JP6028236B2 - 物質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明は、係る知見により完成されたものである。
(1)初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養し、前記細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する被験物質を選別することを含む、物質のスクリーニング方法。
(2)前記疾患がキナーゼの活性の変化に起因する、(1)に記載の方法。
(3)前記疾患がアクチビン受容体様キナーゼ2の活性の変化に起因する、(1)又は(2)に記載の方法。
(4)前記疾患が進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病である、(1)から(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病である、(1)から(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である、(1)から(5)のいずれかに記載の方法。
(7)前記細胞がヒトの細胞である、(1)から(6)のいずれかに記載の方法。
(8)前記細胞が、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、(7)に記載の方法。
(9)前記細胞が、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、(7)又は(8)に記載の方法。
(10)初期化遺伝子が、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子である、(1)から(9)のいずれかに記載の方法。
(11)前記細胞が線維芽細胞である、(1)から(10)のいずれかに記載の方法。
(12)さらに、アクチビン受容体様キナーゼ2を阻害する被験物質を選別することを含む、(1)から(11)のいずれかに記載の方法。
(13)上記疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法である、(1)から(12)のいずれかに記載の方法。
(14)進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、(1)から(13)のいずれかに記載の方法。
(15)進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、(1)から(14)のいずれかに記載の方法。
(16)進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、(1)から(15)のいずれかに記載の方法。
(18)前記疾患がキナーゼの活性の変化に起因する、(17)に記載の方法。
(19)前記疾患がアクチビン受容体様キナーゼ2の活性の変化に起因する、(17)又は(18)に記載の方法。
(20)前記疾患が進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病である、(17)から(19)のいずれかに記載の方法。
(21)前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病である、(17)から(20)のいずれかに記載の方法。
(22)前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である、(17)から(21)のいずれかに記載の方法。
(24)前記細胞が、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、(23)に記載の方法。
(25)前記細胞が、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、(23)又は(24)に記載の方法。
(26)初期化遺伝子が、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子である、(17)から(25)のいずれかに記載の方法。
(27)前記細胞が線維芽細胞である、(17)から(26)のいずれかに記載の方法。
(i)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子
(ii)Oct遺伝子、Sox遺伝子、NANOG遺伝子、LIN28遺伝子
(iii)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子、Myc遺伝子、hTERT遺伝子、SV40 large T遺伝子
(iv)Oct遺伝子、Klf遺伝子、Sox遺伝子
「初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を、該細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する物質の存在下で培養することを含む、人工多能性幹細胞の製造方法」がさらに提供される。
(A)材料及び方法
(1)皮膚由来の線維芽細胞の生成
倫理委員会に承認されたプロトコールにより、インフォームドコンセントの下、FOP患者及び健常者の皮膚生検の外植片から線維芽細胞を作出した。患者及び健常者からの皮膚試料を細かく刻み、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したD−MEM培地で培養した。線維芽細胞が出現したことを確認した後、iPS細胞を誘導するために線維芽細胞を増殖させた。
20%のKNOCKOUT(商標)血清置換物(KSR、インビトロゲン)、2mMのL−グルタミン、1×10-4Mの非必須アミノ酸(NEAA、シグマ)、1×10-4Mの2−メルカプトエタノール(シグマ)、0.5%のペニシリンとストレプトマイシン(日本、ナカライテスク)、及び5ng/mLの基本線維芽細胞増殖因子(bFGF、和光、日本)を添加したDMEM/F12(シグマ)を含有するヒトiPS培地において、マイトマイシンC(MMC)処理したMEF支持細胞上でヒトiPS細胞を維持した。一部の実験では、LDN−193189(STEMGENT;ステムジェント)及びドルソモルフィン(シグマ)等のALK2キナーゼ阻害剤をヒトiPS培地に添加した。
Oct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、K1f4遺伝子及びc−Myc遺伝子を含むSeVベクターは、N. Fusaki, H. Ban, A. Nishiyama, K. Saeki, M. Hasegawa, Proc. Jpn. Acad. Ser., B. Phys. Biol. Eci., 85, 348 (2009)に記載される通り作成した。SeVのゲノムを検出するために、ネストPCRを行った。皮膚線維芽細胞及びiPS細胞から抽出した1マイクログラムのトータルRNAをcDNAに逆転写した。次いで、一対のSeV特異的プライマーを用いてcDNAを増幅し、これらPCR産物の1/10容積をさらに、一対にネストプライマーを用いて増幅させた。プライマーの配列及び増幅条件を表1に示す。
白血球アルカリフォスファターゼキット(Leukocyte Alkaline Phosphatase kit;シグマ)を用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。免疫細胞化学については、4%パラホルムアルデヒドを含有するPBSで4℃にて30分間細胞を固定した。核に局在する分子については、室温にて15分間、0.2%トリトンX−100にて試料を処理した。2%FBSを含有するPBSで細胞を3回洗浄し、次いで一次抗体と共に2%FBSを含有するPBSにて4℃で一晩インキュベートした。一次抗体には、SSEA4(1:500、ミリポア)、TRA−160(1:500、ミリポア)、Nanog(1:1000、R&Dシステムズ)及びOct3/4(1:500、Santa-Cruz)が含まれる。二次抗体には、アレクサ488が結合したヤギ抗マウスIgG(1:1000、インビトロジェン)及びアレクサ488が結合したロバ抗ヤギIgG(1:1000、インビトロジェン)を用いた。分化マーカーの染色については、Sox17(1:200、R&Dシステムズ)、Foxa2(1:200、R&Dシステムズ)及びブラキュリ(Brachyury)(1:200、R&Dシステムズ)を用いた。核は1μg/mLのヘキスト33258(インビトロジェン)で染色した。
