JP6448238B2 - New koji mold, koji seasoning and koji beverage using koji mold, and method for producing koji seasoning and koji beverage - Google Patents
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Description
本発明は、糀調味料・糀飲料、糀調味料・糀飲料の製造方法、及び、該製造方法に好適に用いられる新規の糀菌に関するものである。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a koji seasoning and koji beverage, a method for producing koji seasoning and koji beverage, and a novel koji mold suitably used in the manufacturing method.
米糀は、米の糖化工程において、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、酸性プロテアーゼ、酸性カルポキシペプチダーゼ等の酵素を分泌し、米に含まれる米の澱粉質や蛋白質を分解してブドウ等や各種必須アミノ酸を蓄積することが知られており、斯かる糀菌の米への作用を利用した甘酒は、優れた栄養食品の1つとして季節を問わず飲食されている。 Rice bran secretes enzymes such as α-amylase, glucoamylase, transglucosidase, acid protease, and acid carboxypeptidase in the saccharification process of rice, and decomposes starch and proteins of rice to produce grapes, etc. It is known to accumulate various essential amino acids, and amazake using the action of such koji molds on rice is eaten and consumed regardless of the season as one of excellent nutritional foods.
甘酒は、主に米糀と米、あるいは酒粕を原料とし、作り方は、糀を使用する製造方法と酒粕を使用する方法が知られている。糀を使用する方法は、米糀と米を原料とし、米糀と適宜蒸した米を混合・発酵することで、糀の生産する酵素により米の澱粉質や蛋白質を分解することで得られる。また、酒粕を使用する方法は、湯に酒粕を溶いて加熱し、砂糖などの甘味を加える、または、これらの組合せによる方法も採用されている。 Amazake is mainly made from rice bran and rice, or sake lees, and the production method using koji and the method using sake lees are known. The method of using rice bran is obtained by decomposing rice starch and protein with enzymes produced by rice bran by mixing and fermenting rice bran and rice as raw materials. In addition, as a method of using sake lees, a method in which sake lees are dissolved in hot water and heated to add sweetness such as sugar or a combination thereof is also employed.
甘酒の製造がいずれの手法による場合でも、甘酒を飲みなれないと、米(又は米糀)や酒粕の固形分が違和感となり、敬遠される場合が多く、従来は簡単なスリ機で甘酒をすりつぶした甘酒ペーストを使用している。しかし、従来缶入り甘酒、カートカン甘酒に用いている甘酒ペーストには、水に不溶性の異物が含まれ、飲食した際にこの異物の舌触りが悪くざらつきを感じるという共通の問題がある。そこで、このざらつきを抑制するために、米糀及び/又は酒粕ペーストを一旦水に溶かしてスラリー化したのち、マスコロイダー、ホモミキサー、フレンチプレス等の機械的手法により処理することが提案されている(例えば、特許文献1、特許文献2等)。しかしながら、この方法は高価で特殊な設備が必要であり、粉砕に時間がかかるなど手間も多い。 Regardless of the method used to produce amazake, if you cannot drink amazake, the solid content of rice (or rice bran) or sake lees will be uncomfortable and often shunned. The amazake paste is used. However, the amazake paste conventionally used for canned sake and kartkan amazake has a common problem that water-insoluble foreign matter is included, and the foreign matter feels bad and rough when eating and drinking. Therefore, in order to suppress this roughness, it has been proposed that the rice bran and / or sake lees paste is once dissolved in water to form a slurry and then processed by a mechanical method such as a mass collider, a homomixer, or a French press. (For example, Patent Document 1, Patent Document 2, etc.). However, this method is expensive and requires special equipment, and it takes much time to grind.
本発明の目的は、上記現状に鑑み、微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等が安価で簡便なスリ工程によって短時間に得られる、低コストかつ簡便な製法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a low-cost and simple production method in which, in view of the above-mentioned present situation, a strawberry seasoning and a strawberry beverage with a small amount of fine foreign matter and a smooth touch can be obtained in a short time by an inexpensive and simple threading process. For the purpose.
本発明者らは、鋭意検討するなかで、舌触りのざらつきの原因が粒径0.2mm以上で主要成分を蛋白質とする異物であることを見いだし、この異物の分解または生成抑制のため、種々の酵素剤を検討したところ、セリンプロテアーゼの添加によりざらつき成分が分解することを見いだした。 The inventors of the present invention have intensively studied to find that the cause of the rough texture is a foreign substance having a particle size of 0.2 mm or more and having a main component as a protein. When the enzyme agent was examined, it was found that the roughening component was decomposed by the addition of serine protease.
またとりわけ米糀において、セリンプロテアーゼを高産生する糀菌はこれまで知られておらず、プロテアーゼとしては酸性プロテアーゼのみを産生するものが大半である。これを支持するように、特許文献3では、親株よりも糖質分解酵素活性及び/又はタンパク質分解酵素活性が著しく上昇し、しかも酒類の醸造における実用株として有用な新規糀菌が開示されているが、ここでの「タンパク質分解酵素」は、酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシペプチダーゼからなる酵素群のうち1種又は2種に限定されており、セリンプロテアーゼについては何ら言及されていない。特許文献4は、実質的に糀菌に由来するヌクレオチドだけからなるベクターで形質転換された糀菌をポテトデキストロース培地及び液体培地で培養することによって、アルカリ性プロテアーゼを産生する方法が提案されているが、培地が米糀ではない。特許文献5は、形質転換された糀菌を用いてふすま培地上で蛋白質加水分解酵素を発現させた例であるが、米糀上でのセリンプロテアーゼ産生の検証はなされていない。特許文献6は、重イオンビームを照射して糀菌の育種を行い、高プロテアーゼ生産と高グルタミナーゼ生産とを両立する糀菌を得ているが、プロテアーゼ産生能は総プロテアーゼ活性の評価であり、米糀上でのセリンプロテアーゼの産生を示唆するものではない。 Particularly in rice bran, no koji mold producing high serine protease has been known so far, and most proteases produce only acidic protease. In support of this, Patent Document 3 discloses a novel gonococci that has a significantly increased saccharide-degrading enzyme activity and / or proteolytic enzyme activity than the parent strain, and is useful as a practical strain in liquor brewing. However, the “proteolytic enzyme” here is limited to one or two of the enzyme group consisting of acidic protease and acidic carboxypeptidase, and no mention is made of serine protease. Patent Document 4 proposes a method for producing an alkaline protease by culturing a koji mold transformed with a vector consisting essentially of nucleotides derived from koji mold in a potato dextrose medium and a liquid medium. The medium is not rice bran. Patent Document 5 is an example in which a protein hydrolase is expressed on a bran medium using a transformed koji mold, but the production of serine protease on rice bran has not been verified. Patent Document 6 cultivates koji molds by irradiating heavy ion beams to obtain koji molds that achieve both high protease production and high glutaminase production, but the protease production ability is an evaluation of total protease activity. It does not suggest the production of serine protease on rice bran.
