JP6478464B2 - Method for producing cerebrovascular endothelial cells from pluripotent stem cells - Google Patents
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Description
本発明は、多能性幹細胞から脳血管内皮細胞を製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing cerebrovascular endothelial cells from pluripotent stem cells.
脳には血液脳関門（blood brain barrier：BBB）が存在している。その中心構成成分である脳毛細血管内皮細胞は強固なタイトジャンクションを形成し、さらに特異的トランスポーターを発現している。BBBにより、薬剤等の物質の脳細胞への透過は厳しく制限されている（非特許文献１）。BBBによる物質透過の制限のため、アルツハイマー等の中枢神経疾患の多くでは薬剤の貢献度は著しく低く、十分な治療満足度が得られていない。難治性中枢神経疾患に対して、優れた脳移行性を発揮し十分な薬効を発揮する治療薬を開発するには、BBBの機能解明が必須である。 The brain has a blood brain barrier (BBB). Its central constituent, brain capillary endothelial cells, forms a strong tight junction and expresses a specific transporter. BBB severely restricts the penetration of substances such as drugs into brain cells (Non-patent Document 1). Due to the restriction of substance permeation by BBB, the contribution of drugs is remarkably low in many central nervous diseases such as Alzheimer's, and sufficient treatment satisfaction is not obtained. Elucidation of the function of BBB is indispensable for developing therapeutic agents that exhibit excellent brain migration and sufficient efficacy for refractory central nervous disease.
従来より、BBBの機能解明ならびに創薬研究への応用を目指して、ラット等の実験動物由来の血管内皮細胞を用いて、in vitro BBBモデルが構築されてきた。しかし、実験動物を用いたモデルではヒトの薬物の輸送機能を精度良く反映できないため、中枢神経疾患治療薬のヒト臨床試験における成功率が依然として低い。ヒトの生体内のBBB機能を反映し得る、ヒト脳血管内皮細胞を用いたin vitro BBBモデルの開発が望まれるが、ヒト毛細脳血管内皮細胞の大量入手は困難であるため創薬研究への応用が制限されているのが現状である。ヒト脳血管内皮細胞として不死化細胞株が樹立されているが、初代脳血管内皮細胞に比べて、種々のタイトジャンクション形成タンパク質の発現が低いことが問題視されている（非特許文献２）。 Conventionally, in vitro BBB models have been constructed using vascular endothelial cells derived from experimental animals such as rats, with the aim of elucidating the function of BBB and applying it to drug discovery research. However, since the model using laboratory animals cannot accurately reflect the human drug transport function, the success rate in human clinical trials of drugs for treating central nervous diseases remains low. The development of an in vitro BBB model using human cerebral vascular endothelial cells that can reflect the BBB function in the human body is desired. The application is limited at present. Although immortalized cell lines have been established as human cerebral vascular endothelial cells, it is regarded as a problem that expression of various tight junction forming proteins is lower than that of primary cerebral vascular endothelial cells (Non-patent Document 2).
BBBは脳毛細血管内皮細胞とアストロサイト等の周辺の細胞から構成されている。最近、マウスES細胞由来の血管内皮細胞を、マウスの腎臓組織または肝臓組織に移植したところ、それぞれ腎臓特異的な血管内皮細胞、肝臓特異的な血管内皮細胞に分化誘導されたことが報告されている（非特許文献３）。また、ヒトiPS細胞をin vitroで培養したところ、内皮細胞と神経細胞が同時に分化し、BBB様の内皮細胞を得ることができたという報告がある（非特許文献４）。しかしながら、脳血管内皮細胞を確実にかつ効率よく分化誘導する方法はいまだ確立されていない。 BBB is composed of peripheral cells such as brain capillary endothelial cells and astrocytes. Recently, vascular endothelial cells derived from mouse ES cells were transplanted into mouse kidney tissue or liver tissue, and it was reported that differentiation was induced into kidney-specific vascular endothelial cells and liver-specific vascular endothelial cells, respectively. (Non-patent Document 3). Moreover, when human iPS cells were cultured in vitro, there was a report that endothelial cells and neurons differentiated simultaneously, and BBB-like endothelial cells could be obtained (Non-patent Document 4). However, a method for reliably and efficiently inducing differentiation of cerebrovascular endothelial cells has not yet been established.
本発明は、ヒトのBBBの輸送機能を精度良く反映し得る脳血管内皮細胞を、確実かつ効率よく得る方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for reliably and efficiently obtaining cerebrovascular endothelial cells that can accurately reflect the transport function of human BBB.
本発明者らは、無限増殖能を有する多能性幹細胞から、脳血管内皮細胞を製造する方法において、多能性幹細胞から分化誘導されたCD34発現細胞を培養し、得られた細胞を脳由来細胞を培養した培地に接触させて培養することにより、BBBを構成する脳血管内皮細胞の機能を有する脳血管内皮細胞を確実かつ効率よく分化誘導し得ることに着目し、本発明を完成した。 In the method for producing cerebral vascular endothelial cells from pluripotent stem cells having infinite proliferation ability, the present inventors cultured CD34-expressing cells induced to differentiate from pluripotent stem cells, and obtained cells were derived from the brain. Focusing on the fact that cerebral vascular endothelial cells having the function of cerebral vascular endothelial cells constituting BBB can be reliably and efficiently induced to differentiate by culturing the cells in contact with the cultured medium, the present invention has been completed.
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．以下の１）および２）の工程を含む、多能性幹細胞から脳血管内皮細胞を製造する方法：
１）多能性幹細胞から分化誘導されたCD34発現細胞を培養する工程；および
２）前記工程１）で培養した細胞を、脳由来細胞を培養した培地に接触させて、培養する工程。
２．工程２）における脳由来細胞が、血液脳関門を構成する細胞から選択される少なくとも１種の細胞である、前項１に記載の製造方法。
３．工程２）の培養期間が、１日〜10日間である、前項１または２に記載の製造方法。
４．工程２）が、以下のａ）またはｂ）の工程である、前項１〜３のいずれか１に記載の製造方法：
ａ）前記工程１）で培養した細胞を、脳由来細胞と共培養する工程；または
ｂ）前記工程１）で培養した細胞を、脳由来細胞を培養した培地を添加した培地中にて培養する工程。
５．工程１）のCD34発現細胞を培養する液性因子を含む培地が、水溶性ウシ視床下部抽出物、FGF、およびヘパリンを含む培地である、前項１〜４のいずれか１に記載の製造方法。
６．工程１）が、骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein；BMP4）、アクチビンA、および血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor；VEGF）を用いた培養により、多能性幹細胞からCD34発現細胞を分化誘導することを含む、前項１〜５のいずれか１に記載の製造方法。
７．工程１）における培養期間が、１日〜25日間である、前項６に記載の製造方法。
８．脳血管内皮細胞が、タイトジャンクション関連遺伝子を発現しており、かつ、機能的な特異的トランスポーターを発現している、前項１〜７のいずれか１に記載の製造方法。
９．前項１〜８のいずれか１に記載の製造方法により得られた脳血管内皮細胞。
１０．前項１〜８のいずれか１に記載の製造方法により得られた脳血管細胞を用いる、血液脳関門の解析方法。
That is, this invention consists of the following.
1. A method for producing cerebrovascular endothelial cells from pluripotent stem cells, comprising the following steps 1) and 2):
1) a step of culturing CD34-expressing cells differentiated from pluripotent stem cells; and 2) a step of culturing cells cultured in the above step 1) in contact with a medium in which brain-derived cells are cultured.
2. 2. The production method according to item 1 above, wherein the brain-derived cell in step 2) is at least one cell selected from cells constituting the blood brain barrier.
3. 3. The production method according to item 1 or 2, wherein the culture period in step 2) is from 1 day to 10 days.
4). The production method according to any one of items 1 to 3, wherein step 2) is the following step a) or b):
a) a step of co-culturing the cells cultured in step 1) with brain-derived cells; or b) culturing the cells cultured in step 1) in a medium to which a medium in which brain-derived cells are cultured is added. Process.
5. 5. The production method according to any one of items 1 to 4, wherein the medium containing a humoral factor for culturing CD34-expressing cells in step 1) is a medium containing a water-soluble bovine hypothalamic extract, FGF, and heparin.
6). Step 1) differentiates CD34-expressing cells from pluripotent stem cells by culturing with bone morphogenetic protein (BMP4), activin A, and vascular endothelial growth factor (VEGF) 6. The manufacturing method according to any one of 1 to 5 above, comprising induction.
7). 7. The production method according to item 6 above, wherein the culture period in step 1) is 1 day to 25 days.
8). 8. The production method according to any one of 1 to 7 above, wherein the cerebrovascular endothelial cell expresses a tight junction-related gene and expresses a functional specific transporter.
9. 9. A cerebrovascular endothelial cell obtained by the production method according to any one of 1 to 8 above.
10. 9. A method for analyzing the blood-brain barrier, which uses the cerebral vascular cells obtained by the production method according to any one of 1 to 8 above.
本発明により得られた脳血管内皮細胞は、強い接着性を有しており、タイトジャンクション関連遺伝子が良好に発現しており、物質の透過性が低く、かつ、脳血管内皮細胞特異的なトランスポーターが発現し、かつ機能しているものである。すなわち本発明により得られた脳血管内皮細胞は、脳特異的に存在する血管内皮細胞としての機能を有するものである。本発明によれば、かかる優れた機能を有する脳血管内皮細胞を、確実かつ効率よく、多能性幹細胞から分化誘導することができ、多量に脳血管内皮細胞を入手することができる。 The cerebral vascular endothelial cell obtained by the present invention has strong adhesiveness, expresses tight junction-related genes well, has low substance permeability, and is specific for cerebral vascular endothelial cell-specific trans The porter is expressed and functioning. That is, the cerebral vascular endothelial cell obtained by the present invention has a function as a vascular endothelial cell existing specifically in the brain. According to the present invention, cerebral vascular endothelial cells having such excellent functions can be induced to differentiate from pluripotent stem cells reliably and efficiently, and a large amount of cerebral vascular endothelial cells can be obtained.
本発明は、以下に説明する工程１）および工程２）を含む、多能性幹細胞から脳血管内皮細胞を製造する方法に関する。脳血管内皮細胞とは、脳特異的な性質および／または機能を有している血管内皮細胞である。本発明の製造方法においては、多能性幹細胞から中胚葉細胞を経て、組織または臓器特異性を獲得していない血管内皮細胞を分化誘導し、その後脳血管内皮細胞を分化誘導する。本明細書においては、組織または臓器特異性を獲得していない血管内皮細胞を、単に「血管内皮細胞」と称し、「脳血管内皮細胞」とは区別することとする。 The present invention relates to a method for producing cerebral vascular endothelial cells from pluripotent stem cells, comprising the steps 1) and 2) described below. A cerebral vascular endothelial cell is a vascular endothelial cell having brain-specific properties and / or functions. In the production method of the present invention, vascular endothelial cells that have not acquired tissue or organ specificity are induced to differentiate from pluripotent stem cells through mesoderm cells, and then brain vascular endothelial cells are induced to differentiate. In the present specification, vascular endothelial cells that have not acquired tissue or organ specificity are simply referred to as “vascular endothelial cells” and are distinguished from “brain vascular endothelial cells”.
