JP6464529B2 - 骨分化誘導方法及び骨化促進・抑制分子のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
また近年、骨や軟骨への損傷、歯科治療などで、骨再生能力を利用することが研究されている。骨形成は、未分化間葉系が凝集して軟骨芽細胞に分化し、骨を形作るための鋳型として軟骨が形成される内軟骨性骨形成と、間葉系細胞が凝集し、内部から骨芽細胞に分化する膜性骨形成があるが、いずれの場合も、骨芽細胞が骨形成を担当としているといわれている
1.iPS細胞の作成のための初期化遺伝子を導入した進行性骨化性線維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞又はその細胞由来の継代された細胞を骨誘導因子BMP−6の存在下で培養することを含む体細胞又はそれに由来する細胞の骨芽細胞への分化誘導方法。
2.前記体細胞が皮膚線維芽細胞である前記1に記載の方法。
3.前記細胞がヒト細胞である、前記2に記載の方法。
4.前記細胞が、以下の遺伝子:
1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
を有する、前記1〜3のいずれか一つに記載の方法。
5.前記初期化遺伝子が、少なくともOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子を含む、前記1〜4いずれか一つに記載の方法。
6.前記初期化遺伝子がさらに、Myc遺伝子を含む、前記5に記載の方法。
7.前記細胞の培養を、BMP−6を10〜100ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記1〜5のいずれか一つに記載の方法。
a)進行性骨化性線維異形成症に罹患した個体に由来する体細胞にiPS細胞の作成ための初期遺伝子が導入された細胞又はその細胞由来の継代された細胞を、骨誘導因子BMP−6及び被験物質の存在下で培養する;及び
b)前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する:
ことを含む骨化制御(骨化促進又は骨化抑制)分子のスクリーニング方法。
9.前記体細胞が皮膚線維芽細胞である前記8に記載の方法。
10.前記細胞がヒト細胞である、前記9に記載の方法。
11.前記細胞が、以下の遺伝子:
1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
を有する、前記8〜10のいずれか一つに記載の方法。
12.前記初期化遺伝子が、少なくともOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子、を含む、前記8〜11のいずれか一つに記載の方法。
13.前記初期化遺伝子がさらに、Myc遺伝子を含む、前記12に記載の方法。
14.前記細胞の培養を、BMP−6を10〜100ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記8〜13のいずれか一つに記載の方法。
1)iPS細胞の作成のための初期化遺伝子であるOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子、並びに
2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むALK2変異遺伝子、
を導入した哺乳動物由来の細胞(体細胞(好ましくは皮膚線維芽細胞)又はiPS細胞)を、骨誘導因子BMP−6の存在下で培養することを含む、該細胞の骨芽細胞への分化誘導方法。
16.前記哺乳動物由来の細胞が、初期化遺伝子としてさらにMyc遺伝子が導入された、前記15に記載の分化誘導方法。
17.前記哺乳動物由来の細胞が、ヒト細胞である前記15又は16に記載の方法。
18.前記細胞の培養を、BMP−6を10〜100ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記15〜17のいずれか一つに記載の方法。
19.以下の遺伝子:
1)iPS細胞の作成のための初期化遺伝子であるOct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、及びSox2遺伝子並びに
2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子含むALK2変異遺伝子、
を導入した哺乳動物由来の細胞(体細胞(好ましくは皮膚線維芽細胞)又はiPS細胞)であって、
骨誘導因子BMP−6の存在下(好ましくは10〜100ng/ml、より好ましくは約50ng/mlの濃度で)で培養することにより骨芽細胞へと分化する細胞。
20.前記哺乳動物由来の細胞が、初期化遺伝子としてさらにMyc遺伝子が導入された、前記19に記載の細胞。
21.前記細胞がヒト細胞である前記19又は20に記載の細胞。
a)前記19〜21のいずれか一つに記載の細胞を、骨誘導因子BMP−6及び被験物質の存在下で培養する;及び
b)前記細胞の骨化を評価することにより、骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する:
