WO2021095763A1 - 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 - Google Patents

抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 Download PDF

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三和 桑原
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Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method and an immunoassay instrument for RS virus, and an anti-RS virus antibody for that purpose.
  • Non-Patent Document 1 Monoclonal antibodies are widely used to detect specific antigens because they recognize only specific antigens.
  • G protein which is a glycoprotein
  • F protein which is related to cell fusion
  • Non-Patent Document 1 It is known that the G protein has a large difference in amino acid sequence among RS virus subtypes (A type and B type) (Non-Patent Document 1).
  • the difference in amino acid sequence of F protein is small even among RS virus subtypes (A type and B type), and many RS virus test kits detect F protein.
  • Patent Document 1 it has been very difficult to develop an RS virus test kit showing a practically sufficient positive detection rate so that clinical isolates can be detected without omission only by increasing the affinity of the antibody for the F protein
  • the N protein of RS virus is also called a nucleoprotein and consists of 391 amino acid residues.
  • the N protein is a component of the ribonucleoprotein complex called nucleocapsid, and forms a spiral structure surrounding the genomic RNA of RS virus. It is known that the N protein has the smallest difference in amino acid sequence among RS virus subtypes (type A, B).
  • type A, B RS virus subtypes
  • test reagents using various anti-RS virus antibodies are on the market.
  • RS virus was detected with these conventional RS virus test reagents, the sensitivity was not sufficient.
  • an object of the present invention is to provide a highly sensitive anti-RS virus antibody and a test reagent using the same.
  • the present inventors have detected the RS virus by using an antibody against the N protein (nucleoprotein) of the RS virus in order to efficiently capture the RS virus contained in the sample at the determination site and increase the sensitivity of the immunochromatography apparatus.
  • the present invention has been completed by finding that the sensitivity can be improved.
  • an anti-RS virus N protein monoclonal antibody or a monoclonal antibody thereof which comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.
  • Antigen-binding fragment [1] An anti-RS virus N protein monoclonal antibody or a monoclonal antibody thereof, which comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.
  • a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having binding activity to RS virus N protein, and SEQ ID NO: 2, 3 or 4
  • An anti-RS virus N protein monoclonal antibody or an antigen-binding property thereof which comprises an amino acid sequence having 90% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by, and contains a light chain variable region having binding activity to RS virus N protein. fragment.
  • the antigen-binding fragment is a peptide fragment selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, single chain antibody (scFv), dsFv, diabody and minibody, [1] or [2] Anti-RS virus N protein monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • a reagent for detecting an RS virus which comprises the monoclonal antibody according to any one of [1] to [3] or an antigen-binding fragment thereof.
  • the reagent for detecting RS virus according to [4] which is an immunochromatography reagent.
  • [6] A kit for detecting an RS virus containing the monoclonal antibody according to any one of [1] to [3] or an antigen-binding fragment thereof.
  • [7] A method for detecting an RS virus by an immunological detection method using the monoclonal antibody according to any one of [1] to [3] or an antigen-binding fragment thereof.
  • This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2019-204630, which is the basis of the priority of the present application.
  • the method of the present invention is highly sensitive because it uses an anti-RS virus N protein antibody for immunoassay.
  • the present invention also provides immunoassay instruments and monoclonal antibodies used in the novel detection methods of the present invention.
  • the test subject detected by the method of the present invention is an RS virus, and a monoclonal antibody that recognizes N protein as an antigen is used.
  • immunoassay is performed using a monoclonal antibody that recognizes N protein as an antigen or an antigen-binding fragment thereof.
  • recognizing means that it reacts specifically, that is, it reacts with an antigen-antibody.
  • Specific means that in a liquid system in which a protein and the antibody are mixed, the antibody does not cause an antigen-antibody reaction at a detectable level with a protein component of the antigen, or causes some binding reaction or association reaction. Also means that the reaction is clearly weaker than the antigen-antibody reaction of the antibody with the antigen.
  • An antigen-binding fragment obtained by separating only an antigen-binding site based on the monoclonal antibody of the present invention can also be used in the method of the present invention. That is, specific antigen binding of Fab, Fab', F (ab') 2, single chain antibody (scFv), dsFv, diabody, minibody, etc., which is produced by a known method and binds to the N protein of RS virus. Even when a fragment having sex (antigen-binding fragment) is used, these fragments are included in the monoclonal antibody and are included in the scope of the present invention. Further, the class of the monoclonal antibody is not limited to IgG, and may be IgM or IgY.