本発明において、「多能性幹細胞」とは身体を構成する全ての種類の細胞に分化出来る幹細胞であり、ES細胞またはiPS細胞等が例示される。本発明における多能性幹細胞は特に好適には、ヒト由来細胞であり、ヒトES細胞またはヒトiPS細胞をいう。「多能性幹細胞」は、本明細書中で用いられる場合、自分自身を複製する自己複製能と多分化能を共に有する細胞を意味する。「多能性（pluripotency）」とは、「多分化能」と互換可能に使用され、細胞の有する性質をいい、様々な組織や器官に属する細胞に分化し得る能力をいう。このように用語「多能性」は、複数の種類の細胞に分化し得る能力をいい、全ての種類の細胞に分化し得る能力を意味する用語「全能性（totipotency）」の概念を包含するが、明確に区別する場合は、全能性と多能性は区別することができる。 In the present invention, “pluripotent stem cells” are stem cells that can be differentiated into all types of cells constituting the body, and examples include ES cells and iPS cells. The pluripotent stem cell in the present invention is particularly preferably a human-derived cell and refers to a human ES cell or a human iPS cell. A “pluripotent stem cell” as used herein means a cell that has both self-renewal ability and pluripotency to replicate itself. “Pluripotency” is used interchangeably with “pluripotency”, refers to the properties of cells, and refers to the ability to differentiate into cells belonging to various tissues and organs. Thus, the term “pluripotency” refers to the ability to differentiate into multiple types of cells, and encompasses the concept of the term “totipotency” which means the ability to differentiate into all types of cells. However, when clearly distinguished, totipotency and pluripotency can be distinguished.
ES細胞とは、一般的には胚盤胞期胚の内部にある内部細胞塊(inner cell mass)と呼ばれる細胞集塊をin vitro培養に移し、未分化幹細胞集団として単離した多能性幹細胞である。ES細胞は、M.J.Evans & M.H.Kaufman (Nature, 292, 154, 1981)に続いて、G.R.Martin (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78, 7634, 1981)によりマウスで多分化能を有する細胞株として樹立された。ヒト由来ES細胞についても、既に多くの株が樹立されており、ES Cell International社、Wisconsin Alumni Research Foundation、National Stem Cell Bank (NSCB)等から入手することが可能である。ES細胞は、一般に初期胚を培養することにより樹立されるが、体細胞の核を核移植した初期胚からもES細胞を作製することが可能である。また、異種動物の卵細胞、または脱核した卵細胞を複数に分割した細胞小胞(cytoplasts, ooplastoids)に、所望の動物の細胞核を移植して胚盤胞期胚様の細胞構造体を作製し、それを基にES細胞を作製する方法もある。また、単為発生胚を胚盤胞期と同等の段階まで発生させ、そこからES細胞を作製する試みや、ES細胞と体細胞を融合させることにより、体細胞核の遺伝情報を有したES細胞を作る方法も報告されている。本発明で使用されるES細胞は、上記のような自体公知の方法により作製されたES細胞、または今後開発される新たな方法により作製されるES細胞であってもよい。 ES cells are pluripotent stem cells that have been isolated as undifferentiated stem cell populations by transferring cell clusters called inner cell mass, which are generally inside blastocyst-stage embryos, to in vitro culture It is. ES cells are pluripotent cells in mice by MJEvans & MHKaufman (Nature, 292, 154, 1981) followed by GRMartin (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634, 1981) Established as a stock. Many strains of human-derived ES cells have already been established and can be obtained from ES Cell International, Wisconsin Alumni Research Foundation, National Stem Cell Bank (NSCB), and the like. Although ES cells are generally established by culturing early embryos, ES cells can also be produced from early embryos obtained by nuclear transfer of somatic cell nuclei. In addition, cell nuclei of desired animals are transplanted into cell vesicles (cytoplasts, ooplastoids) obtained by dividing egg cells of heterogeneous animals or enucleated egg cells into a plurality of blastocyst-stage embryo-like cell structures, There is also a method for producing ES cells based on this. In addition, ES cells with genetic information on somatic cell nuclei by developing parthenogenetic embryos to the same stage as the blastocyst stage and trying to produce ES cells from them, or by fusing ES cells and somatic cells The method of making is also reported. The ES cell used in the present invention may be an ES cell produced by a method known per se as described above, or an ES cell produced by a new method developed in the future.
また、iPS細胞とは、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより、卵子、胚やES細胞を利用せずに分化細胞の初期化を誘導し、ES細胞と同様な多能性や増殖能を有する誘導多能性幹細胞をいい、2006年にマウスの線維芽細胞から世界で初めて作られた。さらに、マウスiPS細胞の樹立に用いた４遺伝子のヒト相同遺伝子であるOCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYCを、ヒト由来線維芽細胞に導入してヒトiPS細胞の樹立に成功したことが報告されている(Cell 131: 861-872, 2007)。本発明で使用されるiPS細胞は、上記のような自体公知の方法により作製されたiPS細胞、または今後開発される新たな方法により作製されるiPS細胞であってもよい。 In addition, iPS cells induce the reprogramming of differentiated cells without using eggs, embryos, or ES cells by introducing several types of genes into somatic cells. Induced pluripotent stem cells with, and were first made in 2006 from mouse fibroblasts in the world. Furthermore, we successfully established human iPS cells by introducing OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and C-MYC, which are the four human homologous genes used to establish mouse iPS cells, into human fibroblasts. It has been reported (Cell 131: 861-872, 2007). The iPS cell used in the present invention may be an iPS cell produced by a method known per se as described above, or an iPS cell produced by a new method developed in the future.
ES細胞またはiPS細胞等の多能性幹細胞の培養方法は特に限定されず、自体公知の方法によることができる。ES細胞の未分化性および多能性を維持可能な培地や分化誘導に適した培地として、自体公知の培地、または今後開発される新たな培地を用いることができる。具体的には、DMEMおよび／またはDMEM/F12などの市販のほ乳類細胞用基礎培地に、血清またはknock-out serum replacement (KSR)、並びにLIF（白血病阻止因子）やbFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）などを加えたもの、市販の霊長類ES細胞用培地、霊長類ES細胞増殖用基礎培地hESF-GRO、霊長類ES細胞分化誘導用基礎培地hESF-DIF、霊長類ES細胞増殖用培地CSTI-7等を用いることができる。また、培地には、ES細胞またはiPS細胞等の多能性幹細胞の培養に適する自体公知の添加物、例えば、N2サプリメント、B27サプリメント、インシュリン、bFGF、アクチビンA、ヘパリン、ROCKインヒビターやGSK-3インヒビターなどの各種インヒビター等から選択される１種または複数種の添加物を適当な濃度で添加することができる。培地およびその添加物は、使用する細胞、分化状態等により適宜選択し、使用することができる。例えば、Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) に記載の方法によることができる。 The method for culturing pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells is not particularly limited and can be a method known per se. As a medium capable of maintaining the undifferentiation and pluripotency of ES cells and a medium suitable for differentiation induction, a medium known per se or a new medium developed in the future can be used. Specifically, commercially available basal medium for mammalian cells such as DMEM and / or DMEM / F12, serum or knock-out serum replacement (KSR), LIF (leukemia inhibitory factor) and bFGF (basic fibroblast proliferation) Factor), commercial primate ES cell culture medium, primate ES cell growth basal medium hESF-GRO, primate ES cell differentiation induction basal medium hESF-DIF, primate ES cell proliferation medium CSTI -7 etc. can be used. In addition, the medium includes additives known per se suitable for culturing pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells, such as N2 supplement, B27 supplement, insulin, bFGF, activin A, heparin, ROCK inhibitor and GSK-3. One or more additives selected from various inhibitors such as an inhibitor can be added at an appropriate concentration. The medium and its additives can be appropriately selected and used depending on the cells to be used, the differentiation state, and the like. For example, the method described in Tiss. Cult. Res. Commun., 27: 139-147 (2008) can be used.
本発明の脳血管内皮細胞の製造方法には、以下の工程１）および２）が含まれる。
１）多能性幹細胞から分化誘導されたCD34発現細胞を培養する工程。
２）前記工程１）で培養した細胞を、脳由来細胞を培養した培地に接触させて、培養する工程。
本発明においては、工程１）により、臓器または組織特異的な機能を有する血管内皮細胞に分化する前の血管内皮細胞を分化誘導することができ、工程２）により、工程１）にて得た細胞を脳特異的な機能を有する脳血管内皮細胞に分化誘導することができる。
The method for producing cerebrovascular endothelial cells of the present invention includes the following steps 1) and 2).
1) A step of culturing CD34-expressing cells induced to differentiate from pluripotent stem cells.
2) A step of culturing the cells cultured in the above step 1) by bringing them into contact with a medium in which brain-derived cells are cultured.
In the present invention, vascular endothelial cells before differentiation into vascular endothelial cells having organ- or tissue-specific functions can be induced by step 1), and obtained in step 1) by step 2). The cells can be induced to differentiate into cerebral vascular endothelial cells having brain-specific functions.
本発明の工程１）は、多能性幹細胞から分化誘導されたCD34発現細胞を培養する工程である。CD34発現細胞は、多能性幹細胞から分化誘導されたものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、多能性幹細胞を中胚葉誘導因子や造血因子等の液性因子を含む培地で培養することにより、多能性幹細胞から分化誘導することができる。本発明の工程１）は、多能性幹細胞を液性因子を含む培地で培養する工程、および培養後の細胞集団からCD34発現細胞を単離する工程を含んでいてもよい。多能性幹細胞を液性因子を含む培地で培養することにより、中胚葉細胞が分化誘導される。中胚葉細胞は、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血液細胞などに分化する細胞である。多能性幹細胞から分化誘導された中胚葉細胞からの各細胞系列へのコミットメントの仕組みは、明らかにはなっていない。本発明においては、CD34発現細胞を単離して培養することにより、血管内皮細胞を効率的に分化誘導することができる。本発明において、多能性幹細胞を液性因子を含む培地で培養する工程、および、培養後の細胞集団から単離したCD34発現細胞を培養する工程を含めて、工程１）の培養期間が１〜25日間であることが好ましい。 Step 1) of the present invention is a step of culturing CD34-expressing cells induced to differentiate from pluripotent stem cells. The CD34-expressing cell may be any cell as long as it is induced to differentiate from a pluripotent stem cell. Preferably, the pluripotent stem cell is a medium containing a humoral factor such as a mesoderm-inducing factor or a hematopoietic factor. Can be induced to differentiate from pluripotent stem cells. Step 1) of the present invention may include a step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing a humoral factor and a step of isolating CD34-expressing cells from the cultured cell population. By culturing pluripotent stem cells in a medium containing humoral factors, differentiation of mesoderm cells is induced. Mesodermal cells are cells that differentiate into cardiomyocytes, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells, and the like. The mechanism of commitment to each cell line from mesoderm cells induced to differentiate from pluripotent stem cells has not been clarified. In the present invention, vascular endothelial cells can be efficiently induced to differentiate by isolating and culturing CD34-expressing cells. In the present invention, the culture period of step 1) is 1 including the step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing humoral factors and the step of culturing CD34-expressing cells isolated from the cultured cell population. Preferably it is ˜25 days.