ことを含む骨化制御(骨化促進又は骨化抑制)物質のスクリーニング方法。
23.前記培養を、BMP−6を10〜100ng/mlの濃度で含有する培地で行う、前記22に記載のスクリーニング方法。
24.骨化制御(骨化促進又は骨化抑制)物質をスクリーニングするためのキットであって、前記19〜21のいずれかに記載の細胞、骨誘導因子BMP−6、及び該細胞を培養するための培地を含むキット。
(i)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
(ii)Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
(iii)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
(iv)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
発現ベクターの種類は特に限定されず、ウイルスベクターでもプラスミドベクターでもよいが、好ましくはウイルスベクターである。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、レトロウィルスベクター(レンチウィルスベクターを含む)、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどを挙げることができる。上記の中でも好ましくはセンダイウイルスベクターである。
上記初期化遺伝子及びALK2変異遺伝子を有する細胞は、哺乳動物由来の細胞であって、それらの遺伝子を導入できかつそれらの遺伝子が発現できる細胞であれば特に制限されず、任意の細胞を用いることができる。哺乳動物は特に制限されないが、例えばヒト、マウス、ラット、サルなどをあげることができ、特にヒトが好ましい。また、細胞の例としては、例えば、哺乳動物個体から採取した線維芽細胞、幹細胞、樹立培養細胞、等をあげることができ、好ましくは皮膚線維芽細胞、マウス胎児線維芽細胞であり、特に好ましくはヒト皮膚線維芽細胞である。また、用いる細胞が既に初期化遺伝子を有する場合(例えば樹立iPS細胞)は、細胞に上記ALK2変異遺伝子を導入することにより、本発明の細胞として用いることができる。具体的には、それらの遺伝子を有する細胞を調製した後、BMP−6存在下で細胞を培養することにより、細胞が骨芽細胞に分化することを確認し、本発明に用いることができる。
(1)皮膚由来の線維芽細胞の生成
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、FOP患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を作出した。患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、初期化遺伝子を導入するために線維芽細胞を増殖させ、その後、10%DMSO+90%FBSからなる凍結溶液に入れ、凍結保存した。
20%のKNOCKOUT(商標)血清置換物(KSR、インビトロゲン)、2mMのL−グルタミン、1×10-4Mの非必須アミノ酸(NEAA、シグマ)、1×10-4Mの2−メルカプトエタノール(シグマ)、0.5%のペニシリンとストレプトマイシン(日本、ナカライテスク)、及び5ng/mLの基本線維芽細胞増殖因子(bFGF、和光、日本)を添加したDMEM/F12(シグマ)を含有するヒトiPS培地において、マイトマイシンC(MMC)処理したMEF支持細胞上でヒトiPS細胞を維持した。
iPS細胞の生成に対する骨形成タンパク質(BMP−4,6,及び7)の影響は、感染8日目に置き換える上記ヒトiPS細胞培地に、それぞれ、BMP−4(10ng/ml)、BMP−6(50ng/ml)、及びBMP−7(10ng/ml)を添加した培地を用い、30日目まで培養することにより確認した。また、一部の実験では、ALK2キナーゼ阻害剤であるLDN−193189(STEMGENT;ステムジェント)を200nMの濃度で上記ヒトiPS培地に添加した。
Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子及びc−Myc遺伝子を含むSeVベクターは、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される通り作成した。SeVのゲノムを検出するために、ネストPCRを行った。皮膚線維芽細胞及びiPS細胞から抽出した1マイクログラムのトータルRNAをcDNAに逆転写した。次いで、一対のSeV特異的プライマーを用いてcDNAを増幅し、これらPCR産物の1/10容積をさらに、一対にネストプライマーを用いて増幅させた。プライマーの配列及び増幅条件を表1に示す。
上記(2)と同様にして行った。FOP患者又は健常人から由来する皮膚線維芽細胞に、Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子及びc−Myc遺伝子を含むSeVベクターを感染させ、感染7日後に感染した線維芽細胞を回収し、MEF支持細胞上に播種した。翌日、BMP−6を50 ng/ml添加したヒトiPS細胞培地に置き換え、感染後30日目まで培養を続けた。一部の実験では、ALK2キナーゼ阻害剤であるLDN−193189(STEMGENT;ステムジェント)及びドルソモルフィン(シグマ)をそれぞれ、200nM及び1μM添加したヒトiPS培地を用いた。
