In addition, it can be determined that the higher the inhibition rate, the higher the effect of the therapeutic agent.

配列番号１は、rs3904778の前後１００塩基を含む２０１塩基からなる配列を示す。
配列番号２、３は、rs3904778のクローニング用フラグメントを示す。
配列番号４、５は、rs3850444のクローニング用フラグメントを示す。
配列番号６、７は、rs2383002のクローニング用フラグメントを示す。
配列番号８、９は、rs10738445のクローニング用フラグメントを示す。
配列番号１０、１１は、BNC2の定量的ＲＴ−ＰＣＲに用いたフォワードプライマーまたはリバースプライマーを、それぞれ示す。
配列番号１２、１３は、BNC2のPCRに用いたフォワードプライマーまたはリバースプラ
イマーを、それぞれ示す。
配列番号１４は、rs3850444の前後１００塩基を含む２０１塩基からなる配列を示す。
配列番号１５は、rs2383002の前後１００塩基を含む２０１塩基からなる配列を示す。
配列番号１６は、rs10738445の前後１００塩基を含む２０１塩基からなる配列を示す。
配列番号１７、１８は、BNC2遺伝子のｃＤＮＡ配列およびBNC2蛋白質のアミノ酸配列を、それぞれ示す。 SEQ ID NO: 1 shows a sequence consisting of 201 bases including 100 bases before and after rs3904778.
SEQ ID NOs: 2 and 3 show fragments for cloning of rs3904778.
SEQ ID NOs: 4 and 5 show rs3850444 cloning fragments.
SEQ ID NOs: 6 and 7 show cloning fragments of rs2383002.
SEQ ID NOs: 8 and 9 show rs10738445 cloning fragments.
SEQ ID NOs: 10 and 11 respectively show forward primers or reverse primers used for quantitative RT-PCR of BNC2.
SEQ ID NOs: 12 and 13 respectively represent the forward primer or reverse primer used for BNC2 PCR.
SEQ ID NO: 14 shows a sequence consisting of 201 bases, including 100 bases before and after rs3850444.
SEQ ID NO: 15 shows a sequence consisting of 201 bases including 100 bases before and after rs2383002.
SEQ ID NO: 16 shows a sequence consisting of 201 bases including 100 bases before and after rs10738445.
SEQ ID NOs: 17 and 18 show the cDNA sequence of the BNC2 gene and the amino acid sequence of the BNC2 protein, respectively.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.

AISの感受性遺伝子を同定するために、被験者数を５倍以上に増加し、全ゲノム補完（whole genome imputation）を行うことによりゲノムワイド関連解析（GWAS）を拡張させた。2,142人の思春期特発性側弯症（Adolescent idiopathic scoliosis；ＡＩＳ）の患者（10-59才）が、以前に記載された基準（Nature genetics 45, 676-679 (2013)、Nature genetics 43, 1237-1240 (2011).、Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society 29, 1055-1058 (2011)）に従って、共同研
究する１０の病院から、２００９年２月〜２０１２年１２月にわたって、GWASのために募集された。全ての患者は、側弯症専門の外科医による臨床的および放射線学的検査を受けた。GWASのために、11,144の対照群（7-96才）がバイオバンクジャパンプロジェクトおよびそれに関連するプロジェクトから、以前に記載したように集められた（Nature Genetics 46, (2014) 1012-1016、The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, (2007) 696-697、Nature Genetics 44, (2012) 900-903）。 In order to identify susceptibility genes for AIS, the number of subjects was increased more than 5 times, and genome-wide association analysis (GWAS) was expanded by performing whole genome imputation. 2,142 Adolescent idiopathic scoliosis (AIS) patients (10-59 years old) were referred to previously described criteria (Nature genetics 45, 676-679 (2013), Nature genetics 43, 1237- 1240 (2011), Journal of orthopaedic research: official publication of the Orthopaedic Research Society 29, 1055-1058 (2011)), from 10 hospitals collaborating from February 2009 to December 2012. Was recruited for. All patients underwent clinical and radiological examinations by scoliosis specialists. For GWAS, 11,144 control groups (aged 7-96) were collected from the Biobank Japan project and related projects as previously described (Nature Genetics 46, (2014) 1012-1016, The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol 5, (2007) 696-697, Nature Genetics 44, (2012) 900-903).

