KR20220034733A - 타우의 입체형태-특이적 에피토프, 이에 대한 항체 및 이와 관련된 방법 - Google Patents

타우의 입체형태-특이적 에피토프, 이에 대한 항체 및 이와 관련된 방법 Download PDF

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KR20220034733A
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KR1020217041461A
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스티븐 에스. 플로트킨
닐 알. 캐쉬맨
조안느 카플란
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더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아
프로미스 뉴로사이언스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 올리고머성 타우의 형태적 에피토프, 이에 대한 항체 및 이에 특이적인 면역원과 항체를 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다. 항체는 타우에서 활성 중화 부위에 결합한다. 또한 타우병증을 치료하는 방법을 포함하여, 제조 및 사용하는 방법이 제공된다.

Description

타우의 입체형태-특이적 에피토프, 이에 대한 항체 및 이와 관련된 방법
관련 출원
이 특허 협력 조약 출원은 2019년 5월 27일에 출원된 미국 가출원 62/853,121 및 2019년 10월 16일에 출원된 미국 가출원 62/915,931의 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각은 이의 전체로 본 명세서에 통합된다.
분야
본 개시내용은 타우 에피토프 및 이에 대한 항체, 보다 구체적으로 잘못 접힌 (예를 들어 올리고머) 타우에서 선택적으로 접근가능할 것으로 예측되는 서열 및 형태적으로 특이적 타우 에피토프(conformationally specific tau epitopes), 및 관련된 항체 조성물, 이의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
타우 단백질은 중추신경계 뉴런에서의 미세소관을 안정화하는 데 중요한 역할을 한다. 타우의 잘못 접힌 형태의 발달은 알츠하이머병(AD), 전두측두엽 치매 및 기타 타우병증 예컨대 반복적인 두부 손상(만성 외상성 뇌병증)에 기인한 것에서 나타나는 독성 및 비정상적인 미세소관 기능으로 이어진다.
올리고머성 타우에 대한 항체는 예를 들어 미국 특허 일련 번호 8,778,343에 기재되어 있다.
여러 치료적 타우 항체가 개발 중이지만 그것이 가장 효과적인 표적 에피토프 및 타우 종(tau species)에 대해 지향되는지 여부는 불분명하다. 예를 들어, N-말단 에피토프에 결합하는 항체는 타우 시딩 및 응집의 열악한 억제제로 보고되었다(Courade et al, 2018, Acta Neuropathologica). Biogen과 Abbvie로부터 N-말단 에피토프에 대해 지향된 2개의 항체는 진행성 핵상 마비(PSP) 임상 시험에서 실패했다. 모노머에 대한 항체의 결합은 생리학적 타우에 의한 치료 항체의 "흡수(soaking up)"를 초래할 수 있다.
모노머성 타우보다 잘못 접힌 올리고머성 타우에 우선적으로 또는 선택적으로 결합하고 타우 시딩 또는 기타 병리학적 활성을 억제하거나 중화하는 항체가 바람직하다.
타우의 형태적 에피토프(conformational epitopes in tau)가 본 명세서에 기술되어 있다. 형태적 에피토프는 서열 및 형태적으로 특이적 에피토프이며 여기서 항체는 모노머성 타우 폴리펩티드에 비교하여 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴에서 형태적으로 구별되는 특정 아미노산 서열을 인식한다. 본 발명자들은 몇몇 잔기가 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드에 임의로 노출된다는 것을 결정하고, 활성 중화 부위에서 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴에 대해 선택적인 시약 및 생산된 항체를 설계하였다. 본 명세서에 기재된 다른 양태는 상기 시약 및 항체를 제조하는 방법 및 잘못 접힌 올리고머성 타우를 검출하기 위해 이의 사용 방법을 포함한다. 에피토프는 잘못 접힌 올리고머성 종의 타우에서 임의로 노출되고 타우 모노머에서는 덜 이용가능하다.
일 양태는 KLDFK (서열번호: 1), 임의로 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1) 및 임의로 링커의 4개 이상의 잔기를 포함하고/하거나 이로 구성된 타우 펩티드를 포함하는 환형 화합물을 포함한다. 또한 KLDFK (서열번호: 1), 임의로 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1), 및 임의로 링커의 4개 이상의 잔기를 포함하고/하거나 이로 구성된 타우 펩티드를 포함하는 선형 화합물이 제공된다.
추가 양태는 본 명세서에 기재된 환형 화합물을 포함하는 면역원이다. 면역원은 면역원성이다.
또 다른 양태는 상응하는 선형 화합물과 비교하여 본 명세서에 기재된 환형 화합물 및/또는 가용성 피브릴에서 타우 펩티드에 선택적으로 결합하고/하거나 모노머성 타우 폴리펩티드와 비교하여 선택적으로 잘못 접힌 올리고머성 타우에 결합하고/하거나 본 명세서에 기재된 면역원 또는 상기 면역원을 포함하는 조성물을 사용하여 출현된 항체를 포함한다. 이러한 항체는 다른 에피토프에 결합할 수 있고/있거나 타우에 결합하는 기존 항체에 비해 개선된 결합 특성 및/또는 표적화 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 항체는 타우 활성 중화 부위에서 형태적 에피토프를 모방하는 면역원으로 출현되었다.
또한 본 명세서에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산이 포함된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 벡터에 포함된다.
추가 양태는 타우 응집/응집체 및/또는 증식을 감소 또는 억제하는 방법으로서, 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴을 발현하는 세포 또는 조직을 본 명세서에 개시된 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법을 포함한다.
본 명세서에 개시된 또 다른 양태는 타우병증 치료를 필요로 하는 대상체에서 타우병증을 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 상기 항체를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 사상 및 범주 내에서 다양한 변경 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 예는 본 개시내용의 바람직일 실시형태를 나타내면서 단지 예시의 방식으로 제공된다는 것을 이해해야 한다.
본 개시내용의 실시형태는 이제 도면과 관련하여 설명될 것이며 여기서:
도 1a는 PDB 5O3L에 도시된 바와 같이 10개 사슬을 포함하는 타우의 개략도이다. 도 1b는 피브릴 구조를 부분적으로 무질서하게 하기 위해 집단 좌표 바이어싱 후 10개 사슬을 포함하는 타우의 개략도이다.
도 2a는 예측된 에피토프의 예측 강도를 예시하는 개략도이고, 도 2b는 예측된 KLDFK (서열번호: 1) 에피토프가 중첩된 타우 PDB 5O3L의 개략도이다.
도 3a, 3b 및 3c는 2개의 앙상블 사이의 비유사성의 척도인 Jensen-Shannon 거리(JSD)의 산점도이다. X-축은 환형 펩티드와 타우 모노머 사이의 JSD이고, Y-축은 환형 펩티드와 바이어스된 또는 응력을 받은 (또는 바이어스된) 피브릴 사이의 JSD이다. 플롯에서의 각 점은 주어진 환형 펩티드 스캐폴드에 상응한다.
도 4는 고정화된 타우 올리고머에 대한 출현된 항체(하이브리도마 상청액)의 결합을 예시하는 산점도이다.
도 5는 고정화된 타우 모노머에 대한 출현된 항체(하이브리도마 상청액)의 결합을 예시하는 산점도이다.
도 6은 생성된 각 항체에 대해 항체(하이브리도마 상청액)의 타우 올리고머 및 타우 모노머에 대한 결합을 예시하는 산점도에 대한 결합의 결과를 중첩하는 막대 그래프이다.
도 7은 각 항체(하이브리도마 상청액)에 대한 타우 올리고머/타우 모노머에 대한 결합 반응의 비율을 나타내는 산점도이다.
도 8a-h는 SPR 분석에서 다양한 농도의 타우 올리고머 또는 모노머에 대한 정제된 항체의 결합을 나타내는 일련의 그래프이다. 도 8i 및 8j는 대조군을 나타내는 그래프이다.
도 9는 SPR 검정에서 AD 환자로부터의 가용성 뇌 추출물에서 타우 종과 정제된 mAb 클론 8G7(시험 mAb)의 결합을 예시하는 막대 그래프이다.
도 10은 SPR 검정에서 단일 AD 뇌(좌측 패널) 또는 3개 AD 뇌의 풀(우측 패널)로부터의 가용성 뇌 추출물에서 정제된 mAb의 타우 종에 대한 결합을 예시하는 일련의 막대 그래프이다.
도 11은 SPR 검정에서 정제된 항체의 가용성 타우 사전-형성된 피브릴(PFF)에 대한 결합을 예시하는 막대 그래프이다.
도 12는 세포 형광 에너지 공명 전달(FRET) 검정을 사용하여 세포내 타우 응집체의 타우 사전-형성된 타우 피브릴(PFF)-유도된 형성을 억제하거나 감소시키는 정제된 항체의 능력을 예시하는 막대 그래프이다.
도 13은 Tau RD P301S FRET 바이오센서 세포를 사용한 FRET 검정에서 평가된 바와 같이 AD 뇌 균질물의 시딩 활성을 억제하는 타우 mAb의 능력을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는 AD 뇌 시드에 결합하고 고갈시키는 타우 mAb의 능력을 나타내는 막대 그래프이다.
형태-특이적 항체 및 상기 항체를 발생시키기 위한 면역원의 발생이 본 명세서에서 입증된다. 발명자들은 활성 중화 부위에서 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드에 존재할 가능성이 더 큰 표적을 식별하였다.
천연 단백질 영역에 대해 출현된 항체는 올리고머성 종과 같이 잘못 접힌 단백질에 대해 선택적이지 않은 경향이 있고, 따라서 잘못 접힌 단백질뿐만 아니라 천연 타우 단백질에도 결합할 수 있다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 잘못 접힌 올리고머성 형태의 타우에 대해 선택적인 항체를 개발하기 위해, 발명자들은 피브릴의 맥락에서 붕괴되기 쉬울 수 있고 따라서 잘못 접힘에 대한 촉매 기질로 작용할 수 있는 잘못 접힌 단백질 올리고머의 표면에 노출될 수 있는 타우 서열의 영역을 식별하였다. 식별된 타우의 영역은 상기 형태에 결합하는 항체가 잘못 접힌 타우 시딩 및 잘못 접힌 타우 전파를 억제할 수 있기 때문에 잘못 접힌 타우 질환 활성에 중요할 수 있다.
피브릴 구조의 실험적으로-검증된 구조의 모델은 분자 역학을 사용하여 부분적으로 펼쳐져 있는 그 보고된 형태에서 벗어나 전반적으로 바이어스되어 비정상적인 세포 환경과 같은 외부 도전에 의해 무질서하기 쉬운 인접한 1차 서열의 영역을 산출했다.
이들 약한-안정성 영역은 잘못 접힌 올리고머성 단백질 또는 잘못 접힌 병원성 종에서 임의로 노출될 수 있다고 가정되었다. 따라서 그들은 올리고머-선택적 에피토프 예측 및/또는 천연 모노머성 타우와 구별되는 예측을 구성할 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이, 발명자들은 몇몇 기준을 만족함에 의해 추정되는 선택적 에피토프를 모방하도록 식별된 에피토프를 포함하는 환형 화합물을 설계하였다. 모노클로날 항체는 올리고머성 타우에 우선적으로 결합하고 잘못 접힌 타우 시딩 및 잘못 접힌 타우 전파를 억제할 수 있는 항체를 생산하기 위해 본 명세서에 기술된 환형 화합물을 포함하는 면역원을 사용하여 생산되었다.
I. 정의
본 명세서에 사용된 용어 "타우"는 본 명세서에 사용되고 문맥에 따라 야생형 서열 타우를 포함하는 타우의 모든 형태 및 동형 뿐만 아니라 모든 종, 특히 인간 타우(즉, 후타우)로부터 이의 돌연변이 형태를 포함하는 잘못 접힌 형태를 의미할 수 있다. 인간 뇌에서 타우 단백질은 352-441개 아미노산의 범위를 가진 교대로 스플라이싱된 동형의 패밀리를 구성한다. 중추 신경계에서 가장 긴 동형(tau-F 또는 tau-4)은 총 441개 아미노산을 갖는 4개의 반복 단위(R1, R2, R3 및 R4)와 2개의 삽입체를 갖는 반면, 가장 짧은 동형은 총 352개 아미노산을 갖는, 3개의 반복 단위(R1, R3 및 R4)를 갖지만 삽입체를 갖지 않는다. 아미노산 서열(예를 들어, tau-4에 대한 Uniprot 수탁 번호, P10636-8) 및 뉴클레오티드 서열(예를 들어, NCBI 유전자 이름/ID: MAPT/4137)은 이전에 특성화되었다.
본 명세서에 사용된 "야생형"은, 예를 들어, 인간에서 발견되는 비-돌연변이 또는 천연 발생 타우 단백질의 임의의 동형의 1차 아미노산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "천연 타우 폴리펩티드"는 정상 세포에서 발견되는 미세소관 또는 세포질과 연관되든 상관없이 타우 모노머를 지칭한다. 단리된 모노머성 구조는 본 명세서에 기술된 PDB 피브릴(PDB 5O3L)로부터의 사슬 중 하나를 사용하여 예측될 수 있다. 천연 타우 폴리펩티드는 예를 들어 타우병증에 영향을 받지 않은 뇌에서 팬 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "타우병증"은 타우 단백질의 병리학적 응집과 연관된 신경퇴행성 질환의 부류를 지칭하고, 예를 들어 알츠하이머병(AD), 픽병, 전두측두엽 치매 또는 전두측두엽 변성, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 원발성 연령-관련 타우병증, 만성 외상성 뇌병증, 아급성 경화성 범뇌염, 17번 염색체와 관련된 전두측두엽 치매 및 파킨슨증을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "구조화된 피브릴", "비-응력의 피브릴" 또는 "바이어스되지 않은 피브릴"은 예를 들어, PDB 5O3L이 그의 대표적인 예인, 타우 단백질의 피브릴에 대한 열 평형에서 관찰될 예상되는 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "잘못 접힌 올리고머(misfolded oligomer)"는 다중서브유닛 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 응집체의 2차 및 3차 구조를 지칭하고, 올리고머성 폴리펩티드 또는 그 안의 서브유닛이 천연 모노머에 의해 전형적으로 채택되는 것과 상이한 형태(예를 들어, 하나 이상의 위치에서)를 채택했음을 나타낸다. 잘못 접힘은 아미노산 결실, 치환 또는 추가와 같은 단백질의 돌연변이에 의해 야기될 수 있지만, 야생-형 서열 단백질은 또한 질환에서 잘못 접힘될 수 있으며, 예를 들어 피브릴 형성에 대한 온- 또는 오프-경로에 있을 수 있는 올리고머 형성 또는 미세환경 조건에서 변화의 결과로서 질환-특이적 또는 질환-선택적 에피토프에 노출될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 폴리펩티드를 언급할 때 "잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드" 또는 "잘못 접힌 올리고머성 타우"는 타우 폴리펩티드 올리고머를 지칭하며 여기서 그의 서브유닛은 모노머성 타우의 단위와 상이한 형태를 나타낸다. 예를 들어, 잘못 접힌 올리고머성 타우는 부분적으로-정렬되어 피브릴 구조의 일부를 함유하고 부분적으로-무질서하여 모노머 및/또는 피브릴 타우와 교호적인 형태를 갖는 아미노산의 폴리머 세그먼트를 함유하는 형태를 포함할 수 있다. 잘못 접힌 올리고머성 타우는 결합을 위해 선택적으로 제시된거나 접근가능한 형태적 에피토프를 포함하며 여기서 잘못 접힌 올리고머성 타우의 에피토프 서열은 모노머의 맥락에서 상응하는 서열과 형태적으로 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "가용성 피브릴"은 간질액에 가용성인 피브릴 단편 및 원형피브릴을 지칭한다.