本発明において液性因子としては、造血幹細胞や血液細胞前駆細胞等の血液細胞の自己複製、増幅および分化の少なくとも１つを調節するサイトカインや増殖因子などのいわゆる造血因子、あるいは中胚葉組織を誘導する作用を有するタンパク質である中胚葉誘導因子であれば特に限定されずいずれも使用できる。液性因子としては、骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein4；BMP4）、アクチンビンA、および塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor；bFGF（FGF2とも称する））などの中胚葉誘導因子、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor；VEGF）、トロンボポイエチン（thrombopoietin；TPO）などの血小板増殖因子、幹細胞因子（stem cell factor；SCF）、 FMS様チロシンキナーゼ3リガンド（FMS-like tyrosinekinase 3 Ligand；Flt3L）、インターロイキン−6／可溶性インターロイキン−6受容体複合体（IL-6/sIL-6R）、およびノッチリガンド（以下、Notchリガンドと称する）などの造血因子を例示できる。液性因子は、単独で使用してもよいし、複数を同時に使用してもよい。本発明における多能性幹細胞からCD34発現細胞を分化誘導するための培養工程においては、BMP4、アクチビンA、およびVEGFを用いることが好ましい。また上記液性因子は、ヒト由来であることが好ましい。 In the present invention, as a humoral factor, a so-called hematopoietic factor such as a cytokine or a growth factor that regulates at least one of self-replication, amplification and differentiation of blood cells such as hematopoietic stem cells and blood cell precursor cells, or mesoderm tissue is induced. Any mesoderm-inducing factor, which is a protein having an action to act, can be used without any particular limitation. The humoral factors include mesoderm inducing factors such as bone morphogenetic protein 4 (BMP4), actin bin A, and basic fibroblast growth factor (bFGF (also referred to as FGF2)), blood vessels Platelet growth factor such as vascular endothelial growth factor (VEGF), thrombopoietin (TPO), stem cell factor (SCF), FMS-like tyrosinekinase 3 Ligand Flt3L), interleukin-6 / soluble interleukin-6 receptor complex (IL-6 / sIL-6R), and hematopoietic factors such as Notch ligand (hereinafter referred to as Notch ligand). A liquid factor may be used independently and may use multiple simultaneously. In the culture process for inducing differentiation of CD34-expressing cells from pluripotent stem cells in the present invention, it is preferable to use BMP4, activin A, and VEGF. The humoral factor is preferably derived from a human.
工程１）についてより詳細に説明をすると、複数の工程により多能性幹細胞を培養することにより、多能性幹細胞からCD34発現細胞を分化誘導することができる。複数の工程とは例えば、以下のｉ）〜iv）の工程を例示することができる。
ｉ）多能性幹細胞を、BMP4、アクチビンAおよびRhoキナーゼ阻害剤を含む培地中で培養する工程。
ii）前記工程ｉ）で培養した細胞を、BMP4およびVEGFを含む培地中で培養する工程。
iii） 前記工程ii）で培養した細胞を、BMP4、VEGF、およびTGFファミリー阻害剤を含む培地中で培養する工程。
iv）前記工程iii）で培養した細胞を、VEGE、FGF2、およびTGFファミリー阻害剤を含む培地で培養する工程。
The step 1) will be described in more detail. By culturing pluripotent stem cells through a plurality of steps, it is possible to induce differentiation of CD34-expressing cells from the pluripotent stem cells. Examples of the plurality of steps include the following steps i) to iv).
i) A step of culturing pluripotent stem cells in a medium containing BMP4, activin A and a Rho kinase inhibitor.
ii) A step of culturing the cells cultured in the step i) in a medium containing BMP4 and VEGF.
iii) A step of culturing the cells cultured in the above step ii) in a medium containing BMP4, VEGF, and a TGF family inhibitor.
iv) A step of culturing the cells cultured in the step iii) in a medium containing VEGE, FGF2, and a TGF family inhibitor.
本発明において、Rhoキナーゼ阻害剤は、ROCK（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）阻害剤であり、多能性幹細胞の培養において分散による細胞死の抑制を阻害する作用を発揮する化合物からなる薬剤が好ましい。Rhoキナーゼ阻害剤として、Y-27632と称される低分子化合物〔(R)-(+)-trans-N-(4-ピリジル)-4-(1-アミノエチル)-シクロヘキサンカルボキシアミド・2HCl・H2O〕を好ましく例示できる。 In the present invention, the Rho kinase inhibitor is a ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase) inhibitor, and exhibits an action of inhibiting cell death suppression due to dispersion in pluripotent stem cell culture. Drugs consisting of compounds are preferred. As a Rho kinase inhibitor, a low molecular compound called Y-27632 [(R)-(+)-trans-N- (4-pyridyl) -4- (1-aminoethyl) -cyclohexanecarboxamide, 2HCl, H 2 O] can be preferably exemplified.
本発明において、TGFファミリー阻害剤はTGF-β阻害剤を用いることが好ましい。TGF-β阻害剤は、TGF-βの作用を阻害する効果を有する化合物からなる薬剤を意味し、好ましくはTGF-β受容体阻害剤である。TGF-β受容体阻害剤は、TGF-β受容体および／またはTGF-βシグナル伝達経路に作用してTGF-βの作用を阻害する化合物からなる薬剤を意味する。TGF-β阻害剤として、SB431542と称されるTGF-β受容体阻害剤である低分子化合物4-[4-(3,4-メチレンジオキシフェニル)-5-(2-ピリジル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミドを好ましく例示できる。 In the present invention, the TGF family inhibitor is preferably a TGF-β inhibitor. The TGF-β inhibitor means a drug comprising a compound having an effect of inhibiting the action of TGF-β, and is preferably a TGF-β receptor inhibitor. A TGF-β receptor inhibitor means an agent comprising a compound that acts on the TGF-β receptor and / or TGF-β signaling pathway to inhibit the action of TGF-β. As a TGF-β inhibitor, a low-molecular compound 4- [4- (3,4-methylenedioxyphenyl) -5- (2-pyridyl) -1H-, which is a TGF-β receptor inhibitor called SB431542 A preferred example is imidazol-2-yl] benzamide.
液性因子の適当な濃度は、多能性幹細胞の種類および使用量によるが、例えばアクチビンAは1 ng/ml〜10 ng/ml、BMP4は1 ng/ml〜30 ng/ml、FGF2は0.5 ng/ml〜20 ng/ml、VEGFは1 ng/ml〜100 ng/ml（例えば、工程iii）では1〜20 ng/mL、工程iv）では10〜100 ng/ml）であり得る。好ましくは、アクチビンAは2 ng/ml、BMP4は20 ng/ml、FGF2は2 ng/ml、VEGFは工程iii）では5 ng/mL、工程iv）では20 ng/mlであることが適当である。またTGFファミリー阻害剤の適当な濃度は、多能性幹細胞の種類および使用量によるが、1 〜10 μMであり、好ましくは5 μMである。Rhoキナーゼ阻害剤の適当な濃度は、多能性幹細胞の種類および使用量によるが、1〜20 μMであり、好ましくは10 μMである。 The appropriate concentration of the humoral factor depends on the type and amount of pluripotent stem cells.For example, activin A is 1 ng / ml to 10 ng / ml, BMP4 is 1 ng / ml to 30 ng / ml, and FGF2 is 0.5 ng / ml to 20 ng / ml, VEGF can be 1 ng / ml to 100 ng / ml (eg 1 to 20 ng / mL in step iii), 10 to 100 ng / ml) in step iv). Preferably, activin A is 2 ng / ml, BMP4 is 20 ng / ml, FGF2 is 2 ng / ml, and VEGF is 5 ng / mL in step iii) and 20 ng / ml in step iv). is there. An appropriate concentration of the TGF family inhibitor is 1 to 10 μM, preferably 5 μM, depending on the type and amount of pluripotent stem cells. The appropriate concentration of the Rho kinase inhibitor is 1 to 20 μM, preferably 10 μM, depending on the type and amount of pluripotent stem cells.
本発明の多能性幹細胞を培養する工程において、培養開始時（例えば、工程ｉ）の培養開始時）の多能性幹細胞数は、CD34発現細胞への分化誘導が可能である限り特に限定されないが、総細胞数として約1×106個〜1×107個を使用すればよい。培養温度は約30〜40℃、好ましくは37℃である。培養時の二酸化炭素濃度は約1〜10％、好ましくは約5％が適当である。 In the step of culturing pluripotent stem cells of the present invention, the number of pluripotent stem cells at the start of culture (for example, at the start of culture in step i) is not particularly limited as long as differentiation induction into CD34-expressing cells is possible. However, the total number of cells may be about 1 × 10 6 to 1 × 10 7 . The culture temperature is about 30-40 ° C, preferably 37 ° C. The carbon dioxide concentration during the cultivation is about 1 to 10%, preferably about 5%.
本発明の工程１）において、多能性幹細胞からCD34発現細胞を分化誘導するための培養工程（例えば工程i）〜iv））の培養期間は特に限定されないが、好ましくは0.5日間から15日間である。培養期間中、培養液は1日〜2日に1回新たな培養液と交換することが好ましい。 In step 1) of the present invention, the culture period of the culture step (for example, steps i) to iv)) for inducing differentiation of CD34-expressing cells from pluripotent stem cells is not particularly limited, but preferably 0.5 days to 15 days. is there. During the culture period, the culture medium is preferably replaced with a new culture medium once every 1 to 2 days.
また多能性幹細胞からCD34発現細胞を分化誘導するための培養工程（例えば工程i）〜iv））では、細胞を接着条件ではなく浮遊させて培養することが好ましい。浮遊条件で培養するための培養器具としては、自体公知のものを用いることができるが、例えば市販のLipdureコートプレートやペトリ皿を用いればよい。 In addition, in the culture step for inducing differentiation of CD34-expressing cells from pluripotent stem cells (for example, steps i) to iv)), it is preferable to cultivate cells in a suspended state instead of adhesion conditions. As a culture instrument for culturing under the floating conditions, a publicly known one can be used. For example, a commercially available Lipdure coated plate or Petri dish may be used.