そこで、上記目的を達成するためになされた本発明の1つの側面は、糀菌を用いた糀調味料・糀飲料の製造方法であって、仕込み原料に含まれる穀物の糖化工程において、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含む糀調味料・糀飲料の製造方法である。本製法により、マスコロイダー等の高価で特殊な設備を使用しなくとも、簡単なスリ機などで微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等を短時間で簡便に得ることができる。また、マスコロイダーを使用する場合でも、処理速度が大幅に短縮されるため、製造コストを削減することができる。 Accordingly, one aspect of the present invention made to achieve the above object is a method for producing a koji seasoning and koji beverage using koji mold, and in the saccharification process of cereals contained in raw materials, a serine protease It is the manufacturing method of the strawberry seasoning and the strawberry drink including the step which increases the extracellular concentration of. By this method, it is possible to easily obtain a seasoning seasoning / beverage beverage with a small amount of fine foreign matter and a smooth touch without using expensive and special equipment such as a mascolloider in a short time. it can. Further, even when using a mass colloider, the processing speed can be greatly shortened, so that the manufacturing cost can be reduced.
上記セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、上記新規の糀菌を仕込み原料に含まれる穀物に接種することを含んでいてもよい。これにより、糖化工程中に別途添加すべき酵素剤の量を低減し、望ましくは別途添加を不要とし、製造コストを削減することができる。 The step of increasing the extracellular concentration of the serine protease may include inoculating the new gonococcus with the grains contained in the raw material. As a result, the amount of the enzyme agent to be added separately during the saccharification step can be reduced, desirably no additional addition is required, and the manufacturing cost can be reduced.
上記セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、セリンプロテアーゼを酵素剤として添加することを含んでいてもよい。これにより、より速く酵素反応が進行し、生産性を向上することができる。 The step of increasing the extracellular concentration of the serine protease may include adding serine protease as an enzyme agent. Thereby, an enzyme reaction advances more rapidly and productivity can be improved.
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、ニホンコウジカビ(Aspergillus oryzae)に属し、米糀において、セリンプロテアーゼを産生する糀菌である。本糀菌は、米糀において公知種では全く産生しないセリンプロテアーゼを産生する新規の糀菌であり、例えば、甘酒の製造過程において異物の生成を抑制でき、マスコロイダー等の特殊な機械的処理を不要とする点で有用性著しいものである。 Another aspect of the present invention made to achieve the above object is a koji mold which belongs to Aspergillus oryzae and produces a serine protease in rice bran. This koji mold is a novel koji mold that produces a serine protease that is not produced at all by any known species in rice koji. For example, it can suppress the production of foreign substances during the production of amazake, and can perform special mechanical treatment such as mass colloid. It is extremely useful in that it is unnecessary.
上記糀菌は、雰囲気温度30℃、湿度90%以上で2日間培養された米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定(30℃、pH6.0)において、酵素阻害剤による分別定量によって測定した酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性が20%以上200%以下であることが好ましい。 The above koji mold is fractionally quantified by enzyme inhibitors in protease activity measurement (30 ° C., pH 6.0) by the casein forin method of an aqueous extract of rice bran cultured at an ambient temperature of 30 ° C. and a humidity of 90% or more for 2 days. It is preferable that the relative activity of the serine protease with respect to the acidic protease measured by is from 20% to 200%.
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、Aspergillus oryzae BA−10230(NITE P−01871)又はAspergillus oryzae BA−11400(NITE P−01872)である。 Another aspect of the present invention made to achieve the above object is Aspergillus oryzae BA-10230 (NITE P-01871) or Aspergillus oryzae BA-11400 (NITE P-01872).
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、仕込み原料に含まれる酒粕の処理工程において、セリンプロテアーゼの濃度を増加させる操作を含む糀調味料・糀飲料の製造方法である。本製法により、仕込み原料として米糀を使用しない場合でも、微細な異物が少なく舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料等を短時間で簡便に得ることができる。 Another aspect of the present invention made to achieve the above object is a method for producing a koji seasoning and koji beverage, which includes an operation of increasing the concentration of serine protease in the process of processing sake lees contained in the raw materials. According to this production method, even when rice bran is not used as a raw material to be fed, it is possible to easily obtain a strawberry seasoning, a strawberry beverage, etc. with a small amount of fine foreign matter and a smooth touch in a short time.
上記目的を達成するためになされた本発明の他の側面は、米糀又は酒粕を仕込み原料として含む糀調味料・糀飲料の製造方法によって得られる糀もしくは糀調味料・糀飲料である。本構成により、舌触りが滑らかな糀調味料・糀飲料を得ることができる。 The other aspect of this invention made | formed in order to achieve the said objective is the koji or koji seasoning and koji drink obtained by the manufacturing method of koji seasoning and koji drink containing rice koji or sake koji as a raw material. With this configuration, it is possible to obtain a strawberry seasoning / beverage beverage with a smooth texture.
本発明の他の側面は、酵素活性を有する若しくは失活したセリンプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼの断片を含む糀調味料・糀飲料である。糀調味料・糀飲料内に含まれるセリンプロテアーゼが酵素活性を有するものであると、例えば、肉類、魚肉類を漬け込む用途には味、風味、旨味の浸透とともに肉質を短時間で顕著に軟らかくする効果をもたらす。一方、糀調味料・糀飲料内に含まれるセリンプロテアーゼが失活または分解したものであると、最終製品における酵素反応の進行が製品の劣化につながる用途について製品の保存性、品質保持性を向上できる。 Another aspect of the present invention is a strawberry seasoning / beverage beverage comprising a serine protease having an enzyme activity or inactivated, or a fragment of serine protease. If the serine protease contained in strawberry seasonings and strawberry beverages has an enzymatic activity, for example, for the purpose of immersing meat and fish meat, the meat quality will be significantly softened in a short time with the penetration of taste, flavor and umami Bring effect. On the other hand, if the serine protease contained in strawberry seasonings and strawberry beverages is inactivated or decomposed, the progress of the enzyme reaction in the final product will lead to deterioration of the product. it can.
本発明によれば、従来米糀による米の糖化工程において、糖化物中に生成していた微細な異物の生成を抑制し、舌触りのざらつきを改善した糀調味料・糀飲料が短期間で得られることから生産性を著しく向上することができる。 According to the present invention, in the conventional saccharification process of rice with rice bran, the production of fine foreign matter that has been generated in the saccharified product is suppressed, and a strawberry seasoning / beverage beverage with improved texture of the tongue is obtained in a short period of time. Therefore, productivity can be remarkably improved.
