JP6434736B2 - Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットを認識するモノクローナル抗体及びその利用 - Google Patents
Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットを認識するモノクローナル抗体及びその利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6434736B2 JP6434736B2 JP2014153743A JP2014153743A JP6434736B2 JP 6434736 B2 JP6434736 B2 JP 6434736B2 JP 2014153743 A JP2014153743 A JP 2014153743A JP 2014153743 A JP2014153743 A JP 2014153743A JP 6434736 B2 JP6434736 B2 JP 6434736B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- glua1
- ampa
- function
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
上記のANQXはin vitroで動作することは報告されたが、in vivoで機能することは報告されていない。またGluA1受容体に対する特異性はなく、他のAMPA受容体にも結合すると考えられる。GluA1を含まないAMPA受容体は恒常的にシナプス移行していることが知られており、ANQXは学習記憶に依存しない受容体機能も破壊する可能性が高く、記憶の特異的消去や記憶情報の解析には不向きであった。
(1) GluA1の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体であって、光照射分子不活性化(CALI)により光照射特異的にAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊できるモノクローナル抗体又は前記機能を有するその断片。
(2) GluA1の細胞外ドメインが、GluA1の236-286アミノ酸領域(配列番号2)である、(1)に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(3) 照射分子不活性化(CALI)により、光照射特異的に、GluA1/GluA1であるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊できるが、GluA1/GluA2およびGluA2/GluA3の機能は抑制又は破壊しない、(1)又は(2)に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(4) 光照射分子不活性化(CALI)によりNMDA受容体の機能は抑制又は破壊しない、(1)から(3)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(5) GluA1の活性を中和しない、(1)から(4)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(6) 前記モノクローナル抗体が、受領番号NITE AP−01879(受託番号NITE P−01879)を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、(1)から(5)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(7) 光増感物質で標識されている、(1)から(6)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片。
(8) 受領番号NITE AP−01879(受託番号NITE P−01879)を有するハイブリドーマ。
(9) (1)から(7)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む、AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊するための試薬。
(10) 光増感物質で標識されている(1)から(6)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を、AMPA型グルタミン酸受容体を発現している細胞にインビトロで接触し、光照射する工程を含む、AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊する方法。
(11) 光増感物質で標識されている(1)から(6)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射する工程を含む、前記非ヒト哺乳動物におけるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊する方法。
(12) AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊することにより、前記非ヒト哺乳動物における記憶が消去される、(11)に記載の方法。
(13) 光増感物質で標識されている(1)から(6)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射する工程を含む、前記非ヒト哺乳動物における記憶を消去する方法。
(14) 光増感物質で標識されている(1)から(6)の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射する工程を含む、前記非ヒト哺乳動物におけるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を解析する方法。
(1)本発明のモノクローナル抗体