白血球アルカリフォスファターゼキット(Leukocyte Alkaline Phosphatase kit;シグマ)を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。免疫細胞化学については、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSで4℃にて30分間細胞を固定した。核に局在する分子については、室温にて15分間、0.2%トリトンX−100にて試料を処理した。2%FBSを含有するPBSで細胞を3回洗浄し、次いで一次抗体と共に2%FBSを含有するPBSにて4℃で一晩インキュベートした。一次抗体には、SSEA4(1:500、ミリポア)、TRA−160(1:500、ミリポア)、Nanog(1:1000、R&Dシステムズ)及びOct3/4(1:500、Santa-Cruz)が含まれる。二次抗体には、アレクサ488が結合したヤギ抗マウスIgG(1:1000、インビトロジェン)及びアレクサ488が結合したロバ抗ヤギIgG(1:1000、インビトロジェン)を用いた。分化マーカーの染色については、Sox17(1:200、R&Dシステムズ)、Foxa2(1:200、R&Dシステムズ)及びブラキュリ(Brachyury)(1:200、R&Dシステムズ)を用いた。核は1μg/mLのヘキスト33258(インビトロジェン)で染色した。
DNAの塩基配列決定によってFOP由来のiPS細胞株におけるALK2遺伝子の突然変異(R206H:617G>A及びG356D:1067G>A)を確認した。50mMのトリス−HCl(pH7.5)、20mMのEDTA(pH8.0)、0.1MのNaCl、1%のSDS及び0.15mg/mLのプロテイナーゼKを含有する溶解緩衝液においてiPS細胞株を55℃で一晩インキュベートした。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールによってゲノムDNAを抽出した。次いでPCRによって100ngのゲノムDNAを増幅させた。ABI PRISM(商標)310 Genetic Analyzer(BigDye(登録商標)ターミネータv1.1サイクル・シーケンシング・キット、アプライドバイオシステムズ)によって、得られたPCR産物の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定に使用したプライマーの配列を表2に示す。
(1)FOP患者及び健常者の情報
上記材料及び方法に従い、センダイウイルス(SeV)法によってFOP患者(F1、F2、F3、F4)と健常者(N1、N2、N3)の皮膚由来の線維芽細胞からiPS細胞の生成し、ALK2遺伝子の突然変異を確認した。以下に、本実施例で用いた細胞が由来する患者及び正常者の情報を示す
上記材料及び方法に従い、センダイウイルス(SeV)法によって健常人(N1)の皮膚由来の線維芽細胞からiPS細胞を生成することを試みた。iPS細胞生成における、ALK2キナーゼ阻害剤であるLDN−193189(200nM添加)、及び骨形成タンパク質BMP−4(10ng/ml添加)及びBMP−7(10ng/ml添加)の影響を検討した。結果を図1に示す。(A)は、実験計画を示す。左下の写真は、LDN−193189、BMP−4及びBMP−7の存在下及び非存在下で培養した細胞を、感染後30日目に顕微鏡で細胞の状態を観察した結果である(図1B)。右下の写真は、感染後30日目における、典型的(typical)な及び異常(atypical)なiPS細胞コロニーの数及び比率を示した結果である(図1C)。
また、健常人(N1)の皮膚由来の線維芽細胞からのiPS細胞の生成におけるBMP−6(50ng/ml添加)の影響を検討した。結果を図2に示す。上段は、実験計画を示し、下段の左写真は、BMP−6を添加しない場合、右写真は、BMP−6を添加した場合の結果を示している。
BMP−4添加においては、iPS細胞のコロニー数は少量の減少にとどまり、分化型コロニーが増加するのに対して、BMP−6添加では、iPS細胞コロニーそのものが激減する。この結果はBMP−4とBMP−6の下流シグナルが異なることを示唆している。したがって、1)FOPの原因がBMPの受容体異常であること、2)FOPからはiPS細胞樹立が困難なことを合わせ考えると、FOPの異常は正常細胞へBMP−6を添加した状態に類似していることが考えられる。
上記材料及び方法に従い、センダイウイルス(SeV)法によって健常人(N1)及びFOP患者(F206H変異患者(F2)及びG356D変異患者(F4))の皮膚由来の線維芽細胞に初期化遺伝子を導入し、BMP−6(50ng/ml添加)の存在下及び非存在下で培養を行った。iPS細胞培地に変換後の培養1週間後及び2週間後における骨芽細胞の出現をアルカリフォスファターゼ染色により確認した。結果を図3に示す。
健康人由来の皮膚線維芽細胞では骨芽細胞への誘導がほとんど起こらないのに対して、FOP患者由来皮膚線維芽細胞ではBMP−6存在下で効率よく骨芽細胞へ分化を誘導できることが確認された。