本発明の新規糀菌は、定法に従って、18SrDNAの塩基配列を決定し、既知の塩基配列と比較したところ、アスペルギルス・オリーゼ(Aspergillus oryzae)と99%以上の相同性を示すため、アスペルギルス・オリーゼ(Aspergillus oryzae)に分類される、米糀におけるセリンプロテアーゼ高生産株である。その取得方法としては、市販菌株及び分離菌株に対するスクリーニング、物理的な紫外線(UV)照射や化学的な変異剤の使用等の変異作出手段の作用が挙げられる。なかでも簡便性の観点から、市販菌株に対するスクリーニングやUV照射が好ましい。例えば、アスペルギルス・オリーゼの胞子にUV照射を施した後、プレート上で培養し、セリンプロテアーゼ生産能の向上した変異株を酵素分別定量によって選抜することによって本発明のセリンプロテアーゼ高生産A.オリーゼの変異株が得られる。 The novel koji mold of the present invention determined the base sequence of 18S rDNA according to a conventional method and compared it with a known base sequence. As a result, it showed 99% or more homology with Aspergillus oryzae, so that Aspergillus oryzae ( Aspergillus oryzae) is a serine protease high-producing strain in rice bran. Examples of the acquisition method include screening of commercially available strains and isolated strains, and the action of mutation creation means such as physical ultraviolet (UV) irradiation and use of chemical mutagens. Of these, from the viewpoint of simplicity, screening for commercially available strains and UV irradiation are preferred. For example, the Aspergillus oryzae spores are irradiated with UV, then cultured on a plate, and a mutant having improved serine protease production ability is selected by enzyme fractionation quantification. A mutant of Orise is obtained.
上記方法で新規に分離した糀菌の1株は、下記の遺伝子解析によってアスペルギルス・オリーゼに属することが判明したものであるが、セリンプロテアーゼ生産能が著しく高くなっていることから、その変異株と同定し、Aspergillus oryzae BA−10230と命名、表示し、特許微生物寄託センター(NPMD)にNITE P−01871、さらにもう1株は、Aspergillus oryzae BA−11400と命名、表示し、特許微生物寄託センター(NPMD)にNITE P−01872として寄託されている。 One strain of Neisseria gonorrhoeae newly isolated by the above method was found to belong to Aspergillus oryzae by the following genetic analysis. However, since the serine protease production ability is remarkably high, Identified, named and labeled Aspergillus oryzae BA-10230, named NITE P-01871 at the Patent Microorganism Depositary Center (NPMD), and another strain named and labeled Aspergillus oryzae BA-11400. ) Is deposited as NITE P-01872.
遺伝子解析の方法及び結果を以下に示す。
(1)染色体DNAの取得
サブロー培地(グルコース4.0%、ポリペプトン1.0%、pH5.6)100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、オートクレーブし、アスペルギルス・オリーゼBA−10230又はアスペルギルス・オリーゼBA−11400を植菌した。25℃で4日間振盪培養した後、No.2ろ紙でろ過して菌体を回収した。液体窒素で菌体を凍結し、乳鉢で微粉末になるまで粉砕し、DNA抽出用緩衝液(5.0%SDS、0.1M、NaCl、50mM Tris−HCl、pH8.0)15mlを加えゆっくり振盪して溶解した。遠心分離(5,000rpm、6min、rt.)により上清を得、フェノール/クロロホルム抽出を3回、エーテル抽出を2回行い、エーテルを蒸発させた後、3M酢酸ナトリウム1ml、エタノール25mlを加え、−30℃で30分放置した。遠心分離(12,000rpm、10min、4℃)により染色体DNAを回収し、70%エタノールにて洗浄した後、TE400μlに溶解した。次に、得られたDNA溶液にRNase10μl(0.132U)を加え、37℃で1時間RNase処理した後、プロテイナーゼKを5μl(0.6U)加え、50℃で1時間処理した。フェノール/クロロホルム抽出(2回)、クロロホルム/イソアミルアルコール抽出(1回)を行った後、エタノール沈殿にてDNAを回収した。70%エタノール溶液により洗浄した後、エタノールを除去し、TE200μlに溶解した。
(2)18SrDNA遺伝子断片の増幅
P1 5‘−ATCTGGTTGATCCTGCCAGT−3’(配列番号:1)
P2 5‘−AATGATCCTTCCGCAGGTTC−3’(配列番号:2)
前述の方法で得られた染色体DNA を鋳型DNA としてP1プライマーとP2プライマーの組み合わせでPCR反応を25サイクル行った。得られたDNA断片の塩基配列「配列番号:3」(配列番号:BA−10230の18SrDNA塩基配列)、及び「配列番号:4」(配列番号:BA−11400の18SrDNA塩基配列)を決定した。
「配列番号:3」、「配列番号:4」に示した塩基配列を既知の塩基配列データーベースと比較したところ、いずれもアスペルギルス・オリーゼの18SrDNA塩基配列と99%以上の相同性を示したため、本菌株をアスペルギルス・オリーゼと同定した。
The method and results of gene analysis are shown below.
(1) Acquisition of chromosomal DNA 100 ml of Sabouraud medium (glucose 4.0%, polypeptone 1.0%, pH 5.6) is placed in a 500 ml Sakaguchi flask, autoclaved, and Aspergillus oryzae BA-10230 or Aspergillus oryzae BA- 11400 was inoculated. After 4 days of shaking culture at 25 ° C., no. The cells were collected by filtration with 2 filter paper. Freeze the cells with liquid nitrogen, pulverize them to a fine powder in a mortar, slowly add 15 ml of DNA extraction buffer (5.0% SDS, 0.1 M, NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0). Dissolved by shaking. The supernatant was obtained by centrifugation (5,000 rpm, 6 min, rt.), Phenol / chloroform extraction was performed three times, ether extraction was performed twice, and the ether was evaporated. Then, 1 M of 3M sodium acetate and 25 ml of ethanol were added, It was left at -30 ° C for 30 minutes. Chromosomal DNA was recovered by centrifugation (12,000 rpm, 10 min, 4 ° C.), washed with 70% ethanol, and dissolved in 400 μl of TE. Next, 10 μl (0.132 U) of RNase was added to the obtained DNA solution, treated with RNase at 37 ° C. for 1 hour, then 5 μl (0.6 U) of proteinase K was added, and treated at 50 ° C. for 1 hour. After phenol / chloroform extraction (twice) and chloroform / isoamyl alcohol extraction (once), DNA was collected by ethanol precipitation. After washing with 70% ethanol solution, ethanol was removed and dissolved in 200 μl of TE.
(2) Amplification of 18S rDNA gene fragment P1 5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
P2 5'-AATGATCCCTCCGCAGGTTC-3 '(SEQ ID NO: 2)
Using the chromosomal DNA obtained by the above-described method as a template DNA, 25 cycles of PCR reaction were performed using a combination of P1 primer and P2 primer. The nucleotide sequence “SEQ ID NO: 3” (SEQ ID NO: BA-10230 18S rDNA base sequence) and “SEQ ID NO: 4” (SEQ ID NO: BA-11400 18S rDNA base sequence) of the obtained DNA fragment were determined.
When the base sequences shown in “SEQ ID NO: 3” and “SEQ ID NO: 4” were compared with a known base sequence database, both showed 99% or more homology with the 18S rDNA base sequence of Aspergillus oryzae. This strain was identified as Aspergillus oryzae.
本発明の新規糀菌は、雰囲気温度30℃、湿度90%以上の条件下で2日間培養された米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定(30℃、pH6.0)において、酵素阻害剤による分別定量によって測定した酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性が20%以上200%以下であるものが好ましい。活性のより好ましい下限は、35%、より好ましい上限は、180%以下、150%以下、又は、120%以下である。ここで活性とは、タンパク質分解酵素活性であり、30℃で1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として米糀1gあたりとして算出される数値である。 The novel koji mold of the present invention is a protease activity measurement by a casein forin method (30 ° C., pH 6.0) of an aqueous extract of rice koji cultured for 2 days under conditions of an atmospheric temperature of 30 ° C. and a humidity of 90% or more. It is preferable that the relative activity of serine protease with respect to acidic protease measured by fractional quantification with an enzyme inhibitor is 20% or more and 200% or less. The more preferable lower limit of the activity is 35%, and the more preferable upper limit is 180% or less, 150% or less, or 120% or less. Here, the activity is a proteolytic enzyme activity, which is a numerical value calculated per 1 g of rice bran, with the amount of enzyme that releases a non-protein substance equivalent to 1 μg of tyrosine per minute at 30 ° C. as one unit.
本発明の糀菌は、甘酒の他、清酒、焼酎、みりん、米味噌、塩糀等の酵母によるアルコール発酵を伴う又は伴わない糀飲料・糀調味料の製造用途に幅広く使用することができる。 The koji mold of the present invention can be widely used for producing koji beverages and koji seasonings with or without alcoholic fermentation by yeasts such as sake, shochu, mirin, rice miso, and salt koji, in addition to amazake.
以下、仕込み原料が米である場合の本発明の糀調味料・糀飲料の製造方法について説明するが、大麦、小麦、小豆、蕎麦、粟、稗、トウモロコシ等の他の穀物の場合も同様である。なお、本明細書において「仕込み原料」は、糀原料及び掛原料を含む概念である。 Hereinafter, the method for producing the koji seasoning and koji beverage of the present invention when the raw material is rice will be described, but the same applies to other grains such as barley, wheat, red beans, oats, koji, koji, and corn. is there. In the present specification, the “charged raw material” is a concept that includes a raw material for straw and a hanging raw material.
固体糀を使用する場合、仕込み原料に対して任意に施される前処理工程と、蒸米を得るための蒸し工程と、糖化工程とを含む。 In the case of using solid rice bran, it includes a pretreatment step optionally applied to the raw materials, a steaming step for obtaining steamed rice, and a saccharification step.
前処理工程には、米の焙炒工程、精白工程、浸漬工程等が含まれる。焙炒工程は、任意であるが、精白前又は精白後の穀物原料のいずれにおいて行ってもよい。精白工程において、精米歩合等は任意であるが、通常、40%〜90%の範囲とする。 The pretreatment process includes a rice roasting process, a whitening process, a dipping process, and the like. The roasting step is optional, but may be performed on any grain raw material before or after whitening. In the milling process, the milling rate is optional, but is usually in the range of 40% to 90%.
蒸し工程には、100℃以下での無圧蒸、100℃を越える温度での加圧蒸のいずれを採用することもできる。 For the steaming process, either non-pressure steaming at 100 ° C. or lower and pressurized steaming at a temperature exceeding 100 ° C. can be employed.
糖化工程は、蒸し工程で得られた蒸米に糀菌を接種して米糀を得る第1の段階と、米糀に対して掛原料及び/若しくは塩並びにお湯、焼酎若しくは醸造用アルコールを添加し所定時間、所定温度で維持する第2の段階とを含む。第2の段階において、アミラーゼ製剤を添加する場合もある。本明細書において、「糖化工程」とは、仕込み原料に含まれる穀物中の澱粉をブドウ糖まで分解する一連の工程を意味する。したがって、「糖化工程」は、澱粉をブドウ糖まで至らないまでもある程度小さく分解する意味で当業者に使用される「液化」を含む概念である。 The saccharification process is a first stage in which rice bran obtained in the steaming process is inoculated with koji mold to obtain rice koji, and kake raw materials and / or salt and hot water, shochu or alcohol for brewing are added to the rice koji. And a second stage maintained at a predetermined temperature for a predetermined time. In the second stage, an amylase preparation may be added. In the present specification, the “saccharification step” means a series of steps for decomposing starch in cereal grains contained in raw materials to glucose. Therefore, the “saccharification process” is a concept including “liquefaction” used by those skilled in the art in the sense of degrading starch to a certain extent even if it does not reach glucose.
第1の段階で使用する糀菌としては、従来公知の糀菌、本発明の上記糀菌、その他の変異、スクリーニング又は遺伝子組み換え技術により得られた糀菌のいずれであってもよいが、好ましくは、上述した新規糀菌を接種することでセリンプロテアーゼの分泌を増大させ、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含む。 The koji mold used in the first stage may be any of koji molds obtained by a conventionally known koji mold, the koji mold of the present invention, other mutations, screening, or genetic recombination techniques. Includes the step of increasing the secretion of serine protease and increasing the extracellular concentration of serine protease by inoculating the novel koji mold described above.
第2の段階で使用する掛米としては、一般の酒造米のほか、もち米、低グルテリン米を使用することもできる。精米歩合等は任意であるが、通常、40%〜90%の範囲である。予め蒸きょう法や焙炒法によって殺菌と澱粉成分の糊化をしておくことが好ましい。なお、所定温度は、通常50℃〜65℃、所定時間は、5時間以上で通常一晩放置とされるが特に限定されず、製品によっては室温で長期熟成(1ヶ月〜1年)される。第2の段階において、別途用意したα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、イソアミラーゼ、プルラナーゼからなる群より選択される1種又は2種以上のアミラーゼを補助的に添加してもよい。 As the rice used in the second stage, glutinous rice and low-glutelin rice can be used in addition to general brewed rice. Although the rice polishing rate is arbitrary, it is usually in the range of 40% to 90%. It is preferable to sterilize and gelatinize starch components in advance by a steaming method or roasting method. The predetermined temperature is usually 50 ° C. to 65 ° C., and the predetermined time is usually 5 hours or longer and is usually left overnight. However, depending on the product, it is aged for a long time (1 month to 1 year) at room temperature. . In the second stage, one or more amylases selected from the group consisting of α-amylase, glucoamylase, isoamylase, and pullulanase prepared separately may be supplementarily added.
第2の段階において、別途用意した市販のセリンプロテアーゼを添加し、セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップを含んでいてもよい。第2の段階で使用するセリンプロテアーゼとしては、特に限定されず、例えば、サブチリシン、サーミターゼ、プロテイナーゼK、ランチビオティックペプチダーゼケキシン等のサブチリシン様(subtilisin−like)セリンプロテアーゼ;トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、エラスターゼ等のキモトリプシン様(chymotrypsin−like)セリンプロテアーゼが挙げられる。これらのセリンプロテアーゼは、いかなる菌に由来するものであってもよい。 In the second stage, a commercially available serine protease prepared separately may be added to increase the extracellular concentration of serine protease. The serine protease used in the second step is not particularly limited. For example, subtilisin-like serine proteases such as subtilisin, thermitase, proteinase K, lantibiotic peptidase kexin; trypsin, chymotrypsin, thrombin, elastase And chymotrypsin-like serine proteases. These serine proteases may be derived from any bacteria.
第1の段階及び第2の段階においてセリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させるステップは、択一的ではなく、併用することも許容される。また、本明細書において、「セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加」することには、菌体外においてセリンプロテアーゼが予め所定量存在する状態からセリンプロテアーゼを有意量増加させることのみならず、セリンプロテアーゼが実質的に存在しない濃度ゼロの状態からセリンプロテアーゼを増加させることも含まれる。 The step of increasing the extracellular concentration of serine protease in the first stage and the second stage is not an alternative and can be used in combination. Further, in the present specification, “increasing the extracellular concentration of serine protease” includes not only increasing the amount of serine protease from a state in which a predetermined amount of serine protease exists in advance outside the bacterial cell, but also serine protease. Increasing the serine protease from a zero concentration state in which the protease is substantially absent is also included.
セリンプロテアーゼの菌体外濃度を増加させる他の手法としては、第1の段階又は第2の段階において、またはその後工程として、菌体を破砕することによって菌体内に蓄積されたセリンプロテアーゼを菌体外に放出することを含んでいてもよい。 As another method for increasing the extracellular concentration of serine protease, in the first stage, the second stage, or as a subsequent process, serine protease accumulated in the bacterial body by crushing the bacterial body is used. It may include releasing to the outside.
上記糖化工程により得られた物に含まれる酵素は、適宜加熱処理や失活物質の添加によって失活させることができる。セリンプロテアーゼを添加した場合は、基本的に加熱により失活させるが、活性を維持することを排除するものではない。上記新規糀菌により生産されたセリンプロテアーゼを含むプロテアーゼ群は、製品用途に応じて、活性を維持する選択肢と、失活させる選択肢とがある。例えば、製品が甘酒である場合は、その特性上失活させることが好ましい。一方、製品が塩糀や米みそである場合は、失活させてもよいし、肉類、ハム類、魚肉類等を漬け込んだときに味、風味、旨味の浸透とともに酵素が肉質を軟らかくすることに寄与しうる点で、最終製品に酵素を残すという選択肢も十分考えられる。 The enzyme contained in the product obtained by the saccharification step can be inactivated by appropriate heat treatment or addition of a deactivating substance. When serine protease is added, it is basically inactivated by heating, but it does not exclude maintaining the activity. The protease group containing serine protease produced by the novel koji mold has an option of maintaining activity and an option of deactivating depending on the product application. For example, when the product is amazake, it is preferably deactivated due to its characteristics. On the other hand, if the product is salted salmon or rice miso, it may be deactivated, and when meat, ham, fish meat, etc. are soaked, the enzyme will soften the meat quality along with the penetration of taste, flavor and umami The option of leaving the enzyme in the final product is also conceivable.
以上では、仕込み原料として米(米糀)を使用する場合について説明したが、仕込み原料として米(米糀)を使用しない場合、例えば、酒粕を使用する場合でもセリンプロテアーゼの濃度を増加させ、その活性の至適pH、至適温度に調整することによって、同様の効果を得ることができる。但し、マスコロイダー等の機械的処理を併用することが好ましい。 In the above, the case where rice (rice bran) is used as the feed material has been described. However, when rice (rice bran) is not used as the feed material, for example, the concentration of serine protease is increased even when using sake lees. The same effect can be obtained by adjusting the optimum pH and temperature of activity. However, it is preferable to use a mechanical treatment such as a mass collider.
本発明の製造方法により得られた糀調味料、糀飲料の製品形態としては特に限定されず、例えば、凍結乾燥品、ペースト、スラリー、顆粒、粉末、液体等様々な形態をとり得、これらの製品形態とするために、従来公知の加工法を採用しうる。 The product form of the koji seasoning and koji drink obtained by the production method of the present invention is not particularly limited. For example, it can take various forms such as freeze-dried products, pastes, slurries, granules, powders, liquids, etc. In order to obtain a product form, a conventionally known processing method can be employed.
セリンプロテアーゼ活性を有する糀調味料・糀飲料もまた、本発明の一側面である。セリンプロテアーゼとしては、上述した製造方法において添加したセリンプロテアーゼやスクリーニング株由来又は変異株由来のセリンプロテアーゼと同一である必要はなく、例えば、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、プラスミン、Streptomyces属由来アルカリプロテアーゼ、Aspergillus属由来アルカリプロテアーゼ、Bacillus subtilis属由来アルカリプロテアーゼ等のいずれであってもよい。 A strawberry seasoning and strawberry beverage having serine protease activity is also one aspect of the present invention. The serine protease is not necessarily the same as the serine protease added in the above-described production method or the serine protease derived from the screening strain or the mutant strain. For example, trypsin, chymotrypsin, thrombin, plasmin, Streptomyces genus alkaline protease, Aspergillus Any of alkaline genus derived from the genus, alkaline protease derived from the genus Bacillus subtilis may be used.