용어 "돌연변이 타우"는 타우의 형상, 특히 예를 들어 전측두엽 치매(FTD)의 특징적인 이들 치환과 같은 아미노산 치환을 초래하는 유전적 돌연변이의 결과로 발생하는 타우의 내인성 형상을 지칭한다. 타우 단백질 돌연변이는 일반적으로 AD의 가족형과 관련이 없지만 FTD 및 기타 여러 타우병증을 유발할 수 있다(픽병, 진행성 핵상 마비 및 파킨슨병과 관련된 것들을 포함함; 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된, 공지된 병원성 돌연변이의 목록에 대해서는 https://www.alzforum.org/mutations/mapt 참조).
용어 "KLDF (서열번호: 2)"는 서열번호: 2에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열: 라이신, 류신, 아스파라긴, 페닐알라민을 의미한다. 유사하게 KLDFK (서열번호: 1) 및 기타 서열은 1-글자 아미노산 코드로 식별되는 아미노산 서열을 지칭한다. 문맥에 따라, 아미노산 서열의 참조는 환형 화합물의 에피토프 부분의 아미노산 서열과 같은 타우 내의 서열 또는 단리된 펩티드를 지칭할 수 있다. 서열 KLDF (서열번호: 2) 및 LDFK (서열번호: 3)는 각각 P10636-8에 나타낸 바와 같은 타우 아미노산 1차 서열에서 잔기 343-346 및 잔기 344-347로 구성된다. 언급된 바와 같이 타우의 다른 동형이 있고 당업자는 다른 동형에서 넘버링을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 예를 들어, KLDFK (서열번호: 1)는 파스타 파일 P10636-4에 해당하는 동형 tau-b에서의 아미노산 283-287이다.
아미노산 서열 KLDFK (서열번호: 1)는 인간 뇌에서 발현되는 모든 6개 타우 동형에 존재한다.
본 명세서에 사용된 용어 "KLDFK (서열번호: 1)에서 에피토프"는 항체에 의해 특이적으로 결합된 이의 임의의 부분을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "에피토프"는 서열 내의 아미노산(또는 이의 서브세트)이 항체 또는 결합 단편, 예를 들어 본 명세서에 기술된 항체 또는 결합 단편에 의해 특이적으로 인식되는 항원 내 아미노산의 서열을 의미한다. 에피토프는 하나 이상의 항원 결정기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 형태적 에피토프에 상응하는 분리된 펩티드에 대해 출현된 항체는 상기 에피토프 서열의 일부 또는 전부를 인식한다.
본 명세서에 사용된 용어 "잘못 접힌 올리고머성 타우에서 선택적으로 제시된거나 접근가능한 에피토프"는 다량체성, 올리고머성, 또는 응집된 형태이지만 생체내에서 정상적으로 발견되는 타우의 모노머성 폴리펩티드의 분자 표면이나 미세소관 결합 타우의 표면 상에는 존재하지 않는 AD 및 FTD와 같은 타우병증에 존재하는 잘못 접힌 올리고머성 타우에 선택적으로 제시된거나 접근가능한 형태적 에피토프를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "형태적 에피토프(conformational epitope)"는 단백질의 종에서 특정 3-차원 구조를 갖는 아미노산의 서열 또는 이의 항원 결정기를 지칭하며 여기서 적어도 3-차원 구조의 양태는 상응하는 바이어스되지 않은 피브릴 구조 또는 모노머 구조, 또는 미세소관-연관 타우 단백질과 같은 다른 종에 비해 항체 결합이 존재하거나 더 접근가능하다. 다른 형태와 비교하여 형태적 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체는 그 형태-특이적 에피토프의 하나 이상의 아미노산의 공간적 배열을 인식한다. 예를 들어, KLDFK (서열번호: 1)에서 형태적 에피토프는 항체에 의해 임의로, 예를 들어 다른 형태, 임의로 타우 모노머의 영역 또는 예를 들어 상응하는 선형 펩티드 또는 이의 일부를 사용하여 출현된 항체와 비교하여 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배 또는 적어도 4배 이상의 선택성으로 인식되는 KLDFK (서열번호: 1)의 형태를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 "환형 펩티드"에 대한 언급은 완전한 단백질성 화합물(예를 들어, 여기서 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산임)을 지칭할 수 있다. 실시예에서 결정된 환형 펩티드에 대해 기술된 특성은 비-아미노산 링커 분자를 포함하는 다른 화합물(예를 들어, 환형 화합물)에 통합될 수 있는 것으로 이해된다. "환형 펩티드" 및 "환형 화합물"은 환형 화합물이 아미노산으로 구성되는 경우 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 아미노산 뿐만 아니라 변형된 L-아미노산 모두를 포함한다. 아미노산의 원자는 예를 들어 다른 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 수소에 대해 치환된 중수소, 질소-14에 대해 치환된 질소-15, 및 탄소-12에 대해 치환된 탄소-13 및 기타 유사한 변화를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 단백질의 원하는 특성을 폐지함이 없이 하나의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 적합한 보존적 아미노산 치환은 유사한 소수성, 극성 및 R-기 크기를 갖는 아미노산을 서로 치환함에 의해 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00001
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단일 사슬, 인간화 및 기타 키메라 항체 뿐만 아니라 이의 결합 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 항체는 재조합 공급원으로부터의 것일 수 있고/있거나 형질전환 동물에서 생산될 수 있다. 또한 생화학적 기술을 사용하는 것을 통하여 생성되거나 라이브러리로부터 단리될 수 있는 인간 항체가 포함된다. 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 동형 또는 클래스로부터의 서열을 포함할 수 있다. 개시내용의 항체 또는 항체들에 대한 언급은 예를 들어 본 명세서에 기재된 면역원에 대해 발생되고/되거나 본 명세서에 기재된 에피토프, 예를 들어 에피토프, 잘못 접힌 올리고머 타우, 및/또는 상기 에피토프 서열 중 하나를 포함하는 형태 화합물의 맥락에서 예를 들어 LDFK (서열번호: 3), KLDF (서열번호: 2) 또는 KLDFK (서열번호: 1) 또는 이의 일부에 대해 선택적인 본 명세서에 기재된 항체 또는 항체들을 지칭한다.
문구 "단리된 항체"는 항체를 생성한 공급원, 예를 들어 동물, 하이브리도마 또는 기타 세포주(예를 들어, 항체를 생성하는 재조합 세포)로부터 제거된 생체내 또는 시험관내 출현된 항체를 지칭한다. 단리된 항체는 임의로 "정제"되며, 이는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 순도를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 에피토프 결합에 기여하는 것으로 일반적으로 추정되는 항체의 특정 초가변 영역을 지칭한다. CDR 서열을 식별하기 위한 컴퓨터 방법은 Kabat, Chothia 및 IMGT를 포함한다. 본 개시내용에 열거된 CDR은 IMGT 블라스트를 사용하여 식별된다. 본 명세서에 포함된 서열과 관련하여 당업자는 또한 Kabat 및 Chothia 등에 기반하여 CDR 서열을 식별할 수 있을 것이다. 이러한 항체는 유사하게 포괄된다.
본 명세서에 사용된 용어 "결합 단편"은 온전한 또는 완전한 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하고 항원에 결합하거나 온전한 항체와 경쟁하는 항체 또는 항체 사슬의 일부 또는 부분에 대한 것이다. 예시적인 결합 단편은 제한 없이 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 나노바디, 미니바디, 디아바디, 및 이의 다량체를 포함한다. 단편은 온전하거나 완전한 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 수단에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체를 펩신으로 처리함에 의해 생성될 수 있다. 생성된 F(ab')2 단편을 처리하여 이황화 가교를 환원시켜 Fab' 단편을 생성할 수 있다. 파파인 소화는 Fab 단편의 형성으로 이어질 수 있다. Fab, Fab' 및 F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이량체, 미니바디, 디아바디, 이중특이적 항체 단편 및 기타 단편은 또한 재조합 발현 기술에 의해 구축될 수 있다.
항체가 KLDFK (서열번호:1)와 같은 에피토프에 결합한다고 언급될 때, 그것이 의미하는 것은 항체가 특정 잔기 또는 이의 일부 예를 들어 적어도 1개 잔기 또는 적어도 2개 잔기를 함유하는 폴리펩티드 또는 화합물에 특이적으로 결합한다는 것이다. 이러한 항체는 KLDFK (서열번호: 1)의 모든 잔기와 반드시 접촉하는 것은 아니고, 상기 에피토프 내의 모든 단일 아미노산 치환 또는 결실이 결합 친화도에 반드시 유의하게 영향을 미치거나 동등하게 영향을 미치는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "검출가능한 표지"는 본 명세서에 기재된 펩티드 또는 화합물에 첨부되거나 도입될 수 있고 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 펩티드 서열, 형광성 단백질과 같은 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 표지는 방사선-불투과성, 양전자-방출 방사성핵종(예를 들어, PET 영상화에서의 용도), 또는 방사성동위원소, 예컨대 3H, 13N, 14C, 18F, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; 형광(형광단) 또는 화학발광(발색단) 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소; 영상화제; 또는 금속 이온일 수 있다. 검출가능한 표지는 또한 예를 들어 2차 항체를 사용하여 간접적으로 검출가능할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "더 큰 친화도"는 항체 X가 표적 Z에 비해 표적 Y에 더 강하게(Kon) 및/또는 더 작은 해리 상수(Koff)로 결합하는 항체 결합의 정도를 지칭하고, 이 맥락에서 항체 X는 Z에 대한 것보다 표적 Y에 대해 더 큰 친화도를 갖다. 마찬가지로, 본 명세서에서 용어 "더 낮은 친화도"는 항체 X가 표적 Z보다 표적 Y에 덜 강하게 및/또는 더 큰 해리 상수로 결합하는 항체 결합의 정도를 지칭하고, 이 맥락에서 항체 X는 Z에 대한 것보다 표적 Y에 대해 더 낮은 친화도를 갖는다. 항체와 그 표적 항원 사이의 결합의 친화도는 KD가 koff/kon과 동일한 1/KD와 동일한 KA로 표현될 수 있다. kon 및 koff 값은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정할 수 있다(예를 들어, Biacore 시스템을 사용하여 측정가능).
또한, 본 명세서에 사용된 용어 "면역원성"은 항체의 생성을 유도하고, 면역원의 항원 부분에 대해 지향된 림프구 또는 기타 반응성 면역 세포를 활성화시키는 기질을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "면역원"은 면역 반응을 유발하고 항체의 생산을 유발하는 기질을 의미하고, 예를 들어 다중항원 펩티드로서 접합되고/거나 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 면역원성 증진제에 융합된, 본 명세서에 기재된 환형 펩티드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 접합체에 부가하여, 식별된 에피토프에 대한 교차-반응성 항체를 유도하는 면역원성 펩티드 모방체, 예를 들어, KLDFK (서열번호: 1), KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)는 면역원을 구성한다. 유용한 면역원으로 작용하기 위해, 타우 펩티드는 바람직하게는 예를 들어 K343, L344, D345, F346, K347 및 임의로 타우에서 1, 2 또는 3개 추가 측접하는(flanking) 잔기, 예를 들어 환형 화합물의 맥락에서 최대 2개 잔기 N-말단 및 최대 3개 잔기 C-말단 중 4개 이상을 포함하는 최소 약 4, 5, 6 또는 7개 타우 잔기를 포괄한다. 면역원은 또한 예를 들어 최대 12 또는 13개 아미노산 또는 서브유닛으로 더 클 수 있고 타우 펩티드, 예를 들어 KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)를 포함할 수 있다.
환형 화합물과 관련하여 용어 "상응하는 선형 화합물"은 선형(비-환형) 형태에서가 아닌 환형 화합물과 동일한 서열 또는 화학적 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는 화합물, 임의로 펩티드를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산 서열"은 천연 발생 염기, 당 및 당간(백본) 연결로 이루어진 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 모노머의 서열을 지칭한다. 용어는 또한 비-천연 발생 모노머 또는 이의 부분을 포함하는 변형되거나 치환된 서열을 포함한다. 본 출원의 핵산 서열은 디옥시리보핵산 서열(DNA) 또는 리보핵산 서열(RNA)일 수 있고, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함하는 천연 발생 염기를 포함할 수 있다. 서열은 또한 변형된 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형된 염기의 예는 아자 및 데아자 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실; 및 크산틴 및 하이포크산틴을 포함한다. 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고 센스를 나타낸다. 더욱이, 용어 "핵산"은 상보적 핵산 서열뿐만 아니라 최적화된 코돈 또는 동의어 코돈 등가물을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "단리된 핵산 서열"은 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 때 세포 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 핵산을 지칭한다. 단리된 핵산은 또한 핵산이 유래된 핵산에 자연적으로 측접하는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치하는 서열)이 실질적으로 없다.
타우의 형상(예를 들어, 모노머, 또는 잘못 접힌 올리고머성 단백질)에 우선적으로 결합하는 항체와 관련하여 본 명세서에 사용된 용어 "선택적" 또는 "선택적으로 결합한다"는 결합 단백질이 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 더 큰 친화도로 형상에 결합한다는 것을 의미한다. 따라서, 특정 형태(예를 들어, 잘못 접힌 단백질)에 대해 보다 선택적인 항체는 다른 형상에 비해 적어도 2배 등의 더 큰 친화도로 타우의 특정 형상에 우선적으로 결합한다.
