JP6454274B2 - Rsvを検出するためのイムノクロマトグラフィー装置 - Google Patents
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Description
RSV感染症は乳幼児における肺炎の約50%、細気管支炎の50〜90%の原因を占めると報告されている。肺炎、細気管支炎などの下気道疾患による小児の入院数は、インフルエンザよりむしろRSV感染症の流行のピークと一致する。流行期には年長児や成人におけるRSVの再感染も普遍的に見られるが、乳幼児における重症化とは対照的に、年長児や成人では軽度の感冒様症状を呈するのみで軽快することも多い。
RSVのFタンパク質は、RSVの表面に存在する2種の主要な糖タンパク質のうちの1つである。ウイルス表面にはFタンパク質の他にGタンパク質も存在するが、Gタンパク質がRSVサブタイプA及びBの間で53%程度しか相同性がないのに対して、Fタンパク質はサブタイプ間及びサブタイプ内でよく保存されている。Beeler及びCoelingh(1989)による研究では、RSVのFタンパク質に対する抗体は1956〜1985年にかけて米国又はオーストラリアの各地で単離された14種類の臨床分離株の全てに結合できることが示され、Fタンパク質はウイルス株の間で非常に高度に保存されていることが実証されている(特許文献4、非特許文献1)。
また、本発明は、検体に含まれるウイルス量が少ない場合でも効率よくRSVを検出することを可能にするイムノクロマトグラフィー装置及びイムノクロマトグラフィー法による検査用キット、並びにそれらを用いたRSVの検出方法及びRSV感染症を判定又は診断する方法を提供する。
また、本発明は、前記イムノクロマトグラフィー装置を含有してなるRSVの検査用キットに関する。
さらに、本発明は、判定部位にFタンパク質に特異的に結合する抗体及びNタンパク質に特異的に結合する抗体が固相化されたイムノクロマトグラフィー装置を使用する、RSVの検出方法に関する。また、本発明は、判定部位に固相化されたFタンパク質に対する抗体及びNタンパク質に対する抗体と検体液を接触させる工程を含有してなるイムノクロマトグラフィー法によるRSVの検出率を改善する方法に関する。
(1)RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体を固相化した判定部位を備えたクロマトグラフィー媒体を含有してなる、イムノクロマトグラフィー装置。
(2)試料添加部、クロマトグラフィー媒体及び吸収部から実質的に構成されている、前記(1)に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
(3)さらに、標識試薬保持部を含有する、前記(2)に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
(4)Fタンパク質に特異的に結合する抗体が、サブグループA及びサブグループBのそれぞれのRSV株のFタンパク質のいずれか一つ又はそれらの両方に特異的に結合する抗体である、前記(1)〜(3)に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
(5)RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体を固相化した判定部位を備えたクロマトグラフィー媒体を含有してなるイムノクロマトグラフィー装置、及び、
検体希釈液、
を含有するイムノクロマトグラフィー法によるRSVの検査用キット。
(6)イムノクロマトグラフィー装置が、試料添加部、クロマトグラフィー媒体及び吸収部から実質的に構成されている、前記(5)に記載の検査用キット。
(7)イムノクロマトグラフィー装置が、さらに標識試薬保持部を含有する、前記(6)に記載の検査用キット。
(8)検査用キットが、さらに標識試薬溶液を含有する、前記(6)に記載の検査用キット。
(9)RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体を固相化した判定部位を備えたイムノクロマトグラフィー装置を用いる、RSVの検出方法。
(10)(a)判定部位に、RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体が固相化されているイムノクロマトグラフィー装置に、検体を含有する検体液を供給する工程、
(b)工程(a)で供給された検体液を、標識試薬とともに前記判定部位を通過させる工程、
(c)判定部位において、標識試薬を含有する検体液と固相化されている抗体とを接触させる工程、及び、
