JP6450237B2 - Cross-linked body, cross-linking agent composition, fibrous cross-linked body, manufacturing method of fibrous cross-linked body, cell culture bed, cell culturing method using cell culture bed, and manufacturing method of cell sheet for transplantation using cell culture bed - Google Patents
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Description
本発明は、ポリグルタミン酸を原料とした架橋体、当該架橋体を製造するための架橋剤組成物、繊維状架橋体、繊維状架橋体の製造方法、細胞培養床、細胞培養床による細胞の培養方法、および細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法に関する。 The present invention relates to a crosslinked body using polyglutamic acid as a raw material, a crosslinking agent composition for producing the crosslinked body, a fibrous crosslinked body, a method for producing a fibrous crosslinked body, a cell culture bed, and cell culture using a cell culture bed. The present invention relates to a method and a method for producing a cell sheet for transplantation using a cell culture bed.
ポリグルタミン酸は納豆の糸として古くから知られている。近年、工業的にポリグルタミン酸を製造することが可能となり、生分解性、生体適合性、および高吸水性を有する樹脂として注目されている。そして、これを架橋したゲルは化粧品などの保湿剤として使用されている。
一方、ポリグルタミン酸を用いた繊維および繊維状架橋体についても種々の提案がなされている。例えば、ポリグルタミン酸を含む溶液を用いて静電紡糸を行い、得られた繊維に電子線架橋処理を行って繊維状架橋体を得る技術が開示されている（特許文献１参照）。前記した技術によれば、生分解性、生体適合性、吸水性および保水性に優れた繊維状架橋体を提供できる。また、ポリグルタミン酸からなる繊維に対し各種高分子架橋剤を用いて架橋する技術も開示されている（特許文献２参照）。前記した技術によれば、生分解性、生体適合性、および吸湿・吸水性に優れるとともに、吸湿・吸水した場合に水に溶解しない耐水性を備えた繊維状架橋体を提供できる。
Polyglutamic acid has long been known as a natto thread. In recent years, it has become possible to industrially produce polyglutamic acid, and has attracted attention as a resin having biodegradability, biocompatibility, and high water absorption. And the gel which bridge | crosslinked this is used as moisturizing agents, such as cosmetics.
On the other hand, various proposals have also been made for fibers using polyglutamic acid and fibrous crosslinked bodies. For example, a technique is disclosed in which electrostatic spinning is performed using a solution containing polyglutamic acid, and the obtained fiber is subjected to electron beam crosslinking treatment to obtain a fibrous crosslinked product (see Patent Document 1). According to the technique described above, a fibrous cross-linked body excellent in biodegradability, biocompatibility, water absorption and water retention can be provided. Moreover, the technique which bridge | crosslinks the fiber which consists of polyglutamic acid using various polymer crosslinking agents is also disclosed (refer patent document 2). According to the technique described above, it is possible to provide a fibrous cross-linked body that is excellent in biodegradability, biocompatibility, and moisture absorption / water absorption, and has water resistance that does not dissolve in water when it absorbs moisture.
しかしながら、特許文献１に記載の技術では、水分吸収後の繊維状架橋体がゲル状となり、繊維形状を保つことは必ずしも容易ではない。また、遮蔽設備を有する電子線架橋装置が別途必要であり、コスト的にも問題がある。特許文献２に記載の技術では、架橋剤をポリグルタミン酸と混合して架橋剤組成物とした後、すぐに使用しなければならないほどポットライフが短い。
また、自家移植による再生医療の場においては、移植細胞の迅速な培養・調製が移植の成否の鍵となる。例えば、初代培養による移植片の製造に時間がかかると、熱傷等の皮膚移植の場合には生死にかかわることもある。
However, with the technique described in Patent Document 1, the fibrous cross-linked body after moisture absorption is gelled, and it is not always easy to maintain the fiber shape. In addition, an electron beam cross-linking device having a shielding facility is required separately, and there is a problem in cost. In the technique described in Patent Document 2, the pot life is so short that it must be used immediately after the crosslinking agent is mixed with polyglutamic acid to form a crosslinking agent composition.
In the field of regenerative medicine by autologous transplantation, rapid culture and preparation of transplanted cells is the key to success or failure of transplantation. For example, if it takes time to produce a graft by primary culture, it may be life or death in the case of skin transplantation such as burns.
本発明の第１の目的は、ポリグルタミン酸を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を提供することにある。また、本発明の第２の目的は、前記した架橋体を製造する際に、ポットライフの長い原料（架橋剤組成物）を提供することにある。本発明の第３の目的は、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある繊維状架橋体を提供することにある。本発明の第４の目的は、紡糸工程において原料のポットライフが所定の範囲にある繊維状架橋体の製造方法を提供することにある。さらに、本発明の第５の目的は、移植細胞を効率よく産生することが可能な細胞培養床、前記した細胞培養床による細胞の培養方法、および前記した細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法を提供することにある。 A first object of the present invention is to provide a water-resistant cross-linked product using polyglutamic acid as a raw material, which does not become a gel even if it absorbs moisture or absorbs water. In addition, a second object of the present invention is to provide a raw material (crosslinking agent composition) having a long pot life when the above-mentioned crosslinked body is produced. A third object of the present invention is to provide a fibrous cross-linked product having water resistance that does not become a gel even when it absorbs moisture or absorbs water. The fourth object of the present invention is to provide a method for producing a fibrous crosslinked product in which the pot life of the raw material is within a predetermined range in the spinning process. Furthermore, a fifth object of the present invention is to provide a cell culture bed capable of efficiently producing transplanted cells, a method for culturing cells using the cell culture bed described above, and production of a cell sheet for transplantation using the cell culture bed described above. It is to provide a method.
前記課題を解決すべく、本発明は、以下のような架橋体、架橋剤組成物、繊維状架橋体、繊維状架橋体の製造方法、細胞培養床、細胞培養床による細胞の培養方法、および細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法を提供するものである。
（１）ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかの架橋体であって、当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものであることを特徴とする架橋体。
（２）上述の（１）に記載の架橋体において、当該架橋体が繊維状であることを特徴とする架橋体。
（３）上述の（２）に記載の架橋体において、当該架橋体の平均直径が３μｍ以下であることを特徴とする架橋体。
（４）ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと、数平均分子量１０００以上のカルボジイミドとを含むことを特徴とする架橋剤組成物。
（５）上述の（４）に記載の架橋剤組成物において、前記カルボジイミドを、前記ポリグルタミン酸および前記ポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと前記カルボジイミドとの混合物基準で、０．１質量％以上５０質量％以下配合してなることを特徴とする架橋剤組成物。
（６）縮合性の官能基を有する親水性高分子およびその塩のうち少なくともいずれかである繊維状架橋体であって、当該繊維状架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されていることを特徴とする繊維状架橋体。
（７）上述の（６）に記載の繊維状架橋体において、前記親水性高分子が生体高分子であることを特徴とする繊維状架橋体。
（８）上述の（７）に記載の繊維状架橋体において、
前記生体高分子がポリグルタミン酸である
ことを特徴とする繊維状架橋体。
（９）上述の（６）から（８）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体において、当該繊維状架橋体の平均直径が３μｍ以下であることを特徴とする繊維状架橋体。
（１０）繊維状架橋体の製造方法であって、縮合性の官能基を含有する親水性化合物１質量％以上２０質量％以下と、数平均分子量が１０００以上の高分子架橋剤０．０１質量％以上１０質量％以下とを水中で反応させる紡糸用原料製造工程と前記原料を用いて紡糸する紡糸工程とを備え、前記紡糸工程における前記原料のポットライフが５００時間以下であり、前記紡糸工程における温度が１０℃以上であることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１１）上述の（１０）に記載の繊維状架橋体の製造方法において、前記親水性化合物がポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかであることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１２）上述の（１０）または（１１）に記載の繊維状架橋体の製造方法において、前記高分子架橋剤がカルボジイミドであることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１３）上述の（１０）から（１２）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体の製造方法において、当該繊維状架橋体を構成する繊維の平均直径が３μｍ以下であることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１４）上述の（１０）から（１３）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体の製造方法において、前記紡糸工程における紡糸が静電紡糸であることを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。
（１５）上述の（６）から（９）までのいずれか１つに記載の繊維状架橋体を、細胞培養基材に被覆してなるものであることを特徴とする細胞培養床。
（１６）上述の（１５）に記載の細胞培養床において、前記被覆する手段が塗布または吹付であることを特徴とする細胞培養床。
（１７）上述の（１５）または（１６）に記載の細胞培養床において、前記細胞培養基材の表面の少なくとも一部がプラスチック製またはガラス製であることを特徴とする細胞培養床。
（１８）上述の（１５）から（１７）までのいずれか１つに記載の細胞培養床を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
（１９）上述の（１８）に記載の細胞の培養方法において、前記細胞が正常細胞または幹細胞であることを特徴とする細胞の培養方法。
（２０）上述の（１５）から（１７）までのいずれか１つに記載の細胞培養床を用いることを特徴とする移植用細胞シートの製造方法
In order to solve the above problems, the present invention provides the following crosslinked body, crosslinking agent composition, fibrous crosslinked body, method for producing the crosslinked fibrous body, cell culture bed, cell culture method using the cell culture bed, and A method for producing a cell sheet for transplantation using a cell culture bed is provided.