Illumina Human610 Genotyping BeadChip及びIllumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChipを使用して、1,289人のAIS患者群と3,345人の対照群を遺伝子型解析し、また、Illumina Human OmniExpress Genotyping BeadChip 及びIllumina Human Exome Genotyping BeadChipを使用して、853人のAIS患者群と7,799人の対照群を遺伝子型解析した(表１)。クオリティコントロールは以前に記載された方法を使用した（Nature genetics 43, 1237-1240 (2011)）。サンプルのクオリティコントロールのために、Ｘ染色体上のＳＮＰを使用して、ジェンダー情報をチェックし、アイデンティティ・バイ・ステート法を用いて各サンプルの潜在的関連性を評価し、第２度の関連性（second-degrees relatedness）又はそれに近い関連性を示すサンプルは除外した。本研究の集団階層化をチェックするために、
基準としてのハップマップデータに由来する、ヨーロッパ人（ユタ州の白人により代表される、ＣＥＵ）、アフリカ人（イバダンからのヨルバ族に代表される、ＹＲＩ）、東アジア人（東京からの日本人（ＪＰＴ）および北京からの中国漢族（ＣＨＢ）に代表される）を含む４つの基準集団を用いる主成分分析（ＰＣＡ）を行った。ＪＰＴ／ＣＨＢクラスターに属さない外れ値を有する人を特定するために上位２つの関連主成分（固有ベクトル）を用いて散布図をプロットした（図示せず）。次に、集団の下位構造をさらに評価するために患者群と対照群の遺伝子型の情報のみを使用するＰＣＡ分析を実施した。 Using the Illumina Human610 Genotyping BeadChip and Illumina HumanHap550v3 Genotyping BeadChip, genotyped 1,289 AIS patient groups and 3,345 control groups, and using the Illumina Human OmniExpress Genotyping BeadChip and Illumina Human Exome Genotyping BeadChip, A group of 853 AIS patients and a control group of 7,799 were genotyped (Table 1). The quality control used the method described previously (Nature genetics 43, 1237-1240 (2011)). For sample quality control, SNPs on the X chromosome are used to check gender information, identity by state methods are used to assess each sample's potential relevance, and second degree relevance Samples showing (second-degrees relatedness) or close relatedness were excluded. To check the group stratification in this study,
Europeans (represented by white people in Utah, CEU), Africans (represented by Yorba from Ibadan, YRI), East Asians (Japanese from Tokyo), derived from hapmap data as a reference Principal component analysis (PCA) was performed using 4 reference populations including (JPT) and Chinese Han from Beijing (CHB)). In order to identify persons with outliers not belonging to the JPT / CHB cluster, a scatter plot was plotted using the top two relevant principal components (eigenvectors) (not shown). Next, a PCA analysis using only patient group and control group genotype information was performed to further evaluate population substructure.

クオリティコントロールフィルタリングの後、Illumina Human610 Genotyping BeadChip で458,596 SNP、Illumina Human OmniExpress Genotyping BeadChipで605,478SNPが関
連について調査された。起こり得る集団階層化を、予測Ｐ値(expected Pvalue)に対する
観察Ｐ値(observed P value)を使用して分位数‐分位数（Ｑ‐Ｑ）プロットを構築することにより検討し、各プラットフォームで1.06と0.97のゲノム拡張係数（genomic inflation factor）（λ値）を得た。このことは、集団構造に基づく偽陽性の関連である可能性や、潜在的関連性が低いことを意味している。 After quality control filtering, 458,596 SNPs in Illumina Human610 Genotyping BeadChip and 605,478 SNPs in Illumina Human OmniExpress Genotyping BeadChip were investigated for association. The possible population stratification is examined by constructing a quantile-quantile (QQ) plot using the observed P value against the expected P value for each platform. Obtained genomic inflation factors (λ values) of 1.06 and 0.97. This means that there is a possibility of a false positive association based on the population structure and a low potential association.