(d)標識試薬に起因する発色が検出された場合に検体を「RSV陽性」と判定する工程、
を含有する、イムノクロマトグラフィー法によるRSVを検出する方法。
(11)イムノクロマトグラフィー装置に供給する前に、検体を検体希釈液で希釈する工程をさらに含有する、前記(10)に記載の方法。
(12)前記(10)又は(11)のいずれかに記載の方法による、RSVの検出率を改善する方法。
また、本発明の判定部位に固相化されるNタンパク質に特異的に結合する抗体は、検体に含まれるFタンパク質の抗原性が失われた場合でも、RSV抗原を判定部位に捕捉することができるので、本発明はRSVが含まれる検体を正確に陽性と判定することができる。例えFタンパク質の抗原性が失われてもRSVの存在を確実に判定できるので、Fタンパク質の抗原性に影響を与えるようなより厳しい条件で検体を前処理又は保存することも可能となる。これにより、従来では粘性が高すぎる等の理由からイムノクロマトグラフィー法には適さなかったような検体を、前処理や保存条件を適宜設定することによりクロマトグラフィー媒体を所定の時間内に移動できるような状態に変性することが可能となり、検体の状態に関わらず迅速に正確な検査を実現できるようになる。
RSVは、パラミクソウイルス科に属するRNAウイルスの一種であり、A型及びB型の2つのサブタイプに分類される。RSVの遺伝子配列はすでに決定されている。
RSVのFタンパク質は、RSVの表面に存在する3つの糖タンパク質の1つである。Fタンパク質は融合タンパク質とも呼ばれ、ウイルスのエンベロープ膜と感受性細胞の細胞膜との融合を促進し、ウイルスのリボ核タンパク質が細胞質へ侵入するのを可能にする。Fタンパク質は、さらにウイルス感染細胞とそれに隣接する細胞との細胞膜の融合も促進し、これにより合胞体が形成される。
Fタンパク質は、F0と呼ばれるFタンパク質前駆体の切断により生じる約50kDaのF1ポリペプチド及び約20kDaのF2ポリペプチドが、ジスルフィド結合で結合した約70kDaのヘテロ二量体タンパク質である。
いくつかのRSV株のFタンパク質のアミノ酸配列は公知となっており、例えば、RSV Long株のアミノ酸配列は、NCBIのGenBankデータベースにアクセッション番号P12568として公表されている。
RSVのNタンパク質は核タンパク質とも呼ばれ、391のアミノ酸残基からなる。Nタンパク質は、ヌクレオカプシドと呼ばれるリボ核タンパク質複合体の構成成分であり、RSVのゲノムRNAを囲みらせん構造を形成している。いくつかのRSV株のNタンパク質のアミノ酸配列は公知となっており、例えば、RSV Long株のアミノ酸配列は、NCBIのGenBankデータベースにアクセッション番号DD857370として公表されている。Nタンパク質のアミノ酸配列は、サブタイプA及びBのRSV株の間で高度に保存されている。
本発明に用いることのできる抗体は、公知の方法に従って製造することもできるし、商業的に入手することも可能である。
細胞融合により得られたハイブリドーマの中から、目的の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする方法としては、例えば、Fタンパク質又はNタンパク質を固相化したマイクロプレートを用いた固相ELISAなどの方法により行うことができる。
本発明の抗体は、それを産生するハイブリドーマを、通常の細胞培養に用いられる培地において培養し、培養上清から回収することによって調製できる。また、ハイブリドーマが由来する動物の腹腔内に投与することによって、腹水を貯留させ、この腹水から回収することによって調製することもできる。
Fタンパク質に対する抗体又はNタンパク質に対する抗体は、混合された状態で判定部位の領域全体に固相化されていてもよいし、判定部位の領域をさらに区分けしてそれぞれの部分に分けて固相化されていてもよい。好ましい態様としては、陽性シグナルの増強効果が得られるとの理由から、2つの抗体が混合された状態で判定部位の同一の領域に固相化される。
本発明の判定部位には、RSVのFタンパク質に対する抗体及びNタンパク質に対する抗体の両者が存在すれば、それらの割合は特に限定されるものではないが、Fタンパク質に特異的な抗体に対してNタンパク質に特異的な抗体の割合が大きい方が好ましい。好ましい存在比率としては、抗Fタンパク質抗体/抗Nタンパク質抗体が、1/1〜1/5であり、より好ましくは、1/3〜1/4である。