본 명세서에 사용된 용어 "링커"는 펩티드 N- 및/또는 C-말단에 연결된, KLDFK (서열번호:1), 임의로 KLDF (서열번호: 2), 또는 LDFK (서열번호: 3) 에피토프 펩티드의 적어도 3개 아미노산을 포함하는 타우 펩티드 N- 및/또는 C-말단에 직접적으로 또는 간접적으로 공유적으로 연결될 수 있는 화학적 모이어티, 바람직하게는 약한 면역원성 또는 비-면역원성을 의미한다. 링커 말단은 예를 들어 결합되어 환형 화합물을 생성할 수 있다. 링커는 하나 이상의 시스테인(C) 잔기와 같은 하나 이상의 관능화가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 링커는 관능화가능한 모이어티를 통해 담체 단백질 또는 면역원 강화제 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 소 혈청 알부민(BSA)에 연결될 수 있다. 링커를 포함하는 환형 화합물은 펩티드 자체보다 길이가 더 길다. 즉, 환형화될 때 링커가 있는 펩티드(예를 들어 3개 아미노산 잔기의 링커)는 링커가 없는 펩티드보다 더 큰 닫힌 원을 만든다. 링커는 아미노산 글리신(G) 및 알라닌(A), 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 반복부와 같은 비-면역원성 모이어티를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 링커는 예를 들어 9개 아미노산, 임의로 GGGGCGGGG (서열번호: 74), 또는 8개 아미노산, 임의로 GGGCGGGG (서열번호: 67), GGCGGGGG (서열번호: 68) 또는 GCGGGGGG (서열번호: 69) 또는 7개의 아미노산, 임의로 GGGGCGG (서열번호: 65), GGGCGGG (서열번호: 70), GGCGGGG (서열번호: 71) 또는 GCGGGGG (서열번호: 72), 6개 아미노산, 임의로 GGGCGG (서열번호: 73), GGCGGG (서열번호: 45) 또는 GCGGGG (서열번호: 47), 5개 아미노산 임의로 GCGGG (서열번호: 44) 또는 GGGCG (서열번호: 46), 4개 아미노산 예컨대 GCGG(서열번호: 43) 또는 GGCG (서열번호: 186) 또는 GCG와 같은 3개 아미노산일 수 있다. 링커는 펩티드의 어느 하나의 말단 상의 잔기의 수에 따라 언급될 수 있으며 예를 들어 3,1은 관능화가능한 모이어티 예컨대 시스테인과 N 말단인 3개의 아미노산 및 C 말단인 1개의 아미노산을 갖는 링커인 타우 펩티드를 지칭한다. 링커의 예는 서열번호: 186, 43-47 및 65-74에 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "관능화가능한 모이어티(functionalizable moiety)"는 본 명세서에 사용될 때 원자의 또 다른 기 또는 단일 원자(소위 " 상보적 관능기")와 반응하여 두 기 또는 원자 사이의 화학적 상호작용을 형성할 원자의 기 또는 단일 원자를 지칭하는 "관능기"를 갖는 화학 물질을 지칭한다. 시스테인(C)의 경우, 관능기는 이황화 결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 -SH일 수 있다. 따라서, 링커는 예를 들어 CCC일 수 있다. 다른 원자의 기와의 반응은 공유결합이거나 강한 비-공유결합일 수 있으며, 예를 들어 Kd
Figure pct00002
1e-14를 가질 수 있는 비오틴-스트렙타비딘 결합의 경우에서와 같다. 본 명세서에 사용된 강한 비-공유결합은 적어도 1e-9, 적어도 1e-10, 적어도 1e-11, 적어도 1e-12, 적어도 1e-13 또는 적어도 1e-14의 Kd를 갖는 상호작용을 의미한다.
단백질 및/또는 기타 제제는 면역원성을 돕거나 시험관내 연구에서 프로브로 작용하기 위해 환형 화합물에 결합될 수 있다. 이 목적을 위해, 반응할 수 있는 임의의 관능화가능한 모이어티(예를 들어, 공유 또는 비-공유이지만 강한 결합을 생성)가 사용될 수 있다. 일 특정 실시형태에서, 관능화가능한 모이어티는 반응하여 관심있는 단백질 상의 짝을 이루지 않은 시스테인과 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기이며, 이는 예를 들어 면역원성 증진제 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 또는 담체 단백질 예컨대 시험관내 면역블롯 또는 면역조직화학적 검정에 사용되는 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "와 반응한다"는 일반적으로 화학적 상호작용의 형성을 초래하는 전자의 흐름 또는 정전기 전하의 이동이 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "동물" 또는 "대상체"는 임의로 인간을 포함하거나 배제하는 포유동물을 포함한 동물계의 모든 구성원을 포함한다.
본 명세서에서 사용되고 당업계에서 잘 이해되는 바와 같은 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법을 의미한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출가능하든 검출가능하지 않든, 하나 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환의 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화, 질환 재발의 감소 및 관해(부분적이든 전체적이든)를 포함될 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. "치료하는" 및 "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상된 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "치료하는" 및 "치료"는 또한 예방적 치료를 포함한다. 예를 들어, 전증상 대상체는 진행을 예방하기 위해 치료될 수 있다. 이러한 대상체는 진행을 예방하기 위해 본 명세서에 기재된 화합물, 항체, 면역원, 면역접합체 또는 조성물로 치료될 수 있다.
본 명세서에 사용된 어구 "유효량"은 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 대상체에게 투여될 때의 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별, 체중과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여량 섭생은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 언급되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 "포함하는" 또는 "함유하는" 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "투여된"은 세포 또는 대상체에게 개시내용의 화합물 또는 조성물의 치료학적 유효한 용량의 투여를 의미한다.
본 개시내용의 범위를 이해함에 있어서, 본 명세서에 사용된 용어 "구성되는" 및 그 파생어는 언급된 특징, 요소, 구성성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 특정하고, 그리고 또한 명시되지 않은 다른 특징, 요소, 구성성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하는 닫힌 종결된 용어인 것으로 의되된다.
본 명세서에서 종점에 의한 수치 범위의 언급은 그 범위 내에 포괄된 모든 수 및 분수를 포함한다(예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5 등을 포함한다). 모든 수 및 이의 분수는 "약"이라는 용어에 의해 변형된 것으로 추정된다는 것이 또한 이해되어야 한다.
더욱이, 본 명세서에서 사용된 "실질적으로", "약" 및 "대략"과 같은 정도의 용어는 최종 결과가 유의하게 변경되지 않도록 변형된 용어의 합리적인 편차량을 의미한다.
용어 "약"은 참조되는 숫자의 플러스 또는 마이너스 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15% 또는 20%를 의미한다.
더욱이, 특정 섹션에 기술된 정의 및 실시형태는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그들이 적절한 본 명세서에 기재된 다른 실시형태에 적용가능하도록 의도된다. 예를 들어, 다음 구절에서 다른 양태가 더 자세히 정의된다. 이와 같이 정의된 각 양태는 반대로 명확하게 표시되지 않는 한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 특징은 바람직하거나 유리한 것으로 표시된 임의의 다른 특징 또는 특징들과 조합될 수 있다.
관사의 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함한 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
Ⅱ. 에피토프
본 발명자들은 각각 아미노산 위치 343-347, 343-346, 및 344-347에서 KLDFK (서열번호: 1), KLDF (서열번호: 2) 및 LDFK (서열번호: 3)를 포함하는 타우 단백질에서 에피토프를 식별하였다(동형 타우-F의 파스타 파일 P10636-8.fasta에 따라 인덱싱됨). 그것은 에피토프 또는 이의 일부가 형태적 에피토프일 수 있다는 것과 KLDF (서열번호: 2) 및 LDFK (서열번호: 3) 또는 이의 어느 하나의 일부가 타우의 잘못 접힌 올리고머성 종에서 항체 결합에 선택적으로 접근가능할 수 있다는 것을 추가로 식별했다.
모노머성이고 바이어스된 타우 피브릴 앙상블에서 식별된 에피토프 사이에서 식별된 하나 이상의 형태 차이에 기반하여, 발명자들은 항체를 생산하기 위한 형태적으로 제한된 화합물 및 면역원을 설계하였다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 면역원을 사용하여 출현된 항체는 잘못 접힌 올리고머성 타우를 검출하거나 표적화하는데 유용하다.
실시예에 기술된 바와 같이, 표 2 및 4에 기술된 환형 펩티드와 같은 환형 화합물 및 항체를 생성하는데 사용되는 환형 작제물, 예를 들어, CGGKLDFG (서열번호: 15 (3,1 링커)); CGGGKLDFGG (서열번호: 16 (3,2 링커)) 및 CGGGGKLDFG (서열번호: 19 (4,1 링커))는 모노머 종에 비해 타우의 잘못 접힌 올리고머성 종에서 상응하는 에피토프의 형태 차이를 포착하기 위해 결정되었다. 이것은 환형 화합물이 모노머성 타우에 제시된 서열과 형태적으로-구별되는 형태적 에피토프를 제공할 수 있음을 시사한다.
따라서, 본 개시내용은 아미노산 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1)로 구성된 타우의 형태적 에피토프 또는 이의 일부 예컨대 타우 상의 아미노산 잔기 346-347에 상응하는 FK 또는 타우 상의 아미노산 345-347에 상응하는 DFK를 확인한다. 실시예에서 입증된 바와 같이, KLDFK (서열번호: 1) 또는 이의 일부 예컨대 KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)는 스트레스를 받은 타우 피브릴에서 무질서하기 쉬운 영역으로 식별되었다. 잔기 KLDF (서열번호: 2) 및 LDFK (서열번호: 3)는 실시예에 기재된 바와 같이 집합적 좌표법을 사용한 예측에서 나타났다.
일 양태는 KLDFK (서열번호: 1)의 적어도 3개 또는 적어도 4개 아미노산, 임의로 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 또는 KLDFK (서열번호: 1)를 포함하는 타우 펩티드를 포함하는 화합물을 포함한다. 일 실시형태에서, 타우 펩티드는 KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)로부터 선택된다.
타우 펩티드는 또한 KLDFK (서열번호: 1)에 N-말단 및/또는 C-말단 또는 이러한 KLDF (서열번호: 2)의 그 내부 서열에 1, 2 또는 3개 N-말단 아미노산 잔기를 갖는, 또는 LDFK (서열번호: 3)에 1, 2 또는 3개 C-말단 아미노산 잔기를 갖는, 타우 내 1, 2 또는 3개 아미노산을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 타우 펩티드는 서열번호: 1의 N-말단에 최대 2개 아미노산 및/또는 C 말단에 최대 3개 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, 화합물은 링커를 추가로 포함한다. 링커는 하나 이상의 관능화가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 링커는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티 및/또는 이의 조합과 같은 동등하게 관능화하는 분자를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 링커 아미노산은 G 또는 A와 같은 비-면역원성 또는 빈약하게 면역원성 아미노산 잔기로부터 선택되고, 예를 들어 링커는 GG, GGG, GAG, G(PEG)G, PEG-PEG(또한 PEG2로 지칭됨)-GG 등일 수 있다. 하나 이상의 관능화가능한 모이어티, 예를 들어, 관능기를 갖는 아미노산은 예를 들어 화합물을 작용제 또는 검출가능한 태그 또는 BSA와 같은 담체 또는 KLH와 같은 면역원성 증강제에 커플링하기 위해 포함될 수 있다.
일 실시형태에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 GC-PEG, PEG-GC, GCG 또는 PEG2-CG를 포함한다. 다른 실시형태에서, 링커는 GGCG (서열번호: 186; 1,2 링커), GCGG (서열번호: 43; 2,1 링커), GCG (1,1 링커), GCGGG (서열번호: 44; 3,1 링커), GGCGGG (서열번호: 45; 링커 3,2), GGGCG (서열번호: 46; 1,3 링커), 또는 GCGGGG (서열번호: 47; 링커 4, 1)를 포함하거나 이로 구성된다.
일 실시형태에서, 링커는 GGCG (서열번호: 186; 1,2 링커)를 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 링커는 GCGG (서열번호: 43; 2,1 링커)를 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 링커는 GCG (1,1 링커)를 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 링커는 GCGGG (서열번호: 44; 3,1 링커)를 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 링커는 GGCGGG (서열번호: 45; 링커 3,2)를 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 링커는 GGGCG (서열번호: 46; 1,3 링커)를 포함하거나 이로 구성된다. 일 실시형태에서, 링커는 GCGGGG (서열번호: 47; 링커 4,1)를 포함하거나 이로 구성된다. 다른 링커가 표 2, 4 및/또는 7에 제공되어 있다(타우 펩티드를 포함하는 작제물에 제시됨). 일 실시형태에서, 링커는 서열번호: 65-74 중 임의의 하나로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
화합물(또는 링커가 또한 단백질성인 화합물)의 단백질성 부분은 고상 합성 또는 균질 용액에서의 합성과 같은 단백질의 화학에서 잘 알려진 기술을 사용하여 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.
화합물은 선형일 수 있다. 바람직하게는, 화합물은 K343, L344, D345, F346 및/또는 K347 잔기 중 적어도 하나가 모노머성 및/또는 피브릴 앙상블에서 상응하는 잔기보다 화합물에서 대안적인 형태에 있도록 되는 형태 화합물이다. 실시예에 나타낸 바와 같이 이것은 타우 펩티드를 포함하는 환형 펩티드를 사용하여 달성될 수 있다.
따라서 일 양태는 KLDFK (서열번호: 1)의 적어도 4개 아미노산, 임의로 KLDF (서열번호: 2), 또는 LDFK (서열번호: 3) 및 링커를 포함하는 타우 펩티드를 포함하는 화합물, 임의로 환형 화합물을 제공하며, 여기서 링커는 타우 펩티드에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합으로 커플링된다. 일 실시형태에서, 화합물은 환형 화합물이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 본 명세서에 기재된 타우 펩티드 및 링커를 포함한다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 KLDF (서열번호: 2), 또는 LDFK (서열번호: 3), 및 최대 6개 타우 잔기(예를 들어, KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)에 대한 1 또는 2 또는 3개 아미노산 N 및/또는 C 말단, 및 링커를 포함하는 타우 펩티드를 포함하며, 여기서 링커는 타우 펩티드의 펩티드 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합으로 커플링된다. 환형 펩티드에서 잔기의 노출은 모노머성 및/또는 피브릴 앙상블 또는 세포 모노머성 및/또는 피브릴성 타우에서 상응하는 잔기와 상이할 수 있다. 예를 들어, 환형 화합물에서, K343, L344, D345, F346 및/또는 K347 중 적어도 하나는 피브릴 앙상블에서 차지하는 형태보다 표면 노출이 더 많다.
KLDF (서열번호: 2)를 포함하는 펩티드가 KLDF (서열번호: 2)에 대한 N- 및/또는 C-말단인 타우에서 발견된 1, 2 또는 3개 추가 잔기를 포함하는 실시형태에서, 고리화된 화합물에서의 링커는 타우 추가 잔기의 N- 및/또는 C-말단에 공유적으로 연결된다. 유사하게, 타우 펩티드가 KLDF (서열번호: 2)인 경우, 링커는 잔기 K 및 F에 공유적으로 연결되고, 여기서 타우 펩티드는 LDFK (서열번호: 3)인 경우, 링커는 잔기 L 및 K에 공유적으로 연결되고, 타우 펩티드가 KLDFK (서열번호: 1)인 경우, 링커는 잔기 K 및 K에 공유적으로 연결된다.
일 실시형태에서, 환형 화합물은 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1)를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 및 링커를 포함하고, 여기서 링커는 펩티드의 N- 및 C-말단에 커플링된다.
일 실시형태에서, 환형 펩티드(또는 선형 펩티드)는 표 2, 4 또는 7에 열거된 화합물로부터 선택되고, 임의로 여기서 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKG) (서열번호: 31), 사이클로(CGKLDFKG) (서열번호: 4), 사이클로(CGGGGKLDFKG) (서열번호: 39), 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 5), 사이클로(CGGKLDFKGGGG) (서열번호: 34), 사이클로( CGGGKLDFKG) (서열번호: 35), 사이클로(CGKLDFG) (서열번호: 7), 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15), 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 19), 사이클로(CGGGKLDFGG) (링커 3,2을 갖는 서열번호: 16), 사이클로(CGGLDFKG) (서열번호: 52) 또는 사이클로(CGLDFKGG) (서열번호: 49)로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKG) (서열번호: 31)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGKLDFKG) (서열번호: 4)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGGKLDFKG) (서열번호: 39)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 5)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKGGGG) (서열번호: 34)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 35)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGKLDFG) (서열번호: 7)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGGKLDFG) (서열번호: 19)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGLDFKG) (서열번호: 52)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGLDFKGG) (서열번호: 49)이다.