(1) A crosslinked product of at least one of polyglutamic acid and polyglutamate, wherein the crosslinked product is crosslinked with a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more.
(2) A crosslinked body according to the above (1), wherein the crosslinked body is fibrous.
(3) The cross-linked product according to (2), wherein the cross-linked product has an average diameter of 3 μm or less.
(4) A crosslinking agent composition comprising at least one of polyglutamic acid and polyglutamate and a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more.
(5) In the crosslinking agent composition according to the above (4), the carbodiimide is 0.1% by mass or more and 50% by mass based on a mixture of at least one of the polyglutamic acid and the polyglutamate and the carbodiimide. % Cross-linking agent composition,
(6) A fibrous crosslinked body that is at least one of a hydrophilic polymer having a condensable functional group and a salt thereof, and the fibrous crosslinked body is crosslinked with a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more. A fibrous cross-linked product characterized by the above.
(7) The fibrous crosslinked body according to (6) above, wherein the hydrophilic polymer is a biopolymer.
(8) In the fibrous crosslinked body according to (7) above,
The fibrous cross-linked product, wherein the biopolymer is polyglutamic acid.
(9) The fibrous crosslinked body according to any one of (6) to (8) above, wherein the fibrous crosslinked body has an average diameter of 3 μm or less.
(10) A method for producing a fibrous cross-linked product, which is a hydrophilic compound containing a condensable functional group in an amount of 1% by mass to 20% by mass, and a polymer cross-linking agent having a number average molecular weight of 1,000 or more and 0.01% by mass. % And 10% by mass or less in water, and a spinning process for spinning using the raw material, wherein the pot life of the raw material in the spinning process is 500 hours or less, and the spinning process The manufacturing method of the fibrous crosslinked body characterized by the temperature in being 10 degreeC or more.
(11) The method for producing a fibrous crosslinked body according to (10), wherein the hydrophilic compound is at least one of polyglutamic acid and polyglutamate. .
(12) The method for producing a fibrous crosslinked body according to (10) or (11), wherein the polymer crosslinking agent is carbodiimide.
(13) The method for producing a fibrous crosslinked body according to any one of (10) to (12) above, wherein an average diameter of fibers constituting the fibrous crosslinked body is 3 μm or less. A method for producing a fibrous crosslinked product.
(14) The method for producing a fibrous crosslinked body according to any one of (10) to (13) above, wherein the spinning in the spinning step is electrostatic spinning. Manufacturing method.
(15) A cell culture bed comprising a cell culture substrate coated with the fibrous crosslinked body according to any one of (6) to (9) above.
(16) The cell culture bed according to (15), wherein the means for coating is coating or spraying.
(17) The cell culture bed according to (15) or (16) above, wherein at least a part of the surface of the cell culture substrate is made of plastic or glass.
(18) A cell culture method comprising using the cell culture bed according to any one of (15) to (17) above.
(19) The cell culture method according to (18), wherein the cell is a normal cell or a stem cell.
(20) A method for producing a cell sheet for transplantation, comprising using the cell culture bed according to any one of (15) to (17) above.
第１の発明によれば、ポリグルタミン酸（塩）を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を提供することができる。また、第２の発明によれば、前記した架橋体を製造する際に、原料のポットライフが長い架橋剤組成物を提供することができる。第３の発明によれば、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある繊維状架橋体を提供することができる。第４の発明によれば、紡糸工程において原料のポットライフが所定の範囲にある繊維状架橋体の製造方法を提供することができる。さらに、第５の発明によれば、移植細胞を効率よく産生することが可能な細胞培養床、前記した細胞培養床による細胞の培養方法、および前記した細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法を提供することができる。 According to the first aspect of the present invention, it is possible to provide a water-resistant cross-linked product that does not become a gel even when it absorbs moisture or absorbs water, using polyglutamic acid (salt) as a raw material. Moreover, according to 2nd invention, when manufacturing an above described crosslinked body, the crosslinking agent composition with a long pot life of a raw material can be provided. According to the third aspect of the invention, it is possible to provide a water-resistant fibrous cross-linked body that does not become a gel when it absorbs and absorbs moisture. According to 4th invention, the manufacturing method of the fibrous bridge | crosslinking body which has the pot life of a raw material in a predetermined range in a spinning process can be provided. Furthermore, according to the fifth invention, a cell culture bed capable of efficiently producing transplanted cells, a method for culturing cells using the cell culture bed described above, and a method for producing a cell sheet for transplantation using the cell culture bed described above Can be provided.
本願の第１の発明における架橋体（以下、単に「本架橋体」ともいう。）は、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかの架橋体であって、当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものであることを特徴とする。本願の第２の発明における架橋剤組成物は、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと、数平均分子量１０００以上のカルボジイミド化合物とを含むことを特徴とする。なお、以下の説明において、第１の発明と第２の発明を特に区別する必要がない場合は、単に「本発明」と記載する。 The crosslinked body in the first invention of the present application (hereinafter also simply referred to as “the present crosslinked body”) is a crosslinked body of at least one of polyglutamic acid and polyglutamate, and the crosslinked body has a number average molecular weight of 1000. It is crosslinked by the above carbodiimide. The cross-linking agent composition in the second invention of the present application is characterized by containing at least one of polyglutamic acid and polyglutamate and a carbodiimide compound having a number average molecular weight of 1000 or more. In the following description, when it is not necessary to distinguish between the first invention and the second invention, they are simply described as “the present invention”.
［ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩］
本発明におけるポリグルタミン酸あるいはポリグルタミン酸塩は、公知の製法で得られたもの、あるいは天然物由来のものを使用することができる。
ポリグルタミン酸は、アミノ酸の一種であるグルタミン酸が直鎖状に連結した高分子で、生分解性や生体適合性などの特性を備えている。また、ポリグルタミン酸塩は吸湿性、吸水性および保水性に優れている。ポリグルタミン酸塩としては、アルカリ金属塩が好ましく、特にナトリウム塩が好ましい。
[Polyglutamic acid and polyglutamate]
As the polyglutamic acid or polyglutamate in the present invention, those obtained by a known production method or those derived from natural products can be used.
Polyglutamic acid is a polymer in which glutamic acid, which is a kind of amino acid, is linked in a straight chain, and has characteristics such as biodegradability and biocompatibility. Polyglutamate is excellent in hygroscopicity, water absorption and water retention. As the polyglutamate, an alkali metal salt is preferable, and a sodium salt is particularly preferable.
紡糸性の観点より、ポリグルタミン酸（塩）は、質量平均分子量が２０万以上のものが好ましく、５０万以上のものがより好ましい。なお、後述する静電紡糸の場合は、ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量が２０万未満であると、ポリグルタミン酸（塩）の濃度を上げても粒子しか生成されず、繊維状に紡糸することが困難となるおそれがある。
また、水溶液の取扱い性の観点からは、ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量は１０００万以下のものが好ましい。なお、ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量は、ＧＰＣ法により測定すれば求められる。
From the viewpoint of spinnability, the polyglutamic acid (salt) preferably has a mass average molecular weight of 200,000 or more, more preferably 500,000 or more. In the case of electrospinning, which will be described later, if the mass average molecular weight of polyglutamic acid (salt) is less than 200,000, only particles are generated even if the concentration of polyglutamic acid (salt) is increased, and spinning is performed in a fibrous form. May be difficult.