クロマトグラフィー媒体に抗体を固相化させる方法は、物理的な吸着であってもよく、化学的な結合であってもよい。抗体を物理的吸着によって固相化させる場合には、抗体を緩衝液等に希釈した溶液をクロマトグラフィー媒体に塗布し、乾燥させることにより行うことができる。Fタンパク質に対する抗体及びNタンパク質に対する抗体の固相化は、いずれか一方の抗体をクロマトグラフィー媒体に塗布、乾燥させた後、もう一方の抗体を別の領域に又は同じ領域に重ねて塗布することにより行うことができる。あるいは、Fタンパク質に対する抗体及びNタンパク質に対する抗体を予め所望の比率で混合した後、クロマトグラフィー媒体の所定の位置に塗布し、乾燥させることにより、固相化することもできる。
本発明の標識試薬に用いることのできる抗体は、判定部位に固相化された抗Fタンパク質抗体及び抗Nタンパク質抗体によって捕捉された状態のFタンパク質抗原又はNタンパク質抗原に結合できる抗体であれば、いかなる抗体であってもよい。例えば、RSVに特異的なポリクローナル抗体、Fタンパク質又はNタンパク質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることができるが、Fタンパク質又はNタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いるのが好ましく、さらには判定部位に固相化されたモノクローナル抗体とは異なるエピトープを認識するFタンパク質又はNタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いるのがより好ましい。
本発明の標識試薬に用いることのできる標識物質は、判定部位に抗原及び抗体を介して間接的に結合した状態で目視可能なシグナルを発生できるものであれば、特に限定されないが、一般には酵素又は不溶性担体が好んで用いられる。標識物質として用いることのできる酵素は、例えばアルカリフホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられ、有色の生成物を生じる基質と組み合わせて用いられる。標識物質として用いることのできる不溶性担体は、多孔性のクロマトグラフィー媒体を毛管現象により移動できる粒径であり有色のものであれば特に限定されない。例えば、コロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化物粒子、コロイド状非金属粒子及びラテックス粒子等が用いられ、好ましくは平均粒径1nm〜500nmのコロイド状金属粒子が用いられ、さらに好ましくは平均粒径40nm〜100nmのコロイド状金粒子が用いられる。
抗体として、Fタンパク質に対するモノクローナル抗体及びNタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いる場合、それらの抗体を予め所望の比率で混合してからコロイド状金粒子に結合させることで、判定部位に捕捉されたFタンパク質及びNタンパク質の両者に結合できる標識試薬を製造できる。あるいは、2種以上の抗体をそれぞれ金粒子に結合させた後、抗体が結合した金粒子を所望の比率で混合することにより、Fタンパク質及びNタンパク質に結合できる標識試薬を製造することもできる。標識試薬に含まれる抗Fタンパク質抗体と抗Nタンパク質抗体の比率を厳密に制御できることから、後者の製造方法が好ましい。標識試薬に含まれる抗Fタンパク質抗体と抗Nタンパク質抗体の比率は特に限定されるものではないが、判定部位におけるそれらの抗体の存在比率と同じが好ましい。
本発明の標識試薬保持部は、標識試薬を乾燥保持でき、クロマトグラフィー媒体と毛管で繋がるように配置することができれば、その材質は特に限定されず、例えばセルロースろ紙、ガラス繊維ろ紙、ナイロン不織布等を用いることができる。標識試薬保持部は、標識試薬の再溶解性を良好にするために、サッカロース、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコール等を含んでいてもよい。
本発明によって、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、鼻汁又は鼻腔洗浄液中のRSVの存在を判定する場合には、これらの液体試料をそのままイムノクロマトグラフィー装置に供給し展開することもできる。しかしながら、クロマトグラフィー媒体での移動を容易にするためにこれらの粘性の高い試料を検体希釈液によって希釈し供給することもできる。本発明において、「検体液」とは液性の検体それ自体又は検体希釈液で希釈された検体を意味する。
本発明の検体希釈液に用いられる塩としては、酸と塩基の反応により得られた塩であれば特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等のアルカリ金属無機塩が挙げられる。好ましくは、塩化ナトリウムである。