고리화된 펩티드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 SS-고리화 또는 아미드 고리화(헤드-투-테일 또는 백본 고리화)를 포함한다. 방법은 실시예 부문에 자세히 기술되어 있다. 예를 들어, 그 N- 및 C-말단에 "C" 잔기가 있는 펩티드, 예를 들어, CGGGKLDFGGC (서열번호: 64)는 SS-고리화에 의해 반응하여 환형 펩티드를 생성할 수 있다. 환형 화합물은 타우 펩티드, 임의로 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 또는 관련된 에피토프를 포함하는, 예를 들어 고리화 이전에 추가적인 C 및/또는 N 말단 타우 서열을 포함하는 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 링커가 공유적으로 부착된 선형 분자로서 합성될 수 있다. 대안적으로, 링커의 일부는 고리화 이전에 N-말단에 공유적으로 부착되고 일부는 C-말단에 공유적으로 부착된다. 어느 하나의 경우에서, 선형 화합물은 예를 들어 헤드 투 테일 고리화(예를 들어, 아미드 결합 고리화)에서 고리화된다.
실시예에 기재된 바와 같이, 환형 화합물은 식별된 형태적 에피토프에 대한 그 관련성에 대해 평가되었고, 합성되어 면역원을 제조하는 데 사용될 수 있고 잘못 접힌 올리고머성 타우에 대해 선택적인 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 에피토프 KLDFK (서열번호: 1), KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3)는 타우의 잘못 접힌 증식하는 균주에서 잠재적인 표적이 될 수 있고, 형태적 에피토프를 인식하는 항체는 예를 들어 이러한 증식하는 균주를 검출하는 데 유용할 수 있다.
언급된 바와 같이 타우 펩티드를 포함하는 상기 환형 화합물은 예를 들어 항체를 발생시키기 위한 면역원으로 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 환형 화합물을 포함하는 면역원(예를 들어, 면역원성 화합물)을 포함한다. 일 실시형태에서, 면역원은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 면역원성 향상제를 포함한다. 면역원성 향상제는 결합된 아미드를 통해서와 같이 직접적으로 또는 화학적 링커를 통해 간접적으로 화합물에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 면역원은 다중 항원성 펩티드(MAP)일 수 있다.
면역원은 구속된 타우 에피토프 펩티드를 함유하는 환형 화합물을 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 면역원성 향상제 또는 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 담체에 예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된, Lateef et al 2007에 기재된 방법을 사용하여 접합함에 의해 생성될 수 있다. 환형 펩티드는 절단된 광견병 당단백질(MyBiosource Inc, 캘리포니아주 샌디에고 소재)과 같은 단백질 담체에 접합될 수 있다. 일 실시형태에서, 실시예에 기재된 방법이 사용된다.
III. 항체
따라서, 본 명세서에 기술된 타우 펩티드 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 또는 KLDFK (서열번호: 1)와 같은 KLDFK (서열번호: 1)의 임의의 3개 또는 4개 아미노산 잔기를 포함하는 화합물 및 특히 환형 화합물은 상기 타우 펩티드를 포함하는 환형 화합물을 선택적으로 결합하고/하거나 잘못 접힌 올리고머성 타우를 포함하는 잘못 접힌 형태의 타우에 또한 결합하는 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 항체는 잘못 접힌 올리고머성 타우에서 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1) 또는 이의 일부에 선택적으로 결합할 수 있다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 환형 화합물은 모노머성 타우와 유사하지 않고 부분적으로 펼쳐진 또는 응력을 받은 피브릴형 타우(바이어스된 타우)에 유사한 하나 이상의 공간 형태를 나타낸다. 환형 펩티드에 대해 선택적이고 또한 잘못 접힌 올리고머성 타우에 선택적으로 결합하는 것으로 예상되는 상기 화합물을 사용하여 추가 항체를 생성할 수 있다. 유사하게, 예를 들어 본 명세서에 기술된 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 및/또는 다른 관련 에피토프 서열을 포함하는 환형 화합물은 잘못 접힌 올리고머성 타우의 맥락에서 접근가능한 이들 잔기에서 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 기술된 화합물 및 특히 환형 화합물은, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 차별적 특징을 포함하여, 이들이 포함하는 타우에서 에피토프에 선택적으로 결합하고/하거나 타우에서 이들 잔기의 특이적 형태를 인식하는 항체를 생성시키는 데 사용될 수 있다.
따라서, 일 양태는 타우 상의 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체를 포함하며, 상기 에피토프는 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1), 이의 일부와 같은 관련 에피토프, 임의로 전술한 어떤 것의 형태적 에피토프를 포함하거나 이것으로 구성된다. 일 실시형태에서, 여기서 에피토프가 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1)로 구성되는 경우 그것은 형태적 에피토프이다.
일 실시형태에서, 항체는 형태 선택적 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 형태 선택적 KLDFK (서열번호: 1) 또는 이의 일부 결합 항체, 예컨대 KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3) 결합 항체이다.
일 실시형태에서, 항체는 단리된다.
일 실시형태에서, 항체는 모노머성 타우에 특이적으로 결합하지 않는다. 선택적 결합은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명 측정을 사용하여 측정될 수 있다.
따라서 추가 양태는 잘못 접힌 올리고머성 타우(예를 들어, 형태적 에피토프) 상에 존재하는 에피토프에 선택적으로 결합하는 항체이며, 여기서 에피토프는 서열 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1), 또는 이의 일부를 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 실시형태에서, 에피토프는 형태적 에피토프이고 아미노산 서열 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1)로 구성된다. 일 실시형태에서, 항체는 환형 펩티드에서 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1)에 선택적으로 결합하고, 임의로 여기서 링커는 임의의 GGCG (서열번호: 186; 1,2 링커), GCGG (서열번호: 43; 2,1 링커), GCG (1,1 링커), GCGGG (서열번호: 44; 3,1 링커), GGCGGG (서열번호: 45; 3,2 링커), GGGCG (서열번호: 46; 1,3 링커), GGGGCGG (서열번호: 65; 2,4 링커) 또는 GCGGGG (서열번호: 47; 4,1 링커) 또는 본 명세서에 기재된 임의의 다른 링커로부터 선택된다. 예를 들어, 에피토프 KLDF (서열번호: 2)와 결합된 링커 GGCGGG (서열번호: 45)는 예를 들어 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16)를 생성한다.
일 실시형태에서, 항체는 상응하는 선형 펩티드와 비교하여 환형 화합물에 선택적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKG) (서열번호: 31)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGKLDFKG) (서열번호: 4)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGGKLDFKG) (서열번호: 39)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 5)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKGGGG) (서열번호: 34)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 35)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGKLDFG) (서열번호: 7)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGGKLDFG) (서열번호: 19)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGGLDFKG) (서열번호: 52)이다. 일 실시형태에서, 환형 화합물은 사이클로(CGLDFKGG) (서열번호: 49)이다.
일 실시형태에서, 항체는 (예를 들어, 모노머성 구조 앙상블과 비교하여 환형 화합물에서 에피토프의) 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 대안적 형태 특징을 포함하는 본 명세서에 기재된 에피토프 펩티드를 포함하는 환형 화합물에 선택적으로 결합한다. 예를 들어, 특정 에피토프 형태에 결합하는 항체는 형태 특이적 항체로 지칭될 수 있다. 형태 특이적/선택적 항체는 특정의 잘못 접힌 올리고머성 타우 종을 차등적으로 인식할 수 있고, 모노머성 종과 비교하여 한 종 또는 종의 군에 대해 더 높은 친화도를 가질 수 있다.
일 실시형태에서, 항체는 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), 또는 KLDFK (서열번호: 1) 또는 이의 일부를 포함하는 환형 화합물에, 임의로는 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 35) 또는 모노머성 타우와 비교하여 표 2, 4 및/또는 7에 열거된 다른 환형 펩티드 서열의 맥락에서, 선택적으로 결합한다. 예를 들어, 일 실시형태에서 항체는 환형 형태인 KLDFK (서열번호: 1)에 선택적으로 결합하고, 예를 들어, ELISA 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해, 임의로 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 측정될 때, 모노머성 앙상블에서 KLDFK (서열번호: 1)와 비교한 환형 형태에서 KLDFK (서열번호: 1)에 대해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배 이상의 선택적인 더 큰 선택성(예를 들어, 결합 친화성)을 갖는다.
일 실시형태에서, 항체는 모노머성 앙상블 또는 타우의 종에 비해 에피토프를 포함하는 환형 화합물, 예를 들어 천연 모노머성 타우에 비해 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드에 선택적으로 결합한다. 일 실시형태에서, 선택성은 타우의 모노머성 앙상블에서 선택된 타우 종보다 환형 화합물 및/또는 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드에 대해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배 이상 더 선택적인 것이다.
일 실시형태에서, 항체는 본 명세서에 기재된 환형 펩티드를 포함하는 면역원으로 면역화함에 의해 출현되었다. 일 실시형태에서, 환형 펩티드(또는 선형 펩티드)는 표 2, 4 또는 7에 열거된 화합물로부터 선택되고, 임의로 여기서 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKG) (서열번호: 31; 링커 2,1을 가짐), 사이클로(CGKLDFKG) (서열번호: 4; 링커 1,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 39; 링커 4,1을 가짐), 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 5; 링커 1,2를 가짐), 사이클로(CGKLDFKGGGG) (서열번호: 34; 링커 3,2를 가짐), 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 35, 링커 3,1을 가짐), 사이클로(CGKLDFG) (서열번호: 번호: 7; 링커 1,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15; 링커 3,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 19; 링커 4,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16; 링커 3,2를 가짐), 사이클로(CGGLDFKG) (서열번호: 52; 링커 2,1을 가짐) 또는 사이클로(CGLDFKGG) (서열번호: 49; 링커 1,2를 가짐)로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 항체는 표 10에 언급된 바와 같은 클론의 가변 영역을 갖는 및/또는 표 11에 언급된 바와 같은 CDR 서열 (예를 들어, CDR 서열 세트)을 갖는 항체로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00003
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00004
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00005
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00006
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00007
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00008
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00009
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00010
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00011
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고, 상기 CDR의 아미노산 서열은 다음 서열을 포함한다:
Figure pct00012
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호: 75 및 76; 서열번호: 77 및 78; 서열번호: 79 및 80; 서열번호: 81 및 82; 서열번호: 83 및 84; 서열번호: 85 및 86; 서열번호: 87 및 88; 서열번호: 89 및 90; 서열번호: 91 및 92; 또는 서열번호: 93 및 94의 서열을 포함하거나, 서열번호: 75 및 76; 서열번호: 77 및 78; 서열번호: 79 및 80; 서열번호: 81 및 82; 서열번호: 83 및 84; 서열번호: 85 및 86; 서열번호: 87 및 88; 서열번호: 89 및 90; 서열번호: 91 및 92; 또는 서열번호: 93 및 94의 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 여기서 CDR 서열은 표 10에서 밑줄 친 것과 같다.
모노클로날 항체를 생산하기 위해, 항체 생산 세포(림프구)는 본 명세서에 기재된 면역원으로 면역화된 대상체로부터 수확될 수 있고, 표준 체세포 융합 절차에 의해 골수종 세포와 융합되어 이들 세포를 불멸화하고 본 명세서에 기재된 방법을 포함한 하이브리도마 세포를 생성할 수 있다. 이러한 기술은 당업계(예를 들어, Kohler 및 Milstein에 의해 원래 개발된 하이브리도마 기술(Nature 256:495-497(1975))뿐만 아니라 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al., Immunol.Today 4:72 (1983)), 인간 모노클로날 항체를 출현시키기 위한 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Methods Enzymol, 121:140-67 (1986)), 및 조합 항체 라이브러리의 스크리닝(Huse et al. al., Science 246:1275 (1989))과 같은 다른 기술에서 잘 알려져 있다. 하이브리도마 세포는 원하는 에피토프와 임의로 반응성인 항체의 생산을 위해 면역화학적으로 스크리닝될 수 있고 모노클로날 항체는 단리될 수 있다.
특정 항원 또는 분자에 대해 반응성인 특이적 항체 또는 항체 단편은 또한 세포 표면 성분을 갖는 박테리아에서 발현되는 면역글로불린 유전자 또는 이의 부분을 인코딩하는 발현 라이브러리를 스크리닝함에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 완전한 Fab 단편, VH 영역 및 FV 영역은 파지 발현 라이브러리를 사용하여 박테리아에서 발현될 수 있다(예를 들어 Ward et al., Nature 41:544-546 (1989); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); 및 McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990) 참조).
CDR을 포함하는 항체 서열은 하이브리도마를 생산하는 모노클로날 항체로부터 수득된 면역글로불린 전사체의 서열 분석에 의해 결정될 수 있다.
추가로, 본 명세서에 기재된 에피토프에 특이적인 항체는 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝함에 의해 용이하게 단리된다. 예를 들어, 항체 파지 라이브러리는 질환 특이적 에피토프에 특이적인 항체 단편을 식별하기 위해 본 개시내용의 질환 특이적 에피토프를 사용함에 의해 임의로 스크리닝된다. 식별된 항체 단편은 본 개시내용의 상이일 실시형태에 유용한 다양한 재조합 항체를 출현시키기 위해 임의로 사용된다. 항체 파지 디스플레이 라이브러리는 예를 들어 Xoma(캘리포니아주 버클리 소재)를 통해 상업적으로 입수가능하다 항체 파지 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
일 실시형태에서, 항체는 단일 사슬 항체이다. 일 실시형태에서, 항체는 인간화 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 단일 사슬 인간화 항체이다.
본 명세서에 기재된 항체 및 예를 들어 검출가능한 표지를 포함하는 면역접합체가 또한 제공된다. 이러한 항체는 예를 들어 생체내에서 병원성 종을 검출하거나 혈액 또는 이의 분획 또는 CSF와 같은 샘플에서 병원성 타우를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 병원성 타우의 수준을 결정함에 의해 임상 시험에서 약물 효능 및/또는 표적 계합을 결정하는 데 사용될 수 있다.