Further, from the viewpoint of the handleability of the aqueous solution, the polyglutamic acid (salt) preferably has a mass average molecular weight of 10 million or less. In addition, the mass average molecular weight of polyglutamic acid (salt) is calculated | required if it measures by GPC method.
［架橋体および架橋剤組成物］
ポリグルタミン酸（塩）の質量平均分子量を２０万以上とすることにより、紡糸による繊維化が容易となるが、得られた繊維はそのままでは吸湿、吸水して溶解してしまう。本発明では、ポリグルタミン酸（塩）を、高分子架橋剤である数平均分子量１０００以上のカルボジイミド（以下、「本カルボジイミド」ともいう。）と混合して架橋剤組成物を調製し、紡糸を行った後に熱架橋することで耐水性の繊維状架橋体とすることができる。
[Crosslinked product and crosslinker composition]
By making the mass average molecular weight of the polyglutamic acid (salt) 200,000 or more, fiberization by spinning becomes easy. However, the obtained fiber as it is absorbs moisture and absorbs water and dissolves. In the present invention, polyglutamic acid (salt) is mixed with a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more (hereinafter also referred to as “the present carbodiimide”), which is a polymer crosslinking agent, to prepare a crosslinking agent composition, and spinning is performed. After that, it is possible to obtain a water-resistant fibrous crosslinked body by thermal crosslinking.
本カルボジイミドとしては、例えば市販品として、日清紡ケミカル製のカルボジライトが挙げられる。本カルボジイミドをポリグルタミン酸（塩）と混合した後に加熱するとポリグルタミン酸（塩）が容易に架橋される。
また、架橋を行う際は、必要に応じて電子線架橋、紫外線架橋、放射線架橋、グルタルアルデヒド架橋剤に浸漬するなどの従来公知の架橋処理を併用してもよい。
As this carbodiimide, for example, carbodilite manufactured by Nisshinbo Chemical is listed as a commercial product. When this carbodiimide is mixed with polyglutamic acid (salt) and then heated, polyglutamic acid (salt) is easily crosslinked.
Moreover, when performing crosslinking, conventionally known crosslinking treatment such as electron beam crosslinking, ultraviolet crosslinking, radiation crosslinking, or dipping in a glutaraldehyde crosslinking agent may be used in combination.
本発明の架橋剤組成物は、本カルボジイミドを、前記ポリグルタミン酸（塩）と本カルボジイミドとの混合物基準で、０．１質量％以上５０質量％以下配合してなることが好ましく、より好ましい配合量は０．５質量％以上３０質量％以下であり、さらに好ましい配合量は１質量％以上２０質量％以下である。本カルボジイミドの配合量が０．１質量％以上であれば架橋反応が十分進行し、架橋しても水に溶解しなくなる。また、本カルボジイミドの配合量が５０質量％以下であると、ポリグルタミン酸（塩）の特性を十分に発揮できる。 The cross-linking agent composition of the present invention is preferably formed by blending the present carbodiimide in an amount of 0.1% by mass or more and 50% by mass or less based on the mixture of the polyglutamic acid (salt) and the present carbodiimide, and a more preferable blending amount. Is 0.5% by mass or more and 30% by mass or less, and more preferably 1% by mass or more and 20% by mass or less. If the amount of the present carbodiimide is 0.1% by mass or more, the crosslinking reaction proceeds sufficiently, and even if crosslinked, it will not dissolve in water. Moreover, the characteristic of polyglutamic acid (salt) can fully be exhibited as the compounding quantity of this carbodiimide is 50 mass% or less.
［助剤］
上述の架橋においては、助剤として、硫酸、硝酸、リン酸、塩酸、酢酸、シュウ酸、りんご酸、およびクエン酸などの酸により溶液を酸性にすることで、カルボジイミド基との反応が促進され、架橋体の耐水性が増す。また、上述の酸を用いることでポリグルタミン酸塩（ナトリウム塩など）を用いた場合は、遊離のポリグルタミン酸となり、架橋剤の官能基と反応しやすくなる。この架橋は、溶媒を必要とせず加熱することで生じるため、架橋する前に繊維が溶媒に溶けてしまう問題が無く、処理工程としても加熱設備を設けるだけなので、溶液による架橋方法よりも経済的である。
[Auxiliary]
In the crosslinking described above, the reaction with the carbodiimide group is promoted by acidifying the solution with an acid such as sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, acetic acid, oxalic acid, malic acid, and citric acid as an auxiliary agent. , The water resistance of the crosslinked product is increased. Moreover, when polyglutamic acid salt (sodium salt etc.) is used by using the above-mentioned acid, it becomes free polyglutamic acid and easily reacts with the functional group of the crosslinking agent. Since this cross-linking occurs by heating without the need for a solvent, there is no problem that the fiber dissolves in the solvent before cross-linking, and only a heating facility is provided as a processing step, so it is more economical than a cross-linking method using a solution. It is.
また、架橋剤組成物には、必要に応じてバインダーを配合することもできる。このようなバインダーとしては公知のものが使用可能であり、例えば、ポリ乳酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンイミド、ポリアニリン、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリウレタン、シリコーン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレンサルファイド、ポリスチレン、ポリブタジエン、およびポリエチレンテレフタレートなど溶媒に溶解可能な合成高分子が挙げられる。また、コラーゲン、ゼラチン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、セリシン、フィブロイン、核酸、ヒアルロン酸、エラスチン、ヘパリン、およびカテキンなどの天然高分子もバインダーとして挙げられる。さらに、オルガノシリカやオルガノチタンなどのゾル溶液もバインダーとして挙げられる。 Moreover, a binder can also be mix | blended with a crosslinking agent composition as needed. Known binders can be used such as polylactic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polypropylene oxide, polyethylene imide, polyaniline, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, polyurethane, silicone, polyvinylidene fluoride. And synthetic polymers that can be dissolved in a solvent such as polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyethylene, polypropylene, nylon, polyethylene sulfide, polystyrene, polybutadiene, and polyethylene terephthalate. In addition, natural polymers such as collagen, gelatin, starch, cellulose, chitin, chitosan, sericin, fibroin, nucleic acid, hyaluronic acid, elastin, heparin, and catechin are also included as binders. Furthermore, sol solutions such as organosilica and organotitanium are also mentioned as binders.
また、ポリグルタミン酸（塩）を溶解する溶媒には、水と水溶性有機溶媒が好ましく用いられる。例えばポリグルタミン酸塩（ナトリウム塩など）は水に可溶であるが、後述する静電紡糸の際には、水溶性有機溶媒を併用することが好ましい。水溶性有機溶媒としてはポリグルタミン酸（塩）水溶液と混合しうるものが適宜選択される。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびイソプロパノールなどのアルコール類以外にも、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、およびジメチルスルホキシドなどを用いることができる。これらは１種を単独で用いてもよいし、任意の２種以上を組み合わせて使用してもよい。 Moreover, water and a water-soluble organic solvent are preferably used as a solvent for dissolving polyglutamic acid (salt). For example, polyglutamate (sodium salt or the like) is soluble in water, but it is preferable to use a water-soluble organic solvent in combination during the electrospinning described later. As the water-soluble organic solvent, a solvent that can be mixed with a polyglutamic acid (salt) aqueous solution is appropriately selected. For example, in addition to alcohols such as methanol, ethanol, propanol, and isopropanol, acetone, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, dimethyl sulfoxide, and the like can be used. These may be used alone or in combination of any two or more.
［他の添加剤］
架橋剤組成物には、必要に応じて、界面活性剤、金属塩、および増粘剤等を適宜混合してもよい。
界面活性剤としては、特に制限はなく、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、および両性界面活性剤のような公知の界面活性剤を使用することができる。具体的には、ｐ−ノニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリルオキシスルホン酸ナトリウム、およびラウリルオキシリン酸二ナトリウム等のアニオン界面活性剤、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、およびセチルピリジニウムクロリド等のカチオン界面活性剤、ステアリン酸ポリエチレングリコール、およびペンタエリスリットステアリン酸モノエステル等のノニオン界面活性剤、さらにラウリルジメチルペタイン等の両性界面活性剤が挙げられ、これらの１種を単独で、または、２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。
金属塩としては、金属ハロゲン化物が好ましく、具体的には塩化物、臭化物、およびヨウ化物などが挙げられる。
増粘剤としては、例えば、メチルセルロースやヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体、各種ガム類、ペクチン、アルギン酸ソーダ、デキストリン、寒天、およびゼラチン等の天然高分子増粘剤が挙げられる。
[Other additives]
In the crosslinking agent composition, a surfactant, a metal salt, a thickener, and the like may be appropriately mixed as necessary.