本発明の検体希釈液に用いられる緩衝剤としては、検体を添加しても溶液のpHを一定に保つことができれば特に限定されないが、pHを7〜11の範囲に保つことができる緩衝剤が好ましく、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、トリス緩衝剤又はグッド緩衝剤等が用いられる。
本発明の希釈液に用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、親水親油バランス値(HLB値)が13〜18の非イオン性界面活性剤がより好ましく、HLB値が13〜18のポリオキシエチレン系界面活性剤がさらに好ましい。好ましい界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(商品名「Tween」シリーズ)、ポリオキシエチレンp−t−オクチルフェニルエーテル(商品名「Triton」シリーズ)、ポリオキシエチレンp−t−ノニルフェニルエーテル(商品名「TritonN」シリーズ)等が挙げられる。これらの界面活性剤は単独で用いてもよく、2種以上を混合して用いてもよい。非イオン性界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、検体希釈液全体の重量に対して0.01〜10.0重量%の範囲で用いられ、好ましくは0.1〜5.0重量%、より好ましくは0.1〜1.0重量%、さらに好ましくは0.3〜1.0重量%の範囲で用いられる。
本発明の希釈液に用いられるビニル系水溶性ポリマーとしては、酸素原子及び窒素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマーが好ましく、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、ビニルピロリドンなどのビニル系モノマーの二重結合が開裂した構造単位を有するポリマーを挙げることができる。本発明のビニル系水溶性ポリマーは、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アルキルアクリレートなどの酸素原子含有極性基を有するビニル系モノマーが、例えば、50モル%以下、好ましくは30モル%以下、特に好ましくは15モル%以下の割合で共重合されたものであってもよい。本発明のビニル系水溶性ポリマーの好ましい具体例としては、ポリビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド/ビニルピロリドン共重合体(ジメチルアクリルアミドの共重合割合が50モル%以下のもの)、ビニルアルコール/ビニルピロリドン共重合体(ビニルアルコールの共重合割合が50モル%以下のもの)、酢酸ビニル/ビニルピロリドン共重合体(酢酸ビニルの共重合割合が20モル%以下のもの)などの非イオン性のポリマーを挙げることができる。これらのビニル系水溶性ポリマーの分子量は、1万〜100万、より好ましくは10万〜100万、さらに好ましくは20万〜50万である。ビニル系水溶性ポリマーの含有量は、特に限定されないが、検体希釈液全体の重量に対して0.01〜5.0重量%の範囲で用いられ、好ましくは0.1〜2.0重量%の範囲で用いられる。
本発明の検体希釈液は、液量の少ない検体を展開させるための展開液として使用することもできる。検体の液量が少なく、試料添加部に供給した検体が吸収部まで達しないような場合には、本発明の検体希釈液を追加で供給することで、検体が判定部位を通過し吸収部まで到達することを確実にする。
検体希釈液は、イムノクロマトグラフィー装置とともに、本発明の検査キットに包含される。
さらに、本発明の検査用キットは、必要に応じて、検体採取器具、検体ろ過フィルター、陽性コントロール及び陰性コントロールを含んでいてもよい。検体採取器具は、検体の性質に応じて適宜選択することができ、例えば滅菌綿棒等が挙げられる。検体ろ過フィルターは、例えば、採取した検体それ自体、あるいは検体を検体希釈液で希釈してろ過することにより、固形物を除去するために用いられる。
RSV抗原を含む検体液がイムノクロマトグラフィー装置の試料添加部に供給されると、検体液は毛管現象によりクロマトグラフィー媒体に到達し、クロマトグラフィー媒体を移動する。
供給前に検体液が標識試薬溶液と混合されるか、標識試薬保持部に保持される標識試薬を検体液が溶解するか、又は検体液が供給された後に標識試薬溶液が供給されることにより、検体液に含まれるRSV抗原は標識試薬と結合する。