IV. 핵산 및 세포
추가 양태는 본 명세서에 기재된 항체 또는 부분을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산이다. 예를 들어, 단리된 핵산은 표 11에 나타난 바와 같은 CDR(예를 들어, 거기에 나타난 바와 같은 세트)을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 핵산은 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 일부 (예를 들어, 중쇄 가변 도메인, 경쇄 가변 도메인 등)를 인코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 서열번호: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 또는 94 중 임의의 하나의 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열, 또는 서열번호: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 또는 94 중 임의의 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 서열번호: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 또는 174 중 임의의 하나의 서열, 또는 서열번호: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 또는 174 중 임의의 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 서열번호: 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 또는 93 중 임의의 하나의 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열 또는 서열번호: 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 또는 93 중 임의의 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 실시형태에서, 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 서열번호: 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 또는 173 중 임의의 하나의 서열, 또는 서열번호: 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 또는 173 중 임의의 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 이러한 핵산은 예를 들어 단일 사슬 항체를 출현시키기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 핵산은 단일 사슬 항체를 인코딩한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 서열번호: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 또는 94 중 임의의 하나의 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열, 또는 서열번호: 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 또는 94 중 임의의 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열 및 서열번호: 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 또는 93 중 임의의 하나의 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 서열, 또는 서열번호: 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 또는 93 중 임의의 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 상기 인코딩된 항체는 본 명세서에 기재된 올리고머성 타우 및/또는 환형 화합물에 결합한다. 일 실시형태에서, 핵산은 표 10에 열거된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 서열 및/또는 표 11에 열거된 CDR 서열을 갖는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 핵산은 서열 서열번호: 155 및 156; 서열번호: 157 및 158; 서열번호: 159 및 160; 서열번호: 161 및 162; 서열번호: 163 및 164; 서열번호: 165 및 166; 서열번호: 167 및 168; 서열번호: 169 및 170; 서열번호: 171 및 172; 또는 서열번호: 173 및 174, 또는 서열번호: 155 및 156; 서열번호: 157 및 158; 서열번호: 159 및 160; 서열번호: 161 및 162; 서열번호: 163 및 164; 서열번호: 165 및 166; 서열번호: 167 및 168; 서열번호: 169 및 170; 서열번호: 171 및 172; 또는 서열번호: 173 및 174에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 인코딩된 항체는 본 명세서에 기재된 올리고머성 타우 및/또는 환형 화합물에 결합한다.
표 12에는 표 10에 기재된 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 기재되어 있다. 실시형태에서, 가변 도메인을 인코딩하는 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산이 또한 제공된다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 일부를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산은 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 분비 신호 펩티드는 천연 분비 신호 펩티드 또는 비-천연 신호 분비 신호 펩티드일 수 있다.
일 실시형태에서, 핵산은 분비 신호 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 분비 신호 펩티드는 천연 중쇄 신호 펩티드 또는 천연 경쇄 신호 펩티드일 수 있다. 예시적인 중쇄 신호 서열은 METGLRWLLLVAVLKGVQCQ (서열번호: 175), MEGLGLSWIFLLAILKGVQC (서열번호: 176), MELGLRWVFLVAILEGVQC (서열번호: 177), MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (서열번호: 178), MDWTWRILFLVAAATGAHS (서열번호: 179), MDWTWRFLFVVAAATGVQS (서열번호: 180), MEFGLSWLFLVAILKGVQC (서열번호: 181), MEFGLSWVFLVALFRGVQC (서열번호: 182) 또는 MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS (서열번호: 183)를 함유/포함한다. 예시적인 경쇄 신호 서열은 MDMRVPAQLLGLLLLWLSGARC (서열번호: 184) 또는 MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (서열번호: 185)를 포함한다.
핵산은 또한 검출가능한 태그, 예를 들어 일반적으로 사용되는 정제 태그 또는 검출 태그 예컨대 HA, FLAG, 또는 MYC를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
서열은 코돈 최적화, 예를 들어 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 핵산을 포함하는 발현 카세트 또는 벡터이다. 발현 카세트는 예를 들어 항체를 인코딩하는 핵산, 임의로 단일 사슬 항체, 및 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 벡터는 단리된 벡터이다.
벡터는 임의의 벡터, 적합하게는 본 명세서에 기재된 단일 사슬 항체를 생산하는데 적합한 발현 벡터일 수 있다. 실시형태에서, 벡터는 예를 들어 단일 사슬 항체(예를 들어, 인트라바디)를 발현하는데 적합하다.
핵산 분자는 공지된 방식으로 단백질의 발현을 보장하는 적절한 발현 벡터 안으로 통합될 수 있다.
가능한 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 포함하는 복제 결함 레트로바이러스)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 벡터는 뉴런 세포를 형질도입할 수 있는 아데노 연관 바이러스(예를 들어, AAV 혈청형 9)이다.
벡터는 적절한 조절 서열을 포함할 수 있다.
적합한 조절 서열은 박테리아, 진균, 바이러스, 포유동물 또는 곤충 유전자를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예는 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 번역 개시 신호를 포함하는 리보솜 결합 서열을 포함한다. 추가적으로, 형질감염/감염/형질도입될 세포 및 이용되는 벡터에 따라, 복제 기점, 추가 DNA 제한 부위, 인핸서 및 전사 유도성을 부여하는 서열과 같은 다른 서열이 발현 벡터에 통합될 수 있다. 실시형태에서, 조절 서열은 신경 조직 및/또는 세포에서 발현을 지시하거나 증가시킨다. 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 재조합 발현 벡터는 또한 본 명세서에 기재된 항체를 발현하기 위한 벡터로 형질전환, 감염 또는 형질감염된 숙주 세포의 선택을 용이하게 하는 마커 유전자를 함유할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 또한 예를 들어 본 명세서에 기재된 태그 또는 표지를 포함하여, 검출을 도울 수 있는 (예를 들어, 항체 "융합 단백질"을 출현시키기 위한) 예를 들어 융합 모이어티 또는 검출가능한 표지를 인코딩하는 다른 발현 카세트를 함유할 수 있다.
핵산 또는 벡터는 예를 들어 대상체 내 또는 대상체에 대한 세포에서 세포내 발현을 위해, 세포에서 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 일부를 생성하거나 상기 항체 또는 결합 단편을 전달하는데 사용될 수 있으며, 임의로 여기서 항체는 단일 사슬 항체이다.
바이러스 벡터, "네이키드" DNA, 지질 또는 기타 나노입자 내 DNA, 아쥬번트 보조 DNA, 유전자 건 등을 포함하여 세포를 형질도입하기 위한 광범위한 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터가 또한 세포를 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 양태를 실행하는데 유용한 다른 벡터 시스템은 아데노바이러스 또는 아데노 연관 바이러스 기반 벡터를 포함한다.
또한 다른 양태에서 본 명세서에 기재된 항체를 발현하는 세포가 제공된다. 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기재된 항체를 발현하거나 본 명세서에 기재된 벡터를 포함하는 단리된 및/또는 재조합 세포이다. 실시형태에서, 세포는 하이브리도마와 같은 융합된 세포이다. 실시형태에서, 세포는 CHO 세포, HEK-293 세포와 같은 포유동물 세포이다. 실시형태에서, 세포는 Sf9, Sf21, Tni, 또는 S2와 같은 곤충 세포이다.
V. 조성물
추가 양태는 본 명세서에 기재된 환형 화합물, 면역원, 면역접합체, 핵산, 벡터 또는 항체를 포함하는 조성물이다.
실시형태에서, 조성물은 희석제를 포함한다.
항체 또는 이의 단편 및/또는 세포를 포함하는 폴리펩티드에 적합한 희석제는 염수 용액, pH 완충 용액 및 글리세롤 용액 또는 폴리펩티드 및/또는 세포를 동결시키기에 적합한 기타 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
핵산 또는 벡터에 적합한 희석제는 물, 염수 용액 또는 에탄올을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
조성물은 핵산 및/또는 벡터를 전달하는 것을 돕기 위한 리포솜, 나노입자, 또는 나노솜과 같은 지질 입자를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 일부 및 희석제를 포함한다. 실시형태에서, 조성물은 멸균 조성물이다.
조성물은 척추강내, 실질내 또는 뇌실내 투여용으로 제형화될 수 있다.
실시형태에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함한다. 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 방법을 위한 것이다.
조성물은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체, 면역접합체, 환형 화합물, 면역원, 세포, 핵산 또는 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 항체 또는 결합 단편; 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 면역접합체; 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 환형 화합물; 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 면역원; 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 세포; 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 핵산 또는 본 명세서에 기재된 2, 3, 4 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
예를 들어 환형 화합물, 면역원 또는 이들 중 임의의 조합(예를 들어, 다중 환형 화합물, 면역원 또는 이의 혼합물 포함)을 포함하는 조성물은 면역원성이고 항체, 예를 들어 올리고머성 타우에 대해 선택적인 항체의 생산을 유도한다. 따라서, 양태는 환형 화합물, 면역원 또는 이들 중 임의의 조합, 예를 들어 2, 3, 4 이상의 환형 화합물; 2, 3, 4 이상의 면역원; 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함하는 면역원 조성물을 제공한다.
본 명세서에 기재된 화합물 또는 면역원을 포함하는 실시형태에서, 조성물은 아쥬번트를 포함한다.
사용될 수 있는 아쥬번트는 예를 들어 일반적으로 백신으로 사용되는 사멸되거나 약독화된 박테리아의 성분인 고유 아쥬번트(예컨대 지질다당류)를 포함한다. 외인성 아쥬번트는 전형적으로 항원에 비-공유적으로 연결되고 숙주 면역 반응을 향상시키도록 제형화된 면역조절제이다. 수산화알루미늄, 황산알루미늄 및 인산알루미늄(집합적으로 일반적으로 명반으로 지칭됨)이 아쥬번트로 일상적으로 사용된다. 광범위한 외부 아쥬번트는 면역원에 대한 강력한 면역 반응을 유발할 수 있다. 이들은 사포닌 예컨대 Stimulons(QS21, Aquila, 매사추세츠주 우스터 소재) 또는 이로부터 생성된 입자 예컨대 ISCOM 및 면역 자극 복합체 및, 막 단백질 항원 면역 자극 복합체와 복합된 ISCOMATRIX, 미네랄 오일을 갖는 플루로닉 중합체, 사멸된 마이코박테리아 또는 미네랄 오일, 프로인트의 완전 아쥬번트, 박테리아 생성물 예컨데 무라밀 디펩티드(MDP) 또는 지질다당류(LPS), 뿐만 아니라 지질 A, 또는 리포솜을 포함한다.
일 실시형태에서, 아쥬번트는 수산화알루미늄이다. 또 다른 실시형태에서, 아쥬번트는 인산알루미늄이다. 점막부착 특성을 갖는 아쥬번트는 Carbopols 또는 아크릴산(예컨대 폴리아크릴산)을 포함하는 것과 같은 중합체, 예컨대 Carbigen™ 아쥬번트; Emulsigen® 아쥬번트와 같은 수중유 기반 아쥬번트; 나노입자; 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
수중유 에멀젼은 스쿠알렌; 땅콩 기름; MF59(WO 90/14387); SAF(Syntex Laboratories, 캘리포니아주 팰로앨토 소재); 또는 Ribi™(Ribi Immunochem, 몬타나주 해밀톤 소재)뿐만 아니라 Emulsigen(Phibro Animal Health Corp, 뉴저지주 티넥 소재)을 포함한다. 수중유 에멀젼은 무라밀 펩티드(예를 들어, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), -아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE), N-아세틸글루사미닐-N-아세틸무라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드(DTP-DPP) 테라미드(TM)), 또는 기타 박테리아 세포벽 성분과 같은 면역자극제와 함께 사용될 수 있다.
아쥬번트는 단일 조성물로서 면역원과 함께 투여될 수 있다. 대안적으로, 아쥬번트는 면역원의 투여 전, 동시 및/또는 후에 투여될 수 있다.
실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 및 희석제를 포함한다. 실시형태에서, 조성물은 멸균 조성물이다.
본 명세서에 사용된 용어 화합물은 예를 들어 펩티드, 면역원, 항체, 면역접합체 등을 지칭할 수 있다.
또 다른 양태는 본 명세서에 기재된 항체 및 타우(예를 들어, 잘못 접힌 타우 올리고머 또는 가용성 피브릴)를 포함하는 항체 복합체를 포함한다. 복합체는 용액에 있을 수 있다.
VI. 키트
추가 양태는 i) 항체 및/또는 이의 결합 단편, 또는 상기 항체를 포함하는 면역접합체 ii) 핵산, iii) 환형 및/또는 선형 펩티드 또는 면역원, iv) 조성물 또는 v) 멸균 바이알 또는 기타 하우징과 같은 바이알에 포함된 본 명세서에 기재된 재조합 세포 및 임의로 참조 제제 및/또는 이의 사용 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.
VII. 방법
본 명세서에 기재된 화합물, 면역원, 핵산, 벡터, 면역접합체 및 항체를 제조하는 방법이 포함된다.
특히, KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3), KLDFK (서열번호: 1) 또는 관련 에피토프의 형태적 에피토프에 대해 선택적인 항체를 제조하는 방법이 제공된다. 방법은 현행 항체를 제조하기 위한 실시예에 기재된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 방법은 대상체에 본 명세서에 기재된 환형 화합물 또는 면역원을 투여하고, B 세포를 단리하고, 하이브리도마 세포주를 제조하거나 B 세포를 클로닝하는 단계; 및 면역원 또는 올리고머성 타우의 타우 펩티드에 대한 특이성에 대해 세포주에 의해 출현된 항체를 시험하는 단계, 예를 들어 선형 화합물에 비해 환형 화합물에 존재하는 타우 펩티드에 우선적으로 결합하는 항체를 식별하고/하거나 비-올리고머성 타우(예를 들어, 모노머성 타우)에 비해 올리고머성 타우에서 타우 펩티드에 우선적으로 결합하는 항체를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 서열이 결정되고 항체 또는 이의 단편이 합성된다.
항체 라이브러리는 또한 본 명세서에 기재된 환형 화합물 및 선택된 적합한 특성을 갖는 항체를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 적합한 특성은 본 명세서에 기재된 항체 특성 중 하나 이상을 포함한다.
추가 양태는 시험 샘플이 잘못 접힌 올리고머성 타우를 포함하는지 여부를 검출하는 방법을 제공한다.
실시형태에서, 본 방법은 다음을 포함한다:
a. 시험 샘플을 항체 생성을 허용하는 조건 하에서 본 명세서에 기재된 항체 또는 면역접합체: 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩타이드 복합체와 접촉시키는 단계; 및
b. 임의의 복합체의 존재를 검출하는 단계;
여기서 검출가능한 복합체의 존재는 시험 샘플이 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩타이드를 함유할 수 있다는 것을 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 본 방법은 다음을 포함한다:
a. 상기 대상체의 시험 샘플을 항체-항원 복합체를 생성하도록 허용하는 조건 하에서 본 명세서에 기재된 항체 또는 면역접합체와 접촉시키는 단계;
b. 시험 샘플 내 항체-항원 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
c. 시험 샘플 내 항체-항원 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;
여기서 대조군과 비교하여 시험 샘플에서 항체-항원 복합체를 검출하는 것은 샘플이 잘못 접힌 올리고머성 타우를 포함한다는 것을 나타낸다.
실시형태에서, 시험 샘플은 생물학적 샘플이다. 실시형태에서, 시험 샘플은 뇌 조직 또는 그의 추출물, 타액, 혈액, 및/또는 뇌척수액(CSF)을 포함한다. 실시형태에서, 시험 샘플은 인간 대상체로부터 수득된다.