  • the monoclonal antibody used in the method of the present invention uses a known immunological method to immunize an immunized animal with a complex or extract containing the antigen of interest, or an antigen or a partial peptide thereof, and cells of the immunized animal. It can be obtained by producing a hybridoma using.
  • the length of the peptide used for immunization is not particularly limited, but a peptide having 5 amino acids or more, more preferably 10 amino acids or more can be used as an immunogen.
  • the immunogen can be obtained from the culture medium, but it can also be obtained by incorporating a DNA encoding an arbitrary antigen into a plasmid vector and introducing the DNA into a host cell for expression.
  • any antigen or a partial peptide thereof as an immunogen can be expressed as a fusion protein with a protein as exemplified below, and can be used as an immunogen after purification or as it is unpurified.
  • Glutathione S-transferase GST
  • MBP maltose-binding protein
  • TRX thioredoxin
  • Nus tag, S tag, HSV which are commonly used by those skilled in the art as "protein expression / purification tags" for the preparation of fusion proteins.
  • Tags, FRAG tags, polyhistidine tags, etc. can be used. It is preferable that the fusion protein with these is used as an immunogen after cleaving an arbitrary antigen or a partial peptide portion thereof and a tag portion other than the tag portion using a digestive enzyme, separating and purifying the protein.
  • Preparation of monoclonal antibodies from immunized animals can be easily performed by the method of well-known Keller et al. (Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497 (1975)). That is, antibody-producing cells such as splenocytes and lymphocytes are collected from immunized animals and fused with mouse myeloma cells by a conventional method to prepare a hybridoma, and the obtained hybridoma is cloned by a limiting dilution method or the like. , Among the monoclonal antibodies produced by each of the cloned hybridomas, a monoclonal antibody that reacts with the antigen used for animal immunization is selected.
  • a known immunoglobulin purification method can be used to purify the monoclonal antibody from ascites or culture supernatant.
  • a fractionation method by salting out using ammonium sulfate or sodium sulfate, a PEG fractionation method, an ethanol fractionation method, a DEAE ion exchange chromatography method, a gel filtration method and the like can be mentioned.
  • It can also be purified by an affinity chromatography method using a carrier to which any of protein A, protein G, and protein L is bound, depending on the immune animal species and the class of the monoclonal antibody.
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region of the antibody that recognizes the N protein of the RS virus of the present invention consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the light chain variable region of the antibody that recognizes the N protein of the RS virus of the present invention consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 4.
  • the heavy chain variable region is not limited to the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but in the amino acid sequence, one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, is more preferable. Consists of an amino acid sequence in which one or two, more preferably one amino acid is deleted, substituted or added, and is composed of an amino acid having the activity of the heavy chain variable region of the antibody, that is, the activity of binding RS virus to the N protein. Also includes a heavy chain variable region.
  • the light chain variable region is not limited to the light chain variable region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 or 4, but also one or several, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5 in the amino acid sequence.
  • It consists of an amino acid sequence in which one or two amino acids, more preferably one amino acid is deleted, substituted, or added, and the activity of the light chain variable region of the antibody, that is, the activity of RS virus binding to N protein. It also includes a light chain variable basin consisting of the proteins it has.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in such an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 and BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), etc. (for example, default or default parameters), at least 85%
  • those having a sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 97% or more can be mentioned.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in such an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3 or 4. It is substantially the same as the protein it has.
  • the antibody that recognizes the N protein of the RS virus of the present invention is composed of the above-mentioned heavy chain variable region and heavy chain constant region, and the above-mentioned light chain variable region and light chain constant region.
  • the heavy chain constant region is composed of three domains C H 1, C H 2 and C H 3.
  • the heavy chain constant region is an IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM or IgD constant region.
  • the light chain constant region is comprised of one domain C L.
  • the light chain constant region is a ⁇ or ⁇ constant region.
  • the DNA encoding the heavy chain and the DNA encoding the light chain are inserted into an expression vector, the host cell is transformed with the vector, and the host is transformed. It can be produced by culturing cells.
  • the DNA encoding the heavy chain variable region and the light chain variable region can be found from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof prepared as described above hereinafter, "antibody” unless it is clear from the context in the description prior to Examples. Means “antibody or antigen-binding fragment thereof" and is measured by immunoassay using an antigen-antibody reaction with an antigen in a sample.
  • immunoassay method any method well known to those skilled in the art can be used, such as a competitive method, an agglutination method, a Western blotting method, an immunostaining method, and a sandwich method.
  • “measurement” includes any of quantitative, semi-quantitative, and detection.
  • the sandwich method is preferable for immunoassay.