The surfactant is not particularly limited, and known surfactants such as an anionic surfactant, a cationic surfactant, a nonionic surfactant, and an amphoteric surfactant can be used. Specifically, anionic surfactants such as sodium p-nonylbenzenesulfonate, sodium lauryloxysulfonate, and disodium lauryloxyphosphate, cationic surfactants such as lauryltrimethylammonium chloride, and cetylpyridinium chloride, stearin Nonionic surfactants such as acid polyethylene glycol and pentaerythritol stearic acid monoester, and amphoteric surfactants such as lauryl dimethylpetine are included, and one of these may be used alone, or two or more may be arbitrarily selected Can be used in combination.
The metal salt is preferably a metal halide, and specifically includes chloride, bromide, iodide, and the like.
Examples of the thickener include cellulose derivatives such as methyl cellulose and hydroxyethyl cellulose, various gums, natural polymer thickeners such as pectin, sodium alginate, dextrin, agar, and gelatin.
［繊維状架橋体］
本願における第３の発明は、繊維状架橋体である。具体的には、縮合性の官能基を有する親水性高分子およびその塩のうち少なくともいずれかである繊維状架橋体であって、当該繊維状架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されていることを特徴とする。
ここで、縮合性の官能基とは、縮合反応により高分子架橋剤が有する官能基と反応しうる官能基をいう。例えば、アミノ基、水酸基、カルボニル基、カルボキシル基、シラノール基、エステル基、アミド基などが挙げられる。
縮合性の官能基を有する親水性高分子としては、生体高分子、合成高分子、および天然高分子などが挙げられるが、特に生体高分子が好ましい。
生体高分子としては、アミノ酸（例えば、ポリグルタミン酸）、タンパク質、糖類（例えば、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸）が挙げられる。これらの中では、本発明の効果の観点より、ポリグルタミン酸が特に好ましい。
合成高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ポリスチレンスルホン酸、およびポリアクリル酸などが挙げられる。
天然高分子としては、セルロースやカルボキシメチルセルロールなどが挙げられる。
[Fibrous cross-linked product]
3rd invention in this application is a fibrous bridge | crosslinking body. Specifically, it is a fibrous crosslinked body that is at least one of a hydrophilic polymer having a condensable functional group and a salt thereof, and the fibrous crosslinked body is crosslinked with a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more. It is characterized by.
Here, the condensable functional group refers to a functional group that can react with the functional group of the polymer crosslinking agent by a condensation reaction. Examples thereof include an amino group, a hydroxyl group, a carbonyl group, a carboxyl group, a silanol group, an ester group, and an amide group.
Examples of the hydrophilic polymer having a condensable functional group include biopolymers, synthetic polymers, and natural polymers, with biopolymers being particularly preferred.
Examples of the biopolymer include amino acids (for example, polyglutamic acid), proteins, and sugars (for example, chitosan, hyaluronic acid, chondroitin sulfate). Among these, polyglutamic acid is particularly preferable from the viewpoint of the effects of the present invention.
Examples of the synthetic polymer include polyvinyl alcohol, polyethyleneimine, polyacrylamide, polystyrene sulfonic acid, and polyacrylic acid.
Examples of natural polymers include cellulose and carboxymethyl cellulose.
［繊維状架橋体の製造方法］
本願における第４の発明は、繊維状架橋体の製造方法である。具体的には、縮合性の官能基を含有する親水性化合物１質量％以上２０質量％以下と、数平均分子量が１０００以上の高分子架橋剤０．０１質量％以上１０質量％以下とを水中で反応させる紡糸用原料製造工程と前記原料を用いて紡糸する紡糸工程とを備え、前記紡糸工程における前記原料のポットライフが５００時間以下であり、前記紡糸工程における温度が１０℃以上であることを特徴とする。なお、この第４の発明を上述の第１〜第３の発明と特に区別する必要がない場合は、単に「本発明」とも記載する。
[Method for producing fibrous crosslinked body]
4th invention in this application is a manufacturing method of a fibrous crosslinked body. Specifically, 1% by mass to 20% by mass of a hydrophilic compound containing a condensable functional group and 0.01% by mass to 10% by mass of a polymer crosslinking agent having a number average molecular weight of 1000 or more in water. A raw material production process for spinning to be reacted with a spinning process for spinning using the raw material, the pot life of the raw material in the spinning process is 500 hours or less, and the temperature in the spinning process is 10 ° C. or more It is characterized by. In addition, when it is not necessary to distinguish this 4th invention from the above-mentioned 1st-3rd invention, it is only described as "the present invention".
前記した紡糸工程では、静電紡糸法を用いることが好ましい。例えば、特許第５１２３８７３号公報や特許第５４５１８３７号公報に記載された静電紡糸法を好ましく適用することができる。
静電紡糸法により紡糸すると、電荷の高まりが糸の細化を促進し、細化に伴い溶媒の揮散が進むため、極細繊維（ナノファイバー）を得ることができる。それ故、表面積が大きく、吸湿、吸水性および保水性に優れた繊維状架橋体を提供することができる。また、静電紡糸法においては、ノズル式とロール式のどちらを用いてもよい。ノズル式では他成分との芯／鞘構造であってもよい。なお、紡糸により得られた繊維状プレ架橋体を所定の温度で加熱することにより高分子架橋剤の機能が発揮され、繊維状架橋体とすることができる。
In the spinning step described above, it is preferable to use an electrostatic spinning method. For example, the electrostatic spinning method described in Japanese Patent No. 5123873 and Japanese Patent No. 5451837 can be preferably applied.
When spinning by an electrostatic spinning method, the increase in charge promotes the thinning of the yarn, and the evaporation of the solvent proceeds with the thinning, so that ultrafine fibers (nanofibers) can be obtained. Therefore, a fibrous crosslinked body having a large surface area and excellent in moisture absorption, water absorption and water retention can be provided. In the electrostatic spinning method, either a nozzle type or a roll type may be used. The nozzle type may have a core / sheath structure with other components. In addition, the function of a polymeric crosslinking agent is exhibited by heating the fibrous pre-crosslinked body obtained by spinning at a predetermined temperature, and a fibrous crosslinked body can be obtained.
上述の親水性化合物としては、生分解性、生体適合性、および吸湿・吸水性の観点より、ポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかを用いることが好ましい。ポリグルタミン酸（塩）としては、上述した第１の発明や第２の発明で用いたものを好ましく適用できる。
ポリグルタミン酸塩（特にナトリウム（Ｎａ）塩）と、高分子架橋剤とを混合したポリグルタミン酸溶液から静電紡糸法により紡糸すると、水、水溶性有機溶媒を溶媒として用いることができるので、取り扱いが容易であり、製造を容易に行うことができるので経済的である。
As the above-mentioned hydrophilic compound, it is preferable to use at least one of polyglutamic acid and polyglutamate from the viewpoints of biodegradability, biocompatibility, and moisture absorption and water absorption. As the polyglutamic acid (salt), those used in the first invention and the second invention described above can be preferably applied.
When spinning with a polyglutamic acid solution (especially sodium (Na) salt) and a polyglutamic acid solution mixed with a polymer crosslinking agent by electrostatic spinning, water and a water-soluble organic solvent can be used as a solvent. Since it is easy and can be manufactured easily, it is economical.
ここで、前記した高分子架橋剤としては、架橋効率およびポットライフの観点より、数平均分子量が１０００以上のカルボジイミドを用いることが好ましい。このカルボジイミドは上述した第１〜第３の発明で用いるものを好適に使用できる。
ポリグルタミン酸（塩）と架橋剤を用いた架橋体の製造において、ポリグルタミン酸（塩）と架橋剤を混合すると徐々に反応が進んでゲル化が起こり、さらには硬化することがある。そこで、ポリグルタミン酸（塩）と架橋剤を含む架橋剤組成物を調製してから、架橋が実質的に進行せず、紡糸可能な期間をポットライフ（可使時間）と言う。
Here, it is preferable to use a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more as the above-described polymer crosslinking agent from the viewpoint of crosslinking efficiency and pot life. As this carbodiimide, those used in the first to third inventions described above can be suitably used.