일부 실시형태에서, 시험 샘플은 타우 유전자에 유전적 돌연변이를 포함하는 대상체로부터의 것이다.
또 다른 실시형태에서, 시험 샘플은 타우병증을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체로부터의 것이다. 예를 들어, 타우병증은 알츠하이머병(AD), 픽병, 전두측두엽 치매 또는 전두측두엽 변성, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 원발성 연령-관련 타우병증, 만성 외상성 뇌병증, 아급성 경화성 범뇌염, 17번 염색체와 관련된 전두측두엽 치매 또는 파킨슨증이다.
면역검정 예컨대 유동 세포측정법, 도트 블롯, 웨스턴 블롯, ELISA 또는 면역침전과 뒤이은 SDS-PAGE 면역세포화학 또는 기타 검출 플랫폼(예를 들어, SIMOA, MSD 등)을 포함하여, 본 명세서에 기술된 항체를 사용하여 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩타이드가 시험 샘플에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 다수의 방법이 사용될 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명은 형태 특이적 결합을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 표지된 항체 또는 면역접합체는 또한 잘못 접힌 타우의 위치를 검출하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 측정은 예를 들어 면역형광 또는 PET 트레이서에 의한 것일 수 있다.
방법은 또한 공동국지화 염색, 예를 들어 팬-타우 염색을 포함할 수 있다.
추가 양태는 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물, 면역원, 핵산 또는 벡터 또는 전술한 것 중 임의의 것을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 투여된 화합물 또는 면역원에 특이적으로 결합하는 세포 및/또는 항체를 단리하는 것을 포함한다. 단리된 항체는 실시예에 기재된 하나 이상의 검정을 사용하여 시험될 수 있다.
실시예에 기재된 바와 같이, 세포내 타우 응집체의 타우 PFF-유도 형성을 억제 또는 감소시키는 항체의 능력은 세포 형광 에너지 공명 전달(FRET) 검정을 사용하여 결정되었다. Holmes, BB et al에 의해 보고된 바와 같이, FRET 검정에서 단백질요법 타우 시딩 활성은 마우스 모델에서 "타우병증의 초기 및 강력한 마커"이다. 따라서 본 명세서에 관찰된 바와 같이 항체에 의한 시딩의 억제는 타우 발병을 억제하는 것으로 예상될 것이다.
따라서, 추가 양태는 본 명세서에 개시된 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴, 항체, 환형 화합물, 면역원, 면역접합체, 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포 또는 조직을 - 세포 또는 조직과 접촉시키거나 또는 - 세포 또는 조직에 투여하는 것을 포함하는, 타우 응집/응집체 및/또는 증식을 감소 또는 억제하는 방법을 포함한다.
실시형태에서, 세포 또는 조직은 시험관내에 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포 또는 조직은 생체내에 있다. 예를 들어, 세포 또는 조직은 대상체, 임의로 인간 대상체 내에 있다. 예를 들어, 세포는 뇌 세포이다. 예를 들어, 조직은 뇌 조직 추출물 및/또는 뇌척수액(CSF)이다.
본 명세서에 개시된 또 다른 양태는 유효량의 본 명세서에 개시된 항체, 환형 화합물, 면역원, 면역접합체, 핵산 또는 벡터 또는 상기 항체, 환형 화합물, 면역원, 면역접합체, 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 타우병증 치료를 필요로 하는 대상체에서 타우병증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 항체, 환형 화합물, 면역원, 면역접합체, 핵산 또는 벡터는 CNS 내로, 예를 들어 척수강내, 실질내 또는 뇌실내 투여 경로를 통해, 또는 말초적으로 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 또는 피하 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 벡터화된 항체는 CNS 내로 또는 말초로 전달될 수 있다.
실시형태에서, 타우병증은 알츠하이머병(AD), 픽병, 전두측두엽 치매 또는 전두측두엽 변성, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 원발성 연령-관련 타우병증, 만성 외상성 뇌병증, 아급성 경화성 범뇌염, 17번 염색체와 관련된 전두측두엽 치매 또는 파킨슨증이다.
실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
핵산 또는 벡터는 예를 들어 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물에 포함될 수 있고/있거나 예를 들어 핵산 및/또는 벡터의 전달을 돕기 위한 나노입자, 또는 나노솜에 제형화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물, 항체, 면역접합체, 핵산 및/또는 벡터는 예를 들어 비경구, 정맥내, 피하, 근육내, 두개내, 뇌실내, 척추강내, 안와내, 안과, 척수강내, 지주막내, 복강내, 비강내, 에어로졸 또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시형태는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 이송을 촉진하는 것으로 알려진 생물학적으로 활성인 분자와 본 명세서에 기재된 조성물, 항체, 면역접합체, 핵산 및/또는 벡터의 공동-투여를 고려한다.
특정 실시형태에서 또한, 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 7,012,061의 "혈액 뇌 장벽의 투과성을 증가시키는 방법"에 기재된 바와 같이 혈액 뇌 장벽의 투과성을 일시적으로 증가시키기 위한 것과 같은 혈액 뇌 장벽을 가로질러 본 명세서에 기재된 조성물, 항체, 면역접합체, 핵산 및/또는 벡터를 투여하는 방법이 고려된다.
항체 발현을 필요로 하는 대상체에서 본 명세서에 기재된 하나 이상의 항체의 발현을 위한 본 명세서에 기재된 핵산 또는 벡터의 바이러스 전달이 또한 본 명세서에서 고려된다. 양태는 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 개시내용의 벡터화된 항체, 또는 상기 벡터화된 항체를 포함하는 조성물을 임의로 또 다른 타우병증 치료와 조합하여 투여하는 것을 포함하는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 일 실시형태에서, 벡터화된 항체는 거기에 기재된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 방법은 발현을 필요로 하는 대상체에서 인트라바디의 세포내 발현을 위한 것이다.
예를 들어, 아데노-연관 바이러스(AAV, 예를 들어 AAV9) 또는 렌티바이러스 벡터 등과 같은 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터가 또한 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산, 벡터 또는 조성물은 뇌실내로 또는 척추강내로 주사될 수 있다. 다른 실시형태에서, 핵산, 벡터 또는 조성물은 예를 들어 분비된 단일 사슬 항체의 지속적인 생산을 위한 데포를 사용하여 정맥내로 또는 피하로 또는 근육내로 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 항체, 환형 화합물, 면역원, 면역접합체, 핵산 또는 벡터는 타우병증에 대한 조합 치료의 일부로서 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 실시형태에서, 치료하는 방법은 추가 치료와 함께 본 명세서에 개시된 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
실시형태에서, 추가 치료는 추가 항체, 항우울제(예를 들어, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제), 항정신병제, 레보도파, 도파민 효능제, 및/또는 이의 혼합물이다. 예를 들어, 추가 항체는 국제 특허 공개 번호 WO 2017/079833, WO 2017/079834, WO 2017/079831, WO 2017/079832 또는 WO 2017/079835에 기재된 바와 같은 아밀로이드-베타에 결합하는 항체이고, 그의 각각은 그 전체로 참고로 본 명세서에 포함된다.
상기 개시내용은 본 출원을 일반적으로 기술한다. 다음의 특정한 실시예를 참조하면 보다 완전한 이해를 얻을 수 있다. 이들 실시예는 예시의 목적으로만 기술된 것이며 출원의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 상황이 제안하거나 적절할 수 있는 경우 형식에서의 변경 및 등가물의 대체가 고려된다. 본 명세서에서 특정한 용어가 이용되었지만, 그러한 용어는 제한을 위한 것이 아니라 설명적인 의미로 의도된다.
다음의 비-제한적인 실시예는 본 개시내용을 예시한다:
실시예
실시예 1
단백질(또는 펩티드-응집체)을 강제로 잘못 접히게 한 다음 부분적으로 구조화되지 않은 단백질(또는 펩티드 응집체)의 가장 가능성 있는 펼쳐진 영역을 예측하는 단백질(또는 펩티드-응집체) 상에 전반적 좌표 바이어스를 부과하는 분자-동역학-기반 시뮬레이션이 사용되어, 잘못 접힌 올리고머성 타우에 임의로 또는 우선적으로 표시되는 에피토프를 식별하였다. 바이어싱 시뮬레이션을 수행하고 각 잔기에 상응하는 용매 접근가능 표면적(SASA)에서의 변화를 측정했다(고려 중인 단백질의 초기 피브릴 구조의 것에 비교됨). SASA는 H2O에 접근할 수 있는 표면적을 나타낸다. SASA에서 긍정적인 변화(고려 중인 단백질의 초기 구조의 것에 비교됨)는 연관된 잔기 지수의 영역에서 풀림을 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 2가지 다른 방법이 SASA에 부가하여 사용되어 후보 에피토프를 식별한다. 이들은 컷-오프 길이 내의 비-수소 원자에 의해 정의되는 피브릴 접촉의 손실과 구조적 앙상블에서 평균에 대한 편차의 정도를 측정하는 평균 제곱근 변동(RMSF; root mean squared fluctuations)이었다; 여기서 일부 아미노산에 대한 RMSF에서 증가는 그들 아미노산의 동역학이 증가함을 나타낸다.
NMR에서 자주 사용되는 Lipari-Szabo S2 차수 매개변수[J. Am. Chem. Soc., 1982, 104 (17), pp 4546-4559, DOI: 10.1021/ja00381a009]는 에피토프를 식별하기 위해 RMSF에 대한 대체 차수 매개변수로 사용될 수 있다.
방법은 타우 피브릴에 적용되었다(PDB 엔트리 5O3L).
타우 피브릴의 10개 사슬의 구조가 결정되었고 단백질 데이터뱅크에 PDB 엔트리 5O3L로 열거된다. PDB 5O3L 구조, 임의의 그 일부 또는 예를 들어 N- 및 C- 말단 둘 모두 상의 10개 아미노산에 의해 신장된 각 사슬의 전 서열은 평형 앙상블을 얻기 위해 컴퓨터에서 평형화될 수 있으며, 이는 본 명세서에서 가변적으로 "구조화된 피브릴" 또는 "타우의 바이어스되지 않은 피브릴 구조", "타우의 피브릴 앙상블", "타우의 평형 피브릴 앙상블" 또는 "타우 피브릴 구조 앙상블"로 지칭되는 타우의 피브릴 구조에서 에피토프의 피브릴 형태의 모든 측정에 사용되었다.
모노머 앙상블은 예를 들어 먼저 PDB 피브릴(5O3L)로부터 사슬 중 하나를 출발 구조로 취함에 의해 획득될 수 있다. 타우는 큰 단백질이기 때문에 타우를 포함하는 부분이 분석되었다. 인간 타우의 잔기 296 내지 388이 분석에 사용되었다.
그런 다음, 피벗 알고리즘이 20회 구현되어 구성에 대한 큰 형태 변화를 유도하여, 따라서 새로운 무작위화된 구성을 생성한다. 그런 다음 피벗 알고리즘을 이 구성에서 20회 다시 실행하여 다른 무작위화된 구성을 생성하는 등등, 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 위한 초기 구성으로 사용되어 지는 다중의 상이한 접혀지지 않은 구조를 생성한다. 이들 초기 구조 각각에 대해, 본 발명자들은 그 다음 3ns 평형 시뮬레이션을 수행한다. 이들 시뮬레이션 중 일부의 경우 본 발명자들은 1ns마다 스냅샷을 수집했다. 다른 시뮬레이션의 경우 본 발명자들은 시뮬레이션의 종단에서 스냅샷 구성을 수집했다. 본 발명자들은 이들 MD 시뮬레이션에서 상관 시간이 일반적으로 1ns보다 작기 때문에 상기의 양 방법 모두 평형 앙상블을 생성하는 데 허용가능하다는 것을 발견했다. 모든 스냅샷을 축적하여 7166 구성(KLDFK (서열번호: 1) 및 LDFK (서열번호: 3)) 또는 5500 구성 (KLDF 서열번호: 2)을 갖는 모노머 앙상블을 생성했다.
시뮬레이션은 국제 특허 공개 번호 WO 2017/079836에 기술된 바와 같은 집합 좌표 방법과 다음 문헌 (K. Vanommeslaeghe, E. Hatcher, C.Acharya, S. Kundu, S. Zhong, J. Shim, E. Darian, O. Guvench, P. Lopes, I. Vorobyov, and A. D. Mackerell. Charmm general force field: A force field for drug-like molecules compatible with the CHARMM all-atom additive biological force fields. Journal of Computational Chemistry, 31(4):671-690, 2010; and P. Bjelkmar, P. Larsson, M. A. Cuendet, B. Hess, and E. Lindahl. Implementation of the CHARMM force field in GROMACS: analysis of protein stability effects from correlation maps, virtual interaction sites, and water models. J. Chem. Theo. Comp., 6:459-466, 2010)에 기술된 바와 같은 CHARMM 역장 매개변수(force-field parameters)를 사용하여 초기 피브릴 구조에 대해 수행되었으며, 그 둘 모두는 본 명세서에 참조로 포함되며 TIP3P 물을 용매로 한다. 집합 좌표 방법은 원래 접촉의 60%로 부분적으로 무질서한 피브릴 구조를 유도하기 위해 피브릴 구조에 전역 바이어스를 적용한다. 접촉은 WO/2017/079836에 기재된 바와 같이 컷 오프 거리 내에서 비-수소 애덤스에 의해 정의된다.
부분적으로 무질서한 피브릴 구조는 100ns에 대해 원래 접촉의 60%를 갖도록 유지된다. 이는 WO/2017/079836에 기재된 바와 같이 10회 반복된다. 이들 시뮬레이션의 마지막 49ns는 스냅샷 형태를 얻는 데 사용된다. 스냅샷이 취해지는 총 시뮬레이션 시간은 대략적으로 490ns이다. 4200 스냅샷이 균일하게 샘플링되어 응력을 받은 또는 바이어스된 피브릴 앙상블을 생성한다.
PDB 5O3L 구조의 표현은 도 1에 도시되어 있다. 도 1a는 PDB 5O3L에 도시된 바와 같이 10개 사슬을 포함하는 tau의 도식적 표현이고, 도 1a는 부분적으로 피브릴 구조를 무질서하도록 집단 좌표 바이어싱 후 10개 사슬을 포함하는 타우의 도식적 표현이다.
30ns MD 시뮬레이션은 PDB 5O3L에서의 구조로부터 시작하여 실행되었다. 이 시뮬레이션으로부터, 3010 스냅샷이 균일하게 샘플링되어 피브릴 앙상블을 얻는다.
분석은 응력을 받은 피브릴에서 우선적으로 접근가능한 것으로 예측된 에피토프 서열을 식별했다.
에피토프 예측
응력을 받은 피브릴에서 모든 10개 사슬의 분석은 집합 좌표 방법에 따라 접혀지지 않는 경향이 있는 여러 영역을 식별했다.
아미노산 스트레치 344-346, 341-349, 342-350, 344-346, 343-346, 344-347, 345-347, 343-352 및 345-347은 잘못 접힌 올리고머성 타우에서 접근가능한 후보 영역 및 바이어싱 압력 하에서 접혀지지 않는 경향이 있는 영역으로 식별되었다. 평가된 기준은 용매 접근가능한 표면적(SASA)이었고, 여기서 SASA는 예를 들어 항체 결합에 더 접근하기 쉽고 단백질에 묻힐 가능성이 적은 영역을 식별한다.