２つのプラットフォームに関係するタグＳＮＰは異なるため、全ゲノム補完とメタ解析を行った。欠落する遺伝子型（missing genotype）を予測するための基準パネルとして、東アジア人集団（JPT、CHBおよびCHS (中国南部漢族)）フェーズＩ統合（integrated）リリースバージョン２データセットの１０００ゲノムを用いて全ゲノム補完を行った。クオリティコントロールの後に、遺伝子型割合が９９％より低く、マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）が０．０１より低く、HWEより逸脱(P≦ 1.0×10^-6)しているSNPを除外したインプッ
トファイルを用意した。ＧＷＡＳデータセットと０．１６より大きい差を有する基準パネルとの間で、アレル頻度が同等であるＳＮＰは、除外された。関連研究には、補完クオリティスコアRsq≧0.9のSNPが使用された。 Since the tag SNPs related to the two platforms are different, whole genome complementation and meta-analysis were performed. Using the 1000 genomes of the East Asian population (JPT, CHB and CHS (South China Han)) Phase I integrated release version 2 dataset as a reference panel to predict missing genotypes Whole genome complementation was performed. After quality control, prepare an input file that excludes SNPs with a genotype ratio lower than 99%, minor allele frequency (MAF) lower than 0.01, and deviating from HWE (P ≦ 1.0 × 10 ^-6 ) did. SNPs with similar allele frequencies between the GWAS dataset and the reference panel with a difference greater than 0.16 were excluded. For related studies, SNPs with complementary quality score Rsq ≧ 0.9 were used.

補完SNP(imputed SNP)の関連は、Ｍｉｎｉｍａｃからのアウトプット結果を使用するｍａｃｈ２ｄａｔソフトウェアにより提供された。逆分散法（inverse-variance method）
を使用して、発見（discovery）と確認（validation）フェーズの複合解析のためのメタ
解析が実施され、２つのフェーズ間の異質性（heterogeneity）はBreslow-Dayテストにより評価され、Ｐ<0.05であるＳＮＰは削除された。総計、2,109人の日本人ＡＩＳ患者と11,140人のＡＩＳ患者でない対照群について、4,420789ＳＮＰの関連性を解析した。３部位がP < 5 × 10^-8のゲノムワイド有意レベルを上回り、そのうちの２部位は以前に同定さ
れた10q24.31（Nature Genetics 43, (2011) 1237-1240）と6ｑ24.1（Nature Genetics 45, (2013) 676-679）であった(表２)。 The association of the complemented SNP was provided by the mach2dat software using the output results from Minimac. Inverse-variance method
Is used to perform a meta-analysis for a combined analysis of the discovery and validation phases, and the heterogeneity between the two phases is assessed by the Breslow-Day test, with P <0.05. Some SNPs have been deleted. A total of 2,109 Japanese AIS patients and 11,140 non-AIS patient control groups were analyzed for the association of 4,420789 SNPs. Three sites exceeded the genome-wide significance level of P <5 x ^10-8 , two of which were previously identified 10q24.31 (Nature Genetics 43, (2011) 1237-1240) and 6q24.1 (Nature Genetics 45, (2013) 676-679) (Table 2).

新規な部位の関連を確認するために、共同研究する病院から958人のAIS患者群と、3,551人の対照群とを含む独立したセットを集め（表１）、再現解析を行った。ＧＷＡＳにお
いてP < 1 × 10^-5を上回った27ＳＮＰを選択し（表２）、以前記載されたように（Nature Genetics 45, (2013) 676-679）multiplex PCR-based Invader assay (Third Wave Technologies)を使用して、被検者を遺伝子型解析した。再現解析において、染色体9p22.2に存在するrs3904778ＳＮＰにより示される１部位についての関連の証拠を見いだした（P =
4.46 × 10^-5 、ボンフェローニ補正後はP < 1.85 × 10^-3;表３)。ＧＷＡＳと再現解析の結果を合わせると、rs3904778はP < 5 × 10^-8のゲノムワイド有意性閾値に達した(複
合P = 5.08 × 10^-11; OR = 1.21, 95% 信頼区間 (CI) = 1.14-1.28; 表３)。 In order to confirm the association of new sites, an independent set including 958 AIS patient groups and 3,551 control groups from the collaborating hospitals was collected (Table 1) and reproducibility analysis was performed. 27 SNPs that exceeded P <1 x ^10-5 in GWAS were selected (Table 2) and as previously described (Nature Genetics 45, (2013) 676-679) multiplex PCR-based Invader assay (Third Wave Technologies) Were used to genotype the subjects. In reproducibility analysis, we found relevant evidence for a single site represented by rs3904778 SNP present on chromosome 9p22.2 (P =
4.46 × 10 ^-5 , P <1.85 × 10 ^-3 after Bonferroni correction; Table 3). Combining GWAS and reproducibility results, rs3904778 reached a genome-wide significance threshold of P <5 × 10 ^-8 (complex P = 5.08 × 10 ^-11 ; OR = 1.21, 95% confidence interval (CI) = 1.14-1.28; Table 3).

この関連性をさらにテストするために、南京大学医学部付属鼓楼医院で募集された中国漢族においてrs3904778を遺伝子型解析した。AIS患者は臨床的および放射線医学的検査を通して、以前に記載の基準（Nature genetics 45, 676-679 (2013)）に従って診断された。対照群は、病院の脊柱専門の外科医(Y.Q.)により、アダムの前屈試験を通して、側弯症ではないことが確認されている健康なボランティアであった（表１）。ABI PRISM 7900HTシークエンス検出システム(Applied Biosystems)で読み取られるTaqMan SNP Genotyping Assayを使用して、1,268人の患者群と1,173人の対照群を遺伝子型解析した。関連性がそ
の集団において再現された。全てのメタ解析のP値は2.46× 10^-13で、ORは1.21であった (表３)。 To further test this association, rs3904778 was genotyped in a Han Chinese recruited at the Gulou Clinic attached to Nanjing University School of Medicine. AIS patients were diagnosed through clinical and radiological examinations according to previously described criteria (Nature genetics 45, 676-679 (2013)). The control group was healthy volunteers who had been confirmed not to have scoliosis through Adam's anteversion test by a hospital spine specialist (YQ) (Table 1). Using the TaqMan SNP Genotyping Assay read by the ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), 1,268 patient groups and 1,173 control groups were genotyped. Associations were reproduced in the population. All meta-analyses had a P-value of 2.46 × 10 ⁻¹³ and an OR of 1.21 (Table 3).

染色体9p22.2の特性を明らかにするために、rs3904778周辺の遺伝子型解析をしたSNPと補完SNPをプロットした(図１)。さらなる３つのSNPが関連性の証拠をもたらし、rs3904778と強い関連性を示した(r² ≧ 0.9)（表４）。それらの全てのSNPは、BNC2 (basonuclin-2)遺伝子のイントロン３に位置していた(図１)。 In order to elucidate the characteristics of chromosome 9p22.2, SNPs analyzed for genotypes around rs3904778 and complementary SNPs were plotted (FIG. 1). Three additional SNPs provided evidence of association and showed strong association with rs3904778 (r ² ≧ 0.9) (Table 4). All of these SNPs were located in intron 3 of the BNC2 (basonuclin-2) gene (Figure 1).

ＢＮＣタンパクは、Ｃ２Ｈ２zinc finger proteinのグループに属する高度に保存され
たタンパク質である。マウスＢｎｃ２タンパクはヒトＢＮＣ２タンパクとは９７．０％、ゼブラフィッシュとは６０．８％の同一性を有する（Biochimie 93, 127-133 (2011)）。ＢＮＣ２は核スペックルに集まっており、ｍＲＮＡの核プロセシングにおける機能を示唆している（Nature reviews. Molecular cell biology 4, 605-612 (2003)）。マウスにおいて、Ｂｎｃ２発現は卵巣、子宮、脳、および頭蓋顔面骨において観察されていた（Geno
mics 83, 821-833 (2004)、PNAS 101, 3468-3473 (2004)、PNAS 106, 14432-14437 (2009)）。ゼブラフィッシュにおいては、Ｂｎｃ２発現は卵巣および中枢神経系、すなわち知
覚神経節、後脳および眼において観察されていた（PLoS genetics 5, e1000744 (2009)）。しかし、ヒト筋骨格組織におけるＢＮＣ２発現は調査されていなかった。そこで、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、種々のヒト組織におけるＢＮＣ２ｍＲＮＡの発現を調査した(
表５)。その結果、ＢＮＣ２は子宮と脊髄において最も多く発現しており、骨と軟骨がそ
れに続いた（図２）。 BNC protein is a highly conserved protein belonging to the group of C2H2zinc finger proteins. Mouse Bnc2 protein has 97.0% identity with human BNC2 protein and 60.8% identity with zebrafish (Biochimie 93, 127-133 (2011)). BNC2 is gathered in nuclear speckles and suggests a function in mRNA nuclear processing (Nature reviews. Molecular cell biology 4, 605-612 (2003)). In mice, Bnc2 expression has been observed in the ovary, uterus, brain, and craniofacial bone (Geno
mics 83, 821-833 (2004), PNAS 101, 3468-3473 (2004), PNAS 106, 14432-14437 (2009)). In zebrafish, Bnc2 expression has been observed in the ovary and central nervous system, ie sensory ganglia, hindbrain and eyes (PLoS genetics 5, e1000744 (2009)). However, BNC2 expression in human musculoskeletal tissues has not been investigated. Therefore, the expression of BNC2 mRNA in various human tissues was investigated using quantitative RT-PCR (
Table 5). As a result, BNC2 was most expressed in the uterus and spinal cord, followed by bone and cartilage (FIG. 2).

Genevar (GENe Expression VARiation)データベースを使用して、染色体9p22.2部位に
対して相互参照する発現の量的形質座位(eQTL)データにより、関連性を示したSNPの起こ
り得る機能的な効果を調査した（Yang, T.P., et al. Bioinformatics 26, 2474-2476 (2010)）。rs10738445だけがデータベースにあり、その感受性アレルはBNC2発現レベルを顕著に増加させた(メキシコ人でP = 0.048)。また、関連を示すSNPと、ゲノムエレメントをアノテートしたDNAエレメントのエンサイクロペディア（エンコード）とのオーバーラッ
プを、UCSCゲノムブラウザを使用して評価した。rs3850444のみが、多数の組織にわたるDNase I-過敏性部位に位置した。３つのＳＮＰ（Ｈ１およびＮＨＬＦ（正常ヒト肺線維芽
細胞）におけるrs3850444 とrs3904778、HSMM（ヒト骨格筋芽細胞）とNHLFにおけるrs10738445）は、エンハンサーヒストンマークを有していた。これらの発見は、ＳＮＰがBNC2
の転写活性を調節する可能性があることを示唆している。 Investigate possible functional effects of related SNPs using quantitative gene locus (eQTL) data cross-referenced to the chromosome 9p22.2 site using the Genevar (GENe Expression VARiation) database (Yang, TP, et al. Bioinformatics 26, 2474-2476 (2010)). Only rs10738445 was in the database, and its sensitive allele significantly increased BNC2 expression levels (P = 0.048 in Mexicans). In addition, the overlap between the SNP indicating the association and the encyclopedia (encoding) of the DNA element annotated with the genome element was evaluated using the UCSC genome browser. Only rs3850444 was located at the DNase I-hypersensitive site across multiple tissues. Three SNPs (rs3850444 and rs3904778 in H1 and NHLF (normal human lung fibroblasts), rs10738445 in HSMM (human skeletal myoblasts) and NHLF) had enhancer histone marks. These discoveries are the result of SNP's BNC2
This suggests that it may regulate the transcriptional activity of.

ＳＮＰの転写活性をルシフェラーゼアッセイにより検討した。各ＳＮＰ周辺のオリゴヌクレオチド(表６)をｐＧＬ３プロモーターベクター（プロメガ）の中にクローニングしてレポーターベクターを構築した。ＨｅＬａ細胞に、５００ｎｇのレポーターベクターと１ｎｇのｐＲＬ−ＴＫベクター（プロメガ）を、FuGene6トランスフェクション試薬(Promega)を添付のプロトコールに従って使用してトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、リスクアレルを有するコンストラクトと非リスクアレルを有するコンストラクトのルシフェラーゼ活性を比較した。rs10738445のみがエンハンサー活性を有し、アレル間の顕著な相違を示した。リスクアレルを含むコンストラクトは、非リスクアレルを含むコンストラクトと比べて、約１．３倍高いルシフェラーゼ活性を示し (図３ａ)、この
結果は、rs10738445のリスクアレルはその配列が有するエンハンサー活性の増強によりAISと関連することを示唆した。他の細胞株(HEK293およびA172)を用いた試験も同様の結果
であった。 The transcriptional activity of SNP was examined by luciferase assay. Oligonucleotides (Table 6) around each SNP were cloned into a pGL3 promoter vector (Promega) to construct a reporter vector. HeLa cells were transfected with 500 ng reporter vector and 1 ng pRL-TK vector (Promega) using FuGene6 transfection reagent (Promega) according to the attached protocol. After 48 hours of incubation, the luciferase activity of the construct with the risk allele and the construct with the non-risk allele was compared. Only rs10738445 had enhancer activity and showed significant differences between alleles. The construct containing the risk allele showed about 1.3 times higher luciferase activity than the construct containing the non-risk allele (FIG. 3a). This result shows that the risk allele of rs10738445 has an enhanced enhancer activity. It was suggested to be related to AIS. Tests using other cell lines (HEK293 and A172) gave similar results.

アレル間の相違がrs10738445への転写因子の結合に影響を与えるのかどうかを評価するために、DIGゲルシフトキット第２世代（ロシュ）と二重鎖オリゴヌクレオチド（表６）
を使用して、HeLa細胞からの各抽出物を用いて電気泳動の移動度シフトアッセイ（EMSA）
を行った。その結果、リスクアレルを含むオリゴヌクレオチドに特異的なバンドが検出された(図３ｂ)。次に、JASPARデータベースを使用して、リスクアレルに結合し得る転写因子を探したところ、rs10738445がYY1結合部位内に位置することを見出し、リスクアレル
と非リスクアレル間でその結合性が変化すると予測した。そこで、抗YY1抗体(Santa Cruz)を使用してEMSAを行ったところ、抗YY1抗体の付加によって、リスクアレル特異的なバンドはゲル上の上方へシフトした(図３ｂ)。次に、ルシフェラーゼアッセイにより、rs10738445に対するYY1の効果を試験した。YY1発現ベクターは、そのコーディング配列をpcDNA3.1(+)にクローニングすることにより構築した。rs10738445レポーターベクターと、YY1発現ベクター又は空のpcDNA3.1(+)を、HeLa細胞にコトランスフェクションした。YY1発現ベクターは、リスクアレルおよび非リスクアレルのどちらに対しても、ルシフェラーゼ活性を有意に増加させた(図３ｃ)。よって、YY1はrs10738445を含むエンハンサー配列に結合
し、BNC2発現を上方制御していることが確認された。 To assess whether differences between alleles affect transcription factor binding to rs10738445, DIG Gel Shift Kit 2nd Generation (Roche) and double-stranded oligonucleotides (Table 6)
Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) with each extract from HeLa cells
Went. As a result, a band specific to the oligonucleotide containing the risk allele was detected (FIG. 3b). Next, using the JASPAR database, we searched for a transcription factor that could bind to the risk allele, found that rs10738445 was located within the YY1 binding site, and that the binding between the risk allele and the non-risk allele changed. Predicted. Therefore, when EMSA was performed using an anti-YY1 antibody (Santa Cruz), the addition of the anti-YY1 antibody shifted the risk allele-specific band upward on the gel (FIG. 3b). Next, the effect of YY1 on rs10738445 was tested by luciferase assay. The YY1 expression vector was constructed by cloning the coding sequence into pcDNA3.1 (+). The rs10738445 reporter vector and the YY1 expression vector or empty pcDNA3.1 (+) were cotransfected into HeLa cells. YY1 expression vector significantly increased luciferase activity for both risk and non-risk alleles (FIG. 3c). Thus, it was confirmed that YY1 binds to an enhancer sequence containing rs10738445 and upregulates BNC2 expression.

in vivoでBNC2過剰発現の効果を調査するために、ゼブラフィッシュモデルにおけるtol2仲介遺伝子組み換えシステムを使用した（Gene 240, 239-244 (1999), Developmental Dynamics 236, 3088-3099 (2007)）。BNC2コード領域は、cDNAクローン(IMAGE: 100069207)から、制限酵素配列に結合する特異的プライマー(表５)を使用してPCR増幅された。Tol2遺伝子組み換え構築物を作成するために、p5E-bactin2、pME-MCS BNC2クローンおよびp3E-polyAが、ゲートウェイLRクロネースII酵素ミックス（Life Technologies）によってpDest-Tol2pA2内に組み換えられた。プラスミドDNA(10 ng/μl)を、mMESSAGE mMACHINE SP6 キット(Ambion)を使用して合成されたキャップされたTol2トランスポゼースmRNA(50 ng/
μl)と共に、RIKEN野生株(Danio Rerio、文部科学省のナショナルバイオリソースプロジ
ェクトにより供与された)の１細胞期胚（one-cell stage embryos）の中にコインジェク
ションした。βアクチンプロモーターの制御下でBNC2をゼブラフィッシュ胚において安定的に発現させ、受精後２４〜７２時間の間におけるトランスジェニックゼブラフィッシュ胚の初代（founder）を解析した。ゼブラフィッシュ胚におけるBNC2過剰発現は、異常な
体節形成(65%, n=150)および胚致死性(18%, n=41)を引き起こした。一方、EGFPを注入し
た対照の胚は、正常な発達を遂げた(図４ａ、ｂ)。導入したBNC2遺伝子に由来する異常な胚の多くは側弯症を示し、いくつかは重篤な体節奇形を示し、一週間以内に死亡した。 To investigate the effect of BNC2 overexpression in vivo, the tol2 mediated genetic recombination system in the zebrafish model was used (Gene 240, 239-244 (1999), Developmental Dynamics 236, 3088-3099 (2007)). The BNC2 coding region was PCR amplified from a cDNA clone (IMAGE: 100069207) using specific primers that bind to restriction enzyme sequences (Table 5). To create a Tol2 gene recombination construct, p5E-bactin2, pME-MCS BNC2 clone and p3E-polyA were recombined into pDest-Tol2pA2 by Gateway LR Klonase II enzyme mix (Life Technologies). Plasmid DNA (10 ng / μl) was added to capped Tol2 transposase mRNA (50 ng / μl) synthesized using the mMESSAGE mMACHINE SP6 kit (Ambion).
μl) and coinjected into one-cell stage embryos of the RIKEN wild strain (Danio Rerio, donated by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's National BioResource Project). BNC2 was stably expressed in zebrafish embryos under the control of β-actin promoter, and the founder of transgenic zebrafish embryos was analyzed between 24 and 72 hours after fertilization. BNC2 overexpression in zebrafish embryos caused abnormal segmentation (65%, n = 150) and embryonic lethality (18%, n = 41). On the other hand, control embryos injected with EGFP developed normal development (FIGS. 4a, b). Many of the abnormal embryos derived from the introduced BNC2 gene showed scoliosis, some with severe somatic malformations and died within a week.

さらに、BNC2 mRNAの注入による体節形成に対するBNC2の効果を確認した。BNC2コード
配列をpcDNA3.1の中にクローニングし、キャップされたmRNAを合成し、そしてそれを10〜200pgの投与量で１細胞期胚に注入した。BNC2 mRNAの投与量増加は、側弯症および重篤な体節奇形の増加と関連しており、最も投与量が多い胚では色素形成の遅滞が示された(図
４ｃ，ｄ)。これらの結果は、BNC2発現の増加が側弯症の原因であることを強く示唆して
いる。 Furthermore, the effect of BNC2 on somite formation by BNC2 mRNA injection was confirmed. The BNC2 coding sequence was cloned into pcDNA3.1, capped mRNA was synthesized, and it was injected into 1-cell stage embryos at a dose of 10-200 pg. Increasing dose of BNC2 mRNA was associated with increased scoliosis and severe somatic malformations, with the most dosed embryos showing delayed pigmentation (FIGS. 4c, d). These results strongly suggest that increased BNC2 expression is responsible for scoliosis.

以上の通り、拡大ゲノムワイド関連解析により、ゲノムワイド水準を満たしてＡＩＳと関連する領域が見出された。当該領域に存在するＳＮＰｓは側弯症の検査に有用であり、側弯症の予防および／または治療に貢献するものである。 As described above, an expanded genome-wide association analysis has found a region that satisfies the genome-wide level and is related to AIS. SNPs present in this area are useful for the examination of scoliosis and contribute to the prevention and / or treatment of scoliosis.

Claims

第９染色体短腕２２．２領域のBNC2遺伝子内に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする、側弯症の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法であって、
前記一塩基多型が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡係数ｒ ² ≧０．９の関係にある塩基における一塩基多型であり、
前記一塩基多型における塩基が、リスクアレルである場合に側弯症の発症リスクまたは側弯症の可能性が高いと判定する、方法。 The risk and / or onset of scoliosis characterized by analyzing a single nucleotide polymorphism present in the BNC2 gene of the short arm 22.2 region of chromosome 9 and examining scoliosis based on the analysis result A method for determining the presence or absence of
The single nucleotide polymorphism is a single nucleotide polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the base having a relationship of linkage disequilibrium coefficient r ² ≧ 0.9. And
The method of determining with the onset risk of scoliosis or the possibility of scoliosis being high when the base in the said single nucleotide polymorphism is a risk allele .

前記側弯症が、思春期特発性側弯症である、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the scoliosis is adolescent idiopathic scoliosis.

前記該塩基と連鎖不平衡係数ｒ ² ≧０．９の関係にある塩基における一塩基多型が、配列番号１４に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、配列番号１５に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、または配列番号１６に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基である、請求項１または２に記載の方法。 The single nucleotide polymorphism in the base having a relationship of linkage disequilibrium coefficient r ² ≧ 0.9 with the base is the base corresponding to the base number 101 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 14, shown in SEQ ID NO: 15. The method according to claim 1 or 2 , which is a base corresponding to the base No. 101 in the base sequence or a base corresponding to the base No. 101 in the base sequence shown in SEQ ID No. 16.

配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０１番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する側弯症検査用プローブ。 A scoliosis test probe having a sequence of 15 bases or more including the base of the base number 101 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a complementary sequence thereof.

配列番号１に示す塩基配列において、塩基番号１０１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる側弯症検査用プライマー。 A scoliosis primer that can amplify a region containing the base at the 101st base number in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.

BNC2遺伝子またはBNC2遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、BNC2遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び前記発現量を低下させる物質を選択する工程を含む、側弯症の予防薬又は治療薬をスクリーニングする方法。 A step of adding a drug candidate substance to a cell expressing a BNC2 gene or a reporter gene linked to a promoter of the BNC2 gene, a step of measuring the expression level of the BNC2 gene or the reporter gene, and a substance that reduces the expression level are selected. A method for screening a prophylactic or therapeutic agent for scoliosis, comprising a step.

BNC2遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含み、BNC2遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量が対照と比べて増加している場合に、側弯症に罹患している、
または側弯症の危険性が高いと判定する、側弯症の検査方法。 Look including the step of measuring the expression level of mRNA or protein BNC2 gene, if the expression level of mRNA or protein BNC2 gene is increased compared to controls, suffering from scoliosis,
Or the scoliosis test method which determines that the risk of scoliosis is high .

第９染色体短腕２２．２領域のBNC2遺伝子内に存在する一塩基多型を分析する工程であって、前記一塩基多型が、配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、または該塩基と連鎖不平衡係数ｒA step of analyzing a single nucleotide polymorphism existing in the BNC2 gene of the short arm 22.2 region of chromosome 9, wherein the single nucleotide polymorphism is present at the base number 101 of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Corresponding base, or linkage disequilibrium coefficient r ²² ≧０．９の関係にある塩基における一塩基多型である、工程、A single nucleotide polymorphism in a base in a relationship of ≧ 0.9,
及び、as well as,
BNC2遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程、Measuring the expression level of BNC2 gene mRNA or protein,
の少なくともいずれかの工程を含む、Including at least one of the following steps:
側弯症の発症リスクおよび／または発症の有無の検査のための検査データを得る方法。A method for obtaining test data for testing the risk of developing scoliosis and / or the presence or absence of onset.