RSV抗原は、標識試薬を伴って、クロマトグラフィー媒体の判定部位を通過する。検体液と抗体の接触により、固相化された抗Fタンパク質抗体又は抗Nタンパク質抗体がRSV抗原を判定部位に捕捉する。
余剰の検体及び標識試薬は、クロマトグラフィー媒体をさらに移動して吸収部に吸収される。
検体がRSV抗原を含んでいる場合、判定部位に標識試薬と結合したFタンパク質抗原及び/又はNタンパク質抗原が捕捉されるので、判定部位に目視可能なシグナルが出現する。すなわち、判定部位に現れた明瞭なシグナルは、検体がRSVを含んでいることを意味し、検体は陽性と判定される。
一方、判定部位に標識試薬と結合したRSV抗原が十分な量で捕捉されなかった場合には、判定部位にシグナルが出現しない。これは、一般に、検体がRSVを含んでいないか、含んでいてもその量が検出限界以下であることを意味し、検体は陰性と判定される。
(1)判定部位に、RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体が固相化されているイムノクロマトグラフィー装置に、検体液を供給する、
(2)検体液と同時に又は続けて標識試薬溶液をイムノクロマトグラフィー装置に供給する、
(3)標識試薬をともなった検体を前記判定部位を通過させ、判定部位に固相化された抗体と検体を接触させる、
(4)判定部位において、標識試薬に起因する発色を検出する、
(5)発色が検出された場合に検体を「RSV陽性」と判定し、発色が検出されなかった場合に検体を「RSV陰性」と判定する。
なお、(1)の工程において、検体液は検体希釈液で希釈された検体であってもよい。また、(2)の工程は任意であり、例えばイムノクロマトグラフィー装置に標識試薬保持部が設けられている場合には省略することができる。
上記の手順により検体に含まれるRSVの検出を行うことができる。特に、前記の手順によりRSVの検出を行うことで、従来のイムノクロマトグラフィー法による検査方法に比べて、ウイルスの検出率を格段に上昇させることができる。
(1)抗RSVモノクローナル抗体の作製
精製RSV株又はRSV感染細胞をBALB/cマウスに免疫し、採血によりRSVのFタンパク質又はNタンパク質に対する抗体価の上昇を確認した。抗体価の上昇が認められたマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞と融合させた。
得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で培養し、RSVのFタンパク質抗原又はNタンパク質抗原を固相化したプレートを用いたELISAにより培養上清の抗体価を確認した。RSVのサブタイプA及びBのそれぞれに由来するFタンパク質又はNタンパク質に対して、培養上清中の抗体価の上昇が認められたハイブリドーマを選択した。さらにクローニングを行ってハイブリドーマを純化(単クローン化)した。
単クローン化した抗体産生ハイブリドーマをプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔内投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水からProteinAカラムクロマトグラフィー(アマシャム社製)を用いたアフィニティ精製によってIgGを精製し、抗Fタンパク質モノクローナル抗体又は抗Nタンパク質モノクローナル抗体を得た。
前記(1)で作製された抗Fタンパク質モノクローナル抗体又は抗Nタンパク質モノクローナル抗体を重量比1:1で混合し、5重量%のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液(pH7.4)で0.5mg/mLの濃度になるように希釈し抗体溶液を作製した。
25×2.5cmのニトロセルロース膜(ミリポア社製:HF120)に、抗体塗布機(BioDot社製)を用いて、前記抗体溶液を塗布し、50℃で30分間乾燥させた後、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフィー媒体に判定部位を作製した。
判定部位の作製に用いられた抗Fタンパク質抗体又は抗Nタンパク質抗体とは異なるクローンから得られた抗Fタンパク質抗体又は抗Nタンパク質抗体を用いて、標識試薬の作製を行った。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製:平均粒子径40nm)0.5mLに、HEPES緩衝液(pH7.5)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗Fタンパク質モノクローナル抗体又は抗Nタンパク質モノクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、10重量%の牛血清アルブミンを含むHEPES緩衝液(pH7.5)を0.1ml加え、室温で10分間静置した。その後、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行い、上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、抗Fタンパク質抗体含有標識試薬溶液又は抗Nタンパク質抗体含有標識試薬溶液を作製した。