皮膚線維芽細胞を用いた上記の方法では、正常(健常人由来線維芽細胞)ではほとんど分化が誘導されないのに対して、FOP患者由来皮膚線芽細胞は骨芽細胞への分化が容易に増強される。そこで上記方法に従い、FOP患者(F2)由来皮膚線維芽細胞を用いた骨芽細胞への分化誘導における、ALK2キナーゼ阻害剤であるLDN−193189とドルソモルフィンの影響を確認した。LDN−193189、ドルソモルフィン、及びBMP−6の添加量は、それぞれ、200nM、1μM、及び50ng/mlである。iPS細胞培地に変換後の培養2週間後における骨芽細胞の出現をアルカリフォスファターゼ染色により確認した結果を図4に示す。LDN−193189又はドルソモルフィンを添加するとFOP由来皮膚線維芽細胞では優位に骨芽細胞への分化を抑制することができた。
同様にして、F206H変異FOP患者(F2)及びG356D変異FOP患者(F4)由来の皮膚線維芽細胞を用いて、LDN−193189とドルソモルフィンの影響を確認した。LDN−193189、ドルソモルフィン及びBMP−6の添加量は上記と同様である。iPS細胞培地に変換後の培養2週間後における骨芽細胞の出現をアルカリフォスファターゼ染色により確認した結果を図5に示す。いずれの変異のFOP患者由来の皮膚線維芽細胞においても、ALK2キナーゼ阻害剤(LDN−193189とドルソモルフィン)により、骨芽細胞への分化が抑制されることが確認された。
上記材料及び方法に従い、センダイウイルス(SeV)法によって健常人(N1)及びFOP患者(F2)の皮膚由来の線維芽細胞に初期化遺伝子を導入し、BMP−4(10ng/ml添加)、BMP−6(50ng/ml添加)又はBMP−7(10ng/ml添加)の存在下及び非存在下で培養を行った。iPS細胞培地に変換後の培養1週間後及び2週間後におけるアルカリフォスファターゼ活性を測定した。アルカリフォスファターゼ活性は、ラボアッセイTMALP(和光純薬工業)を用いて、製造元の手順書に従って測定した。結果を図6に示す。
Claims (10)
- Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子及びc-Myc遺伝子を含む初期化遺伝子を導入した進行性骨化性線維異形成症に罹患したヒトに由来する線維芽細胞を用いてインビトロにて骨化の促進を誘導する方法であって、以下の工程:
a)進行性骨化性線維異形成症に罹患したヒトに由来する線維芽細胞に前記4つの遺伝子を含むセンダイウイルスベクターを感染させ、次いで該細胞をドルソモルフィン及び/又はLDN-193189の存在下で培養する工程;
b)前記細胞を回収する工程;及び
c)回収した細胞を、10〜50ng/mlの骨誘導因子BMP−6を含みかつドルソモルフィン及びLDN-193189のいずれも含まない培地で培養することにより、該細胞の骨化の促進を誘導する工程、
を含むことを特徴とする誘導方法。 - 前記工程c)におけるBMP−6存在下での細胞の培養を、BMP−6を50ng/mlの濃度で含有する培地で行う、請求項1に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が、以下の遺伝子:
1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
を有する、請求項1〜3のいずれか一つに記載の方法。 - 前記初期化遺伝子が、さらにMyc遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- 骨化制御(骨化促進又は骨化抑制)物質のスクリーニング方法であって、以下の工程:a)進行性骨化性線維異形成症に罹患したヒトに由来する線維芽細胞に、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子及びc-Myc遺伝子を含む初期化遺伝子をもつセンダイウイルスベクターを感染させ、次いで該細胞をドルソモルフィン及び/又はLDN-193189の存在下で培養する工程;
b)前記細胞を回収する工程;及び
c)回収した細胞を、10〜50ng/mlの骨誘導因子BMP−6を含みかつドルソモルフィン及びLDN-193189のいずれも含まない培地で、被験物質の存在下で培養し、次いで、培養後の該細胞の骨化を評価することにより骨化を抑制する又は骨化を促進する被験物質を選別する工程、
を含むスクリーニング方法。 - 前記工程c)におけるBMP−6存在下での細胞の培養を、BMP−6を50ng/mlの濃度で含有する培地で行う、請求項6に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が、以下の遺伝子:
1)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、及び/又は
2)配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子、
を有する、請求項6〜8のいずれか一つに記載の方法。 - 前記初期化遺伝子がさらに、Myc遺伝子を含む、請求項6に記載の方法。
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