  • a complex is formed by sandwiching an antigen between two antibodies, and the complex is detected.
  • the sandwich method itself is well known in the field of immunoassay and can be performed, for example, by immunochromatography or ELISA. All of these sandwich methods themselves are well known, and the method of the present invention can be carried out by a well-known sandwich method except that a monoclonal antibody that recognizes the above-mentioned N protein as an antigen is used.
  • one type or two or more types of antibodies that recognize antigens are used.
  • antibodies immobilized on the solid phase and labeled antibodies are used.
  • at least one of these two types of antibodies is a monoclonal antibody that recognizes the above-mentioned N protein as an antigen.
  • the same two antibodies may sandwich the antigen to form a complex.
  • any solid phase in which the antibody can be immobilized by a known technique can be used as the solid phase on which the antibody is immobilized.
  • a porous thin film (membrane) having a capillary action. Particulate matter, test tube, resin flat plate and other known substances can be arbitrarily selected.
  • an enzyme, a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, colored particles, colloidal particles and the like can be used.
  • the immunochromatography method which is a lateral flow type immunoassay method using a membrane, is particularly preferable from the viewpoint of simplicity and speed of clinical examination.
  • the present invention also provides an immunoassay device capable of laterally flow immunoassay using a monoclonal antibody that recognizes N protein as an antigen.
  • the immunoassay device provided by the present invention includes a support having a detection region in which an antibody (antibody 1) that captures an object to be measured (antigen) is immobilized, and a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2). It consists of a sample pad for dropping a sample, an absorption band for absorbing the developed sample solution, and a backing sheet for bonding these members together, and at least one of the antibody 1 and the antibody 2 contains the N protein of the present invention. It is an immunoassay device that is a monoclonal antibody that is recognized as an antigen.
  • the immunoassay instrument is also called an immunochromatographic test piece.
  • the support is a material having the ability to immobilize an antibody for capturing a substance to be detected (antigen), and has the ability not to prevent the liquid from passing in the horizontal direction.
  • it is a porous thin film having a capillary action, and is a material capable of transporting a liquid and components dispersed therein by absorption.
  • the material forming the support is not particularly limited, and examples thereof include cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride (PVDF), glass fiber, nylon, and polyketone. Of these, those made into a thin film using nitrocellulose are more preferable.
  • An antibody-immobilized membrane is called an antibody-immobilized membrane.
  • the labeled body region is made of a porous base material containing a labeled antibody, and the material of the base material can be glass fiber, non-woven fabric, or the like which are generally used.
  • the base material is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 0.6 mm in order to impregnate a large amount of labeled antibody.
  • a porous substrate impregnated with a labeled antibody and dried is also called a drying pad.
  • Enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, metal colloids such as colloidal gold, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, etc. are often used for labeling of labeled antibodies.
  • metal colloids such as colloidal gold, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, colored latex particles, etc.
  • coloring occurs due to the aggregation of these labeling reagents, and this coloring is measured.
  • Particles on which an antibody is immobilized are called antibody-immobilized particles.
  • the amount of the antibody immobilized is not particularly limited, but it may be several ng to several tens of ⁇ g in the labeled region.
  • the detection region refers to a part of the support on which the antibody that captures the substance to be detected (antigen) is immobilized.
  • the detection region is provided with at least one region in which an antibody for capturing an antigen is immobilized.
  • the detection region may be included in the support, and the antibody may be immobilized on the support.
  • the amount of antibody immobilized is not particularly limited, but may be immobilized in the detection region from several ng to several tens of ⁇ g.
  • the sample pad is a part for dropping a sample and is a porous material.
  • the sample pad is the most upstream part of the immunoassay.
  • filter paper, glass fiber, non-woven fabric and the like can be used as the material.
  • it is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 1 mm.
  • the sample also includes a sample prepared by using the sample, such as a sample obtained by suspending the sample in another solution.
  • the absorption band is a member that is supplied to the support and absorbs components that were not involved in the reaction in the detection region.
  • a filter paper having high water retention, a sponge or the like made of a general natural polymer compound, a synthetic polymer compound or the like can be used, but a material having high water absorption is preferable in order to promote the development of the sample. ..
  • the backing sheet is a member for attaching and fixing all the above-mentioned materials, that is, a support, a sample pad, a marker region, an absorption band, etc. with partial overlap.
  • the backing sheet is not always necessary as long as these materials are arranged and fixed at the optimum intervals, but it is generally preferable to use the backing sheet from the viewpoint of convenience in manufacturing or use.
  • the immunoassay device of the present invention may further have a control display region (member).
  • the control display area is the site indicating that the test was performed accurately.