In the production of a crosslinked product using a polyglutamic acid (salt) and a crosslinking agent, when the polyglutamic acid (salt) and the crosslinking agent are mixed, the reaction gradually proceeds to cause gelation and further hardening. Therefore, after preparing a cross-linking agent composition containing polyglutamic acid (salt) and a cross-linking agent, the period in which cross-linking does not proceed substantially and can be spun is called pot life (pot life).
静電紡糸法の特徴として常温にて紡糸工程が可能であることも挙げられるが、事前に原料液（架橋剤組成物）を調製して装置に仕込むため、原料液には長時間の安定性が必要とされる。これまで架橋性能とポットライフとを両立させる製造法は確立されておらず、その製造法の確立が望まれていた。上記したカルボジイミドを高分子架橋剤として用いると、上記目的を容易に達成できるようになる。
ポットライフは、基本的に長い方が好ましく、具体的には５時間以上であることが好ましく、１０時間以上あることが好ましい。一方、ポリグルタミン酸（塩）を原料として、吸湿・吸水してもゲル状とならない耐水性のある架橋体を製造するため、架橋剤組成物のポットライフは、５００時間以下であり、好ましくは２００時間以下であり、より好ましくは７２時間以下である。
One of the characteristics of the electrospinning method is that the spinning process is possible at room temperature. However, since the raw material liquid (crosslinking agent composition) is prepared in advance and charged into the equipment, the raw material liquid has long-term stability. Is needed. So far, a production method that achieves both crosslinking performance and pot life has not been established, and establishment of the production method has been desired. When the above carbodiimide is used as a polymer crosslinking agent, the above object can be easily achieved.
The pot life is basically preferably longer, specifically 5 hours or longer, and preferably 10 hours or longer. On the other hand, a polyglutamic acid (salt) is used as a raw material to produce a water-resistant crosslinked product that does not become a gel even if it absorbs moisture or absorbs water. Therefore, the pot life of the crosslinking agent composition is 500 hours or less, preferably 200 It is less than time, More preferably, it is less than 72 hours.
本発明により得られる繊維状架橋体において、繊維は、繊維集合体を構成していることが好ましく、この繊維集合体が架橋されて繊維状架橋体を形成する。この繊維状架橋体は吸湿、吸水しても架橋しているため元の形態を十分に保持している。
本発明により得られる繊維状架橋体において、前記繊維の平均径は３μｍ以下であることが好ましく、０．０１μｍ以上３μｍ以下であることがより好ましく、０．０５μｍ以上１．８μｍ以下であることがさらに好ましい。
上述の繊維の平均径が３μｍを超えると、超極細繊維としての特徴であるフィルター性能や、表面積による吸水性が繊維集合体の単位重量あたりで必ずしも優位ではなくなってしまい、風合い的にもいわゆるゴアゴア感が生じてくるおそれがある。繊維の平均径は基本的に細い方が好ましいが、０．０１μｍ未満になると、生産性、強度、取り扱いの面で問題が生じるおそれもある。なお、繊維の平均径は、電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）により任意の１０本を選定しその算術平均値を取れば求められる。
In the fibrous crosslinked body obtained by the present invention, the fibers preferably constitute a fiber assembly, and the fiber assembly is crosslinked to form a fibrous crosslinked body. Since this fibrous crosslinked body is crosslinked even if it absorbs moisture and absorbs water, it retains its original form sufficiently.
In the fibrous crosslinked body obtained by the present invention, the average diameter of the fibers is preferably 3 μm or less, more preferably 0.01 μm or more and 3 μm or less, and 0.05 μm or more and 1.8 μm or less. Further preferred.
If the average fiber diameter exceeds 3 μm, the filter performance and water absorption due to the surface area are not necessarily superior per unit weight of the fiber assembly, which is a characteristic of ultra-fine fibers. There is a risk of feeling. The average diameter of the fiber is basically preferably thinner, but if it is less than 0.01 μm, there may be a problem in terms of productivity, strength, and handling. In addition, the average diameter of a fiber is calculated | required if arbitrary 10 pieces are selected with an electron micrograph (SEM image), and the arithmetic average value is taken.
本願における第５の発明は、移植細胞を効率よく産生することが可能な細胞培養床、前記した細胞培養床による細胞の培養方法、および前記した細胞培養床による移植用細胞シートの製造方法である。
上述の繊維状架橋体に細胞接着因子を配合すると、当該繊維状架橋体に付着させた細胞の増殖速度を飛躍的に高めることができる。細胞接着因子としては、ラミニン、ポリエルリジン（ＰＬＬ）、およびコラーゲンなどを好ましく用いることができる。増殖の対象となる細胞としては、特に制限はなく正常細胞でも幹細胞でもよい。
細胞培養床は、上記した繊維状架橋体を、細胞培養基材に被覆するだけで容易に製造することができる。被覆する手段は特に問わないが、塗布でも吹付でもよい。
細胞培養基材としては、表面の少なくとも一部がプラスチック製またはガラス製であることが好ましい。
また、上記した細胞培養床を用いると、移植用細胞シートを効率的かつ迅速に製造することができる。
A fifth invention in the present application is a cell culture bed capable of efficiently producing transplanted cells, a cell culture method using the cell culture bed, and a method for producing a cell sheet for transplantation using the cell culture bed. .
When a cell adhesion factor is blended with the above-mentioned fibrous crosslinked body, the growth rate of cells attached to the fibrous crosslinked body can be dramatically increased. As cell adhesion factors, laminin, polyerlysine (PLL), collagen and the like can be preferably used. The cells to be proliferated are not particularly limited and may be normal cells or stem cells.
The cell culture bed can be easily produced simply by coating the above-mentioned fibrous crosslinked body on the cell culture substrate. The means for coating is not particularly limited, but may be applied or sprayed.
As the cell culture substrate, at least a part of the surface is preferably made of plastic or glass.
Moreover, when the above cell culture bed is used, a cell sheet for transplantation can be produced efficiently and rapidly.
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例や比較例によって何ら限定されるものではない。
〔紡糸方法および架橋方法〕
（１）原料液（架橋剤組成物）の調製
ポリグルタミン酸として、味丹社製ＨＭ−ＮａＦＯＲＭ（Ｍｗ＝１．３×１０６）を用いた。カルボジイミド基含有高分子架橋剤として、日清紡ケミカル株式会社製カルボジライトＳＶ−０２（固形分４０質量％の水溶液）およびＳＷ−１２Ｂ（固形分１００質量％）を用いた。オキサゾリン基含有高分子架橋剤として、日本触媒社製ＷＳ−７００（固形分２５質量％の水溶液）を用いた。エポキシ基含有高分子架橋剤として、日本油脂社製エピオールＥ−４００を用いた。上記した各成分を所定の配合で混合し、それぞれの高分子架橋剤を含むポリグルタミン酸溶液（架橋剤組成物）を作製した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a comparative example demonstrate this invention further more concretely, this invention is not limited at all by these Examples and comparative examples.
[Spinning method and crosslinking method]
(1) Preparation of raw material liquid (crosslinking agent composition) As polyglutamic acid, HM-NaFORM (Mw = 1.3 × 10 6 ) manufactured by Ajitan Co., Ltd. was used. As the carbodiimide group-containing polymer crosslinking agent, Carbodilite SV-02 (aqueous solution having a solid content of 40% by mass) and SW-12B (solid content of 100% by mass) manufactured by Nisshinbo Chemical Co., Ltd. were used. WS-700 (an aqueous solution having a solid content of 25% by mass) manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd. was used as the oxazoline group-containing polymer crosslinking agent. Epiol E-400 manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd. was used as the epoxy group-containing polymer crosslinking agent. Each component described above was mixed in a predetermined composition to prepare a polyglutamic acid solution (crosslinking agent composition) containing each polymer crosslinking agent.
（２）紡糸装置および繊維状プレ架橋体の紡糸条件
（１）で調製した各架橋剤組成物を、エルマルコ社製ＮＳ−ＬＡＢ２００Ｓを用いて、電極間距離１００〜１６０ｍｍ、電圧４０〜８０ｋＶ、電極回転速度４ｒ／ｍｉｎ、ライン速度０．０８ｍ／ｍｉｎで、目付け３０ｇ／ｍ２のポリプロピレン製不織布（出光ユニテック社製、ＲＣ２０３０）またはガラスシャーレに対し繊維状プレ架橋体をシート状に堆積させた。
（３）架橋方法
（２）で得られた繊維状プレ架橋体が堆積したシートを、真空オーブンにより１２０℃〜１４０℃で３０分〜１時間加熱し、ポリグルタミン酸の繊維状架橋体を製造した。具体的な加熱温度と加熱時間は以下の通りである。
実施例１〜４：１２０℃で１時間
実施例５、６：１４０℃で３０分
比較例１、２：１２０℃で１時間
(2) Spinning apparatus and spinning conditions of fibrous pre-crosslinked body Each crosslinker composition prepared in (1) was subjected to NS-LAB200S manufactured by El Marco Co., electrode-to-electrode distance 100 to 160 mm, voltage 40 to 80 kV, electrode A fibrous pre-crosslinked body was deposited in a sheet form on a polypropylene nonwoven fabric (RC2030 manufactured by Idemitsu Unitech Co., Ltd.) or a glass petri dish with a basis weight of 30 g / m 2 at a rotational speed of 4 r / min and a line speed of 0.08 m / min.
(3) Crosslinking method The sheet on which the fibrous precrosslinked body obtained in (2) was deposited was heated in a vacuum oven at 120 ° C. to 140 ° C. for 30 minutes to 1 hour to produce a polyglutamic acid fibrous crosslinked body. . Specific heating temperature and heating time are as follows.
Examples 1-4: 1 hour at 120 ° C Example 5, 6: 30 minutes at 140 ° C Comparative Example 1, 2: 1 hour at 120 ° C
〔実施例１〕
１５質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液５４．０ｇ、カルボジイミド基含有高分子架橋剤（ＳＶ−０２）１０．１ｇ、エタノール３０．０ｇ、および１Ｎ塩酸２２．５ｇを混合して、原料液（架橋剤組成物）を調製した。ここでポリグルタミン酸ナトリウムの割合は６６．７質量％とした。そして、原料液調製直後に上述した製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）を図１に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
[Example 1]
A 15 mass% polyglutamic acid Na aqueous solution 54.0 g, a carbodiimide group-containing polymer cross-linking agent (SV-02) 10.1 g, ethanol 30.0 g, and 1N hydrochloric acid 22.5 g were mixed to prepare a raw material liquid (crosslinking agent composition). ) Was prepared. Here, the ratio of sodium polyglutamate was 66.7% by mass. And the fibrous crosslinked body was manufactured on the conditions of the manufacture example mentioned above immediately after raw material liquid preparation. The electron micrograph (SEM image) of the obtained fibrous crosslinked body is shown in FIG. Although this fibrous crosslinked body was immersed in water, the fiber shape was maintained without dissolving in water.
〔実施例２〕
実施例１と同様にして原料液を調製後、２５℃にて１２時間放置した。その後、製造例の条件にて繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図２に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
[Example 2]
After preparing the raw material liquid in the same manner as in Example 1, it was left at 25 ° C. for 12 hours. Then, the fibrous crosslinked body was manufactured on condition of a manufacture example. An electron micrograph of the obtained fibrous crosslinked product is shown in FIG. Although this fibrous crosslinked body was immersed in water, the fiber shape was maintained without dissolving in water.
〔実施例３〕
１５質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液５４．０ｇ、カルボジイミド基含有高分子架橋剤（ＳＶ−０２）２．０ｇ、エタノール３０．０ｇ、および１Ｎ塩酸１６．９ｇを混合して原料液を調製した。ポリグルタミン酸Ｎａの割合は９１．０質量％とした。原料液の調製直後に製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図３に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
Example 3
A raw material solution was prepared by mixing 54.0 g of a 15 mass% polyglutamic acid Na aqueous solution, 2.0 g of a carbodiimide group-containing polymer crosslinking agent (SV-02), 30.0 g of ethanol, and 16.9 g of 1N hydrochloric acid. The ratio of sodium polyglutamate was 91.0% by mass. Immediately after the preparation of the raw material liquid, a fibrous crosslinked body was produced under the conditions of the production example. An electron micrograph of the obtained fibrous crosslinked product is shown in FIG. Although this fibrous crosslinked body was immersed in water, the fiber shape was maintained without dissolving in water.
〔実施例４〕
実施例３と同様にして原料液を調製し、２５℃にて１２時間放置した。その後、製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図４に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
Example 4
A raw material solution was prepared in the same manner as in Example 3, and allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours. Then, the fibrous crosslinked body was manufactured on the conditions of the manufacture example. An electron micrograph of the obtained fibrous crosslinked product is shown in FIG. Although this fibrous crosslinked body was immersed in water, the fiber shape was maintained without dissolving in water.
〔実施例５〕
３０質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液３８．６ｇ、カルボジイミド基含有高分子架橋剤（ＳＷ−１２Ｂ）４０質量％水溶液５．１ｇ、１Ｎ−ＮａＯＨ水溶液２１．０ｇ、５３質量％エタノール水溶液４０．６ｇを混合した。その後、溶液粘度を調整するためにエタノールを１３．６ｇ加え、原料液（架橋剤組成物）を調製した。ここで、ポリグルタミン酸ナトリウムの割合は８５質量％とした。そして、原料液調製直後に上述した製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真（ＳＥＭ像）を図５に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
Example 5
30 mass% polyglutamic acid Na aqueous solution 38.6g, carbodiimide group containing polymer crosslinking agent (SW-12B) 40 mass% aqueous solution 5.1g, 1N NaOH aqueous solution 21.0g, 53 mass% ethanol aqueous solution 40.6g were mixed. . Thereafter, 13.6 g of ethanol was added to adjust the solution viscosity to prepare a raw material liquid (crosslinking agent composition). Here, the ratio of sodium polyglutamate was 85% by mass. And the fibrous crosslinked body was manufactured on the conditions of the manufacture example mentioned above immediately after raw material liquid preparation. An electron micrograph (SEM image) of the obtained fibrous crosslinked product is shown in FIG. Although this fibrous crosslinked body was immersed in water, the fiber shape was maintained without dissolving in water.
〔実施例６〕
実施例５と同様にして原料液を調製後、５℃にて１２０時間放置した。その後、製造例の条件にて繊維状架橋体の製造を行った。得られた繊維状架橋体の電子顕微鏡写真を図６に示す。この繊維状架橋体を水に浸漬したが水中で溶解することもなく繊維の形状を保った。
Example 6
A raw material solution was prepared in the same manner as in Example 5, and then allowed to stand at 5 ° C. for 120 hours. Then, the fibrous crosslinked body was manufactured on condition of a manufacture example. An electron micrograph of the obtained fibrous crosslinked product is shown in FIG. Although this fibrous crosslinked body was immersed in water, the fiber shape was maintained without dissolving in water.
〔比較例１〕
１５質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液３６．０ｇ、オキサゾリン基含有高分子架橋剤（ＷＳ−７００）１４．４ｇ、エタノール３０．０ｇ、１Ｎ塩酸２２．５ｇ、および水９．６ｇを混合して原料液を調製した。ポリグルタミン酸Ｎａの割合は５４．０質量％とした。
原料液を調製後、２５℃にて１２時間放置した。その後、製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行おうとしたが、ポットライフが短すぎて、紡糸が不可能であった。
[Comparative Example 1]
A raw material solution was prepared by mixing 36.0 g of a 15 mass% polyglutamic acid Na aqueous solution, 14.4 g of an oxazoline group-containing polymer crosslinking agent (WS-700), 30.0 g of ethanol, 22.5 g of 1N hydrochloric acid, and 9.6 g of water. Prepared. The ratio of sodium polyglutamate was 54.0% by mass.
After preparing the raw material liquid, it was left at 25 ° C. for 12 hours. Thereafter, an attempt was made to produce a fibrous crosslinked product under the conditions of the production example, but the pot life was too short and spinning was impossible.