本発明においては先ず、ラットGluA1(配列番号1)の細胞外ドメインである236-286アミノ酸領域(配列番号2)に対するモノクローナル抗体を取得した。ウエスタンブロットで特異性が確認できた抗体のうち5種類に関して抗体をエオシンで標識し、CHO細胞に発現したGluA1をCALIできるかスクリーニングした。その結果、GluA1をCALI により機能破壊できる抗体として、Z9139抗体が同定された。さらにこのZ9139抗体を添加しても中和活性は示さないことも確認した。また、培養した海馬ニューロンのシナプスにおいてCALIの特異性を調べたところ、NMDA受容体を壊さずAMPA受容体を特異的に機能破壊できることが分かった。最後にin vitroで機能が明らかになったZ9139抗体について、in vivo CALIによる海馬依存的記憶の消去を試みたところ、光照射依存的に記憶の消去ができることがわかった。本発明によるin vivo CALIによる記憶消去技術は、学習記憶と神経活動間における因果関係の詳細なマッピングが初めて可能にするものである。
本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、光照射分子不活性化(CALI)においてAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊するための試薬として使用することができる。
さらに本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、GluA1の活性を中和しないものが好ましい。
本発明によれば、光増感物質で標識されている本発明のモノクローナル抗体又はその断片を、AMPA型グルタミン酸受容体を発現している細胞にインビトロで接触し、光照射することによって、AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊することができる。同様に、光増感物質で標識されている本発明のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射することによって、前記非ヒト哺乳動物におけるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊することができる。上記のように、AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊することにより、前記非ヒト哺乳動物における記憶を消去することができる。即ち、非ヒト哺乳動物における記憶を消去する方法も本発明の範囲内である。
GluA1のN末端領域(236-286アミノ酸残基)のcDNA GFP-GluA1/pHSV プラスミドをテンプレートとし、プライマーとして下記の2種類のオリゴDNAを用いてPCR法により増幅し、gp64遺伝子と連結させた。
5'- CCTGCAGATGGACATTGACTTAAAT -3(配列番号3)
5'-CCCCGGGGTGGCCTCTTCCAGTCCAC-3'(配列番号4)
GluA1遺伝子が導入された組換え発芽型バキュロウイルスの調製は、既報(1,2)の記述に従った。簡潔に述べると、組換えウイルスをSf9細胞に感染させ、72時間後に培養上清画分を40,000×g、40分遠心して、沈澱画分に発芽型ウイルス(GluA1 BV)を回収し、免疫原として使用した。
GluA1BV 60 μgにアジュバントとして0.1 μgの百日咳毒素(フナコシ社製)を混合し、BALB/cマウス(日本クレア社製)の腹腔内に投与、免疫した。追加免疫はアジュバントを含まない60 μgの GluA1BVを2週間間隔で2回投与した。最終免疫から3日後に脾細胞を採取し、ポリエチレングリコール(ロッシュ社製)を用いた標準的な方法(3)に従いマウスミエローマ細胞NS-1(大日本ファーマ社製)と細胞融合した。融合細胞はHAT選択培地(0.1 mM hypoxanthine, 0.1 mM aminopterine, and 0.16 mM thymidine)で7日間培養した。細胞融合から8日後、ハイブリドーマの培養上清を回収し、GluA1BVに対するELISAとウェスタンブロッティングにより抗体産生陽性のウェルを選別した。 抗原発現BVを用いたELISAおよびウエスタンブロットは(1,2)の記述に従った。陽性ウェルの細胞について限界希釈法でクローニングを行い、抗GluA1モノクローナル抗体産生ハイブリドーマクローンとして樹立した。ハイブリドーマ細胞をBALB/cマウス(日本クレア社製)に接種し腹水を調製し、50%硫酸アンモニウム塩析精製を2回行ない、150mM NaClに透析して抗体蛋白質を調製した。
ポリスチレン製ELISAプレート(Greiner社製)に、GluA1 BVをウイルス総蛋白量として0.5μg/ウェル固相化した。40%ブロックエース(大日本ファーマ社製)/TBSでブロッキング後、0.05% Tween 20を添加した150mM NaCl(以下洗浄液)で洗浄した。ここに1次抗体としてハイブリドーマ培養上清および精製抗体を1次抗体希釈液で希釈調製して添加し、室温で1時間振とう反応させた。洗浄液で洗浄後、2次抗体としてHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社製)を添加して、室温で1時間振とう反応を行なった。洗浄液で洗浄後2次抗体としてHRP-標識ヤギ抗マウスIgG抗体の30,000倍希釈液を室温で1時間浸とう反応させた。洗浄液で洗浄後、TMB Soluble Reagent (ScyTek Laboratories社製)を添加して暗所で室温30分間呈色反応を行い、TMB Stop buffer(ScyTek Laboratories社製)を添加して反応停止後、マイクロプレートリーダー(Biotrak II, GEヘルスケア社製)により450nmの吸光度(以下A450)を測定した。陰性コントロール用として、Wild BV(GluA1の発現なし)を0.5μg/ウェル固相化したプレートを用いて、同様のアッセイを行なった。GluA1 BV固相とWild BV固相の両系の感度をモニターするために、gp64蛋白質特異的抗体K7124(自家調製, 参考文献1)1μg/mLを1次抗体として使用した。陰性コントロールIgG (クローン3423)は特殊免疫研究所(Tokyo, Japan)より購入した。