  • the control display region exists downstream of the detection region, and when the sample sample passes through the detection region and reaches the control display region, a signal is emitted by coloring or the like.
  • a substance that binds to the antibody to which the labeled carrier is bound may be immobilized, or a reagent such as a pH indicator that changes color when the sample arrives may be immobilized. May be good.
  • the antibody to which the labeled carrier is bound is a mouse monoclonal antibody, an anti-mouse IgG antibody may be used.
  • the size of the immunoassay device is not limited, but for example, it is about several cm to a dozen cm in length and several mm to several cm in width.
  • the immunoassay device of the present invention may be housed in a containment vessel, which can prevent deterioration due to, for example, ultraviolet rays or moisture in the air.
  • the containment vessel can prevent the tester performing the assay from being contaminated or infected.
  • a resin case of an appropriate size may be used as a containment vessel, and the device of the present invention may be stored in the case.
  • the containment vessel and the immunoassay device contained therein may be collectively referred to as an immunoassay device.
  • the RS virus detection reagent containing the anti-RS virus N protein monoclonal antibody of the present invention includes the immunoassay device.
  • the RS virus detection kit containing the anti-RS virus N protein monoclonal antibody of the present invention includes the immunoassay device.
  • the kit may also include a blower, a sample collection device, and the like.
  • the solid phase support on which antibody 1 is immobilized is bound to a substance to be detected (labeling reagent) labeled with an appropriate labeling substance such as colored polystyrene particles or colloidal gold by utilizing the capillary phenomenon.
  • labeling reagent labeled with an appropriate labeling substance such as colored polystyrene particles or colloidal gold by utilizing the capillary phenomenon.
  • the complex of the obtained antibody 2 and the substance to be detected is expanded and moved.
  • a complex of the immobilized substance-substance to be detected-labeling reagent is formed on the solid phase support, and the signal of the labeling reagent emitted from the complex (in the case of colloidal gold, it can bind to the substance to be detected).
  • the substance to be detected can be detected by detecting (the solid-phase support portion on which the substance is immobilized turns red).
  • the immunoassay method can be carried out at 5 to 35 ° C., preferably room temperature.
  • the number of detection regions and the type of labeled antibody contained in the labeled region are not limited to one, and two or more antigens can be immunoassayed in the same manner by using antibodies corresponding to a plurality of measurement targets. It can be detected with an instrument.
  • the method of the present invention it is possible to detect whether or not the patient is infected with the RS virus, and when the N protein is detected in the sample sample, it can be determined that the sample is infected with the RS virus.
  • the RS virus can be specifically recognized, and the antibody that recognizes the N protein includes other viruses such as adenovirus, Coxsackievirus, and the like. Echovirus, Herpes simplex virus, Human Metapneumovirus, Influenzavirus, Measlesvirus, Mumpsvirus, Parainfluenza virus It does not recognize viruses) and does not falsely detect these viruses.
  • a pharyngeal or nasal swab As the sample to be sample, a pharyngeal or nasal swab, a pharyngeal or nasal cavity lavage fluid, a nasal aspirate, saliva, serum, rectal wipe, stool, stool suspension, urine, corneal wipe, etc. may be used.
  • Example 1 Preparation of anti-RS virus N protein monoclonal antibody 1.
  • Preparation of RS virus N protein antigen RS virus was infected with susceptible mammalian cells, cultured for several days, and then the culture medium of RS virus-infected cells was inactivated by ultraviolet irradiation.
  • the acquired cell line was intraperitoneally administered to pristane-treated BALB / c mice, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected. From the obtained ascites, IgG was purified by an affinity chromatography method using a protein A column to obtain a plurality of purified anti-RS virus N protein monoclonal antibodies (hereinafter, may be referred to as "anti-N protein antibodies"). ..
  • Example 2 Immunoassay device for measuring RS virus 1. Immobilization of anti-RS virus N protein antibody on nitrocellulose membrane A solution obtained by diluting the anti-N protein antibody prepared in Example 1 with a buffer solution and an anti-mouse IgG antibody were prepared, and the nitrocellulose membrane lined with a PET film was prepared. An anti-N protein antibody was linearly applied to the sample pad side, and an anti-mouse IgG antibody was linearly applied to the absorber side. Then, the nitrocellulose membrane was sufficiently dried under warm air to obtain an anti-N protein antibody-immobilized membrane.
  • anti-RS virus N protein antibody on colored polystyrene particles
  • the anti-N protein antibody prepared in Example 1 was covalently bound to colored polystyrene particles, suspended in a suspension, and sufficiently dispersed by ultrasonic treatment. N-protein antibody-bound colored polystyrene particles were obtained. In the present specification, they are referred to as anti-N protein antibody-immobilized particles.