〔比較例２〕
１６．７質量％ポリグルタミン酸Ｎａ水溶液６０．０ｇ、エポキシ基含有高分子架橋剤（エピオールＥ−４００）６．６６ｇ、メタノール１００．０ｇ、クエン酸０．６６ｇ、および塩化カルシウム０．６６ｇを混合して原料液を調製した。ポリグルタミン酸Ｎａの割合は５５．６質量％とした。原料液の調製直後に製造例の条件で繊維状架橋体の製造を行った。この繊維状架橋体を水に浸漬すると水中で溶解してしまい繊維の形状を保つことができなかった。
[Comparative Example 2]
16.7% by mass of polyglutamic acid Na aqueous solution 60.0 g, epoxy group-containing polymer cross-linking agent (Epiol E-400) 6.66 g, methanol 100.0 g, citric acid 0.66 g, and calcium chloride 0.66 g were mixed. A raw material solution was prepared. The ratio of sodium polyglutamate was 55.6% by mass. Immediately after the preparation of the raw material liquid, a fibrous crosslinked body was produced under the conditions of the production example. When this fibrous crosslinked body was immersed in water, it was dissolved in water and the shape of the fiber could not be maintained.
〔評価結果１〕
実施例１〜６の原料液（架橋剤組成物）は、高分子量のカルボジイミドを架橋剤としているので、いずれもポットライフおよび紡糸性に優れ、得られた繊維状架橋体も耐水性に優れている。
これに対して、比較例１の原料液では、ポットライフが短すぎ紡糸そのものが不可能であった。また比較例２の原料液では、耐水性に優れた繊維状架橋体を得ることができなかった。
[Evaluation result 1]
Since the raw material liquids (crosslinking agent compositions) of Examples 1 to 6 have high molecular weight carbodiimide as a crosslinking agent, all have excellent pot life and spinnability, and the obtained fibrous crosslinked bodies also have excellent water resistance. Yes.
On the other hand, with the raw material liquid of Comparative Example 1, the pot life was too short to allow spinning itself. Moreover, in the raw material liquid of Comparative Example 2, a fibrous crosslinked product excellent in water resistance could not be obtained.
〔実施例７〕
本発明の細胞培養床が、ヒト角膜上皮細胞、およびヒト皮膚繊維芽細胞の増殖速度に対して与える効果を確認した。
（１）細胞および培地
クラボウ社より購入して使用した。具体的には、初代細胞２種類（ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥＣ−２：クラボウ社製品番号ＫＣ−４００９）、およびヒト皮膚繊維芽細胞（成人）（ＮＨＤＦ（ＡＤ）)：クラボウ社製品番号ＫＦ−４１０９）をクラボウ社より購入し、クラボウ社の推奨する培地（正常ヒト角膜上皮細胞用培地：FibroLifeR Comp kit、正常ヒト皮膚繊維芽細胞：OcuLifeR Comp kit）にて前培養し、７５ｃｍ２ Ｔ−Ｆｌａｓｋ×１枚がセミコンフルエントになるまで培養した細胞を使用した。
Example 7
The effect of the cell culture bed of the present invention on the growth rate of human corneal epithelial cells and human skin fibroblasts was confirmed.
(1) Cells and medium Used from Kurabo Industries. Specifically, two types of primary cells (human corneal epithelial cells (HCEC-2: Kurabo Industries, product number KC-4009) and human dermal fibroblasts (adult) (NHDF (AD)): Kurabo Industries, product number KF- 4109) was purchased from Kurabo Industries, Inc. and precultured in a culture medium recommended by Kurabo Industries (medium for normal human corneal epithelial cells: FibroLife® Comp kit, normal human dermal fibroblast: OcuLife® Comp kit), and 75 cm 2 T-Flash. Cells cultured until × 1 was semi-confluent were used.
（２）細胞培養床
実施例５と同様にして原料液を調製し、静電紡糸した繊維状架橋体（ＰＧＡナノファイバー）を内面に塗布したガラスシャーレ（φ９ｃｍ）（細胞培養基材）と未処理のガラスシャーレ（φ９ｃｍ 滅菌処理済）を用いた。
（３）細胞密度
７５ｃｍ２ Ｔ−Ｆｌａｓｋでセミコンフルエントとなった正常細胞を、下記の細胞密度となるよう、ＰＧＡナノファイバーを内面に塗布したφ９ｃｍガラスシャーレ、および未処理のφ９ｃｍガラスシャーレに播種した。ｎ数はいずれも２である。
ＨＣＥＣ−２：正常ヒト角膜上皮細胞：５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２
ＮＨＤＦ：正常ヒト皮膚繊維芽細胞：２５００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２
(2) Cell culture bed A raw material solution was prepared in the same manner as in Example 5, and a glass petri dish (φ9 cm) (cell culture substrate) coated with an electrospun fibrous cross-linked body (PGA nanofiber) on the inner surface was not used. A treated glass petri dish (φ9 cm sterilized) was used.
(3) Cell density Normal cells that became semi-confluent with 75 cm 2 T-Flash were seeded in a φ9 cm glass petri dish coated with PGA nanofibers on the inner surface and an untreated φ9 cm glass petri dish so as to have the following cell density. . The n number is 2 in all cases.
HCEC-2: normal human corneal epithelial cells: 5000 cells / cm 2
NHDF: Normal human skin fibroblasts: 2500 cells / cm 2
（４）細胞の播種方法
両細胞とも手順は共通である（播種細胞数のみ異なる。）。具体的な手順は以下の通りである。
１）培養上清をアスピレータで除去した。
２）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を６ｍＬ添加し、細胞表面を洗浄した。
３）トリプシン／ＥＤＴＡ（クラボウ、ＨＫ−３１２０）を６ｍＬ添加し、細胞表面の全体に行き渡らせた。
４）室温で１分間静置した。
５）トリプシン／ＥＤＴＡを４．５ｍＬ除去した。
６）室温で５分間静置した。
７）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を３．５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
８）トリプシン中和液（クラボウ、ＨＫ−３２２０）を５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
９）細胞懸濁液を１５ｍＬ ｔｕｂｅに移した。
１０）遠心分離（２００Ｇ、５分、２５℃）を行った。
１１）上清をアスピレータで除去した。
１２）各細胞用の培地を１ｍＬ、ピペットマンで取り、細胞塊をよく懸濁させた。
１３）各細胞用の培地を９ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
１４）細胞懸濁液を１０μＬ取り、細胞数を計測した。
１５）１ｗｅｌｌあたり上記細胞数になるように細胞を播種した。
(4) Cell seeding method The procedure is the same for both cells (only the number of seeded cells is different). The specific procedure is as follows.
1) The culture supernatant was removed with an aspirator.
2) 6 mL of HEPES buffer (Kurabo, HK-3320) was added to wash the cell surface.
3) 6 mL of trypsin / EDTA (Kurabo, HK-3120) was added to spread the entire cell surface.
4) Left at room temperature for 1 minute.
5) 4.5 mL of trypsin / EDTA was removed.
6) Left at room temperature for 5 minutes.
7) 3.5 mL of HEPES buffer (Kurabo, HK-3320) was added and well suspended.
8) 5 mL of trypsin neutralizing solution (Kurabo, HK-3220) was added and well suspended.
9) The cell suspension was transferred to a 15 mL tube.
10) Centrifugation (200 G, 5 minutes, 25 ° C.) was performed.
11) The supernatant was removed with an aspirator.
12) 1 mL of the medium for each cell was taken with a pipetman, and the cell mass was well suspended.
13) 9 mL of a medium for each cell was added and well suspended.
14) 10 μL of the cell suspension was taken and the number of cells was counted.
15) Cells were seeded so that the number of cells per well was obtained.
（５）播種後の細胞増殖および増殖後の細胞の形態観察
炭酸ガスインキュベーター（サーモ社製）にて３７℃、５ｖｏｌ％炭酸ガス条件下で７日間培養したのち、光学顕微鏡にて細胞の形態を観察した。光学顕微鏡写真を図７〜図１０に示す。
なお、ガラスシャーレならびにプラスチックシャーレ（ナノファイバー吹付細胞培養基材）からシート状の細胞隗を剥離すれば、移植用細胞シートとして用いることもできる。その際は、上記（４）の３）、４）において処理時間を短くし、シート状で剥離する。
(5) Cell growth after seeding and observation of cell morphology after growth After culturing at 37 ° C. under 5 vol% carbon dioxide gas conditions in a carbon dioxide incubator (manufactured by Thermo Co.), the cell morphology was examined with an optical microscope. Observed. Optical micrographs are shown in FIGS.