上記酵素活性を有するセリンプロテアーゼ又はセリンプロテアーゼの断片は、少なくとも外部から添加したか又は菌株が産生したことが判別できる程度に有意量含まれていることが好ましく、雰囲気温度30℃、湿度90%以上の条件下で2日間培養された米糀の水抽出液のカゼインフォーリン法によるプロテアーゼ活性測定(30℃、pH6.0)において、酵素阻害剤による分別定量によって測定したセリンプロテアーゼ活性で、1U/g以上含まれていることが好ましい。製品中に残存するセリンプロテアーゼまたはその断片の分離検出方法としては特に限定されないが、例えば、酵素活性、又は、ウエスタンブロッティング法等を採用することができる。 The serine protease or serine protease fragment having the enzyme activity is preferably contained in a significant amount at least so that it can be determined that it has been added from the outside or produced by the strain, and the atmospheric temperature is 30 ° C. and the humidity is 90% or more. 1 U / g of serine protease activity measured by fractional quantification using an enzyme inhibitor in the protease activity measurement (30 ° C., pH 6.0) of the aqueous extract of rice bran cultured under the above conditions for 2 days by the casein forin method It is preferable that it is contained above. A method for separating and detecting serine protease remaining in the product or a fragment thereof is not particularly limited, and for example, an enzyme activity or a Western blotting method can be employed.
本発明の糀調味料・糀飲料には、甘酒の他、清酒、塩糀、みりん、みりん風調味料、米味噌等の米由来の糀調味料・糀飲料が含まれる。 The koji seasoning and koji beverage of the present invention includes rice-derived koji seasoning and koji beverages such as sake, salt koji, mirin, mirin-like seasoning, rice miso, etc. in addition to amazake.
(セリンプロテアーゼ高産生株のスクリーニングによる選抜)
市販種糀及びイチビキ分離株(土壌、米等自然界より分離)約200株をPDA平板培地に塗沫し、生育した糀菌を90%精米の米を用いた固体培養(30〜35℃で2日間)に供した。得られた米糀10gを水50mlで室温3時間抽出濾過後、その上清0.4ml相当を酵素阻害剤による分別定量法に供し、セリンプロテアーゼ高産生株を選択した。
(Selection by screening of high serine protease producing strain)
About 200 strains of commercially available seed koji and Ichibiki isolates (isolated from nature such as soil and rice) were smeared on a PDA plate medium, and the grown koji molds were solid-cultured using 90% polished rice (2 at 30 to 35 ° C). Day). 10 g of the resulting rice bran was extracted and filtered with 50 ml of water at room temperature for 3 hours, and then 0.4 ml of the supernatant was subjected to a fractional quantification method using an enzyme inhibitor to select a serine protease high-producing strain.
(セリンプロテアーゼ高産生変異株の作出)
上記スクリーニングで得られたセリンプロテアーゼ高生産株の胞子懸濁液を調製し、常法に従ってUV照射(15W殺菌灯下、7分、致死率95%)を行い、変異を誘発させた。UV処理した胞子懸濁液をPDA平板培地に塗沫し、生育した候補株をPDA斜面培地に釣菌して30℃、3日間培養した。得られた変異株を90%精米の米を用いた固体培養(30〜35℃で2日間)に供した。得られた米糀10gを水50mlで室温3時間抽出濾過後、その上清0.4ml相当を酵素阻害剤による分別定量法に供し、セリンプロテアーゼ高産生変異株を選択した。
(Creation of a serine protease high-producing mutant)
A spore suspension of the serine protease high-producing strain obtained by the above screening was prepared, and UV irradiation (15 W germicidal lamp, 7 minutes, lethality 95%) was performed according to a conventional method to induce mutation. The UV-treated spore suspension was smeared on a PDA plate medium, and the grown candidate strains were fished on a PDA slant medium and cultured at 30 ° C. for 3 days. The obtained mutant strain was subjected to solid culture (2 days at 30 to 35 ° C.) using 90% polished rice. 10 g of the resulting rice bran was extracted and filtered with 50 ml of water at room temperature for 3 hours, and then 0.4 ml of the supernatant was subjected to a fractional quantification method using an enzyme inhibitor to select a serine protease high-producing mutant.
(酵素分別法による各酵素活性の測定と相対活性の計算)
以上のスクリーニングまたは突然変異法により得られたセリンプロテアーゼ高産生株の米糀における酵素活性の評価は以下の手順で行った。
上記で得られた粗酵素液0.4mlに対して、各種阻害剤溶液0.1mlを終濃度0.1mMになるように加え、室温で10分間放置した。10分後、予め、30℃に保温しておいたpH6.0に調整した2%ミルクカゼイン溶液1.0mlを加え、30℃で20分反応させた。0.4Mトリクロロ酢酸溶液2.5mlを加えて反応を停止させ、室温で10分間放置した。10分後、No.6ろ紙でろ過してろ液を得、ろ液0.5mlに対して0.4M炭酸ナトリウム溶液2.5mlとFolin試薬(1N)0.5mlを加えてよく混和し、室温で10分間放置した後、マイクロプレートリーダー(テカン社製サンライズレインボー)を用いて660nmの吸光度を測定した。
(Measurement of enzyme activity and calculation of relative activity by enzyme fractionation method)
Evaluation of the enzyme activity in rice bran of the serine protease high-producing strain obtained by the above screening or mutation method was performed according to the following procedure.
To 0.4 ml of the crude enzyme solution obtained above, 0.1 ml of various inhibitor solutions were added to a final concentration of 0.1 mM and left at room temperature for 10 minutes. Ten minutes later, 1.0 ml of a 2% milk casein solution adjusted to pH 6.0, which had been kept at 30 ° C., was added and reacted at 30 ° C. for 20 minutes. The reaction was stopped by adding 2.5 ml of 0.4 M trichloroacetic acid solution and left at room temperature for 10 minutes. After 10 minutes, no. Filter through 6 filter paper to obtain a filtrate. Add 0.5 ml of 0.4M sodium carbonate solution and 0.5 ml of Folin reagent (1N) to 0.5 ml of the filtrate, mix well, and let stand at room temperature for 10 minutes. The absorbance at 660 nm was measured using a microplate reader (Sunrise Rainbow manufactured by Tecan).
本条件での各種プロテアーゼ活性は、下記のように定義した。
(1)総プロテアーゼ活性:阻害剤溶液に水を用い、上記操作を行い、1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として評価した。
(2)酸性プロテアーゼ活性:阻害剤溶液にペプスタチンAを用い、上記操作を行い、総プロテアーゼ活性と比較して、ペプスタチンAにより阻害を受けるたんぱく質分解活性を1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として評価した。
(3)セリンプロテアーゼ活性:阻害剤溶液にフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)を用い、上記操作を行い、総プロテアーゼ活性と比較して、PMSFにより阻害を受けるたんぱく質分解活性を1分間にチロシン1μgに相当する非タンパク性物質を遊離させる酵素量を1単位として評価した。
(4)セリンプロテアーゼ活性の酸性プロテアーゼ活性に対する相対活性は、上記セリンプロテアーゼ活性÷酸性プロテアーゼ活性×100(%)で算出した。
Various protease activities under these conditions were defined as follows.
(1) Total protease activity: The above procedure was performed using water as an inhibitor solution, and the amount of enzyme that liberates non-proteinaceous substances corresponding to 1 μg of tyrosine per minute was evaluated as 1 unit.