本発明におけるCD34発現細胞は、上記多能性幹細胞を液性因子を含む培地で培養して得られた細胞集団から、単離して得ることが好ましい。すなわち、本発明の工程１）は、CD34発現細胞を単離する工程、具体的には以下のｖ）の工程を含んでいることが好ましい。
ｖ）多能性幹細胞を液性因子を用いて培養して得られた細胞集団から、CD34発現細胞を単離する工程。
多能性幹細胞を液性因子を用いて培養して得られた細胞集団は、CD34発現細胞、CD34発現細胞以外の細胞、培地、培地に添加した種々の因子などを含む培養物であってもよい。多能性幹細胞を液性因子を用いて培養して得られた細胞集団は、上記工程ｉ）〜iv）により得られた細胞集団であることが好ましい。
The CD34-expressing cells in the present invention are preferably obtained by isolation from a cell population obtained by culturing the pluripotent stem cells in a medium containing a humoral factor. That is, step 1) of the present invention preferably includes a step of isolating CD34-expressing cells, specifically the following step v).
v) A step of isolating CD34-expressing cells from a cell population obtained by culturing pluripotent stem cells using humoral factors.
The cell population obtained by culturing pluripotent stem cells using humoral factors may be a culture containing CD34-expressing cells, cells other than CD34-expressing cells, media, various factors added to the media, etc. Good. The cell population obtained by culturing pluripotent stem cells using a humoral factor is preferably the cell population obtained by the above steps i) to iv).
CD34は細胞表面糖タンパク質であり、造血系細胞や内皮性の前駆細胞のマーカーとしても知られている。CD34発現細胞は血液細胞と内皮細胞への分化能を持つ。CD34発現細胞は、多能性幹細胞を培養して得られる細胞集団について、CD34の発現を確認し、CD34が発現している細胞を単離して得られた細胞集団（CD34+細胞）を意味する。CD34の発現の解析は、蛍光標識された抗CD34抗体を作用させて染色し、その後フローサイトメーターにて蛍光強度を測定することにより解析することが可能である。この際、蛍光標識されたコントロール抗体を作用させた細胞をネガティブコントロールとして使用し、当該ネガティブコントロール細胞の蛍光強度をバックグラウンドとすることができる。ネガティブコントロール細胞と同程度の蛍光強度を示す細胞をCD34が発現していない細胞（CD34-細胞）とし、CD34発現細胞はCD34が発現していない細胞よりCD34の蛍光強度が高い細胞である。CD34発現細胞の単離は、CD34の発現解析の結果に基づいて自体公知の手法により行うことができるが、フローサイトメトリー法（FACS）などの自体公知の方法によっても濃縮または単離することができる。あるいは、CD34分子を認識する抗体と反応性を有する細胞を回収するために、CD34抗体をビオチンや磁気ビーズで標識し、分離したい細胞群と反応させ、その後それぞれアビジンビーズや磁石でCD34発現細胞を回収したり、抗CD34抗体をコートした培養器具に細胞を入れ、抗CD34抗体と反応しない細胞を除去した後、CD34発現細胞を回収したりすることにより、CD34発現細胞を単離することもできる。 CD34 is a cell surface glycoprotein and is also known as a marker for hematopoietic cells and endothelial progenitor cells. CD34-expressing cells have the ability to differentiate into blood cells and endothelial cells. The CD34-expressing cell means a cell population (CD34 + cell) obtained by confirming the expression of CD34 and isolating a cell expressing CD34 from a cell population obtained by culturing pluripotent stem cells. Analysis of CD34 expression can be carried out by staining with a fluorescently labeled anti-CD34 antibody and then measuring the fluorescence intensity with a flow cytometer. At this time, cells treated with a fluorescently labeled control antibody can be used as a negative control, and the fluorescence intensity of the negative control cell can be used as the background. Cells showing the same fluorescence intensity as that of the negative control cells are defined as cells that do not express CD34 (CD34-cells), and CD34-expressing cells are cells that have a higher CD34 fluorescence intensity than cells that do not express CD34. CD34-expressing cells can be isolated by a method known per se based on the results of CD34 expression analysis, but can also be concentrated or isolated by a method known per se such as flow cytometry (FACS). it can. Alternatively, to recover cells that are reactive with the antibody that recognizes the CD34 molecule, label the CD34 antibody with biotin or magnetic beads, react with the cells to be separated, and then use avidin beads or magnets to express CD34-expressing cells. CD34-expressing cells can also be isolated by collecting or putting cells into a culture device coated with anti-CD34 antibody, removing cells that do not react with anti-CD34 antibody, and then recovering CD34-expressing cells .
多能性幹細胞から単離されたCD34発現細胞を、培養することにより血管内皮細胞を効率よく分化誘導することができる。CD34発現細胞の培養は、以下の工程vi）により行うことができる。
vi）CD34発現細胞を、水溶性ウシ視床下部抽出物、FGF2、ヘパリンを含む培地で培養する工程。
工程vi）において、CD34発現細胞は、上記iv）の工程により単離して得られた細胞であることが好ましい。
By culturing CD34-expressing cells isolated from pluripotent stem cells, vascular endothelial cells can be efficiently induced to differentiate. The culture of CD34-expressing cells can be performed by the following step vi).
vi) A step of culturing CD34-expressing cells in a medium containing a water-soluble bovine hypothalamic extract, FGF2, and heparin.
In step vi), the CD34-expressing cell is preferably a cell obtained by isolation in the step iv).
水溶性ウシ視床下部抽出物は、ECGS（内皮細胞増殖サプリメント）と称されるものである。ECGSは、内皮細胞や数種類の細胞に対して***促進効果を持ち、特に低血清や無血清条件下での細胞培養に使用されるものであり、哺乳類由来の血管内皮細胞の増殖促進因子を含有するウシ神経組織からの抽出物である。ECGSとしては例えば、Sigma社から市販されているものを使用することができる。 The water-soluble bovine hypothalamic extract is called ECGS (endothelial cell growth supplement). ECGS has a mitogenic effect on endothelial cells and several types of cells, and is especially used for cell culture under low serum and serum-free conditions. It contains growth-promoting factors for mammalian vascular endothelial cells. Extract from bovine nerve tissue. As ECGS, for example, those commercially available from Sigma can be used.
工程vi）において用いられる因子の適当な濃度は、CD34発現細胞の種類および使用量によるが、例えばECGSは10〜300 ng/ml、FGF2は1 ng/ml〜30 ng/ml、ヘパリンは10 ng/ml〜200 ng/mlであり得る。好ましくは、ECGSは100〜200 ng/ml、FGF2は10 ng/ml、ヘパリンは100 ng/mlであることが適当である。 The appropriate concentration of the factor used in step vi) depends on the type and amount of CD34-expressing cells. For example, ECGS is 10 to 300 ng / ml, FGF2 is 1 ng / ml to 30 ng / ml, and heparin is 10 ng. / ml to 200 ng / ml. Preferably, ECGS is 100 to 200 ng / ml, FGF2 is 10 ng / ml, and heparin is 100 ng / ml.
本発明のCD34発現細胞を培養する工程において、CD34発現細胞の密度は特に限定されないが、約5×104個〜40×104個/cm2が 例示される。培養温度は約30〜40℃、好ましくは37℃である。培養時の二酸化炭素濃度は約1〜10％、好ましくは約5％が適当である。 In the step of culturing the CD34-expressing cell of the present invention, the density of the CD34-expressing cell is not particularly limited, but is about 5 × 10 4 to 40 × 10 4 / cm 2 . The culture temperature is about 30-40 ° C, preferably 37 ° C. The carbon dioxide concentration during the cultivation is about 1 to 10%, preferably about 5%.
本発明のCD34発現細胞を培養する工程において、培養期間は特に限定されないが、好ましくは0.5日間から10日間である。培養期間中、培養液は1日〜2日に1回新たな培養液と交換することが好ましい。 In the step of culturing CD34-expressing cells of the present invention, the culture period is not particularly limited, but is preferably 0.5 days to 10 days. During the culture period, the culture medium is preferably replaced with a new culture medium once every 1 to 2 days.
またCD34発現細胞の培養工程では、細胞を浮遊条件ではなく接着させて培養することが好ましい。接着条件で培養するための培養器具としては自体公知のものを使用することができるが、例えば、Fibronectinでコーティングしたプレート等を用いればよい。 Further, in the step of culturing CD34-expressing cells, it is preferable that the cells are cultured while being adhered instead of floating conditions. As a culture instrument for culturing under adhesion conditions, a known one can be used, but for example, a plate coated with Fibronectin may be used.
CD34発現細胞を培養することにより得られた細胞が、血管内皮細胞であるかを確認するためには、形態の観察や、血管内皮マーカーの発現、アセチル化LDLの取り込み能、管腔形成能を確認することにより行うことができる。これらの項目は、自体公知の方法により確認することができるが、例えば後述する実施例に記載の方法により確認することができる。血管内皮マーカーとしては、CD31、von Willebrand Factor（vWF）が例示される。 In order to confirm whether the cells obtained by culturing CD34-expressing cells are vascular endothelial cells, morphological observation, vascular endothelial marker expression, acetylated LDL uptake ability, and lumen formation ability are required. This can be done by checking. These items can be confirmed by a method known per se. For example, these items can be confirmed by a method described in Examples described later. Examples of vascular endothelial markers include CD31 and von Willebrand Factor (vWF).
工程２）においては、上記工程１）にてCD34発現細胞を培養して得られた細胞を、脳由来細胞を培養した培地に接触させて培養することにより、脳血管内皮細胞を分化誘導する。脳由来細胞は、いかなる細胞であってもよく、神経細胞および非神経細胞のいずれであってもよい。また脳由来細胞は、ヒト由来、マウスやラット等の哺乳動物由来の細胞を使用することができる。脳由来細胞は血液脳関門を構成する細胞であることが好ましい。また脳由来細胞は、正常細胞でも脳腫瘍細胞（例えば神経膠腫細胞）でもよいが、例えば、ラットグリオーマ株であるC6細胞などが例示される。脳由来細胞を培養した培地とは、脳由来細胞を含んでいてもよいし、脳由来細胞を含んでいなくてもよい。すなわち、工程２）は以下の工程ａ）またはｂ）により行うことができる。
ａ）前記工程１）で培養した細胞を、脳由来細胞と共培養する工程。
ｂ）前記工程１）で培養した細胞を、脳由来細胞を培養した培地を添加した培地中にて培養する工程。
In step 2), the cells obtained by culturing the CD34-expressing cells in step 1) are cultured in contact with a medium in which brain-derived cells are cultured, thereby inducing differentiation of cerebral vascular endothelial cells. The brain-derived cell may be any cell, and may be a nerve cell or a non-neuronal cell. As the brain-derived cells, cells derived from humans and mammals such as mice and rats can be used. The brain-derived cells are preferably cells that constitute the blood brain barrier. The brain-derived cells may be normal cells or brain tumor cells (for example, glioma cells), and examples thereof include C6 cells that are rat glioma strains. The medium in which the brain-derived cells are cultured may contain brain-derived cells or may not contain brain-derived cells. That is, step 2) can be performed by the following steps a) or b).
a) co-culturing the cells cultured in the above step 1) with brain-derived cells.
b) A step of culturing the cells cultured in the step 1) in a medium to which a medium in which brain-derived cells are cultured is added.
工程ａ）においては、工程１）で得た細胞と、脳由来細胞とを接触した状態で共培養してもよいし、非接触の状態で共培養してもよい。共培養とは、工程１）で得た細胞と脳由来細胞とが一つの培地（培養液）中で存在している状態を意味し、これにより工程１）で得た細胞を、脳由来細胞を培養した培地に接触させて培養することができる。本発明の共培養は、好ましくは非接触の状態で培養する。非接触とは、工程１）の細胞と、脳由来細胞とを支持体により、培地中で距離を隔てて別々に存在し、互いに直接的に触れ合っていない状態、又は微孔性の支持膜を介してその表面側と裏面側にそれぞれ隔てて層状に存在する状態等、直接細胞同士が接触していない状態を意味する。 In step a), the cells obtained in step 1) and the brain-derived cells may be co-cultured in contact with each other, or may be co-cultured in a non-contact state. Co-culture means a state in which the cells obtained in step 1) and the brain-derived cells are present in one medium (culture solution), whereby the cells obtained in step 1) are treated as brain-derived cells. Can be cultured in contact with the cultured medium. The co-culture of the present invention is preferably cultured in a non-contact state. Non-contact means that the cells in step 1) and the brain-derived cells are separately present in the medium at a distance from each other by a support and are not in direct contact with each other, or a microporous support membrane. It means a state in which cells are not in direct contact with each other, such as a state in which the surface side and the back side are separated from each other.
本発明において共培養するための支持体は、工程１）にて得た細胞を培養容器中にて支持するためのものであり、例えば支持膜と支持具から構成される。支持体は工程１）の細胞を担持し、かつ支持膜を培養容器に固定するための部材であり、具体的にはシルクハット形状をしたセルカルチャーインサートと呼ばれるものが例示される。支持膜は、微孔性のものが好ましく、孔の大きさは、細胞が通過できない大きさの孔であるが、培地等が通過できる大きさであることが好ましい。膜の素材は、脳由来細胞の維持・生存を妨げるものではなく、工程１）で得た細胞の維持・生存・分化誘導を妨げるものでなければ、いかなる素材であってもよい。 The support for co-culture in the present invention is for supporting the cells obtained in step 1) in a culture vessel, and is composed of, for example, a support membrane and a support. The support is a member for supporting the cells of step 1) and fixing the support membrane to the culture vessel, and specifically, a so-called cell culture insert having a top hat shape is exemplified. The support membrane is preferably microporous, and the size of the pores is such a size that the cells cannot pass through, but it is preferable that the medium or the like can pass through. The material of the membrane may be any material as long as it does not prevent the maintenance / survival of brain-derived cells and does not interfere with the maintenance / survival / differentiation induction of the cells obtained in step 1).
本発明の上記工程ａ）において、工程１）で得た細胞の密度は、脳血管内皮細胞への分化誘導が可能である限り特に限定されないが、約1×105個〜1×106個/cm2が例示される。また脳由来細胞の濃度は、特に限定されないが、約1×104個〜3×104個/cm2が例示される。培養温度は約30〜40℃、好ましくは37℃である。培養時の二酸化炭素濃度は約1〜10％、好ましくは約5％が適当である。 In the above step a) of the present invention, the density of the cells obtained in step 1) is not particularly limited as long as differentiation into cerebral vascular endothelial cells can be induced, but about 1 × 10 5 to 1 × 10 6 cells. / cm 2 is exemplified. The concentration of the brain-derived cells is not particularly limited, but is about 1 × 10 4 to 3 × 10 4 cells / cm 2 . The culture temperature is about 30-40 ° C, preferably 37 ° C. The carbon dioxide concentration during the cultivation is about 1 to 10%, preferably about 5%.
また工程ｂ）においては、予め脳由来細胞を培養した培地を回収し、脳由来細胞を除去した後、当該培地を工程１）で培養した細胞の培地に添加することにより、工程１）で得た細胞を、脳由来細胞を培養した培地に接触させて培養することができる。 In step b), the culture medium in which the brain-derived cells are cultured in advance is collected, the brain-derived cells are removed, and then the medium is added to the culture medium of the cells cultured in step 1), thereby obtaining in step 1). The cultured cells can be cultured in contact with a medium in which brain-derived cells are cultured.
脳由来細胞の濃度は、特に限定されないが、約0.5×104個〜3×104個/cm2が例示される。培養温度は約30〜40℃、好ましくは37℃である。培養時の二酸化炭素濃度は約1〜10％、好ましくは約5％が適当である。また培地は脳由来細胞の生存・維持を妨げず、工程１）にて得た細胞の維持・生存・分化誘導を妨げるものであれば、いかなるものであってもよい。好ましくは工程１）の細胞の培養に用いる培地と同種の培地を用いて、脳由来細胞を培養すればよい。脳由来細胞の培養時間は、特に制限されないが、脳由来細胞から必要な液性因子が放出される程度の間培養を行うことが好ましく、例えば12〜48時間培養することが好ましい。 The concentration of the brain-derived cell is not particularly limited, but is exemplified by about 0.5 × 10 4 to 3 × 10 4 / cm 2 . The culture temperature is about 30-40 ° C, preferably 37 ° C. The carbon dioxide concentration during the cultivation is about 1 to 10%, preferably about 5%. The medium may be any medium as long as it does not hinder the survival / maintenance of brain-derived cells and prevents the maintenance / survival / differentiation induction of the cells obtained in step 1). Preferably, brain-derived cells may be cultured using the same type of medium as that used for culturing cells in step 1). The culture time of the brain-derived cells is not particularly limited, but it is preferable to perform the culture for a time during which necessary humoral factors are released from the brain-derived cells, for example, preferably for 12 to 48 hours.
工程ｂ）における、工程１）で得た細胞の培養培地への、脳由来細胞を培養した培地の添加量は特に制限されないが、培養培地の50 v/v%〜100 v/v%で添加することが好ましい。培養培地を100 v/v%添加するとは、工程１）で得た細胞の培養培地を、工程ｂ）において、脳由来細胞を培養した培地で置換することを意味する。また工程ｂ）において、工程１）で得た細胞の密度は、脳血管内皮細胞への分化誘導が可能である限り特に限定されないが、約1×105個〜1×106個/cm2が例示される。培養温度は約30〜40℃、好ましくは37℃である。培養時の二酸化炭素濃度は約1〜10％、好ましくは約5％が適当である。 The amount of the culture medium in which the brain-derived cells are cultured is not particularly limited to the culture medium of the cells obtained in step 1) in step b), but is added at 50 v / v% to 100 v / v% of the culture medium. It is preferable to do. Adding 100 v / v% culture medium means replacing the culture medium of the cells obtained in step 1) with the medium in which brain-derived cells are cultured in step b). In step b), the density of the cells obtained in step 1) is not particularly limited as long as differentiation into cerebral vascular endothelial cells can be induced, but it is about 1 × 10 5 to 1 × 10 6 cells / cm 2. Is exemplified. The culture temperature is about 30-40 ° C, preferably 37 ° C. The carbon dioxide concentration during the cultivation is about 1 to 10%, preferably about 5%.
工程ａ）およびｂ）のいずれであっても、適当な培養期間は脳血液内皮細胞を分化誘導し得る期間であれば特に限定されず、好ましくは1日間〜10日間である。また工程ａ）および工程ｂ）において脳血管内皮細胞を分化誘導するためには、上記工程１）にて説明した液性因子を含む培地を用いることが好ましく、上記工程iv）にて説明した水溶性ウシ視床下部抽出物、FGF2、ヘパリンを含む培地を用いて、接着培養することがより好ましい。接着培養には、自体公知の培養容器を用いることができるが、例えばFibronectinでコーティングしたプレート等の容器を用いればよい。 In any of steps a) and b), an appropriate culture period is not particularly limited as long as it can induce differentiation of brain blood endothelial cells, and is preferably 1 day to 10 days. In order to induce differentiation of cerebral vascular endothelial cells in steps a) and b), it is preferable to use a medium containing the humoral factor described in step 1) above, and the water solution described in step iv) above. It is more preferable to perform adhesion culture using a medium containing fetal bovine hypothalamus extract, FGF2, and heparin. For the adhesion culture, a culture vessel known per se can be used. For example, a vessel such as a plate coated with Fibronectin may be used.
本発明において、脳血管内皮細胞は、生体内のBBBを構成する脳血管内皮細胞と同様に、良好な接着性と物質輸送の調節能を有するものである。接着性は、電気抵抗を測定およびタイトジャンクション関連遺伝子の発現を解析することにより確認することができる。タイトジャンクション関連遺伝子としては、Claudin-5、Occludin、ZO-1が例示される。物質輸送の調節能は、標識されたデキストランを用いた物質透過性解析および脳血管内皮細胞に特異的に発現するトランスポーターの発現、当該トランスポーターの物質輸送機能を解析することにより確認することができる。当該トランスポーターとしては、MDR-1、BCRP、MRP-4、Glut1が例示される。接着性と物質輸送の調節能は、自体公知の手法により確認することができるが、例えば後述する実験例に記載の方法により確認することができる。分化誘導された脳血管内皮細胞は、細胞を含む培養物の状態であってもよい。 In the present invention, cerebral vascular endothelial cells have good adhesiveness and ability to regulate substance transport, similar to cerebral vascular endothelial cells constituting BBB in vivo. Adhesion can be confirmed by measuring electrical resistance and analyzing the expression of tight junction related genes. Examples of tight junction-related genes include Claudin-5, Occludin, and ZO-1. The ability to regulate substance transport can be confirmed by analyzing substance permeability using labeled dextran, analyzing the expression of transporters specifically expressed in cerebral vascular endothelial cells, and the substance transport function of the transporters. it can. Examples of the transporter include MDR-1, BCRP, MRP-4, and Glut1. Although the adhesiveness and the ability to regulate substance transport can be confirmed by a method known per se, it can be confirmed, for example, by the method described in Experimental Examples described later. Differentiated cerebrovascular endothelial cells may be in the state of a culture containing the cells.
本発明の工程１）および工程２）に使用する培養培地は、通常の細胞培養用、特にほ乳動物細胞培養用の培地であれば特に限定されない。培養培地は、血清由来のウイルスやプリオンの混入を防ぐなどの目的で、無血清培地を使用してもよいし、血清含有培地を使用してもよい。中胚葉細胞の培養に適した培養培地を用いることが適当である。具体的には、無血清完全合成培地であるmTeSR（Stemcell Technologies社製）やStemPro34培地（Life Technologies社製）、血清を含む培地であるMEMα（Sigma社製）を例示できる。また、培地には、工程１）および工程２）にて示した各種因子以外にも添加物を添加してもよく、添加物としては例えばアスコルビン酸やモノチオグリセロール（MTG）等が例示される。 The culture medium used in step 1) and step 2) of the present invention is not particularly limited as long as it is a normal cell culture medium, particularly a mammalian cell culture medium. As the culture medium, a serum-free medium or a serum-containing medium may be used for the purpose of preventing contamination of serum-derived viruses and prions. It is appropriate to use a culture medium suitable for culturing mesoderm cells. Specific examples include mTeSR (manufactured by Stemcell Technologies) and StemPro34 medium (manufactured by Life Technologies) which are serum-free complete synthetic media, and MEMα (manufactured by Sigma) which is a medium containing serum. In addition to the various factors shown in Step 1) and Step 2), additives may be added to the medium. Examples of the additive include ascorbic acid and monothioglycerol (MTG). .
本発明は、本発明の工程１）および工程２）を含む製造方法により得られた脳血管内皮細胞にも及ぶ。
また本発明は、本発明の製造方法により得られた脳血管内皮細胞を用いる、血液脳関門の解析方法にも及ぶ。本発明の血液脳関門の解析方法としては、例えば、後述する実験例１，２に記載の、電気抵抗の測定、タイトジャンクション関連遺伝子の発現量の解析、物質透過性解析、各種トランスポーターの発現量解析、トランスポーターの機能評価などが例示される。タイトジャンクション関連遺伝子としては、Claudin-5、Occuldin、ZO-1が挙げられる。またトランスポーター遺伝子としては、MDR-1、BCRP、MRP-4、Glut1が挙げられる。
The present invention also extends to cerebral vascular endothelial cells obtained by the production method including the steps 1) and 2) of the present invention.
The present invention also extends to a method for analyzing the blood-brain barrier using the cerebral vascular endothelial cells obtained by the production method of the present invention. Examples of the method for analyzing the blood brain barrier of the present invention include, for example, measurement of electrical resistance, analysis of expression level of tight junction-related genes, substance permeability analysis, and expression of various transporters described in Experimental Examples 1 and 2 described later. Examples include quantitative analysis and transporter function evaluation. Examples of tight junction-related genes include Claudin-5, Occuldin, and ZO-1. Examples of transporter genes include MDR-1, BCRP, MRP-4, and Glut1.
本発明の理解を深めるために、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは、いうまでもない。 In order to deepen the understanding of the present invention, the present invention will be specifically described with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
（実施例１）多能性幹細胞から血管内皮細胞への分化誘導
ヒトiPS細胞は、201B7（京都大学山中伸弥教授よりご供与：Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-872.）を用いた。培養方法を、図１を参照しながら、以下の（１）および（２）にて説明する。
(Example 1) Differentiation induction from pluripotent stem cells to vascular endothelial cells Human iPS cells are 201B7 (provided by Professor Shinya Yamanaka, Kyoto University: Cell. 2007 Nov 30; 131 (5): 861-872.) Using. The culture method will be described in the following (1) and (2) with reference to FIG.
（１）多能性幹細胞からCD34発現細胞の分化誘導
ヒトiPS細胞を用いて、Blood. 2013 Jan 17;121(3):447-458の手法を多少改変した手法により分化誘導を行った。まず細胞をAccutase（MILLIPORE社製）を用いて単一細胞懸濁液とした。2×104個の単一細胞を96ウェルのLipidureコートプレート（Thermo Scientific社製）の1ウェルに播種して、分化誘導を行った。培養液は培養日数に応じて組成を変化させた。Stempro34培地（Life Technologies社製）に50 μg/mlのアスコルビン酸（Sigma社製）と450μMのMTG（Sigma社製）を添加した培地を分化誘導用基本培地として用いた。培養開始0日目〜2日目までは分化誘導用基本培地に、20 ng/ml ヒトBMP4（hBMP4）（R&D Systems社製）、2 ng/mlヒトアクチビンA（R&D Systems社製）、10 μM Rhoキナーゼ阻害剤 Y27632を添加したものを用いた。培養開始2日目に、培地を20 ng/ml hBMP4（R&D Systems社製）、5 ng/ml ヒトVEGF（hVEGF）（Peprotech社製）を添加した分化誘導用基本培地で置換した。培養開始4日目に20 ng/ml hBMP4、5 ng/ml hVEGF、5 μM SB431542（Wako社製）を添加した分化誘導用基本培地に置換して、さらに培養を行った。培養開始6日目に、20 ng/ml hVEGF、2 ng/ml FGF2（片山化学社製）、5 μM SB431542（Wako社製）を添加した分化誘導用基本培地に置換して、さらに培養を9日目まで行った。なお培養開始6〜9日目までは、ペトリ皿を用いて培養を行った。
(1) Differentiation induction of CD34 expression cells from pluripotent stem cells Differentiation induction was performed using human iPS cells by a technique slightly modified from the technique of Blood. 2013 Jan 17; 121 (3): 447-458. First, the cells were made into a single cell suspension using Accutase (MILLIPORE). Differentiation induction was performed by seeding 2 × 10 4 single cells in 1 well of a 96-well Lipidure-coated plate (Thermo Scientific). The composition of the culture solution was changed according to the number of culture days. A medium in which 50 μg / ml ascorbic acid (manufactured by Sigma) and 450 μM MTG (manufactured by Sigma) were added to Stempro34 medium (manufactured by Life Technologies) was used as a basic medium for differentiation induction. From day 0 to day 2 of culture, 20 ng / ml human BMP4 (hBMP4) (R & D Systems), 2 ng / ml human activin A (R & D Systems), 10 μM What added the Rho kinase inhibitor Y27632 was used. On the second day of culture, the medium was replaced with a differentiation-inducing basic medium supplemented with 20 ng / ml hBMP4 (R & D Systems) and 5 ng / ml human VEGF (hVEGF) (Peprotech). On the 4th day from the start of culture, the culture medium was further replaced with a differentiation-inducing basic medium supplemented with 20 ng / ml hBMP4, 5 ng / ml hVEGF, and 5 μM SB431542 (manufactured by Wako). On the 6th day, the culture medium was replaced with a differentiation-inducing basic medium supplemented with 20 ng / ml hVEGF, 2 ng / ml FGF2 (Katayama Chemical Co., Ltd.) and 5 μM SB431542 (Wako Co., Ltd.). I went to the day. In addition, it culture | cultivated using the Petri dish from the 6th to 9th day of culture | cultivation start.
（２）CD34発現細胞の培養
培養9日目のヒトiPS細胞由来細胞を、0.25% トリプシン-EDTA（Life Technologies社製）で37℃、二酸化炭素濃度5％で処理し、単一細胞懸濁液とした。単一細胞に解離しきれなかった細胞塊をメッシュで取り除いた後、CD34発現を指標とした細胞単離を行った。
(2) Cultivation of CD34-expressing cells Human iPS cell-derived cells on the ninth day of culture were treated with 0.25% trypsin-EDTA (Life Technologies) at 37 ° C and a carbon dioxide concentration of 5% to obtain a single cell suspension. It was. Cell masses that could not be dissociated into single cells were removed with a mesh, and cell isolation was performed using CD34 expression as an indicator.
具体的には、上記調製した単一細胞懸濁液に、蛍光標識された抗ヒトCD34抗体（Biolegend社製）を添加して、細胞の染色を行った。その後フローサイトメーター（FACS Aria、BD Bioscience社製、またはSH800、Sony社製）にて蛍光強度を測定して、CD34+細胞を検出して単離した。なお、ネガティブコントロールとしては、蛍光標識されたコントロール抗体を作用させた細胞を用いた。コントロール抗体はいかなる抗原とも反応しないため、コントロール抗体を作用させた細胞の蛍光強度をバックグラウンドとした。蛍光標識された抗ヒトCD34抗体を作用させた細胞の解析においては、ネガティブコントロールの細胞と同程度の蛍光強度を示す細胞集団をCD34-細胞として単離し、それより発現が高い細胞集団をCD34+細胞として単離した。 Specifically, a fluorescently labeled anti-human CD34 antibody (manufactured by Biolegend) was added to the prepared single cell suspension to stain the cells. Thereafter, the fluorescence intensity was measured with a flow cytometer (FACS Aria, BD Bioscience, or SH800, Sony) to detect and isolate CD34 + cells. As a negative control, cells treated with a fluorescently labeled control antibody were used. Since the control antibody did not react with any antigen, the fluorescence intensity of the cells treated with the control antibody was used as the background. For analysis of cells treated with fluorescently labeled anti-human CD34 antibody, a cell population showing the same fluorescence intensity as that of the negative control cells was isolated as CD34− cells, and a cell population with higher expression was expressed as CD34 + cells. As isolated.
単離したCD34発現細胞を、100 μg/ml ECGS（Sigma社製）、10 ng/mlMのFGF2（片山化学社製）、100 μg/ml ヘパリン（Sigma社製）を添加した分化誘導用基本培地により、さらに4日間培養を行った。CD34細胞は、Fibronectin（BD Bioscience社製）を20μ/cm2でコーティングしたプレートを用いて、接着培養を行った。 Isolated CD34-expressing cells were added to 100 μg / ml ECGS (Sigma), 10 ng / ml M FGF2 (Katayama Chemical), 100 μg / ml heparin (Sigma) basic medium for differentiation induction By further culturing for 4 days. CD34 cells were subjected to adhesion culture using a plate coated with Fibronectin (BD Bioscience) at 20 μ / cm 2 .
（３）分化誘導した細胞の特性解析
単離したCD34発現細胞を上記（２）に従って培養した後、顕微鏡にて形態を観察し、血管内皮細胞が分化誘導されているかを確認した。
また培養した細胞について、抗CD31抗体（Dako社製）あるいは抗von Willebrand Factor（vWF）抗体（Dako社製）を反応させ、その後、各々Alexa488（緑色）あるいはAlexa594（赤色）標識した2次抗体（Life Technologies社製）用いて免疫抗体染色を行うことにより、血管内皮細胞マーカータンパク質の発現を確認した。
培養した細胞について、アセチル化LDL取り込み能とマトリゲル中での管腔形成能を調べることにより、血管内皮細胞としての機能を検証した。アセチル化LDLの取り込み能の解析は以下のように行った。CD34発現細胞を接着培養した後、培地を10 μg/ml Alexa Fluor 488 acetylated LDL（Life Technologies社製）を含む培地で置換し、37℃、4時間培養した。その後、細胞内に取り込まれたアセチル化LDLを蛍光顕微鏡にて観察した。
マトリゲル中での管腔形成能の解析は以下のように行った。48 wellプレートに100 μlのマトリゲル（BD Bioscience社製）溶液を加えて37℃、1時間静置することにより、プレートをコーティングした。CD34発現細胞を接着培養した後、0.25 % trypsin-EDTAにて回収し、10 ng/ml VEGFを含む培地に懸濁し、1×105個/ウェルの細胞数で播種した。37℃、16時間培養後に顕微鏡下で細胞を観察した。
(3) Characteristic analysis of differentiation-induced cells After culturing the isolated CD34-expressing cells according to (2) above, the morphology was observed with a microscope to confirm whether vascular endothelial cells were induced to differentiate.
The cultured cells are reacted with anti-CD31 antibody (Dako) or anti-von Willebrand Factor (vWF) antibody (Dako), and then labeled with Alexa488 (green) or Alexa594 (red) labeled secondary antibody ( The expression of vascular endothelial cell marker protein was confirmed by performing immunoantibody staining using Life Technologies.
The cultured cells were examined for their ability as vascular endothelial cells by examining their ability to take up acetylated LDL and their ability to form lumens in Matrigel. Analysis of acetylated LDL uptake ability was performed as follows. After adherent culture of CD34-expressing cells, the medium was replaced with a medium containing 10 μg / ml Alexa Fluor 488 acetylated LDL (manufactured by Life Technologies) and cultured at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, acetylated LDL incorporated into the cells was observed with a fluorescence microscope.
Analysis of the ability to form lumens in Matrigel was performed as follows. The plate was coated by adding 100 μl of Matrigel (BD Bioscience) solution to a 48-well plate and allowing to stand at 37 ° C. for 1 hour. After adherent culture of CD34-expressing cells, the cells were collected with 0.25% trypsin-EDTA, suspended in a medium containing 10 ng / ml VEGF, and seeded at a cell number of 1 × 10 5 cells / well. After culturing at 37 ° C. for 16 hours, the cells were observed under a microscope.
単離したCD34発現細胞を接着培養し、得られた細胞の特性解析を行った結果を図２に示す。図２ｂにおいては、CD31の染色およびvWFの染色を示す代表的な部分を矢印で示している。図２ｃにおいては、アセチル化LDLの蛍光（緑色）を示す代表的な部分を矢印で示している。
接着培養4日目における細胞形態を観察したところ、CD34発現細胞から血管内皮細胞様の形態を示す均一の細胞が増殖していた（図２ａ）。また、これらの細胞は血管内皮細胞のマーカー分子であるCD31やvWFを発現していることも明らかとなった（図２ｂ）。さらにCD34発現細胞を培養して得られた細胞は、アセチル化LDLの取り込み能（図２ｃ）やマトリゲル中での管腔形成能を有していることも示された（図２ｄ）。以上の結果から、本培養法によりヒトiPS細胞から機能的な血管内皮細胞が誘導可能であることが示された。
FIG. 2 shows the results of adhesion culture of the isolated CD34-expressing cells and the analysis of the characteristics of the obtained cells. In FIG. 2b, representative portions showing CD31 staining and vWF staining are indicated by arrows. In FIG. 2c, a representative portion showing fluorescence (green) of acetylated LDL is indicated by an arrow.
When the cell morphology on the 4th day of adhesion culture was observed, uniform cells showing vascular endothelial cell-like morphology were proliferating from CD34-expressing cells (FIG. 2a). It was also revealed that these cells expressed CD31 and vWF, which are marker molecules for vascular endothelial cells (FIG. 2b). Furthermore, the cells obtained by culturing CD34-expressing cells were also shown to have the ability to take up acetylated LDL (FIG. 2c) and the ability to form lumens in matrigel (FIG. 2d). From the above results, it was shown that functional vascular endothelial cells can be induced from human iPS cells by this culture method.
（実施例２）血管内皮細胞から脳血管内皮細胞への分化誘導１
実施例１にて分化誘導した血管内皮細胞を、ラットグリオーマ株C6細胞と共培養した（図３上段参照）。まず、実施例１にて分化誘導した細胞5×104個を、実施例１（２）にて使用したのと同様の、ECGS、FGF2、ヘパリン、アスコルビン酸、MTGを含むStempro34培地（Life Technologies社製）に再懸濁し、Fibronectinをコートしたインサート（コーニング社製）に播種した。インサート上の細胞がコンフルエントになった時に、予めラットC6細胞との共培養を開始した。ラットC6細胞5×103個を播種したプレート（コーニング社製）に、インサート上の細胞とラットC6細胞が接触しないようにインサートを設置した。なお、プレート側の培地は、実施例１に記載の分化誘導用基本培地であるアスコルビン酸とMTGを含むStempro34培地を用いた。インサート上の細胞は、ディッシュの培養液中に、浸漬するようにした。
(Example 2) Differentiation induction 1 from vascular endothelial cells to cerebral vascular endothelial cells 1
The vascular endothelial cells induced to differentiate in Example 1 were co-cultured with rat glioma strain C6 cells (see the upper part of FIG. 3). First, 5 × 10 4 cells induced to differentiate in Example 1 were used in Stempro34 medium (Life Technologies) containing ECGS, FGF2, heparin, ascorbic acid, and MTG, similar to those used in Example 1 (2). And then seeded on a fibronectin-coated insert (Corning). When cells on the insert became confluent, co-culture with rat C6 cells was started in advance. The insert was placed on a plate (manufactured by Corning) on which 5 × 10 3 rat C6 cells were seeded so that the cells on the insert did not contact the rat C6 cells. As the plate-side medium, a Stempro 34 medium containing ascorbic acid and MTG, which is the basic medium for differentiation induction described in Example 1, was used. The cells on the insert were immersed in the culture medium of the dish.
（実験例１）分化誘導した脳血管内皮細胞の機能の確認
実施例２において、共培養を開始した0、3、5、7日後のインサート上の細胞について、Millicell ERS-2（Millipore社製）を用いて電気抵抗（TEER）を測定した。測定方法は、Millicell ERS-2の取扱い説明書に記載の方法に従って行った。TEERは以下の計算式に従い算出した。TEER（Ω・cm2）= R sample（Ω）×Membrane area（cm2）
(Experimental example 1) Confirmation of the function of the differentiation-induced cerebral vascular endothelial cell In Example 2, the cells on the inserts 0, 3, 5, and 7 days after the start of co-culture were treated with Millicell ERS-2 (manufactured by Millipore). Was used to measure the electrical resistance (TEER). The measuring method was performed according to the method described in the instruction manual for Millicell ERS-2. TEER was calculated according to the following formula. TEER (Ω · cm 2 ) = R sample (Ω) × Membrane area (cm 2 )
また、実施例２における共培養を開始した5日後のインサート上の細胞について、RNAを抽出し定法に従ってcDNAを合成した。その後、Stepone PlusリアルタイムPCRシステム（Life Technologeis社製）を用いてタイトジャンクション関連遺伝子（Claudin-5、Occludin、ZO-1）の発現を解析した。 Further, RNA was extracted from the cells on the insert 5 days after the start of co-culture in Example 2, and cDNA was synthesized according to a conventional method. Thereafter, expression of tight junction-related genes (Claudin-5, Occludin, ZO-1) was analyzed using a Stepone Plus real-time PCR system (manufactured by Life Technologeis).
さらに、実施例２における共培養開始5日後のインサート上の細胞について、物質透過性を解析した。物質透過性の解析は以下のように行った。0.1 % FBS/内皮細胞基本培地（EBM-PRF、無血清、フェノールレッド不含 ; Lonza社製）で、Fluoresceinで標識したdextran（FD ; 分子量3000 ; Life Technologies）を100 μg/mlに調製した。インサート内の培地を100 μg/mlのFD溶液にて置換し、プレート側の培地をFD不含の0.1 %FBS EBM-PRFにて置換した。15時間培養後、プレート側の培地を懸濁した後に回収し、インサートからプレート側へ移行したFD量を蛍光強度計を用いて測定した（励起波長 ; 494 nm、蛍光波長 ; 521 nm）。FD溶液の段階希釈により検量線を作成して濃度を算出した。そして、得られた濃度を用いて透過係数（P sample）を算出した。透過係数の計算式は下記に従った(BMC Neurosci. 14, 59, 2013.、Front Psychiatry 3, 47, 2012)。
・インサートからプレート側へ通過したFD容積の算出： V =（AA×VA）/AL
・見かけ上の透過係数の算出： P =（dV/dt）/S
・各サンプルの透過係数の算出： 1/P sample = 1/P total - 1/P non
（AA : ある時間におけるプレート側のFD濃度、AL : インサート内のFD初濃度、VA : プレート側のwellの培地の容積、S : インサートのメンブレン面積、P sample : サンプルの透過係数、P total : サンプルの測定値から得られる見かけ上の透過係数、P non : 無細胞時の透過係数）
Furthermore, substance permeability was analyzed for cells on the insert 5 days after the start of co-culture in Example 2. The substance permeability analysis was performed as follows. Dextran (FD; molecular weight 3000; Life Technologies) labeled with Fluorescein was prepared at 100 μg / ml in 0.1% FBS / endothelial cell basal medium (EBM-PRF, serum-free, phenol red-free; manufactured by Lonza). The medium in the insert was replaced with 100 μg / ml FD solution, and the medium on the plate side was replaced with FD-free 0.1% FBS EBM-PRF. After culturing for 15 hours, the medium on the plate side was suspended and recovered, and the amount of FD transferred from the insert to the plate side was measured using a fluorescence intensity meter (excitation wavelength: 494 nm, fluorescence wavelength: 521 nm). A calibration curve was prepared by serial dilution of the FD solution to calculate the concentration. Then, the transmission coefficient (P sample ) was calculated using the obtained concentration. The formula for calculating the transmission coefficient was as follows (BMC Neurosci. 14, 59, 2013., Front Psychiatry 3, 47, 2012).
・ Calculation of FD volume that passed from the insert to the plate side: V = (A A × V A ) / A L
・ Calculation of apparent transmission coefficient: P = (dV / dt) / S
・ Calculation of transmission coefficient for each sample: 1 / P sample = 1 / P total -1 / P non
(A A : FD concentration on the plate side at a certain time, A L : Initial concentration of FD in the insert, V A : Volume of the medium in the well on the plate side, S: Membrane area of the insert, P sample : Permeability coefficient of the sample, P total : Apparent transmission coefficient obtained from the measured value of the sample, P non : Cell-free transmission coefficient)
実施例２における共培養を開始して5日目の細胞について、脳血管内皮細胞に特異的に発現する各種トランスポーター遺伝子（MDR-1、BCRP、MRP-4、Glut1）の発現を、タイトジャンクション関連遺伝子の発現解析と同様にして、RT-PCR法にて解析した。 The expression of various transporter genes (MDR-1, BCRP, MRP-4, Glut1) specifically expressed in the cerebral vascular endothelial cells was determined for the cells on day 5 after the start of co-culture in Example 2. The RT-PCR method was used in the same manner as the related gene expression analysis.
また、排出トランスポーターであるMDR-1の機能解析を以下の手順で行った。実施例２の共培養開始後5日目の細胞について、5 μM cyclospolin A（CSA：Wako社製）または10 μM MK571（Sigma社製）を37℃で1時間作用させた。その後、PBSを用いてインサート上の細胞を洗浄し、10 μM Rhodamin123（Sigma社製）を添加し、遮光で37℃、1時間作用させた。その後、プレート側の培地を懸濁して回収し、移行したローダミンを検出した（励起波長:485 nm、蛍光波長:530 nm）。阻害剤を作用させていない共培養後の細胞のRhodamin 123の移行量を1として各群の値を補正した。また、本実験の培地は全てEBM-PRFを用いた。 Moreover, the functional analysis of MDR-1 which is an effluent transporter was performed in the following procedures. 5 μM cyclospolin A (CSA: manufactured by Wako) or 10 μM MK571 (manufactured by Sigma) was allowed to act at 37 ° C. for 1 hour on the 5th day after the start of co-culture in Example 2. Thereafter, the cells on the insert were washed with PBS, 10 μM Rhodamin123 (Sigma) was added, and the mixture was allowed to act at 37 ° C. for 1 hour with light shielding. Thereafter, the medium on the plate side was suspended and collected, and the transferred rhodamine was detected (excitation wavelength: 485 nm, fluorescence wavelength: 530 nm). The value of each group was corrected with the amount of transfer of Rhodamin 123 in the cells after co-culture without an inhibitor acting as 1. In addition, EBM-PRF was used as the medium for this experiment.
なお、コントロールとして、実施例１の細胞の代わりに正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を脳由来細胞なしで単培養、または脳由来細胞と共培養し、上記と同様にして各解析を行った。 As a control, normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) instead of the cells of Example 1 were cultured in a single culture without brain-derived cells or co-cultured with brain-derived cells, and each analysis was performed in the same manner as described above. .
電気抵抗と物質透過性を確認した結果を図４に、タイトジャンクション関連遺伝子の発現を解析した結果を図５に、トランスポーター遺伝子の発現とMDR-1の排出機能を解析した結果を図６に示す。
脳由来細胞と共培養した本発明の細胞は、脳由来細胞なしで単培養した場合と比較して、電気抵抗が有意に上昇しており、タイトジャンクション関連遺伝子の発現も上昇していることが明らかとなった。さらに、デキストランの透過量は有意に低下していたことから、共培養した細胞が強固なタイトジャンクションを形成していることが示された。
一方、脳由来細胞と共培養したHUVECでは、脳由来細胞なしで単培養したHUVECと比較して、電気抵抗の上昇、タイトジャンクション関連遺伝子の上昇、デキストランの透過量の低下は見られなかった。
Fig. 4 shows the results of confirming electrical resistance and substance permeability, Fig. 5 shows the results of analysis of tight junction-related gene expression, and Fig. 6 shows the results of analysis of transporter gene expression and MDR-1 excretion function. Show.
The cells of the present invention co-cultured with brain-derived cells have significantly increased electrical resistance and increased expression of tight junction-related genes as compared to single culture without brain-derived cells. It became clear. Furthermore, since the amount of dextran permeated significantly decreased, it was shown that the co-cultured cells formed a strong tight junction.
On the other hand, in HUVEC co-cultured with brain-derived cells, there was no increase in electrical resistance, increase in tight junction-related genes, or decrease in the amount of dextran permeated as compared to HUVEC that was cultured alone without brain-derived cells.
加えて、共培養した細胞はトランスポーター遺伝子の発現が上昇していることも観察された。また、排出トランスポーターMDR-1の基質であるRhodamin123、そしてMDR-1の阻害剤であるCSAを用いて、MDR-1の機能を解析したところ、共培養開始後5日目の細胞にCSAを作用させた場合、Rhodamin123のプレート側への移行量が有意に上昇していたことから、脳由来細胞と共培養した血管内皮細胞は、機能的なMDR-1を発現していることが示された。なお、Rhodamin123は排出トランスポーターMRP-1の基質ではないことが知られているため、MRP-1の阻害剤MK571を作用させた場合にはローダミンの移行量に変化はみとめられなかった。 In addition, it was also observed that co-cultured cells had increased transporter gene expression. In addition, when the function of MDR-1 was analyzed using Rhodamin123, a substrate of the efflux transporter MDR-1, and CSA, an inhibitor of MDR-1, CSA was added to the cells on day 5 after the start of co-culture. When applied, the amount of Rhodamin123 transferred to the plate side was significantly increased, indicating that vascular endothelial cells co-cultured with brain-derived cells expressed functional MDR-1. It was. Since Rhodamin123 is known not to be a substrate for the efflux transporter MRP-1, no change was observed in the amount of rhodamine transferred when MK571 inhibitor MK571 was allowed to act.
以上の結果より、ヒトiPS細胞から誘導した血管内皮細胞は、脳由来細胞と共培養することにより、タイトジャンクションを形成し、かつ機能的な排出トランスポーターを発現する脳血管内皮細胞へ成熟化しているものと考えられた。 Based on the above results, vascular endothelial cells derived from human iPS cells are matured into cerebral vascular endothelial cells that form tight junctions and express functional efflux transporters by co-culture with brain-derived cells. It was thought that there was.
（実施例３）血管内皮細胞から脳血管内皮細胞への分化誘導２
実施例１にて分化誘導した血管内皮細胞を、ラットC6細胞を培養した培地を用いて培養した（図３下段参照）。まず、実施例１にて分化誘導した細胞5×104個を、実施例２と同様に、ECGS、FGF2、ヘパリン、アスコルビン酸、MTGを含むStempro34培地（Life Technologies社製）に再懸濁し、インサート上に播種した。別途、実施例１の分化誘導用基本培地であるアスコルビン酸とMTGを含むStempro34培地を用いて、ラットC6細胞を24時間培養し、その後培養上清をフィルトレーションして回収し、C6細胞コンディショナルミディウム（C6 CM）とした。インサート上の血管内皮細胞がコンフルエント（約1〜1.5×105個）になった時に、プレート側の培地をC6 CM 0.7mlと置換し、培養を行った。インサート側の培地（実施例１（２）で使用したのと同様のECGSやFGF2等の液性因子を含む培地）およびプレート側の培地（C6 CM）は2日おきに置換して培養した。
(Example 3) Differentiation induction 2 from vascular endothelial cells to cerebral vascular endothelial cells 2
The vascular endothelial cells induced to differentiate in Example 1 were cultured using a medium in which rat C6 cells were cultured (see the lower part of FIG. 3). First, 5 × 10 4 cells induced to differentiate in Example 1 were resuspended in Stempro34 medium (Life Technologies) containing ECGS, FGF2, heparin, ascorbic acid, and MTG as in Example 2. Seeded on insert. Separately, rat C6 cells were cultured for 24 hours using the Stempro34 medium containing ascorbic acid and MTG, which is the basic medium for differentiation induction of Example 1, and then the culture supernatant was collected by filtration and recovered in C6 cell condition. Narmidium (C6 CM). When vascular endothelial cells on the insert became confluent (about 1 to 1.5 × 10 5 cells), the medium on the plate side was replaced with 0.7 ml of C6 CM, and culture was performed. The medium on the insert side (the same medium containing ECGS, FGF2 and other liquid factors as used in Example 1 (2)) and the medium on the plate side (C6 CM) were replaced every two days for culture.
（実験例２）
実施例３において、培養を開始した0、3、5、7日後の細胞について、実験例１と同様にして、電気抵抗（TEER）を測定した。
また、培養開始5日後の細胞について、タイトジャンクション関連遺伝子の発現と物質透過性を解析した。
さらに、脳血管内皮細胞に特異的に発現する各種トランスポーター遺伝子（MDR-1、BCRP、MRP-4、Glut1）の発現を解析するとともに、MDR-1についてはトランスポーターとしての機能についても解析した。
これらの解析は、実験例１と同様の手法により行った。
(Experimental example 2)
In Example 3, the electrical resistance (TEER) was measured in the same manner as in Experimental Example 1 for the cells after 0, 3, 5, and 7 days after the start of culture.
In addition, the expression and substance permeability of tight junction-related genes were analyzed for cells 5 days after the start of culture.
Furthermore, we analyzed the expression of various transporter genes (MDR-1, BCRP, MRP-4, Glut1) that are specifically expressed in cerebral vascular endothelial cells, and also analyzed the function of MDR-1 as a transporter. .
These analyzes were performed by the same method as in Experimental Example 1.
電気抵抗を測定した結果と、物質透過性を確認した結果を図７に、タイトジャンクション関連遺伝子の発現を解析した結果を図８に、トランスポーター遺伝子の発現を解析した結果を図９に示す。
C6 CMを添加して培養した細胞は、脳由来細胞と共培養した細胞と同程度に電気抵抗が上昇し、さらに物質の透過性が低下していることが明らかとなった。さらに、トランスポーター遺伝子の発現量も、脳由来細胞と共培養したときと同様に上昇していた。また、C6 CMを用いて培養した細胞が発現するMDR-1は排出トランスポーターとして機能していることも確認できた。したがって、C6 CMを用いることにより脳血管内皮細胞を誘導できていることが示された。
FIG. 7 shows the results of measuring electrical resistance and the results of confirming substance permeability, FIG. 8 shows the results of analyzing the expression of tight junction-related genes, and FIG. 9 shows the results of analyzing the expression of transporter genes.
It was revealed that the cells cultured with C6 CM added had the same electrical resistance as the cells co-cultured with the brain-derived cells, and the permeability of the substance decreased. Furthermore, the expression level of the transporter gene was also increased in the same manner as when co-cultured with brain-derived cells. It was also confirmed that MDR-1 expressed by cells cultured with C6 CM functions as an efflux transporter. Therefore, it was shown that cerebral vascular endothelial cells could be induced by using C6 CM.
本発明により得られた脳血管内皮細胞は、電気抵抗値を測定したところ強い接着性を有しており、各種タイトジャンクション関連遺伝子が良好に発現しており、物質の透過性が低く、かつ各種トランスポーターが発現し、かつ機能しているものである。すなわち本発明により得られた脳血管内皮細胞は、ヒトのBBBの輸送機能を精度良く反映する機能を有するものである。本発明により得られた脳血管内皮細胞は、中枢神経疾患治療薬のヒト臨床試験に利用可能であり、有用である。 The cerebral vascular endothelial cell obtained by the present invention has strong adhesion as measured by electric resistance value, and various tight junction-related genes are well expressed, the permeability of the substance is low, and various The transporter is expressed and functioning. That is, the cerebral vascular endothelial cell obtained by the present invention has a function that accurately reflects the transport function of human BBB. The cerebrovascular endothelial cells obtained by the present invention can be used in human clinical trials for therapeutic agents for central nervous disease, and are useful.
Claims (9)
１）ヒト多能性幹細胞から分化誘導されたCD34発現ヒト細胞を培養する工程；および
２）前記工程１）で培養したヒト細胞を、ラットグリオーマ株C6細胞を培養した培地に接触させて、培養する工程。 The following 1) and 2) a process, a method of producing a human cerebrovascular endothelial cells from human pluripotent stem cells:
1) a step of culturing CD34-expressing human cells induced to differentiate from human pluripotent stem cells; and 2) contacting the human cells cultured in step 1) with a medium in which rat glioma strain C6 cells are cultured. Process.
ａ）前記工程１）で培養したヒト細胞を、ラットグリオーマ株C6細胞と共培養する工程；または
ｂ）前記工程１）で培養したヒト細胞を、ラットグリオーマ株C6株細胞を培養した培地を添加した培地中にて培養する工程。 Step 2), are the following a) or b) of the process, a method of producing a human cerebrovascular endothelial cell according to claim 1 or 2:
a) a step of co-culturing the human cells cultured in the above step 1) with rat glioma strain C6 cells; or b) a medium in which the rat glioma strain C6 strain cells are cultured added to the human cells cultured in the above step 1) Culturing in the prepared medium.
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