  • RS virus test device The antibody-immobilized membrane prepared in 1 and the labeled pad prepared in 2 and 3 were bonded to other members (backing sheet, absorption band, sample pad) and cut into a width of 5 mm to cut the RS virus. It was used as an inspection device.
  • the RS virus test device prepared in 4 contains a sample suspension containing a virus that causes respiratory infections (10 mM Tris (pH 8.0), 1% (w / v)). 50 ⁇ L of polyoxyethylene octylphenyl ether, 3% (w / v) arginine, 3% (w / v) BSA) was added, and the mixture was allowed to stand for 5 minutes.
  • the immunoassay device using the anti-RS virus N protein antibody of the present invention reacts with RS virus but does not show cross-reactivity with other causative viruses of respiratory infections. From this, it was confirmed that it reacts specifically with the RS virus.
  • Example 3 Variable region analysis of anti-RS virus N protein monoclonal antibody 1.
  • Nucleotide sequence analysis of the variable region of the anti-N protein antibody The hybridoma cell line producing the anti-N protein antibody prepared in Example 1 was sent to Takara Bio Co., Ltd. to analyze the base sequence of the variable region of the anti-N protein antibody. I asked. RNA was extracted from a hybridoma cell line at Takara Bio Inc., and a nucleotide sequence was obtained from the amplification product of the anti-N protein antibody variable region obtained by 5'-RACE PCR.
  • Example 4 Sensitivity comparison of anti-RS virus N protein antibody
  • an antigen detection reagent using the anti-N protein antibody of the present invention and a commercially available anti-F protein antibody were used. The detection sensitivities of the antigen detection reagents were compared.
  • RS virus strains isolated from clinical specimens collected in 2016 were inoculated into Vero cells and propagated.
  • a 2-fold dilution series of the RS virus-infected cell culture supernatant was prepared using a buffer solution, and a predetermined amount was added to the sample suspension as a sample.
  • the antigen detection reagent using the anti-N protein antibody was equivalent to the antigen detection reagent using the anti-F protein antibody in 2 of the 3 strains.
  • the above sensitivity was shown.
  • the antibody of the present invention can be used to specifically detect respiratory syncytial virus infection.

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Abstract

感度の高い抗ＲＳウイルス抗体、及びそれを用いた検査試薬の提供。　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。

Description

抗ＲＳウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具
　本発明は、ＲＳウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具並びにそのための抗ＲＳウイルス抗体に関する。
　モノクローナル抗体は、特定の抗原のみを認識するため、その特定の抗原の検出に広く用いられている。ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）のエンベロープには、糖蛋白質であるＧ蛋白質と、細胞融合に関連するＦ蛋白質とが存在する（非特許文献１）。Ｇ蛋白質は、ＲＳウイルスのサブタイプ（Ａ型、Ｂ型）間でアミノ酸配列の違いが大きいことが知られている（非特許文献１）。一方、Ｆ蛋白質は、ＲＳウイルスのサブタイプ（Ａ型、Ｂ型）間でもアミノ酸配列の違いが小さいことが知られており、多くのＲＳウイルス検査キットがＦ蛋白質を検出している。しかしながら、Ｆ蛋白質に対する抗体の親和性を高めることのみによっては、臨床分離株を漏れなく検出できるような実用に足る陽性検出率を示すＲＳウイルス検査キットを開発することは非常に困難であった（特許文献１）。
　また、ＲＳウイルスのＮ蛋白質は核蛋白質とも呼ばれ、391のアミノ酸残基からなる。Ｎ蛋白質は、ヌクレオカプシドと呼ばれるリボ核蛋白質複合体の構成成分であり、ＲＳウイルスのゲノムＲＮＡを囲みらせん構造を形成している。Ｎ蛋白質は、ＲＳウイルスのサブタイプ（Ａ型、Ｂ）間で最もアミノ酸配列の違いが小さいことが知られている。しかしながら、Ｎ蛋白質に対する抗体のみで臨床分離株を漏れなく検出することは非常に困難であり、臨床分離株を漏れなく検出できるようなＲＳウイルス検査キットの開発には、Ｆ蛋白質に対する抗体とＮ蛋白質に対する抗体とを混合する必要があった（特許文献１）。
特許第6454274号
Collins PL and Karron RA. Respiratory syncytial virus. In: Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia: pp 1086-1123 (2013).
　現在、各種抗ＲＳウイルス抗体を用いた検査試薬が販売されている。しかしながら、これらの従来のＲＳウイルス検査試薬でＲＳウイルスの検出を行った場合、感度が充分ではなかった。
　上記の現状に鑑み、本発明は、感度の高い抗ＲＳウイルス抗体、及びそれを用いた検査試薬を提供することを目的とする。
　本発明者らは、検体に含まれるＲＳウイルスを効率よく判定部位に捕捉してイムノクロマトグラフィー装置の感度を高めるために、ＲＳウイルスのＮ蛋白質（核タンパク質）に対する抗体を用いることでＲＳウイルスの検出感度を向上させ得ることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[２]　配列番号１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[３]　抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、dsFv、diabody及びminibodyからなる群から選択されるペプチド断片である、[１]又は[２]の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[４]　[１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用試薬。
[５]　イムノクロマト法試薬である、[４]のＲＳウイルス検出用試薬。
[６]　[１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用キット。
[７]　[１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫学的検出法により、ＲＳウイルスを検出する方法。
[８]　イムノクロマト法である、[７]の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2019-204630号の開示内容を包含する。
　本発明の方法は、免疫測定に抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を用いるので感度が高い。また、本発明により、本発明の新規な検出方法に用いる免疫測定器具及びモノクローナル抗体が提供される。
　本発明の方法により検出される被検対象は、ＲＳウイルスであり、Ｎ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いる。
　本発明の方法では、Ｎ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫測定を行う。ここで、「認識する」とは、特異的に反応する、すなわち、抗原抗体反応する、という意味である。「特異的」とは、タンパク質と該抗体が混じり合う液系において、該抗体が抗原のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、又は何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体の抗原との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。
　本発明のモノクローナル抗体を基に、抗原結合部位のみを分離させた抗原結合性断片も本発明の方法に使用することができる。すなわち、公知の方法により作製された、ＲＳウイルスのＮ蛋白質に結合するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、dsFv、diabody、minibodyなどの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）を用いる場合もこれらの断片はモノクローナル抗体に包含され、本発明の範囲に含まれる。また、モノクローナル抗体のクラスはIgGに限定されず、IgMやIgYでもよい。
　本発明の方法に用いるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、目的の抗原を含む複合体や抽出物、あるいは抗原又はそれらの部分ペプチドを被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。免疫原は培養液から得ることもできるが、任意の抗原をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。免疫原とする任意の抗原又はその部分ペプチドは以下に例示するようなタンパク質と融合タンパク質として発現させ、精製の後、又は未精製のまま免疫原として用いることもできる。融合タンパク質の作製には、当業者が「タンパク質発現・精製タグ」として一般的に用いる、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＲＡＧタグ、ポリヒスチジンタグなどが利用できる。これらとの融合タンパク質は、消化酵素を用いて任意の抗原あるいはその部分ペプチド部分とそれ以外のタグ部分とを切断し、分離精製した後に免疫原として用いることが好ましい。
　免疫した動物からのモノクローナル抗体の調製は、周知のケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により容易に行うことができる。すなわち、免疫した動物から、脾細胞やリンパ球等の抗体産生細胞を回収し、これを常法によりマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、動物の免疫に用いた抗原と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択する。
　腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。また免疫動物種とモノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法によっても精製することが可能である。
　本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。また、本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる。
　重鎖可変領域は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性、すなわちＲＳウイルスのＮ蛋白質への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。軽鎖可変領域は配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の軽鎖可変領域の活性、すなわちＲＳウイルスのＮ蛋白質への結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変流域も含む。
　このような配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
　このような配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
　本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体は、上記の重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに上記の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３個のドメインCH1、CH2及びCH3から構成されている。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域である。また、軽鎖定常領域は、１個のドメインCLで構成されている。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域である。
　本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体は、上記の重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を培養することにより産生させることができる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするDNAは配列番号１のアミノ酸配列よりわかる。
　本発明の免疫測定方法では、上記のようにして作製したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片（以下、実施例の前までの記述において、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「抗体」は、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する）と検体中の抗原との抗原抗体反応を利用した免疫測定により測定する。このための免疫測定法としては、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色法、サンドイッチ法など、当業者にとって周知のいずれの方法も用いることができる。なお、本発明において、「測定」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。
　免疫測定としては、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法においては、２つの抗体で抗原を挟む形で複合体を形成させ、該複合体を検出する。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばイムノクロマトグラフィー法やELISA法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は、上記したＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いること以外は、周知のサンドイッチ法により行うことができる。
　サンドイッチ法には、抗原を認識する１種類又は２種類以上の抗体（固相に固定化される抗体と、標識抗体）が用いられる。２種類以上の抗体を用いる場合、これらの２種類の抗体のうち、少なくともいずれか一方が、上記したＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体である。また、同じ２つの抗体で抗原を挟んで複合体を形成させてもよい。
　サンドイッチ法を検出原理とする免疫測定において、抗体が固定化される固相としては、抗体を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、抗体を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。前述の種々の材料による免疫測定法の中でも、特に臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法であるイムノクロマト法が好ましい。
　本発明では、Ｎ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いてラテラルフロー式に免疫測定を行うことができる免疫測定器具をも提供する。本発明が提供する免疫測定器具は、測定対象物（抗原）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートから成り、抗体１及び抗体２の少なくとも一方が本発明のＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体である免疫測定器具である。該免疫測定器具をイムノクロマト試験片とも呼ぶ。
　支持体は、被検出物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体及びそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。抗体を固定化したメンブレンを抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
　標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm～0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。標識抗体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を乾燥パッドとも呼ぶ。
　標識抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、着色ポリスチレン粒子及び着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。抗体を固定化した粒子を抗体固定化粒子と呼ぶ。抗体の固定化量は、特に限定されないが、標識領域に数ngから数十μg存在すればよい。
　検出領域は、被検出物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。検出領域は支持体に含まれていればよく、支持体上に抗体を固定化すればよい。抗体の固定化量は、特に限定されないが検出領域に数ngから数十μg固定化すればよい。
　サンプルパッドは、検体を滴加するための部位であり、多孔性材料である。サンプルパッドは免疫測定器具の最も上流にある部位である。該材料には一般的に用いられるろ紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm～1mm程度のパッド状であることが好ましい。検体には、検体を他の溶液に浮遊して得られる試料等、検体を用いて調製された試料も含む。
　吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
　バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯等が、部分的な重なりをもって貼付し固定されるための部材である。バッキングシートは、これらの材料が最適な間隔で配置し固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
　本発明の免疫測定器具には、さらに対照表示領域(部材）が存在していてもよい。対照表示領域は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示領域は、検出領域の下流に存在し、検体試料が検出領域を通過し、対照表示領域に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示領域には、標識担体を結合させた抗体に結合する物質を固相化しておいてもよいし、検体が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固相化しておいてもよい。標識担体を結合させた抗体がマウスモノクローナル抗体の場合、抗マウスIgG抗体を用いればよい。
　免疫測定器具の大きさは限定されないが、例えば、縦の長さ数cm～十数cm、横の長さ数mm～数cm程度である。
　本発明の免疫測定器具は、格納容器内に収められていてもよく、該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、汚染性、感染性の有る検体試料を用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者が汚染又は感染するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の器具を収納すればよい。格納容器とその中に納められた免疫測定器具を、一体として免疫測定デバイスという場合がある。
　本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を含むＲＳウイルス検出用試薬は前記免疫測定器具を含む。また、本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を含むＲＳウイルス検出用キットは前記免疫測定器具を含む。該キットは、他にブロッシャー、検体採取器具等を含んでいてもよい。
　本発明の方法においては、抗体１を固定化した固相支持体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した被検出物質（標識試薬）と結合し得る抗体２と被検出物質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、被検出物質を検出することができる。該免疫測定方法は、５～３５℃、好ましくは室温で行うことができる。
　なお、検出領域の数及び標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１つに限られるものではなく、複数の測定対象物に対応する抗体を用いることで、２以上の抗原を同一の免疫測定器具にて検出することができる。
　本発明の方法により、ＲＳウイルスに感染しているか否かを検出することができ、被検体試料中にＮ蛋白質が検出された場合に、ＲＳウイルスに感染していると判断することができる。
　本発明のＮ蛋白質を認識する抗体を用いた場合、ＲＳウイルスを特異的に認識することができ、Ｎ蛋白質を認識する抗体は、他のウイルス、例えばアデノウイルス（Adenovirus)、コクサッキーウイルス（Coxsackievirus）、エコーウイルス（Echo virus）、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）、ヒトニューモウイルス（Human Metapneumovirus)、インフルエンザウイルス（Influenza virus)、麻疹ウイルス（Measles virus）、ムンプスウイルス（Mumps virus）、パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus）を認識することはなく、これらのウイルスを誤検出することはない。
　また、ＲＳウイルスのＦ蛋白質を認識する抗体を用いた場合に検出できない臨床分離株でも、本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体を用いた場合に検出することができる。