(2) Acid protease activity: Pepstatin A is used as an inhibitor solution, and the above procedure is performed. Compared with the total protease activity, the proteolytic activity inhibited by pepstatin A is non-protein equivalent to 1 μg of tyrosine per minute. The amount of enzyme liberating the substance was evaluated as 1 unit.
(3) Serine protease activity: Using phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) as an inhibitor solution, the above operation is performed, and the proteolytic activity inhibited by PMSF is reduced to 1 μg of tyrosine per minute compared to the total protease activity. The amount of enzyme that liberates the corresponding non-proteinaceous substance was evaluated as 1 unit.
(4) The relative activity of serine protease activity to acidic protease activity was calculated by the above serine protease activity / acidic protease activity × 100 (%).
(実施例1:甘酒の製造)
精米歩合90%で精米することにより得られた精白米を常法に従って、洗米し、水に20時間浸漬し、1時間水切りした後、30分間無圧蒸によって蒸煮した。得られた蒸米200gに予め用意しておいた市販の種糀を接種し、雰囲気温度30℃、湿度90%以上の条件下で2日間培養し、得られた米糀150gに上記と同様に蒸煮した掛米410g、お湯320g、アミラーゼ製剤0.5g、市販のセリンプロテアーゼ(商品名:オリエンターゼ22BF、HBI社製)0.4gを添加して50〜60℃で一晩糖化させた。得られた糖化物をみそスリ機(スクリュー押出式、通し孔径0.4mm)にかけ、その後85℃で加熱処理を施すことで甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。
(Example 1: Production of amazake)
The polished rice obtained by milling at 90% of the polished rice ratio was washed according to a conventional method, immersed in water for 20 hours, drained for 1 hour, and then steamed by pressureless steaming for 30 minutes. 200 g of the obtained steamed rice is inoculated with a commercially available seed meal prepared in advance, and cultured for 2 days under conditions of an atmospheric temperature of 30 ° C. and a humidity of 90% or more. 410 g of cooked rice, 320 g of hot water, 0.5 g of amylase preparation, and 0.4 g of commercially available serine protease (trade name: Orientase 22BF, manufactured by HBI) were added and saccharified overnight at 50-60 ° C. The obtained saccharified product was subjected to a miso-sleeving machine (screw extrusion type, through-hole diameter 0.4 mm), and then heat-treated at 85 ° C. to obtain a sweet sake paste. When the resulting amazake paste was dissolved in water and eaten, there was no rough texture.
(実施例2:甘酒の製造)
予め製造しておいたアスペルギルス・オリーゼ変異株BA−10230(NITE P−01871)を含む種糀を接種したほかは実施例1と同様の手順で甘酒ペーストを得た。得られた米糀の酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性は55.1%であり、得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。同様に、アスペルギルス・オリーゼ変異株BA−11400(NITE P−01872)を含む種糀を接種した他は実施例1と同様の手順で甘酒ペーストを得た。得られた米糀の酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性は54.8%であり、得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。
(Example 2: Production of amazake)
Amazake paste was obtained in the same manner as in Example 1 except that seed pods containing Aspergillus oryzae mutant BA-10230 (NITE P-01871) prepared in advance were inoculated. The relative activity of serine protease with respect to the acidic protease of the obtained rice bran was 55.1%, and when the obtained amazake paste was dissolved in water and eaten, there was no rough texture. Similarly, amazake paste was obtained in the same procedure as in Example 1 except that seed pods containing Aspergillus oryzae mutant BA-11400 (NITE P-01872) were inoculated. The relative activity of serine protease with respect to the acidic protease of the obtained rice bran was 54.8%. When the obtained amazake paste was dissolved in water and eaten, there was no roughness of the touch.
(参考例:甘酒の製造)
上記実施例1で得られた米糀をさらに培養を継続し、4日間培養した。その結果得られた米糀は緑色の胞子が着生し、甘酒としての商品価値はなくなってしまったが、その酸性プロテアーゼとセリンプロテアーゼの相対活性はBA−10230で195%、BA−11400で186%とセリンプロテアーゼの相対活性が大幅に増大した。得られた米糀を使用して作成した甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、舌触りのざらつきはなかった。上記麹菌変異株にさらに変異を導入し、胞子着生し難くする、胞子の色を白色化する、又は、生育速度を早くすることで、相対活性にして200%近い変異株を実用に供し得ることが示唆された。
(Reference example: Amazake production)
The rice bran obtained in Example 1 was further cultured and cultured for 4 days. As a result, the rice bran obtained had green spores and its commercial value as amazake was lost. However, the relative activity of acid protease and serine protease was 195% for BA-10230 and 186 for BA-11400. % And the relative activity of serine proteases was greatly increased. When the amazake paste prepared using the obtained rice bran was dissolved in water and eaten, there was no rough texture. By further introducing a mutation into the gonococcal mutant strain to make it difficult for spore to grow, whitening the color of the spore, or increasing the growth rate, a mutant strain having a relative activity of nearly 200% can be put to practical use. It has been suggested.
(比較例1:甘酒の製造)
市販のセリンプロテアーゼに代えて酸性プロテアーゼ(商品名:オリエンターゼAY、HBI社製)を添加したほかは実施例1と同様にして甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、依然として舌触りのざらつきが感じられ、異物の存在が確認された。
(Comparative Example 1: Production of amazake)
Amazake paste was obtained in the same manner as in Example 1 except that acidic protease (trade name: Orientase AY, manufactured by HBI) was added instead of the commercially available serine protease. When the resulting amazake paste was dissolved in water and eaten, a rough texture was still felt and the presence of foreign matter was confirmed.
(比較例2:甘酒の製造)
市販のセリンプロテアーゼに代えてメタルプロテアーゼ(商品名:ヌクレイシン、HBI社製)を添加したほかは実施例1と同様にして甘酒ペーストを得た。得られた甘酒ペーストを水に溶かして飲食したところ、依然として舌触りのざらつきが感じられ、異物の存在が確認された。
(Comparative Example 2: Production of amazake)
An amazake paste was obtained in the same manner as in Example 1 except that metal protease (trade name: Nuclidein, manufactured by HBI) was added instead of the commercially available serine protease. When the resulting amazake paste was dissolved in water and eaten, a rough texture was still felt and the presence of foreign matter was confirmed.