上記で作製した抗Fタンパク質抗体含有標識試薬溶液及び抗Nタンパク質抗体含有標識試薬溶液を体積比1:1で混合した。混合後の標識試薬溶液200μlに100μlの25重量%トレハロース水溶液を加えたものを16mm×100mmのグラスファイバーパッド(ミリポア社製)に均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識試薬保持部を作製した。次に、プラスチック製のバッキングシートに、判定部位を有するクロマトグラフィー媒体、標識試薬保持部、試料添加部であるグラスファイバー製のサンプルパッド、余剰の検体や標識物質を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。そして、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー装置を作製した。
0.5%Tween20、0.6%ポリビニルピロリドン(PVP)K−90(分子量 36万)、1.0%牛血清アルブミンと150mM塩化ナトリウムを含むトリス緩衝溶液(pH8.0)からなる溶液を作製し、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、鼻腔吸引液、鼻汁又は鼻腔洗浄液等の検体を希釈処理するための検体希釈液とした。
上記で作製したイムノクロマトグラフィー装置及び検体希釈液を用いて、以下の方法で検体中のRSウイルスの存在の有無を判定した。
RSVに感染している人から採取した鼻汁を上記検体希釈液で10倍、50倍、100倍に希釈した。これらの試料120μLをイムノクロマトグラフィー装置のサンプルパッド上に供給し展開させ、10分後に目視にて判定を行った。判定部位に赤い線を鮮明に確認できるものを「+++」、確認できるものを「++」、赤い線は確認できるが、色が薄いものを「+」、赤い線を確認できないものを「−」とした。結果を表1に示す。
(1)クロマトグラフィー媒体の判定部位の作製
抗Fタンパク質モノクローナル抗体のみを用いて、上記実施例1の(2)と同様にクロマトグラフィー媒体の判定部位を作製した。使用された抗Fタンパク質モノクローナル抗体は、実施例1の判定部位に用いられた抗体と同じクローンに由来する抗体であった。
(2)イムノクロマトグラフィー装置の作製
上記実施例1の(3)と同様の方法で、抗Fタンパク質抗体のみを含有する標識試薬溶液を作製し、上記実施例1の(4)と同様にしてイムノクロマトグラフィー装置を作製した。
(3)測定
上記実施例1の(5)に記載の検体希釈液を用いて、実施例1の(6)と同様にして、検体の測定を行った。結果を表1に示す。
(1)クロマトグラフィー媒体の判定部位の作製
抗Fタンパク質モノクローナル抗体のみを用いて、上記実施例1の(2)と同様にクロマトグラフィー媒体の判定部位を作製した。使用された抗Fタンパク質モノクローナル抗体は、実施例1の判定部位に用いられた抗体とは異なるクローンに由来する抗体であった。
(2)イムノクロマトグラフィー装置の作製
上記実施例1の(3)と同様の方法で、抗Fタンパク質抗体のみを含有する標識試薬溶液を作製し、上記実施例1の(4)と同様にしてイムノクロマトグラフィー装置を作製した。
(3)測定
上記実施例1の(5)に記載の検体希釈液を用いて、実施例1の(6)と同様にして、検体の測定を行った。結果を表1に示す。
(1)クロマトグラフィー媒体の判定部位の作製
抗Nタンパク質モノクローナル抗体のみを用いて、上記実施例1の(2)と同様にクロマトグラフィー媒体の判定部位を作製した。使用された抗Nタンパク質モノクローナル抗体は、実施例1の判定部位に用いられた抗体と同じクローンに由来する抗体であった。
(2)イムノクロマトグラフィー装置の作製
上記実施例1の(3)と同様の方法で、抗Nタンパク質抗体のみを含有する標識試薬溶液を作製し、上記実施例1の(4)と同様にしてイムノクロマトグラフィー装置を作製した。
(3)測定
上記実施例1の(5)に記載の検体希釈液を用いて、実施例1の(6)と同様にして、検体の測定を行った。結果を表1に示す。