아미노산 스트레치 337-346, 343-350, 341-346, 342-345, 341-345, 346-348 및 343-345는 잘못 접힌 올리고머성 타우에서 접근가능한 후보 영역 및 바이어싱 압력 하에서 접혀지지 않는 경향이 있는 영역으로 식별되었다. 평가된 기준은 피브릴 접촉의 수였으며, 여기서 피브릴 접촉의 손실은 접혀지지 않는 경향이 있는 영역을 식별한다.
에피토프 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 및 KLDFK (서열번호: 1)는 집합적 좌표 접근법을 사용하여 PDB 구조 5O3L로부터 예측된 에피토프로서 나타난다.
상기 지시된 바와 같이, 타우의 잔기 337 내지 352 내의 서열은 VEVKSEKLDFKDRVQS (서열번호: 23)에 상응하는 바이어싱 조건 하에 우선적으로 노출되는 것으로 식별되었다. 추가 에피토프는 예를 들어 임의의 4개 이상의 아미노산 스트레치, EKLDFKDR (서열번호: 24), KLDFKDR (서열번호: 25) 또는 SEKLDFKDRV (서열번호: 26)를 포함하는 서열번호: 23에 의해 제공된다. 도 2a에 도시된 바와 같이, ΔSASA, Δ접촉 및 ΔRMSF를 함께 고려할 때 서열 KLDFK (서열번호: 1)에서의 잔기가 가장 높은 예측 강도를 갖는다. 더 낮은 역치를 사용하여, 에피토프는 또한 N-말단 상의 SE 또는 이의 일부 또는 C-말단 상의 DRV 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
KLDF (서열번호: 2)는 PDB 5O3L의 아미노산 343 내지 346에 존재하고, LDFK (서열번호: 3)는 아미노산 344 내지 347에 존재하고 KLDFK (서열번호: 1)는 아미노산 343 내지 347에 존재한다.
16개 상이한 환형 펩티드 서열은 예측된 에피토프 서열(예를 들어, KLDFK (서열번호: 1), KLDF (서열번호: 2) 및 LDFK (서열번호: 3))의 어느 하나의 측면, N-말단 및 C-말단 상에 1-4개의 글리신을 추가함에 의해 출현되었다. 작제물을 단백질(예를 들어, KLH 또는 BSA)에 묶기 위해 시스테인 잔기가 포함되었다. 가능한 환형 펩티드 서열은 사이클로(CGKLDFKG) (서열번호: 4), 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 5), 및 사이클로(CGGKLDFKG) (서열번호: 6) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. MD 시뮬레이션을 2500개 스냅샷 형태(KLDFK (서열번호: 1) 또는 LDFK (서열번호: 3)) 또는 6000개 환형 펩티드 스냅샷 형태(KLDF (서열번호: 2))를 출현시키기 위해 이들 16개 서열 각각에 대해 300ns(KLDF (서열번호: 2) 스캐폴드의 경우 600ns)에 대해 실행했다.
아미노산 스캐폴드(예를 들어, 링커 포함)에 에피토프를 포함하는 상이한 환형 화합물을 본 명세서 및 실시예 2에 기술되고 추가 분석에 사용된 에피토프를 제시하기 위한 그 적합성에 대해 평가하였다.
환형 펩티드 앙상블에서의 에피토프 형태와 피브릴 앙상블 또는 모노머 앙상블에서의 그 형태 사이의 비유사성은 Jensen-Shannon 거리(JSD)를 사용하여 정량화할 수 있다. 이 거리는 임의의 두 쌍의 앙상블 사이에 효과적인 분리를 제공하며, 이는 2개의 가우시안 앙상블 간의 효과적인 분리로 재구성될 수 있다. 그 앙상블이 타우 모노머의 앙상블과 별개인, 에피토프 KLDF (서열번호: 2)(예를 들어, 사이클로(CGGGGKLDFG) (서열번호: 19)), 및 마찬가지로 LDFK (서열번호: 3) 및 KLDFK (서열번호: 1)의 환형 펩티드 스캐폴드, 및 바이어스되거나 응력을 받는 피브릴에 유사한 스캐폴드가 바람직하게 된다. 이들 2가지 기준인, 모노머 앙상블에 대한 큰 JSD와 응력을 받은 피브릴 앙상블에 대한 작은 JSD를 사용하여 다른 스캐폴드를 평가했다.
도 3a, b 및 c는 에피토프 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 및 KLDFK (서열번호: 1)에 대한 16개 환형 펩티드 스캐폴드에 대한 JSD의 산점도를 도시한다. XX의 JSD는 2개의 1-차원 가우시안 사이의 7.8 표준 편차(XX σ)의 유효 거리에 해당한다.
실시예 2
식별된 에피토프를 환형 형태로 제시하는 데 사용될 수 있는 스캐폴딩을 평가했다.
하기 표 2는 에피토프에 대한 다양한 수의 글리신 아미노산 N- 및 C-말단 및 시스테인 잔기로 에피토프를 측접함에 의하여 획득된 KLDF (서열번호: 2)에 대한 여러 환형 에피토프 스캐폴드를 제공한다. 적합성은 환형 펩티드의 앙상블과 타우 모노머의 평형 앙상블 사이, 및 환형 펩티드의 앙상블과 응력을 받는(즉, 바이어스된) 피브릴의 평형 앙상블 사이의 Jenson-Shannon-거리(JSD)를 측정함에 의해 평가된다. 응력을 받은/바이어스된 피브릴에 대한 유사성이 요구되는 반면, 생체내 기능에 대한 간섭을 회피하기 위해 모노머 앙상블에 대한 비유사성이 또한 요구된다. 이들 기준을 기반으로 적합할 것으로 예측되는 환형 펩티드 스캐폴드가 표 2에 기술되어 있다.
도 3a는 KLDF (서열번호: 2)에 대한 16개 환형 에피토프 스캐폴드에 대한 이의 데이터의 산점도를 도시한다.
[표 2]. 에피토프 KLDF (서열번호: 2)에 대한 환형 펩티드
Figure pct00013
[표 3]. JSD에 의해 측정된 바이어스된, 피브릴 및 모노머 앙상블에 대한 환형 작제물의 유사성
Figure pct00014
유사한 분석이 에피토프 KLDFK (서열번호: 1) 및 LDFK (서열번호: 3)에 대해 수행되었다. 적합한 스캐폴드가 표 4에 나타나 있다.
[표 4]. 에피토프 KLDFK (서열번호: 1) 및 LDFK (서열번호: 3)에 대한 환형 펩티드
Figure pct00015
도 3b 및 3c는 각각 LDFK (서열번호: 3) 및 KLDFK (서열번호: 1)에 대한 16개 순환 에피토프 스캐폴드에 대한 이 데이터의 산점도를 도시한다.
[표 5]. JSD에 의해 측정된 바이어스된 피브릴 및 모노머 앙상블에 대한 환형 작제물의 유사성
Figure pct00016
[표 6]. JSD에 의해 측정된 바이어스된 피브릴 및 모노머 앙상블에 대한 환형 작제물의 유사성
Figure pct00017
실시예 3
예측된 에피토프를 포함하는 환형 화합물 구성
예측된 에피토프 서열을 포함하는 화합물은 KLDFK (서열번호: 1), KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)와 같은 본 명세서에 기술된 에피토프 및 링커 서열을 포함하거나 이로 구성되는 선형 펩티드를 제조함에 의해 준비되고 고리화되어 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 28) 또는 사이클로(CGGKLDFKGGGG) (서열번호: 34)와 같은 환형 화합물을 만들 수 있다. 예를 들어, 환형 화합물은 선형 펩티드를 머리에서 꼬리로 고리화함에 의하여 제조될 수 있다.
예를 들어, KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)와 같은 에피토프 서열을 포함하는 펩티드는 바람직하게는 에피토프 서열에 대해 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 예컨대 글리신 및/또는 PEG 단위 C 말단 및/또는 N 말단을 포함하는 링커로 합성되거나 이에 접합될 수 있다. 시스테인 잔기 또는 기타 관능화가능한 잔기도 링커의 일부로 추가될 수 있다. 링커가 아미노산 서열로 구성되는 경우, 그것은 Fmoc 기반 고체상 펩티드 합성과 같은 공지된 방법을 단독으로 또는 다른 방법과 조합하여 사용하여 합성될 수 있다. PEG 분자는 예를 들어, 각각이 본 명세서에 참조로 포함된, 문헌(Hamley 2014 [Biomacromolecules, 2014, 15 (5), pp 1543-1559, DOI: 10.1021/bm500246w] 및 Roberts et al 2012 [ Advanced Drug Delivery Reviews, Volume 64, Supplement,　December 2012, Pages 116-127; M.J.RobertsM.D.BentleyJ.M.Harris https://doi.org/10.1016/j.addr.2012.09.025])에 기술된 커플링 화학을 사용하여 N 말단에서 아민기에 커플링될 수 있다. 화합물은 1) 펩티드 결합을 형성(예를 들어, 백본 고리화)하기 위해 펩티드+링커의 아미노 말단과 카르복시 말단, 2) 펩티드+링커에서 측쇄가 있는 아미노 또는 카르복시 말단 또는 3) 펩티드+링커에서 2개의 측쇄를 공유적으로 결합함에 의해 고리화될 수 있다.
환형 화합물에서의 결합은 모두 규칙적인 펩티드 결합(동종연결 환형 펩티드)이거나 에스테르, 에테르, 아미드 또는 이황화 결합과 같은 다른 유형의 결합(이종연결 환형 펩티드)을 포함할 수 있다.
펩티드는 N-말단 또는 C-말단에서, 또는 예를 들어 시스테인 및 호모시스테인을 포함하는 펩티드에 대해 내부에서 티올- 또는 메르캅탄-함유 잔기의 산화에 의해 고리화될 수 있다. 예를 들어, 펩티드에 측접하는 2개의 시스테인 잔기는 산화되어 이황화 결합을 형성할 수 있다. 이용될 수 있는 산화 시약은 예를 들어 산소(공기), 디메틸 설폭사이드, 산화된 글루타티온, 시스틴, 염화구리(II), 포타슘 페리시아나이드, 탈륨(III) 트리플루오로 아세테이트, 또는 당업자에게 공지되어 있을 수 있는 다른 산화 시약을 포함하고 당업자에게 공지된 바와 같은 방법과 함께 사용된다.
환형 펩티드 합성과 관련된 방법 및 조성물은 미국 특허 공개 2009/0215172에 기재되어 있다. 미국 특허 공개 2010/0240865, 미국 특허 공개 2010/0137559 및 미국 특허 7,569,541은 다양한 고리화의 방법을 기술한다. 다른 예는 PCT 공개 WO01/92466 및 Andreu et al., 1994. Methods in Molecular Biology 35:91-169에 기재되어 있다. 이들 참고문헌 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
언급된 바와 같이, 링커는 링커에 측접하는 및/또는 삽입된 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함할 수 있다. 펩티드는 펩티드의 N- 및 C-말단에 추가된 비-천연 시스테인 잔기 사이에 이황화 연결을 생성함에 의해 환형 구조로 구조화될 수 있다.
환형 펩티드는 담체, 임의로 BSA 모이어티 또는 KLH와 같은 면역원성 증강제에 연결될 수 있다.
본 명세서에 기재된 에피토프 서열을 포함하는 선형 및 환형 펩티드가 제조될 수 있다. 예는 표 7에 제공되어 있다.
[표 7]. 면역원에 대한 환형 펩티드 및 상응하는 선형 펩티드
Figure pct00018
펩티드 합성은 CPC Scientific Inc.(미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에 의해 수행된다. 펩티드는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지에 대한 표준 기존 Fmoc-기반 고체상 펩티드 합성에 의해 합성된 다음 수지로부터 절단된다. 펩티드 서열은 전자분무 MS에 의해 확인되고 순도는 HPLC에 의해 평가되어 적어도 95% 순도를 확인한다. 고리화는 헤드-투-테일 (C-G) 아미드 결합을 통해 수행될 수 있다. 비-고리화된 선형 펩티드가 또한 CPC Scientific에 의해 생산된다.
면역원 구축
환형 화합물은 그 다음 예를 들어 말레이미드-기반 커플링(CPC Scientific Inc, 캘리포니아주 서니베일 소재)을 통해 KLH(면역화용) 또는 BSA(스크리닝용)에 접합될 수 있다.
실시예 4
환형 펩티드(4,1) 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 19), (3,2) 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16) 및 (3,1) 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15)는 실시예 3에 기재된 바와 같이 CPC Scientific Inc.(미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에 의해 제조되고 KLH 또는 BSA에 접합되었으며 실시예 5에 기재된 바와 같이 항체를 생성하는데 사용되었다.
실시예 5
항체 생성 및 선택
연결된 펩티드는 캐나다 동물 관리 협의회(Immunoprecise Antibodies LTD(캐나다 빅토리아 BC 소재), 본 명세서에서 IPA로 지칭됨)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 마우스 모노클로날 항체 생산에 사용되었다.
면역화
간략하게, 암컷 BALB/c 마우스(Charles River Laboratories, 퀘벡 소재)를 IPA의 신속 프라임 면역화 절차를 사용하여 KLH-접합된 환형 펩티드로 면역화시켰다. 마우스를 랩 프로덕츠로부터의 환기식 랙 시스템에 수용했다. 모든 마우스를 19일차에 안락사시키고 하이브리도마 세포주 생성을 위해 림프구를 수확하였다.
융합/하이브리도마 개발
림프구는 단리되고 폴리-에틸렌 글리콜(PEG 1500)의 존재에서 또는 전기융합을 통해 뮤어라인 SP2/0 골수종 세포와 융합되었다. 융합된 세포는 HAT 선택을 사용하여 배양되었다. 이 방법은 반-고체 메틸셀룰로오스-기반 HAT 선택 배지를 사용하여 하이브리도마 선택과 클로닝을 한 단계로 결합된다. 단세포-유래 하이브리도마는 반-고체 배지 상에 단일 클론 콜로니를 형성하도록 성장된다. 융합 이벤트 약 10일 후에 생성된 하이브리도마 클론은 96-웰 조직 배양 플레이트로 이전될 수 있고 mid-log 성장에 도달할 때까지(5일) HT 함유 배지에서 성장될 수 있다.
하이브리도마 분석
하이브리도마로부터의 조직 배양 상청액을 스크리닝 항원(환형 펩티드-BSA 및 선형 펩티드-BSA)에 대한 간접 ELISA에 의해 테스트하고 염소 항-IgG/IgM(H&L)-HRP 이차 항체를 사용하여 IgG 및 IgM 항체 둘 모두에 대해 탐침하였고 TMB 기질로 전개하였다.
양성 배양물은 분비를 확인하기 위한 스크리닝 항원 및 관련 없는 항원(예컨대 인간 트랜스페린)에 대해 재검사하였다. 클론을 항체 트래핑 ELISA에 의해 동형화하여 이들이 IgG 또는 IgM 동형인지 결정하고 동일한 에피토프를 포함하는 다른 환형 펩티드-BSA 접합체에 대해 간접 ELISA에 의해 시험하여 교차-반응성을 평가하였다.