セパゾール・スーパーG試薬(Sepazol Super G reagent)(ナカライテスク、日本)を用いてトータルRNAを精製した。製造元の指示書に従って、SuperscriptIII(インビトロジェン)及びランダムプライマー(インビトロジェン)による逆転写反応に1マイクログラムのトータルRNAを用いた。H. Sakurai et al., Stem Cells, 24, 575 (2006)に記載される通り、QuickTaq(商標)(日本、東洋紡)によってRT−PCRを行った。プライマーの配列及び増幅条件を表1に示す。
T. Fukuda et al., J. Biol. Chem., 284, 7149 (2009)に記載される免疫ブロッティング法によって、リン酸化されたSmad1/5/8を検出した。およそ10マイクログラムのタンパク質をSDS−PAGEに供試し、PVDF膜に転写した。抗リン酸化Smad1(Ser463/465)/Smad5(Ser436/465)/Smad8(Ser426/428)抗体(セルシグナリング)と抗Smad1抗体(EPITOMICS及びセルシグナリング)によってリン酸化Smad1/5/8及び総Smad1を検出した。総Smad1の発現に対してデータを標準化する。
LDN−193189の存在下又は非存在下で培養したiPS細胞株(F1−1、F2−1、F2−2、F4−1及びN3−1)から抽出したトータルRNA250ngをビオチンで標識し、製造元のプロトコール(3’IVT発現キット(3'IVT Express kit)、アフィメトリクス)に従って断片化した。次いで、GeneChip(登録商標)ヒトゲノムU133プラス2.0(アフィメトリクス)に試料をハイブリダイズさせた。GeneChip(登録商標)スキャナー300(アフィメトリクス)によってアレイをスキャンした。GeneSpringGX11.5ソフトウエア(Agilent technologies;アジレント・テクノロジーズ)を用いてデータを解析した。測定値の中央値に対して各チップを標準化した。
DNAの塩基配列決定によってFOP由来のiPS細胞株におけるALK2遺伝子の突然変異(R206H:617G>A及びG356D:1067G>A)を確認した。50mMのトリス−HCl(pH7.5)、20mMのEDTA(pH8.0)、0.1MのNaCl、1%のSDS及び0.15mg/mLのプロテイナーゼKを含有する溶解緩衝液においてiPS細胞株を55℃で一晩インキュベートした。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールによってゲノムDNAを抽出した。次いでPCRによって100ngのゲノムDNAを増幅させた。ABI PRISM(商標)310 Genetic Analyzer(BigDye(登録商標)ターミネータv1.1サイクル・シーケンシング・キット、アプライドバイオシステムズ)によって、得られたPCR産物の塩基配列の決定を行った。塩基配列の決定に使用したプライマーの配列を表3に示す。
化合物のALK2阻害活性を評価するために、Y. Katsuno et al., Oncogene, 27, 6322 (2008)に記載される通り、ルシフェラーゼリポーターアッセイを行った。BMP反応性のBREリポーターの制御下でFluc(ホタル・ルシフェラーゼ)を発現し、同様に活性のあるRluc(ウミシイタケ・ルシフェラーゼ)を構成的に発現するレンチウイルスによって形質導入されたMDA−231−Dヒト乳癌細胞株である、MDA−D−BREFluc/Rluc細胞株をBMP−4又はBMP−6の存在下で化合物と共に培養した。24時間の培養の後、ルシフェラーゼ活性(ホタル及びウミシイタケの双方)を測定した。相対的なALK2活性をFluc/Rlucとして表した。化合物の最大半量の阻害濃度(IC50)を個々の化合物についての用量反応曲線から算出した。
上述の通り、センダイウイルス(SeV)法によって4人のFOP患者と3人の健常者の皮膚由来の線維芽細胞からiPS細胞を生成することを試みた。患者及び健常者の情報を以下の表4に示す。
本実施例は、酪酸ナトリウム(Sodium butyrate;NaB)を用いて、乳児型クラッベ(Krabbe)病患者由来の線維芽細胞からiPS細胞を誘導した例である。
Claims (16)
- 初期化遺伝子の導入のみでは人工多能性幹細胞を製造できない疾患に罹患した個体に由来する細胞であって初期化遺伝子が導入された細胞を被験物質の存在下で培養し、前記細胞の人工多能性幹細胞への誘導を促進する被験物質を選別することを含む、物質のスクリーニング方法。
- 前記疾患がキナーゼの活性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。
- 前記疾患がアクチビン受容体様キナーゼ2の活性の変化に起因する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記疾患が進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病である、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記疾患が進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病である、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞がヒトの細胞である、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第206番目のアルギニンがヒスチジンに変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞が、配列番号2に示されるアミノ酸配列において第356番目のグリシンがアスパラギン酸に変異したアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する、請求項7又は8に記載の方法。
- 初期化遺伝子が、Oct3/4遺伝子、Klf4遺伝子、Sox2遺伝子、及びc-Myc遺伝子である、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞である、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、アクチビン受容体様キナーゼ2を阻害する被験物質を選別することを含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 上記疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 進行性骨化性線維異形成症、ミトコンドリア病又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項1から13のいずれか1項に記載の方法。
- 進行性骨化性線維異形成症又はライソゾーム病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 進行性骨化性線維異形成症又はクラッベ病に対する治療剤をスクリーニングする方法である、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
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