BVを総蛋白量で200μg/mLとなるようにPBSで調製し、3%SDSと3% 2MEを含むSDS-ポリアクリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)用サンプル緩衝液で2倍希釈し、10%分離ゲルに3μL/laneアプライしてSDS-PAGEにより分離した。その後、ニトロセルロース膜(GEヘルスケア社製)へ転写し、転写膜への非特異結合をブロックエース(大日本ファーマ社製)でブロッキングし一次抗体およびハイブリドーマの培養上清を反応させた。TBS-T (0.05% Tween20/10 mM トリス緩衝液生理食塩水) で洗浄後、転写膜を1万倍希釈したhorseradish peroxidase (HRP)-conjugatedヤギ抗マウス抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories社製) で反応させ、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo社製) を用いて検出した。gp64融合タンパク質の検出には、野生型バキュロウイルスを免疫し我々が作製したgp64タンパク質特異的抗体K7124(1) を用いた。コントロールIgG (3423, 2AHB12) は特殊免疫研究所(Tokyo, Japan)より購入した。
取得した抗GluA1抗体のうち、ウエスタンブロットで特異性が認められた中から5種類の抗体のハイブリドーマ培養上精に関し、エオシンイソチオシアネート(Molecular Probe製)にてラベル化を行い、CALI活性があるかを解析した。GFP-GluA1を発現したCHO細胞に本ラベル化抗体を抗体濃度10ug/mlで2hr反応させ、HBSSにて3回洗浄後、HBSS溶液(含100uM シクロチアザイド)中においてホールセルパッチクランプ法にてAMPA電流の計測を行った。ここではAMPA電流を発生させるために、10mM グルタミン酸(含100uM シクロチアザイド)を細胞に反応させた。CALIは60倍対物レンズとフィルターセット(励起フィルター535/22-25(semrock製)、555DRLP(OMEGA製)、蛍光フィルター580DF30(OMEGA製))及び水銀ランプを光源に用い、7.5W/cm2の光強度で行った。その結果、エピトープ2のZ9139抗体において、光照射依存的にAMPA電流が減少することを見出した(図1)。さらにCHO細胞にGluA1, GluA2, GluA3/pEFBOSベクターをそれぞれGluA1のみ、GluA1/GluA2、GluA2/GluA3の組み合わせでトランスフェクトし、同様にパッチクランプ後にCALIで光照射前後のAMPA電流値を比較したところ、GluA1ホモマーでのみCALI効果が認められた。以上からZ9139抗体はGluA1ホモマー特異的に機能破壊することが分かった(図2)。
Z9139抗体をproteinAカラムで精製し、以下の実験に用いた。海馬初代培養ニューロンについて、シナプスに発現するGluA1のCALIを検討した。妊娠17日目SDラットの胎児から海馬を摘出し、1x106個/35mm dishの細胞密度で培養した海馬初代培養ニューロンについて、培養後15-16日目の海馬ニューロンにエオシンラベル化Z9139抗体を抗体濃度10ug/mlで2hr反応させ、ACSFにて3回洗浄後、ACSF中でホールセルパッチクランプ法にてシナプス性AMPA電流の計測を行った。ここではシナプス性AMPA電流を発生させるために、刺激電極を5-10個程度の細胞塊付近に設置した。また、そこから300-350um程度の距離にある細胞についてパッチクランプを行い、シナプス性のAMPA電流を検出した。CALIは60倍対物レンズとフィルターセット(励起フィルター535/22-25(semrock製)、555DRLP(OMEGA製)、蛍光フィルター580DF30(OMEGA製))及び水銀ランプを光源に用い、7.5W/cm2の光強度で行った。光照射領域は、60倍対物レンズを用いて電極とパッチクランプ細胞の間で行った。その結果、シナプスにおいてもAMPA電流をCALIで破壊することができた(図3)。さらにニューロン内で同様の発現パターンをもつNMDA受容体を機能破壊しないことから、GluA1のCALI法には分子特異性があることが示唆された。
CHO細胞にGluA1/pEFaとEGFP-N3 ベクターをトランスフェクションし両者を共発現させた。翌日Z9139エオシンラベル抗体を抗体濃度10ug/mlで30min反応させ、HBSSで3回洗浄後、HBSS溶液(含100uM シクロチアザイド)中においてGFP陽性細胞をパッチクランプした。ここではAMPA電流を発生させるために、10mM グルタミン酸(含100uM シクロチアザイド)を細胞に反応させた。CALIは60倍対物レンズとフィルターセット(励起フィルター535/22-25(semrock製)、555DRLP(OMEGA製)、蛍光フィルター580DF30(OMEGA製))及び水銀ランプを光源に用い、7.5W/cm2の光強度で行った。その結果、CALIが可能であることが分かり、30minの抗体反応によっても、GluA1とZ9139抗体は抗原抗体反応を起こしていることが分かった(図4)。次に同様にGFP陽性細胞をパッチクランプし、抗体反応前後のAMPA電流を比較することで中和活性があるかを調べた。その結果、抗体反応前後においてもAMPA電流は変化しないことが分かり、よってZ9139抗体はGluA1の活性を中和しないことが分かった(図4)。