　被検体試料としては、検体として、咽頭若しくは鼻腔ぬぐい液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、血清、直腸拭い液、便、便懸濁液、尿、角膜拭い液等を用いればよい。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１　抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の作製
１．ＲＳウイルスＮ蛋白質抗原の調製
　ＲＳウイルスを感受性のある哺乳類細胞に感染させ、数日間培養した後にＲＳウイルス感染細胞の培養液を紫外線照射で不活化したものを用いた。 
２．ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の作製
　１．のＲＳウイルス不活化抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから腸骨リンパ節を摘出する、「マウス腸骨リンパ節法」(Sado Y et al., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89-94 (2006))により抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が複数得られた。
　取得した細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体（以下、「抗Ｎ蛋白質抗体」と称することがある。）を複数得た。
　以下の実施例では複数得られた抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体のうち、反応性及び特異性を考慮して選択した抗体を用いた。
実施例２　ＲＳウイルスを測定する免疫測定器具
１．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
　実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を緩衝液で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Ｎ蛋白質抗体、吸収体側に抗マウスIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを温風下で十分に乾燥させ、抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンを得た。
２．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を着色ポリスチレン粒子に共有結合させ、浮遊液に懸濁し、超音波処理により十分に分散させた、抗Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｎ蛋白質抗体固定化粒子と呼ぶ。
３．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布及び乾燥
　２で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量塗布し、温風化で十分に乾燥させた。本明細書において、標識体パッドと呼ぶ。
４．ＲＳウイルス検査デバイスの作製
　１で作製した抗体固定化メンブレンと２及び３で作製した標識体パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて5mm幅に切断し、ＲＳウイルス検査デバイスとした。
５．ＲＳウイルス検査デバイスの特異性及び正確性の確認
　４で作製したＲＳウイルス検査デバイスに、呼吸器感染症を引き起こすウイルスを含む検体浮遊液（10mM Tris（pH8.0）、1%(w/v)ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、3%(w/v)アルギニン、3%(w/v)BSA）を50μＬ滴加し、5分間静置した。
　抗マウスIgG抗体及び抗Ｎ蛋白質抗体の両方の塗布位置で発色を目視で確認できた場合に＋と判定した。抗マウスIgG抗体の塗布位置のみで発色を目視で確認でき、抗Ｎ蛋白質抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は－と判定した。また、抗マウスIgG抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は無効と判定した。
　結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示された通り、本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を用いた免疫測定器具は、ＲＳウイルスに反応するものの、他の呼吸器感染症の病因ウイルスに対して交差反応性を示さないことから、ＲＳウイルスに対して特異的に反応することが確認できた。
実施例３　抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の可変領域解析
１．抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域の塩基配列解析
　実施例１にて作製された抗Ｎ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をタカラバイオ株式会社へ送付し、抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域の塩基配列解析を依頼した。タカラバイオ株式会社にて、ハイブリドーマ細胞株からRNAを抽出し、5'-RACE PCRにより得られた抗Ｎ蛋白質抗体可変領域の増幅産物から塩基配列を得た。
２．抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域のアミノ酸配列予測
　１で得られた塩基配列情報から、IMGT（登録商標）データベースの塩基配列分析ツールであるIMGT / V-QUESTを用いて可変領域のアミノ酸配列を予測した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４　抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体の感度比較
　臨床検体から分離され培養されたＲＳウイルス3株について、本発明の抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬と、市販の抗F蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬の検出感度を比較した。
　2016年に採取された臨床検体から分離したＲＳウイルス3株を、それぞれVero細胞に接種し増殖させた。緩衝液を用いてＲＳウイルス感染細胞培養上清の2倍希釈系列を調製し、そのうち所定量を検体浮遊液へ添加したものを試料とした。
　結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　臨床検体から分離されたウイルス3株を用いて感度比較試験を実施した結果、3株中2株において、抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬は抗Ｆ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬と同等以上の感度を示した。
　3株のうち1株については、抗Ｆ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬では全く反応がみられなかったのに対し、抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬では高い検出感度を示した。
　本発明の抗体を用いてＲＳウイルス感染症を特異的に検出することができる。
配列番号１～４　合成
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (8)

  1. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  2. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  3. 　抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、dsFv、diabody及びminibodyからなる群から選択されるペプチド断片である、請求項１又は２に記載の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用試薬。
  5. 　イムノクロマト法試薬である、請求項４記載のＲＳウイルス検出用試薬。
  6. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用キット。
  7. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫学的検出法により、ＲＳウイルスを検出する方法。
  8. 　イムノクロマト法である、請求項７記載の方法。
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