(1)クロマトグラフィー媒体の判定部位の作製
抗Nタンパク質モノクローナル抗体のみを用いて、上記実施例1の(2)と同様にクロマトグラフィー媒体の判定部位を作製した。使用された抗Nタンパク質モノクローナル抗体は、実施例1の判定部位に用いられた抗体とは異なるクローンに由来する抗体であった。
(2)イムノクロマトグラフィー装置の作製
上記実施例1の(3)と同様の方法で、抗Nタンパク質抗体のみを含有する標識試薬溶液を作製し、上記実施例1の(4)と同様にしてイムノクロマトグラフィー装置を作製した。
(3)測定
上記実施例1の(5)に記載の検体希釈液を用いて、実施例1の(6)と同様にして、検体の測定を行った。結果を表1に示す。
(1)クロマトグラフィー媒体の判定部位の作製
上記実施例1の(2)と同じ抗Fタンパク質モノクローナル抗体及び抗Nタンパク質モノクローナル抗体を用いて判定部位の作製を行った。抗Fタンパク質抗体(抗FP抗体)と抗Nタンパク質抗体(抗NP抗体)の混合比を、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5と変化させ、上記実施例1の(2)と同じ手順で判定部位を作製した。
(2)イムノクロマトグラフィー装置の作製
上記実施例1の(3)と同様の方法で、抗Fタンパク質抗体含有標識試薬及び抗Nタンパク質抗体含有標識試薬を作製した。それらの混合比を、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5と変化させ、それぞれの混合溶液を用いて、実施例1の(4)と同様にしてイムノクロマトグラフィー装置を作製した。
(3)測定
上記実施例1の(5)に記載の検体希釈液を用いて、実施例1の(6)と同様にして、検体の測定を行った。結果を表2に示す。
したがって、本発明は、RSV感染症の臨床検査の産業分野において有用であり、産業上の利用可能性を有している。
Claims (11)
- RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体を混合された状態で固相化した判定部位を備えたクロマトグラフィー媒体を含有してなる、イムノクロマトグラフィー装置。
- さらに、試料添加部及び吸収部を含有する、請求項1に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
- さらに、標識試薬保持部を含有する、請求項2に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
- Fタンパク質に特異的に結合する抗体が、サブグループA及びサブグループBのそれぞれのRSV株のFタンパク質のいずれか一つ又はそれらの両方に特異的に結合する抗体である、請求項1〜3に記載のイムノクロマトグラフィー装置。
- RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体を混合された状態で固相化した判定部位を備えたクロマトグラフィー媒体を含有してなるイムノクロマトグラフィー装置、及び、
検体希釈液、
を含有するイムノクロマトグラフィー法によるRSVの検査用キット。 - イムノクロマトグラフィー装置が、さらに試料添加部及び吸収部を含有する、請求項5に記載の検査用キット。
- イムノクロマトグラフィー装置が、さらに標識試薬保持部を含有する、請求項6に記載の検査用キット。
- 検査用キットが、さらに標識試薬溶液を含有する、請求項6に記載の検査用キット。
- RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体を混合された状態で固相化した判定部位を備えたイムノクロマトグラフィー装置を用いる、RSVの検出方法。
- (a)判定部位に、RSVのFタンパク質に特異的に結合する抗体及びRSVのNタンパク質に特異的に結合する抗体が混合された状態で固相化されているイムノクロマトグラフィー装置に、検体を含有する検体液を供給する工程、
(b)工程(a)で供給された検体液を、標識試薬とともに前記判定部位を通過させる工程、
(c)判定部位において、標識試薬を含有する検体液と固相化されている抗体とを接触させる工程、及び、
(d)標識試薬に起因する発色が検出された場合に検体を「RSV陽性」と判定する工程、
を含有する、イムノクロマトグラフィー法によるRSVを検出する方法。 - イムノクロマトグラフィー装置に供給する前に、検体を検体希釈液で希釈する工程をさらに含有する、請求項10に記載の方法。
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