生後28-31日(体重20-25g)のICRマウスの頭蓋骨にドリルで穴を開け、35ゲージ針(WPI製)と10ulシリンジ(WPI製)と電動インジェクターを用い、海馬両側のCA1領域にエオシンラベルZ9139抗体を抗体濃度150ng/ulで0.18ulインジェクションした。その際の脳座標は後ろ2.3mm左右1.6mm深さは1.4mmである。なお深さ方向は一度1.5mmまで針を刺し、インジェクションは1.4mm地点で行った。さらに光照射用に光照射カヌラ(Doric製)を先端が海馬CA1の直上にくるような脳座標(後ろ2.3mm左右1.6mm深さは0.9mm)に設置し、セメント固定した。手術後6hrは飼育箱で静置し、文脈的恐怖条件付け学習(電気ショック条件は0.35mA, 2secである)を行った。学習後1hrにおいてマウスを麻酔後、光ファイバーを埋め込んだカヌラに接続し、543nmレーザー光を海馬CA1領域に光照射した。光照射は60mWを2minで行った。光照射の翌日20-24時間後に学習のチェックを行い、記憶消去の効果を調べたところ、光照射依存的にlatencyが半分程度に抑制できることが分かった(図5)。以上から本技術は、in vivoにおいて記憶情報を光照射で消去できる技術であることが分かった。
Claims (10)
- GluA1の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体であって、光照射分子不活性化(CALI)により光照射特異的にAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊でき、
GluA1の細胞外ドメインが、GluA1の236-286アミノ酸領域(配列番号2)であり、
照射分子不活性化(CALI)により、光照射特異的に、GluA1/GluA1であるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊できるが、GluA1/GluA2およびGluA2/GluA3の機能は抑制又は破壊せず、
光照射分子不活性化(CALI)によりNMDA受容体の機能は抑制又は破壊せず、
GluA1の活性を中和しない、
モノクローナル抗体又は前記機能を有するその断片。 - 前記モノクローナル抗体が、受領番号NITE AP−01879(受託番号NITE P−01879)を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項1に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 光増感物質で標識されている、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 受領番号NITE AP−01879(受託番号NITE P−01879)を有するハイブリドーマ。
- 請求項1から3の何れかに記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む、AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊するための試薬。
- 光増感物質で標識されている請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその断片を、AMPA型グルタミン酸受容体を発現している細胞にインビトロで接触し、光照射する工程を含む、AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊する方法。
- 光増感物質で標識されている請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射する工程を含む、前記非ヒト哺乳動物におけるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊する方法。
- AMPA型グルタミン酸受容体の機能を抑制又は破壊することにより、前記非ヒト哺乳動物における記憶が消去される、請求項7に記載の方法。
- 光増感物質で標識されている請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射する工程を含む、前記非ヒト哺乳動物における記憶を消去する方法。
- 光増感物質で標識されている請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその断片を非ヒト哺乳動物に投与し、光照射する工程を含む、前記非ヒト哺乳動物におけるAMPA型グルタミン酸受容体の機能を解析する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014153743A JP6434736B2 (ja) | 2014-07-29 | 2014-07-29 | Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットを認識するモノクローナル抗体及びその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014153743A JP6434736B2 (ja) | 2014-07-29 | 2014-07-29 | Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットを認識するモノクローナル抗体及びその利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016030733A JP2016030733A (ja) | 2016-03-07 |
JP6434736B2 true JP6434736B2 (ja) | 2018-12-05 |
Family
ID=55441329
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014153743A Expired - Fee Related JP6434736B2 (ja) | 2014-07-29 | 2014-07-29 | Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットを認識するモノクローナル抗体及びその利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6434736B2 (ja) |
