CN111012772B - 咖啡酸苯乙酯在治疗主动脉瓣膜钙化病中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及主动脉瓣膜钙化病的预防和/或治疗领域，发明人经研究发现咖啡酸苯乙酯可以有效下调瓣膜***中成骨分化标志基因RUNX2和ALP的表达，抑制瓣膜***钙化，从而抑制或延缓瓣膜钙化，进而提供了咖啡酸苯乙酯在制备用于预防和/或治疗个体主动脉瓣膜钙化病的药物中的用途。为采用非手术方法来治疗主动脉瓣膜钙化病提供了新的选择。

Description

咖啡酸苯乙酯在治疗主动脉瓣膜钙化病中的用途
技术领域
本发明涉及主动脉瓣膜钙化病的预防和/或治疗领域，具体涉及咖啡酸苯乙酯在预防和/或治疗主动脉瓣膜钙化病中的用途。
背景技术
咖啡酸苯乙酯(CAPE)是一种天然的多酚化合物，主要存在于针叶树的树皮以及蜜蜂蜂巢的蜂胶中，现有的研究将其描述为抵抗各种病理学例如感染、氧化应激、炎症、癌症、糖尿病、神经退行性疾病和焦虑的有效部分。此外，CAPE已被证明可抑制NF-κB并有助于抗炎活性。但是，对于咖啡酸苯乙酯与主动脉瓣膜钙化之间的研究，目前尚未见报道。
钙化是指人体中的某种组织在一些因素的作用下发生坏死，继而体内的钙盐沉积于坏死灶内，使病变局限而趋于稳定的过程。实质上，钙化是机体对于病变的一种防御性的反应，其有利于坏死灶的清除和炎症的消退。虽然大多数钙化是一种防御性反应，但是一些钙化却会导致不良后果，例如，***钙化可能导致***炎的治疗困难和易复发等等。
主动脉瓣膜钙化病(CAVD)，是钙化性心脏瓣膜病(Calcific heart valvedisease,CHVD)的一种。它是一种因心脏主动脉瓣膜钙化而引起的疾病，会引起栓塞从而导致脑卒中，还可能导致感染性心内膜炎，而严重危害人的健康。主动脉瓣膜钙化病在世界范围内是一种常见且多发的疾病：在发达国家65岁以上的人群中，超过20％有不同程度主动脉瓣硬化，在我国50岁以上人群中瓣膜钙化检出率达12.5％，其中主动脉瓣受累占94.4％。据统计，近年来主动脉瓣膜钙化病发病率仍呈逐年增高的趋势。
瓣膜组织中的细胞主要包括有瓣膜内皮细胞(Valvular endothelial cells,VEC)、人瓣膜***(Valvular interstitial cells,VIC)、瓣膜前体细胞等。已有研究提出：人瓣膜***向成骨样细胞表型转化所导致的骨基质蛋白和钙盐含量增加可能是引发瓣膜钙化发生的关键始动因素之一。
目前，人们认为，CAVD达到了“无可救药的地步”，主动脉瓣膜钙化病最主要的治疗手段是手术，例如，主动脉瓣置换术、主动脉去钙化术和经皮穿刺球囊瓣膜成形术等。然而，手术将不可避免地对患者带来较高的风险，如围术期死亡率高、远期效果欠佳，同时还会加重患者家庭的经济负担，仍然有许多临床试验来验证一些有前途的药物干预措施，它们可以停止或减缓其进展。
因此，存在对采用非手术方法来有效治疗主动脉瓣膜钙化病的强烈需求。
发明内容
本发明要解决的问题是如何有效地治疗或预防个体主动脉瓣膜钙化病。
根据上述需求，在第一方面，本发明提供了咖啡酸苯乙酯在制备用于预防和/或治疗个体的主动脉瓣膜钙化病中的用途。
在本发明中，咖啡酸苯乙酯是指CAS号为104594-70-9；分子式为C17H16O4的物质；其是从蜂胶中提取的天然化合物，其化学结构如图1b所示。
在本发明中，“预防和/或治疗”是指预防和/或延缓疾病或病症的发生或使之正常化。
在一个实施方案中，所述咖啡酸苯乙酯的浓度为1μM-10μM。
进一步的，在优选的实施方案中，所述咖啡酸苯乙酯的浓度为5μM-10μM。
更优选的实施方案中，所述咖啡酸苯乙酯的浓度为10μM。
在一个实施方案中，所述个体为哺乳动物，所述哺乳动物包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。
优选地，所述个体为人。
在这一方面，本发明的有益效果在于咖啡酸苯乙酯可以有效下调瓣膜***中成骨分化标志基因ALP和RUNX2的表达，抑制瓣膜***钙化，从而抑制或延缓瓣膜钙化。
附图说明
图1：用CAPE处理VIC的活力和钙化。(a)在有或没有CAPE(10μM)处理5天的情况下的细胞增殖曲线；(b)CAPE的分子结构；(c)CAPE在VIC上的IC50，浓度转移到Log(c)；n＝5(d)经过或未经过CAPE处理(10μM)5天的VIC的细胞形态；(e)用不同条件培养对细胞进行茜素红S染色：对照(正常培养基)、OM(成骨培养基)、OM+CAPE(成骨细胞培养基加CAPE处理)；当分别与对照(*与对照)和OM(#与OM)比较时，p<0.05被认为是显著差异，n＝3；
图2：CAPE对OM诱导的VIC中钙相关基因/蛋白质表达的影响。(a)用OM刺激VIC，然后用10μM CAPE处理或不处理24和48小时，通过qRT-PCR检测RUNX2、ALP的mRNA表达水平；(b)通过上述条件培养48小时，在VIC上对ALP、RUNX2进行免疫荧光染色；(c)通过Western印迹和定量分析确定上述基因的蛋白表达水平。与对照相比，*p＜0.05，与OM相比，#p＜0.05；
图3：CAPE通过干扰Akt、ERK1/2、NF-κB和NLRP3炎性小体激活来抑制VIC的钙化。(a)在有或没有CAPE的OM(成骨培养基)条件培养下，磷酸化ERK、IκBα和AKT的蛋白表达谱；(b)通过Western blot测定NLRP3、ASC、P20的蛋白表达水平；(c)根据灰色半定量收集的p/t-ERK(磷酸化Erk/总ERK)、p/t-IκBα(磷酸化IκBα/总IκBα)、p/t-AKT(磷酸化-AKT/总AKT)，和NLRP3、ASC、P20的统计分析；(d)免疫荧光染色，以验证CAPE抑制OM诱导的P65细胞核易位。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、商品化成骨诱导培养基诱导人瓣膜***钙化模型的构建
取培养密度接近80％的人瓣膜***，用2％的FBS+DMEM高糖培养液饥饿过夜，然后以新配置成骨诱导培养基(赛业生物Cyagen，货号：HUXMA-90021)对饥饿完毕的瓣膜***进行钙化诱导，诱导21天后进行茜素红染色，考察不同处理对瓣膜***钙化的影响。
实施例2、咖啡酸苯乙酯抑制人瓣膜***钙化
采用如上述实施例1构建的人瓣膜***钙化模型，并将人瓣膜***分为3组，分别为对照组(未处理，正常培养基)、OM组(成骨培养基诱导)和OM+CAPE组(成骨培养基诱导之后加入咖啡酸苯乙酯)。使用不同浓度的咖啡酸苯乙酯(咖啡酸苯乙酯购自Selleck，产品目录编号：S7414)处理人瓣膜***，进行IC50测试、CCK8测定和茜素红染色分析。
IC50结果如图1c所示，当浓度超过10μM时，CAPE会显示明显的毒性迹象，因此，将10μM的CAPE用于进一步的实验。cck8细胞生存活力检测，10μM的咖啡酸苯乙酯的浓度并未见明显细胞毒性，并不影响细胞形态(图1d)，如图1a所示，与对照组相比，CAPE组细胞活力在第5天下降，但是未观察到细胞毒性。在用成骨培养基处理人瓣膜***21天后，茜素红染色呈现阳性，与对照细胞相比显示出显著差异，而加入10μM咖啡酸苯乙酯处理以后，茜素红阳性染色降低，与未加入咖啡酸苯乙酯的的阳性组细胞比较显示出显著差异(*p<0.05)(图1e)，表明咖啡酸苯乙酯能够显著抑制人瓣膜***钙化。
实施例3、咖啡酸苯乙酯抑制人瓣膜***钙化的基因蛋白表现情况
采用如上述实施例1构建的人瓣膜***钙化模型，并将人瓣膜***分为3组，分别为对照组(未处理，正常培养基)、OM组(成骨培养基诱导)和OM+CAPE组(成骨培养基诱导之后加入咖啡酸苯乙酯)。使用10μM终浓度(培养液中终浓度)的咖啡酸苯乙酯来处理人瓣膜***，于24h和48h检测成骨特异性基因RUNX2和ALP。
定量qRT-PCR结果显示，与对照组相比，成骨培养基显著上调ALP和RUNX2(成骨分化标志基因)的表达(*p<0.05)。但随着在培养基中添加咖啡酸苯乙酯，BMP2和RUNX2均被下调(图2a)，显示出统计学上的显著差异(#p<0.05)。同样，在处理48小时后，测试了RUNX2和ALP的蛋白质表达。结果与上述基因表达一致(图2c)。通过上述条件培养对人瓣膜***上的ALP、RUNX2进行免疫荧光染色，以另一种方式验证蛋白质表达。结果与蛋白质印迹结果一致(图2b)。
实施例4、咖啡酸苯乙酯抑制人瓣膜***钙化的机理
通过蛋白质印迹法检测了在有或没有咖啡酸苯乙酯的OM处理下的OM处理的磷酸化ERK、IκBα和AKT的蛋白水平。结果表明，咖啡酸苯乙酯能够有效逆转OM诱导的磷酸化ERK、IκBα和AKT蛋白表达的增加(图3a)。然后进行免疫荧光染色以观察P65的细胞核易位，结果表明咖啡酸苯乙酯可以抑制OM诱导的P65的细胞核易位(图3d)。同时，咖啡酸苯乙酯可以有效抑制NLRP3炎症小体(inflammasome)的激活(图3b、c)。

Claims (6)

1.咖啡酸苯乙酯在制备用于预防和/或治疗个体主动脉瓣膜钙化病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述咖啡酸苯乙酯的浓度为1μM-10μM。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述咖啡酸苯乙酯的浓度为5μM-10μM。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述咖啡酸苯乙酯的浓度为10μM。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的用途，其中，所述个体为哺乳动物。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的用途，其中，所述个体为人。
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