In addition, if a sheet-like cell cage is peeled from a glass petri dish or a plastic petri dish (nanofiber sprayed cell culture substrate), it can also be used as a cell sheet for transplantation. In that case, in 3) and 4) of the above (4), the processing time is shortened and the sheet is peeled off.
（６）細胞増殖性（増殖速度）の評価
光学顕鏡鏡による観察後、下記手順にて細胞数をカウントし、増殖性を評価した。両細胞とも手順は共通である。
１）培養上清をアスピレータで除去した。
２）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を２ｍＬ添加し、細胞表面を洗浄した。
３）トリプシン／ＥＤＴＡ（クラボウ、ＨＫ−３１２０）を１ｍＬ添加し、細胞表面の全体に行き渡らせた。
４）室温で１分間静置した。
５）トリプシン／ＥＤＴＡを０．７５ｍＬ除去した。
６）室温で５分間静置した。
７）ＨＥＰＥＳ緩衝液（クラボウ、ＨＫ−３３２０）を０．２５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
８）トリプシン中和液（クラボウ、ＨＫ−３２２０）を０．５ｍＬ添加し、よく懸濁させた。
９）細胞懸濁液を１０μＬ取り、細胞数を計測した。初日から７日後までの細胞数の変化を図１１、図１２に示す。いずれも、ＰＧＡナノファイバーを塗布したガラスシャーレ（ＰＧＡＮＦ（＋））を用いたものと、未処理のガラスシャーレを用いたものとを比較して示したものである。
(6) Evaluation of cell proliferation (growth rate) After observation with an optical microscope, the number of cells was counted by the following procedure to evaluate proliferation. The procedure is the same for both cells.
1) The culture supernatant was removed with an aspirator.
2) 2 mL of HEPES buffer (Kurabo, HK-3320) was added to wash the cell surface.
3) 1 mL of trypsin / EDTA (Kurabo, HK-3120) was added to spread the entire cell surface.
4) Left at room temperature for 1 minute.
5) 0.75 mL of trypsin / EDTA was removed.
6) Left at room temperature for 5 minutes.
7) 0.25 mL of HEPES buffer (Kurabo, HK-3320) was added and well suspended.
8) 0.5 mL of trypsin neutralizing solution (Kurabo, HK-3220) was added and well suspended.
9) 10 μL of the cell suspension was taken and the number of cells was counted. Changes in the number of cells from the first day to 7 days later are shown in FIGS. In both cases, a glass petri dish (PGANF (+)) coated with PGA nanofibers is compared with a glass petri dish using an untreated glass petri dish.
〔評価結果２〕
図１１、図１２より、両細胞とも、ＰＧＡナノファイバーが塗布されたガラスシャーレを用いることにより増殖性（増殖速度）が向上していることがわかる。
[Evaluation result 2]
From FIG. 11 and FIG. 12, it can be seen that the proliferation (growth rate) of both cells is improved by using a glass petri dish coated with PGA nanofibers.
本発明は、パックやフェイスマスクなどの化粧用品、創傷被覆剤や止血シートや癒着防止シートなどの医療用品、また、細胞培養床や発芽シートなどのバイオ、農業用品、さらには、水系インクの受理体としての日用品や電気電子材料に利用できる。 The present invention relates to cosmetic supplies such as packs and face masks, medical supplies such as wound dressings, hemostatic sheets and anti-adhesion sheets, bio- and agricultural supplies such as cell culture beds and germination sheets, and water-based ink receivers. Can be used for daily necessities and electrical and electronic materials.
Claims (16)
当該架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋されたものである
ことを特徴とする架橋体。 A cross-linking of Po Li glutamates,
The cross-linked product is a cross-linked product with a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more.
当該架橋体が繊維状である
ことを特徴とする架橋体。 In the crosslinked body according to claim 1,
A crosslinked body, wherein the crosslinked body is fibrous.
当該架橋体の平均直径が３μｍ以下である
ことを特徴とする架橋体。 The cross-linked product according to claim 2,
The average diameter of the said crosslinked body is 3 micrometers or less. The crosslinked body characterized by the above-mentioned.
ことを特徴とする架橋剤組成物。 A crosslinker composition comprising at least one of polyglutamic acid and polyglutamate and a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more.
前記カルボジイミドを、前記ポリグルタミン酸および前記ポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかと前記カルボジイミドとの混合物基準で、０．１質量％以上５０質量％以下配合してなる
ことを特徴とする架橋剤組成物。 The crosslinker composition according to claim 4,
A crosslinking agent composition comprising 0.1% by mass or more and 50% by mass or less of the carbodiimide based on a mixture of at least one of the polyglutamic acid and the polyglutamate and the carbodiimide.
当該繊維状架橋体が数平均分子量１０００以上のカルボジイミドにより架橋され、
前記親水性高分子が生体高分子であり、
前記生体高分子がポリグルタミン酸である
ことを特徴とする繊維状架橋体。 A fibrous crosslinked body that is at least one of a hydrophilic polymer having a condensable functional group and a salt thereof,
The fibrous crosslinked body is crosslinked with a carbodiimide having a number average molecular weight of 1000 or more ,
The hydrophilic polymer is a biopolymer;
Fibrous crosslinked, wherein the biopolymer Ru der polyglutamic acid.
当該繊維状架橋体の平均直径が３μｍ以下である
ことを特徴とする繊維状架橋体。 In the fibrous crosslinked body according to claim 6 ,
An average diameter of the fibrous crosslinked body is 3 μm or less.
縮合性の官能基を含有する親水性化合物１質量％以上２０質量％以下と、
数平均分子量が１０００以上の高分子架橋剤０．０１質量％以上１０質量％以下とを水中で反応させる紡糸用原料製造工程と
前記原料を用いて紡糸する紡糸工程とを備え、
前記紡糸工程における前記原料のポットライフが５００時間以下であり、
前記紡糸工程における温度が１０℃以上であり、
前記親水性化合物がポリグルタミン酸およびポリグルタミン酸塩のうち少なくともいずれかであり、
前記高分子架橋剤がカルボジイミドである
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。 A method for producing a fibrous crosslinked body, comprising:
1% by mass or more and 20% by mass or less of a hydrophilic compound containing a condensable functional group;
A raw material production process for spinning in which a polymer crosslinking agent having a number average molecular weight of 1000 or more and 0.01% by mass or more and 10% by mass or less is reacted in water, and a spinning process for spinning using the raw material,
The pot life of the raw material in the spinning process is 500 hours or less,
Ri der temperature is 10 ° C. or higher in the spinning step,
The hydrophilic compound is at least one of polyglutamic acid and polyglutamate;
The method for producing a fibrous cross-linked product, wherein the polymer cross-linking agent is carbodiimide .
当該繊維状架橋体を構成する繊維の平均直径が３μｍ以下である
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。 In the manufacturing method of the fibrous crosslinked body of Claim 8 ,
The average diameter of the fiber which comprises the said fibrous crosslinked body is 3 micrometers or less. The manufacturing method of the fibrous crosslinked body characterized by the above-mentioned.
前記紡糸工程における紡糸が静電紡糸である
ことを特徴とする繊維状架橋体の製造方法。 In the manufacturing method of the fibrous crosslinked body of Claim 8 or Claim 9 ,
The method for producing a fibrous crosslinked body, wherein spinning in the spinning step is electrostatic spinning.
ことを特徴とする細胞培養床。 A cell culture bed, wherein the fibrous crosslinked body according to claim 6 or 7 is coated on a cell culture substrate.
前記被覆する手段が塗布または吹付である
ことを特徴とする細胞培養床。 The cell culture bed according to claim 11 ,
The cell culture bed, wherein the coating means is coating or spraying.
前記細胞培養基材の表面の少なくとも一部がプラスチック製またはガラス製である
ことを特徴とする細胞培養床。 In the cell culture bed according to claim 11 or 12 ,
A cell culture bed, wherein at least a part of the surface of the cell culture substrate is made of plastic or glass.
ことを特徴とする細胞の培養方法。 A cell culture method according to any one of claims 11 to 13 , wherein the cell culture bed is used.
前記細胞が正常細胞または幹細胞である
ことを特徴とする細胞の培養方法。 The method for culturing cells according to claim 14 ,
The cell culture method, wherein the cell is a normal cell or a stem cell.
ことを特徴とする移植用細胞シートの製造方法。 A method for producing a cell sheet for transplantation, wherein the cell culture bed according to any one of claims 11 to 13 is used.
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