(比較例3:甘酒の製造)
市販のセリンプロテアーゼを加えなかったほかは実施例1と同様にして甘酒を得た。得られた甘酒をマスコロイダー(機種:スーパーマスコロイダーMKCA6−2Jα、砥石:MK E)(クリアランス:軽接より−100μm、回転砥石の回転速度:1,800rpm)で破砕処理した。この手法によって70メッシュでもメッシュ上に残らない甘酒ペーストを得るための破砕処理速度は、118kg/hであり、実施例1の手法で同水準のものを生産するための処理速度は296kg/hであり、本発明を用いることで摩砕処理速度は、およそ3倍に向上した。
(Comparative Example 3: Production of amazake)
Amazake was obtained in the same manner as in Example 1 except that no commercially available serine protease was added. The obtained amazake was crushed with a mass colloid (model: super mass colloid MKCA6-2Jα, grinding wheel: MKE) (clearance: -100 μm from light contact, rotational speed of rotating grindstone: 1,800 rpm). By this method, the crushing processing speed for obtaining amazake paste that does not remain on the mesh even at 70 mesh is 118 kg / h, and the processing speed for producing the same level by the method of Example 1 is 296 kg / h. Yes, by using the present invention, the milling speed was improved approximately 3 times.
(実施例3:塩糀の製造手順)
精米歩合90%で精米することにより得られた精白米を常法に従って、洗米し、水に20時間浸漬し、1時間水切りした後、30分間無圧蒸によって蒸煮した。得られた蒸米4kgに予め用意しておいたアスペルギルス・オリーゼ変異株BA−10230(NITE P−01871)又はアスペルギルス・オリーゼ変異株BA−11400(NITE P−01872)を含む種糀をそれぞれ接種し、雰囲気温度30℃、湿度90%以上の条件下で2日間培養し、得られた米糀450gに、お湯550gと食塩111gを添加して30℃で1週間熟成させた。得られた塩糀は、色、味、香りとも通常の塩糀と遜色なかった。得られた塩糀中のプロテアーゼ活性を分別定量したところ、酸性プロテアーゼに対するセリンプロテアーゼの相対活性はそれぞれ54.1%、50.2%であった。
比較として、市販の塩糀(H社製、M社製)を同様に測定したが、セリンプロテアーゼ活性は認められなかった(相対活性10%未満)。
(Example 3: Production procedure of salted salmon)
The polished rice obtained by milling at 90% of the polished rice ratio was washed according to a conventional method, immersed in water for 20 hours, drained for 1 hour, and then steamed by pressureless steaming for 30 minutes. 4 kg of the obtained steamed rice was inoculated with a seed meal containing Aspergillus oryzae mutant BA-10230 (NITE P-01871) or Aspergillus oryzae mutant BA-11400 (NITE P-01872) prepared in advance, Culturing was performed for 2 days under the conditions of an atmospheric temperature of 30 ° C. and a humidity of 90% or more, and 550 g of hot water and 111 g of sodium chloride were added to 450 g of the obtained rice bran and aged at 30 ° C. for 1 week. The obtained salted salmon was not inferior to ordinary salted salmon in color, taste and aroma. When the protease activity in the salted salmon obtained was separately quantified, the relative activity of serine protease with respect to acidic protease was 54.1% and 50.2%, respectively.
As a comparison, commercially available salt koji (manufactured by H company, manufactured by M company) was measured in the same manner, but serine protease activity was not observed (relative activity of less than 10%).
(実施例4:ハムの分解実験手順)
結着材にでんぷんを使用しないスライスハム(伊藤ハム社製)4つ切りにし、5枚1組(25g)として、これに実施例3で得た塩糀5gを加えて5℃で2日間漬け込んだ。比較として市販の塩糀(H社製、M社製)を用いて、同様にスライスハムの漬け込みを行った。
その結果、写真に示すように、実施例3で得たセリンプロテアーゼを含む塩糀で漬け込んだスライスハムはボロボロになるまで分解されていたが、酸性プロテアーゼ活性は同程度のH社製の塩糀も酸性プロテアーゼが半量程度のM社製塩糀のいずれも、スライスハムの顕著な分解は起こらなかった。
(Example 4: Ham experimental procedure)
Cut 4 slices of ham (made by Itoham Co.) without using starch as a binder, add 5 g of salt candy from Example 3 to this, and immerse it at 5 ° C for 2 days. It is. As a comparison, sliced ham was soaked in the same manner using commercially available salted salmon (manufactured by Company H, Company M).
As a result, as shown in the photograph, the sliced ham soaked in the salt koji containing the serine protease obtained in Example 3 was decomposed until it became tattered, but the acidic protease activity was the same level. In addition, none of the salt candy produced by Company M, which had about half the amount of acidic protease, caused significant degradation of sliced ham.
(実施例5:豚ロース肉の漬け込み実験)
厚さ1cmにカットした豚ロース肉(約100g)に対して実施例3で得られた塩糀又は市販の塩糀20gを袋に入れ、よく混ぜて肉と馴染ませた後、密封して5℃で3時間漬け込みを行った。3時間後、布巾で豚肉をはさんで軽く押して水気と塩糀を軽く拭い取った。その後、肉を袋に入れ替え、密封後、75℃の水槽中で30分間加熱した。加熱したロース肉を巾1.5cmにカットし、柔らかさを比較した。その結果、下記の通り、実施例3で得られた塩糀で漬けた豚ロース肉は明らかに市販の塩糀で漬けたものよりも柔らかいと評価された。やわらかさの評価は、すべての試料を盲検化した後、パネラー10名による官能評価により行い、柔らかさの基準を7段階で評価し、各パネラーの点数の平均値で比較した。なお、評価点数は7点に近いほど、柔らかいことを示す。
(Example 5: Experiment of immersing pork loin)
Put pork loin (about 100 g) cut to a thickness of 1 cm into the bag with 20 g of salted salmon obtained in Example 3 or commercially available salted salmon and mix well with the meat. Dipping was carried out at 3 ° C. for 3 hours. After 3 hours, the pork was lightly wiped with a cloth to wipe off moisture and salt. Thereafter, the meat was replaced with a bag, and after sealing, it was heated in a 75 ° C. water bath for 30 minutes. The heated loin meat was cut into a width of 1.5 cm, and the softness was compared. As a result, as described below, the pork loin soaked in salted salmon obtained in Example 3 was clearly evaluated to be softer than that soaked in commercially available salted salmon. The softness was evaluated by blinding all samples and then by sensory evaluation by 10 panelists. The softness criteria were evaluated in 7 stages, and the average score of each panel was compared. Note that the closer the score is to 7, the softer the score.
以上、本発明の実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限られるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲内においてさらに種々の形態で実施することができる。 As mentioned above, although the Example of this invention was described, this invention is not restricted to these Examples, In the range which does not deviate from the summary, it can implement with a various form further.
本発明は、糀調味料・糀飲料の製造やこれらを用いた肉、魚肉、野菜等の漬け製品の製造等に特に好適に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be particularly suitably used for the production of koji seasonings and koji beverages and the production of pickled products such as meat, fish meat and vegetables using these.
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