-
2014
- 2014-07-29 JP JP2014153743A patent/JP6434736B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016030733A (ja) | 2016-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7071329B2 (ja) | Cd3およびcd123に特異的に結合する二重特異性抗体様結合タンパク質 | |
CN116063464A (zh) | 冠状病毒的抗体或其抗原结合片段 | |
KR20230091201A (ko) | Ig-유사 분자의 제조방법 및 제조수단 | |
CN116023478A (zh) | 冠状病毒的中和抗体或其抗原结合片段 | |
TWI483737B (zh) | Anti-system ASC amino acid transporter 2 (ASCT2) antibody | |
KR20210050535A (ko) | 항-bcma 단일 도메인 항체 및 그 적용 | |
UA108064C2 (uk) | Вектор експресії, що містить молекулу нуклеїнової кислоти, яка кодує ізольований тимусний стромальний лімфопоетичний білок (tslp) або його антигенний фрагмент | |
WO2002006305A1 (fr) | Procede permettant de recueillir l'enveloppe virale d'un baculovirus | |
US20120027763A1 (en) | Antibody for Targeted induction of Apoptosis, CDC and ADCC mediated killing of Cancer cells, TBL-CLN1 | |
CA3205854A1 (en) | Therapeutic and diagnostic agents and uses thereof | |
CN108178796B (zh) | 发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白定量检测试剂盒 | |
US11174312B2 (en) | Nav1.9 target polypeptide, antibody and antibody fragment combined with same, and related pharmaceutical composition | |
ES2929585T3 (es) | Procedimiento para la selección de moléculas de fijación biológicas | |
JP6434736B2 (ja) | Ampa型グルタミン酸受容体サブユニットを認識するモノクローナル抗体及びその利用 | |
JP4982848B2 (ja) | 新規ダニアレルゲンおよびその利用 | |
CN110662763B (zh) | Nav1.9的靶点多肽、与其结合的抗体及抗体片段和相关药物组合物 | |
WO2007023782A1 (ja) | キラートキシン様タンパク質に対する中和抗体、およびその利用 | |
WO2007037245A1 (ja) | 血管新生抑制作用を有するポリペプチド | |
JP4931347B2 (ja) | 抗−tsg101抗体およびウイルス感染の処置に対するそれらの用法 | |
KR20220034733A (ko) | 타우의 입체형태-특이적 에피토프, 이에 대한 항체 및 이와 관련된 방법 | |
CN114790239B (zh) | 一种抗冠状病毒n蛋白的抗体及其应用 | |
Mondal et al. | A Feasible Alternative Strategy Targeting Furin Disrupts SARS-CoV-2 Infection Cycle | |
US20240209065A1 (en) | Secretory iga antibodies against covid infection | |
WO2023134716A1 (zh) | 一种结合b7h3和nkp30的双特异性抗体及其应用 | |
CN106432486A (zh) | 全人源抗狂犬病毒中和抗体及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170324 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180124 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180130 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180329 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180717 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181023 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181109 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6434736 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |