JP6474540B2 - 溶液から細胞を分離する細胞分離方法、細胞吸着用水和性組成物、および細胞分離システム - Google Patents
溶液から細胞を分離する細胞分離方法、細胞吸着用水和性組成物、および細胞分離システム Download PDFInfo
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Description
さらに、白血病細胞の検出、治療などを代表とする細胞医療にとって細胞の分離は重要な技術である。近年、幹細胞があらゆる臓器に分化増殖することが示され、幹細胞や前駆細胞、各種分化誘導因子・増殖因子などの細胞や生理活性物質に損傷を与えることなく分離・回収することは再生医療、遺伝子治療、病気の診断の分野にとって欠かせない技術である。
現在用いられている細胞や生理活性物質の分離方法には、膜分離法、遠心分離法、電気的分離法、標的細胞以外の細胞を死滅させる方法、標的細胞に親和性を有するリガンドを固定化した担体に、目的細胞を結合させる方法、磁気ビーズによる分離法等があり、それぞれ特定の用途に使用されている。
上記生体組織液から標的物質を選択的に分離回収する従来の技術のうち、特に特定の細胞を分取する技術については、それぞれ細胞の分離に使用する原理に起因する問題点があり、必ずしも一般的に使用できるものとはいえない。
例えば、膜分離法や遠心分離法は、細胞の大きさや比重の違いによって分離する方法であるため、白血球、赤血球及び血小板のように物理的性質に大きな相違がある場合には分離が可能であるが、白血球の亜集団の分離(例えば、T、B細胞の分離)など、対象となる物質間での物理的な差が小さい場合には使用できず、特異性が低い欠点がある。
また、電気的分離法は、電場中の細胞の荷電特性、誘電特性の違いを利用するものであるが、同じく細胞の選択性に限界がある。標的細胞以外の細胞を死滅させる方法は種々検討され、開発されているが、標的細胞がダメージを受ける場合があり、副作用の原因となる。
磁気ビーズ法は、細胞混合液を抗体を結合させた磁気ビーズと共にインキュベートすることにより、目的細胞を磁気ビーズでラベルし、磁気装置を用いてラベルされていない細胞から、ラベルした細胞を分離する方法である。この方法の場合、ビーズと標的細胞を効率よく結合させるために長時間のインキュベートが必要であり、その結果、標的以外の細胞の非特異的な吸着が生じて目的細胞の純度低下を招く恐れがあり、また、 小さな磁気ビーズに吸着した目的細胞を回収することが困難である。
免疫吸着カラム法は、標的細胞の膜抗原に対する抗体等のリガンドをビーズ等の基材表面に固定化し、これをカラムに充填して細胞分離を行うものである。このような免疫吸着等のリガンド間の相互作用を利用したものとしては、ビオチン−アビジン間の結合を利用したものが開示されているが、ビオチン−アビジン間の結合力が非常に強いため、分離した細胞を回収することが困難であり、回収効率が低下する等の欠点を有する。これらの方法は、抗体を用いるため、標的細胞への選択性が高いことが利点であるが、吸着細胞の回収にプロテアーゼやパパインなどの酵素を用いるため、回収率が低く、細胞自体への損傷が大きいという欠点を有している。
その他の医療用材料には、ポリエチレングリコール(poly(ethylene glycol), PEG) (Mori, Y.; Nagaoka, S.; Takiguchi T, Kikuchi, T, Noguchi N, Tanzawa, H.; Noishiki, Y. A new antithrombogenic material with long polyethylene oxide chains, Trans. ASAIO. 1982, 28, 459-463. または、Harris JM, ed, Poly(ethylene glycol) chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications Plenum Press, New York (1992).)がある。PEGは非常に優れた生体適合性を有しており、医療分野への応用研究も多くなされている。しかし、目標となる生体物質等を、選択的に吸着することはできなかった。
また、特に当該細胞分離の際に、分離の対象となる血液や体液への悪影響を抑制可能な細胞分離方法、および、細胞分取用の器具に使用可能な水和性組成物を提供することを目的とする。
<1> 中間水の量が30wt%以下の水和性組成物を溶液に接触させて、当該水和性組成物の表面に溶液中の細胞を吸着して溶液から分離することを特徴とする細胞分離方法。
<2> 前記水和性組成物の中間水の量が1wt%以上であることを更に特徴とする上記の細胞分離方法。
<3> 前記水和性組成物が、60mol%以上のポリ(2−メトキシエチルアクリレート)を含む重合物であることを更に特徴とする上記の細胞分離方法。
<4> 中間水の量が30wt%以下であることを特徴とするがん細胞分取用水和性組成物
<5> 中間水の量が30wt%以下であることを特徴とする幹細胞分取用水和性組成物
<6> 血液を流通させるための管であって、少なくとも血液に接触する面の一部が中間水の量が1〜30wt%である水和性組成物からなることを特徴とする管。
各種の物質を水と接触させることにより、当該物質の表面に一定量の水が所定の形態で拘束されることにより物質表面が含水して水和し、その表面には所定の構造を有する表面水層が形成されることが知られている。また、この表面水層の構造や厚さは、当該物質の表面付近の構造に依存して変化することが知られている。このように、その表面に一定量の水を拘束して水和することが可能な水和性組成物として、典型的にはゼラチンやコラーゲンのように多量の水と水和可能な物質の他にも、各種の有機物、無機物がその表面に水和により一定量の水を拘束して表面水層を形成可能であることが知られている。
図1に示されるように、所定量の水を含水した水和性組成物を一旦十分に冷却し、その後に比較的ゆっくりした速度で加熱した場合に、0℃以下の特定の温度域において所定の発熱を生じると共に、−10℃近辺から0℃までの広い温度範囲において吸熱が観察されることが明らかにされている(例えば、非特許文献1等を参照)。図1においては、−40℃近辺において顕著な発熱を生じている。通常の凍結状態の水(氷)を加熱した際には、その融点である0℃において融解熱としての吸熱を生じて液体の水に変態を生じるのに対して、水和性組成物で観察される上記の現象は、含水した水和性組成物表面の表面水層に拘束されている水が特異な挙動をすることに起因すると理解されている。また、水和性組成物の表面水層を十分な低温から0℃以上に加熱した際にDSC測定で測定される全吸熱量(=吸熱量−発熱量)が、当該水和性組成物の含水量と一致しないことから、加熱や冷却によって変態を生じないことでDSC測定の測定に関わらない水が存在することも知られている。
上記−40℃近辺の発熱に関して、PMEAのガラス転移点が−40℃近辺に存在することが知られていることから、上記発熱は過冷却により準安定な状態で凝固していた水が、当該PMEAのガラス転移点以上に加熱されたことで規則化(コールドクリスタリゼーション)を生じたことに起因するものと推察されている。また、当該コールドクリスタリゼーションに伴う発熱量は、規則化を生じている水の量に比例するものと推察され、この発熱量を測定することで水和性組成物の表面の状態が評価できるものと考えられる。
図2に示した各DSC測定の結果より求めたコールドクリスタリゼーションに伴う発熱量(ΔHCC)と、−20℃〜0℃の間で見られる吸熱量(ΔHm)を表1に示す。
更に、上記中間水の外側に弱く拘束された「自由水」の層が存在し、これが上記DSC測定の際に0℃における鋭い吸熱ピークを生じさせるものと推察されている(図4)。水和性組成物を水中に設置した際には、この自由水は、周囲の水相中の水(バルク水)と比較的自由に交換可能である一方で、中間水などとの相互作用により表面から除去されにくく、表面水層を形成するものと考えられている。
図6には、図5に示したMEAとHEMAを各割合で混合して得られた共重合体における不凍水、中間水、自由水の含有量を示す。当該不凍水、中間水、自由水の各含有量は、図2に示したような含有量の変化に伴うコールドクリスタリゼーションに伴う発熱ピークの挙動と、全含水量から求めることができる。図6に示されるように、MEAとHEMAの共重合体においては、その割合を適宜変化することにより、各共重合体に含まれる不凍水、中間水、自由水の量やその割合を変化することができる。
一方、中間水の量が過剰に少ない水和性組成物を用いた場合には、吸着された細胞が水和性組成物の表面や、そこに存在する不凍水の影響でダメージを受ける可能性があるため、特に吸着分離した細胞を培養などして使用する際には好ましくない。他方、中間水の量が1wt%以上となる水和性組成物を用いることで、血小板や血漿タンパク質の吸着を回避しつつ、がん細胞や幹細胞などにダメージを加えることなく吸着を行うことが可能となる。特に、中間水の量が3wt%以上となる水和性組成物を用いることで、血小板や血漿タンパク質の吸着を有効に回避しつつ、がん細胞や幹細胞などを変質することなく吸着を行うことが可能となる。
これらの高分子の中でも、下記の式(2)で表されるポリ(2−メトキシエチル・アクリレート(PMEA))等が生体適合性に優れる点で特に好ましい。
例えば、該水和性組成物の塗布法によるコーティング処理は、適当な溶媒に該共重合体を溶解したコーティング溶液に、濾材を浸漬した後、余分な溶液を除き、ついで風乾させるなどの簡単な操作で実施できる。また、濾材に該水和性組成物をより強固に固定化させるために、コーティング後のフィルター濾材に熱を加え、濾材と該水和性組成物との接着性を更に高めることもできる。また、表面を架橋することで固定化しても良い。架橋する方法として、コモノマー成分として架橋性モノマ−を導入しても良い。また、電子線、γ線、光照射によって架橋しても良い。
以下、実施例を参照して、本発明について具体的に説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されるものではない。
(1)Sample A:ポリ(2−メトキシエチルアクリレート)(PMEA)材の作製
2−メトキシエチルアクリレート15gを1,4−ジオキサン60g中でアゾビスイソブチロニトリル(0.1重量%)を開始剤として、窒素バブリングしながら75℃で10時間重合を行った。重合反応終了後、n−ヘキサンに滴下し沈殿させ、生成物を単離した。生成物をテトラヒドロフランに溶解し、さらに2回n−ヘキサンを用いて精製を行った。精製物を一昼夜減圧乾燥した。無色透明で水飴状のポリマーが得られた。収量(収率)は12.3g(82.0%)であった。得られたポリマー構造は、1H−NMRによって確認した。GPCの分子量分析の結果から、数平均分子量(Mn)が26,000であり分子量分布(Mw/Mn)は3.27であった。得られたポリマー(ポリ(2−メトキシエチルアクリレート)(PMEA))をメタノールに溶解した0.2重量%溶液をポリエチレンテレフタレート(PET)製の円板上にキャストし、スピンコーターを用いて2回コーティングを行った。水の静的接触角とX-ray Photoelectron Spectroscopy(XPS)測定により、PET表面上にPMEAが被覆されていることを確認した。
2−メトキシエチルアクリレート(MEA)と、2−ヒドロキシエチル・メタクリレート(HEMA)を、HEMAの割合が10,20,30,40,50,100mol%であって、合計で15gとなるように混合した混合物を用いた他は、上記PMEA材と同様に重合してポリマーを得た。得られたポリマーをメタノールに溶解した0.2重量%溶液をPET製の円板上にキャストし、スピンコーターを用いて2回コーティングを行った。
2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)のエタノール溶液をPET製の円板上にキャストし、スピンコーターを用いてコーティングを行ったものに対して、60Coを放射線源として、80 kGy(10kGy/hで8時間) のγ線を照射して架橋を行い水不溶性としたポリ(2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン)(PMPC)を作製した。
上記で作製した水和性組成物試料(Sample A〜C)について、含湿雰囲気への暴露や、最高で7日間の水中へ浸漬により飽和含水を与える等の方法によりそれぞれ適量の水を含水させた。含水後の各試料の所定量を取り、あらかじめ重量を測定した酸化アルミパンの底に薄く広げた。示差走査熱量計(DSC-8230, リガク社製) を用いて、室温から-100℃まで冷却し、ついで10分間ホールドした後、昇温速度2.5℃/min.で−100℃から50℃まで加熱を行う過程での吸発熱量の測定を行った。なお、予め各試料の基材に用いたPET基板は有意な量の含水を生じないことを確認した。
各試料について、DSC測定後にアルミパンにピンホールをあけて真空乾燥後、その重量減少分を含水量として求めた。含水量(WC)は、基材に用いたPET基板の質量を除外した上で、以下の式(I)で求めた。
含水量(WC) = (W1−W0 ) / W0 (I)
(W0:試料の乾燥重量(g)、W1:試料の含水重量(g))
飽和含水させたSample A〜Cと、対照材としてのガラス基板とガラス基板を用いて、クエン酸ナトリウムで抗凝固した人新鮮多血小板血漿と試料表面とを37℃、60分間接触させた後、リン酸緩衝溶液でリンスし、グルタルアルデヒドで固定した。その後、試料表面1×104μm2に粘着した血小板数を電子顕微鏡で観察した。血小板の粘着形態変化の進行度により、I(正常)、II(偽足形成)、III(伸展)型に分類して血液との適合性の評価を行った。
PETに吸着した全血小板を1000とした場合の、各試料における粘着血小板の相対数を各試料における中間水の量に対して図7に示す。
飽和含水させたSample A,Cと、対照材としてのガラス基板とPET基板を用いて、がん細胞の吸着試験を行った。ウシ胎児血清を添加した培地で培養したヒト線維肉腫細胞(HT-1080)に、各試料を37℃、60分間接触させた後、リン酸緩衝溶液でリンスし、ホルムアルデヒドで固定した。細胞の核をDAPI、アクチン骨格をphalloidin抗体、ビンキュリン接着班を抗vinculin抗体でそれぞれ染色して共焦点レーザー顕微鏡を用いて接着細胞数の計測を行った。
PETに吸着した癌胞数を1000とした場合の、各試料における吸着癌細胞数の相対数を各試料における中間水の量に対して図7に合わせて示す。なお、Sample CであるPMPC表面上では、がん細胞の接着が弱く、リン酸緩衝溶液でのリンス時にほとんどのがん細胞の剥離が観察されたため、図7には概数を記入した。
飽和含水させたSample A,Cと、対照材としてのガラス基板とPET基板を用いて、ヒト血管内皮細胞の吸着試験を行った。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、ウシ胎児血清、へパリン、endothelial cell growth supplementを添加した培地で培養したものを用いた。各試料を血管内皮細胞の培養液に37℃、60分間接触させた後、リン酸緩衝溶液でリンスし、ホルムアルデヒドで固定した。細胞の核をDAPI、アクチン骨格をphalloidin抗体、ビンキュリン接着班を抗vinculin抗体でそれぞれ染色して共焦点レーザー顕微鏡を用いて接着細胞数の計測を行った。
PETに吸着した血管内皮細胞数を1000とした場合の、各試料における吸着血管内皮細胞数の相対数を各試料における中間水の量に対して図7に合わせて示す。なお、Sample CであるPMPC表面上では、血管内皮細胞の接着が弱く、リン酸緩衝溶液でのリンス時にほとんどの細胞の剥離が観察されたため、図7には概数を記入した。
飽和含水させたSample A,Cと、対照材としてのガラス基板とPET基板を用いて、ヒト歯根膜由来細胞の吸着試験を行った。ヒト歯根膜由来細胞(PDL)は、ウシ胎児血清を添加した培地で培養したものを用いた。各試料を血管内皮細胞の培養液に37℃、60分間接触させた後、リン酸緩衝溶液でリンスし、ホルムアルデヒドで固定した。細胞の核をDAPI、アクチン骨格をphalloidin抗体、ビンキュリン接着班を抗vinculin抗体でそれぞれ染色して共焦点レーザー顕微鏡を用いて接着細胞数の計測を行った。
PETに吸着した歯根膜由来細胞数を1000とした場合の、各試料における吸着歯根膜由来細胞数の相対数を各試料における中間水の量に対して図7に合わせて示す。なお、Sample CであるPMPC表面上では、歯根膜由来細胞の接着が弱く、リン酸緩衝溶液でのリンス時にほとんどの細胞の剥離が観察されたため、図7には概数を記入した。
飽和含水させたSample A,Cと、対照材としてのガラス基板とPET基板を用いて、ヒト新鮮血より遠心分離機により分離した血漿に37℃、60分間浸漬した。浸漬後、リン酸緩衝溶液でリンスし、各基材表面に吸着した血漿タンパク質の量を、金コロイドドットプロット法により求めた。結果を表3に示す。
図7において、PET基板以外の試料については、PET基板への各細胞の吸着数を1000とした場合の相対数により各細胞の吸着数を示している。このため、各試料表面に各細胞が接触した回数と、当該細胞がPET基板に接触した回数が同等であることを考慮すれば、図8におけるそれぞれの値は、各細胞が各試料に吸着を生じる頻度(確率)を示すものである。
Claims (7)
- 中間水の量が1wt%以上、且つ30wt%以下の水和性組成物を溶液に接触させ(中間水の量が30wt%以下の水和性組成物を塗布した細胞分離用フィルターで溶液を濾過して細胞を分離する形態を除く)て、当該水和性組成物の表面に溶液中に存在する腫瘍細胞、幹細胞、血管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、および膵ラ島細胞の少なくても一種を吸着して溶液から分離することを特徴とする細胞分離方法。
- 前記水和性組成物の中間水の量が3wt%以上であることを特徴とする請求項1に記載の細胞分離方法。
- 前記水和性組成物が、60mol%以上の2−メトキシエチルアクリレートを含む(共)重合物を含むことを特徴とする請求項1又は2に記載の細胞分離方法。
- 少なくても表面の一部に中間水の量が1wt%以上、且つ30wt%以下の水和性組成物を有する基材を有し、当該水和性組成物の表面に溶液中の細胞を吸着して分離する細胞分離システムであって、
前記細胞が、腫瘍細胞、幹細胞、血管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、肝実質細胞、肝非実質細胞、および膵ラ島細胞の少なくても一種であることを特徴とする細胞分離システム。 - 前記水和性組成物が、基材の表面を被覆していることを特徴とする、請求項4に記載の細胞分離システム。
- 前記水和性組成物の中間水の量が3wt%以上であることを特徴とする請求項4又は5に記載の細胞分離システム。
- 前記水和性組成物が、60mol%以上の2−メトキシエチルアクリレートを含む(共)重合物を含むことを特徴とする請求項4〜6のいずれかに記載の細胞分離システム。
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