동형화
하이브리도마 항체는 항체 트랩 실험을 사용하여 동형화될 수 있다. 트랩 플레이트를 4C에서 밤새 100uL/웰 탄산염 코팅 완충액 pH 9.6에서 1:10,000 염소 항-마우스 IgG/IgM(H&L) 항체로 코팅했다. 1차 항체(하이브리도마 상청액)를 100ug/mL로 첨가한다. 이차 항체는 1:5,000 염소 항-마우스 IgGγ-HRP 또는 1:10,000 염소 항-마우스 IgMμ-HRP로 PBS-트윈에서 100uL/웰로 37C에서 진탕하면서 1시간 동안 첨가한다. 모든 세정 단계는 PBS-트윈으로 30분 동안 수행한다. 기질 TMB를 50uL/웰로 첨가하고 암실에서 전개하고 동일한 부피의 1M HCl로 중단시켰다.
결과
(4,1) 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 19), (3,2) 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16) 및 (3,1) 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15)로 면역화하여 얻은 항체는 ELISA에 의해 상응하는 선형 펩티드에 비해 환형 펩티드에 선택적으로 결합하였다. 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 분석된 항체의 대부분은 환형 펩티드와 반응성이었고 시험된 조건 하에서 상응하는 선형 펩티드와 거의 없는 또는 낮은 반응성을 나타내었다. 대부분의 항체는 다른 환형 펩티드 중 하나 또는 둘 모두의 환형 펩티드와 반응했다. 클론의 하위집합은 그것이 생성된 환형 펩티드와만 반응했다. (OD = 광학 밀도)
[표 8]. 환형 및 선형 펩티드에 대한 항체 클론의 반응성
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예 6
항-잘못 접힘 올리고머성 타우 항체 특성화
항체는 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 뿐만 아니라 모노머성 타우 폴리펩티드에 결합하는 그 능력에 대해 시험되었다. 표면 플라즈몬 공명 측정은 분자 친화도 스크리닝 시스템(Sierra Sensors, 독일 함부르그 소재)을 사용하여 수행되었다. 타우 모노머(Stressmarq, 캐나다 BC 빅토리아 소재) 또는 타우 올리고머(SynAging, 프랑스 방되브르-레-낭시 소재)는 높은 아민 용량 센서칩 상에 고정화되고 하이브리도마 상층액(50% 희석)은 4분 동안 10μl/min으로 고정화 표면 위로 주입된 후 5분 해리 단계가 수행되었다. 마우스 IgG1은 음성 대조군으로 사용되었고 팬-타우 반응성 항체는 양성 대조군으로 사용되었다. 정제된 항체에 대해 역 방향화가 사용되었다: mAb는 센서칩(8000-12000 RU)의 표면에 공유적으로 고정되었고 타우 모노머 또는 올리고머의 일련의 희석액이 표면 위로 주입되었다.
도 4는 고정화된 타우 올리고머에 대한 하이브리도마 클론 상청액의 결합 반응(RU-반응 단위)을 나타낸다.
도 5는 고정화된 타우 모노머에 대한 하이브리도마 클론 상청액의 결합 반응(RU-반응 단위)을 나타낸다.
도 6은 각 하이브리도마 클론에 대한 타우 올리고머 및 모노머에 대한 결합 반응을 중첩한다.
도 7은 각 하이브리도마 클론에 대한 타우 올리고머/타우 모노머에 대한 결합 반응의 비율을 나타낸다. 결과는 모든 3개 환형 펩티드 스캐폴드가 모노머 대비 타우 올리고머에 우선적으로 결합하는 다중 항체 클론을 발생시켰음을 나타낸다(비-선택적 팬-타우 항체로 획득된 1.4 비율보다 더 큰 올리고머 대 모노머 결합의 비율).
하기 표 9는 29개 하이브리도마 클론 상층액을 나열하고 각 하이브리도마 클론에 대한 타우 올리고머 및 모노머에 대한 그의 결합 반응을 나타낸다.
[표 9]. 타우 올리고머 및 모노머에 대한 하이브리도마 상청액 결합 반응
Figure pct00021
도 8a-h는 표면 위에 주입된 다양한 농도의 타우 모노머 또는 올리고머에 대한 고정화된 정제된 mAb(센서 칩 상에 대략 8,000-12,000 RU)의 결합 반응을 나타낸다. 도 8i는 IgG 대조군을 나타내고, 도 8j는 또 다른 항-타우 항체인 Gosuranemab 또는 BIIB092를 나타낸다. 해리 단계에서 30초 주사-후 중단에서 측정된 결합 반응(RU)이 나타나있다.
실시예 7
생물학적 샘플의 표면 플라즈몬 공명 분석
균질화: 인간 신경 조직 샘플을 조직의 최종 농도가 10%(w/v)가 되도록 다량의 신선하고 얼음처럼 차가운 TBS(5mM EGTA, 5mM EDTA(둘 모두 Sigma 제품) 및 캐나다 라발 QC 소재의 Roche Diagnostics로부터의 EDTA-프리 프로테아제 억제제 칵테일로 보충됨)에 침지시켰다. 기계적 프로브 균질화기를 사용하여 이 완충액에서 조직을 균질화했다(사이에 30초 정지를 갖는 3 × 30초 펄스, 모두 얼음 상에서 수행됨). 그런 다음 TBS 균질화된 샘플을 초원심분리(90분 동안 100,000xg)에 적용했다. 상층액을 수집하고 분취하여 -80℃에 보관했다. TBS 균질물의 단백질 농도는 BCA 단백질 검정(Pierce Biotechnology Inc, 미국 일리노이스주 록포드 소재)을 사용하여 결정되었다.
표면 플라스몬 공명 분석: AD 환자로부터의 신경 조직 샘플이 분석되었다. 테스트 항체, 양성 대조군 항체 및 IgG 동형 대조군은 센서 칩의 플로우 셀 상에 고밀도(~10,000 RU)(대략 8,000 내지 12,000 RU)로 고정화되었다. 희석된 샘플(200μg 단백질/ml)은 대략 300-900초 동안 표면 위에 순차적으로 주입되었고, 그 후 완충액에서 150초의 해리 및 표면 재생이 이어졌다.
결과: 클론 8G7(시험 mAb), 상업적 팬 타우 항체(양성 대조군) 및 뮤어라인 IgG1(음성 대조군)에 대한 3개 개별 AD 뇌로부터의 추출물에 대한 대표적인 결합 반응이 도 9에 도시되어 있다. 도 10은 개별 AD 뇌로부터의 가용성 추출물(패널 A) 또는 3개 AD 뇌로부터의 가용성 추출물의 풀(패널 B)에 대한 선택된 mAb의 결합 반응을 도시한다. 해리 단계에서 30초 주사-후 중단에서 측정된 결합 반응(RU)이 나타나있다.
실시예 8
AD 뇌의 면역조직화학(IHC) 염색 및 면역형광
AD가 있는 환자의 뇌 전두엽 피질로부터 동결 절편은 4-10μg/ml 농도에서 시험 항체 또는 대조군 항체에 노출된다. 결합된 항체는 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 양 항-마우스 IgG(ECL, 1:1000 희석) 또는 토끼 항-인간 IgG(Abcam, 1:5000 희석)의 첨가에 의해 검출된다. HRP 효소 기질(Vector Laboratories)인 디아미노벤지딘(DAB) 발색 시약이 그런 다음 섹션에 추가되어 갈색을 생성한다. 섹션은 세포와 세포 핵을 시각화하기 위해 헤마톡실린으로 대조염색된다(청자색 염색). 면역형광의 경우, 결합된 항체의 검출은 DAPI 대조염색과 함께 1:1000 작업 농도에서 Alexa fluor 568-접합된 염소 항-마우스 IgG(Invitrogen)를 사용하여 수행될 수 있다.
실시예 9
타우 펩티드를 사용한 사전-형성된 피브릴의 시딩 활성의 복제 및 항체에 의한 단백질요법 타우 시딩의 억제
가용성 타우 피브릴에 대한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 결합
타우 올리고머 대 모노머에 대해 더 큰 결합을 나타내는 하이브리도마 상청액을 갖는 선택된 항체 클론(도 6 참조)을 정제하고 SPR에 의해 가용성 타우 피브릴(StressMarq Biosciences)에 대한 결합에 대해 검정하였다. 가용성 타우 피브릴을 센서 칩(대략 1200 RU)의 플로우 셀에 고정화하고 항체(1uM)를 대략 3분 동안 표면 위에 주입한 후 대략 5분의 해리 기간을 가졌다. 도 11에 도시된 바와 같이 다수의 항체가 가용성 타우 피브릴과 교차-반응했다.
세포내 타우 응집체를 유도하는 가용성 사전-형성된 타우 피브릴(PFF)의 능력의 억제
타우 PFF에 의한 단백질요법 시딩을 억제하는 항체의 능력은 문헌(Holmes, BB et al., Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(41):E4376-85, 2014) (본 명세서에 그 전체로 참조로 포함됨)에 기술된 바와 같이 세포 형광 에너지 공명 전달(FRET) 검정을 사용하여 시험되었다. 간단히 말해서, 타우 RD P301S FRET 바이오센서 세포(ATCC)를 타우 PFF(StressMarq로부터의 Tau441(2N4R) P301S 돌연변이체) 및 리포펙타민에 노출시켜 시딩을 유도했다. 바이오센서 세포는 황색 형광 단백질(YFP)에 융합된 타우 단백질 뿐만 아니라 청록색 형광 단백질(CFP)에 융합된 타우 단백질을 안정적으로 발현한다. 응집이 발생하면 이들 2개 형광 라벨이 근접하여 상이한 파장(별도의 단백질의 경우 526nm 대 476nm)에서 발광이 발생하고 신호는 유세포분석으로 검출할 수 있다. 바이오센서 세포를 0.6 ug/ml PFF + 리포펙타민에 노출시키고 시험 항체(400nM)를 대략 20분 후에 추가했다. 유세포분석에 의한 FRET 검출은 48시간 후에 수행되었다. 결과는 도 12에 나타나 있고 항체 없이 배양된 세포(100% 시딩 대조군)에 대한 FRET 신호의 백분율로 표시된다. 이 검정에서 대부분의 타우 항체는 시딩을 억제하여 FRET에 의해 검출된 세포 내 타우 응집체의 더 낮은 수준을 초래했다. 문헌(Holmes, BB et al)에 의해 보고된 바와 같이 이 검정에서 단백질요법 타우 시딩 활성은 마우스 모델에서 "타우병증의 초기 및 강력한 마커"이다. 따라서, 본 명세서에서 관찰된 바와 같이 항체에 의한 시딩의 억제는 타우 발병을 억제할 것으로 예상될 것이다.
실시예 10
AD 뇌 추출물의 시딩 활성의 억제
mAb는 AD 뇌 시드에 의한 응집의 유도를 억제한다
타우 RD P301S FRET 바이오센서 세포를 사용하여 FRET 검정에서 AD 뇌 균질물의 시딩 활성을 억제하는 타우 mAb의 능력을 평가하였다. 뇌 균질물(10% wt/vol 균질화된 뇌 조직으로부터의 20,000xg 상청액)을 리포펙타민 2000 시약을 사용하여 바이오센서 세포 안으로 형질도입하고 48시간 후 유세포분석에 의해 FRET 신호를 측정했다.
항체에 의한 AD 뇌 시드의 직접적인 억제를 시험하는 연구에서 뇌 균질물 +/- mAb(0.8μM)가 바이오센서 세포 안으로 형질도입되었다. 결과는 표준화된 통합 FRET 밀도(FRET 양성 세포의 퍼센트에 이들 FRET 양성 세포의 중앙 형광 강도를 곱하고 IgG로 처리된 세포에 대해 표준화된 것으로 정의됨)로 표시되고 도 13에 도시된다. 예상대로 건강한 뇌 균질물은 AD 뇌가 FRET 신호를 생성하는 타우 응집을 유도하는 동안 시딩 활성이 없었다. 시험된 3개 항체(9D12, 9E4, 8E11)는 IgG 동형 대조군과 비교하여 AD 뇌 균질물의 시딩 활성을 억제했다.
mAb로 AD 뇌 추출물의 사전-처리는 시딩 활성을 감소킨다.
항체가 AD 뇌 시드에 결합하고 고갈시키는 능력을 시험하는 면역고갈 연구에서, 뇌 균질물은 mAb-코팅된 자기 비드(6μg의 각 타우 항체 또는 대조군 IgG로 인큐베이션된 0.75mg의 Dynabeads 단백질 G)로 30분 동안 사전-처리되었고 비드 및 결합된 타우 종을 제거한 후 남은 물질을 바이오센서 세포 안으로 형질도입되었다. 결과는 정규화된 통합 FRET 밀도로 표현된다. 도 14에 도시된 바와 같이, 시험된 3개 항체(9D12, 9E4, 8E11)에 대한 AD 뇌 균질물의 사전-노출은 IgG 동형 대조군과 비교하여 시딩 활성을 감소시켰다.
실시예 11
항체 시퀀싱
10개 mAb 클론이 시퀀싱을 위해 선택되었다. 시퀀싱은 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 수행되었다. 10개 하이브리도마 각각에서 RNA를 추출하여 cDNA로 만들었다. IgG, IgK 및 IgL의 가변 영역은 5' RACE 전략으로 증폭되었다. 하이브리도마 가변 영역 앰플리콘은 Illumina MiSeq 차세대 시퀀서로 시퀀싱되었다. 각 하이브리도마의 판독의 적어도 5%를 차지하는 항체 서열만이 고려되었다. 모든 하이브리도마는 5% 역치에 대해 검출된 단지 하나의 우성 서열을 가졌다. 모든 하이브리도마 경쇄는 카파로 식별되었다. 식별된 항체 및 CDR의 서열은 하기 표 10 및 11에 요약되어 있다.
[표 10]: 선택된 항체 가변 영역의 서열. CDR 영역은 굵게 및 밑줄로 표시된다.
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
[표 11]: 선택된 항체의 CDR의 서열.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
시퀀싱 데이터는 시퀀싱된 10개 하이브리도마 클론에 대해 고유한 무거운 및 가벼운 페어링이 생성되었음을 나타낸다. 다음 클론은 동일한 경쇄를 공유하는 것으로 밝혀졌다: 12D11.1(3,1 환형 펩티드에 대해 출현됨) 및 10.B10.1(3,2 환형 펩티드에 대해 출현됨); 및 9E4.1 및 10C9.1(둘 모두 3,2 환형 펩티드로 출현됨).
상이한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 하기에 제공된다:
[표 12] 항체 클론에 대한 핵산 서열
Figure pct00028
본 출원은 현재 바람직한 실시예인 것으로 간주되는 것을 참조하여 기술되었지만, 출원은 개시된 실시예에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 반대로, 출원은 첨부된 청구범위의 사상 및 범주 내에 포함된 다양한 변형 및 등가 배열을 포함하도록 의도된다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다. 구체적으로, 예를 들어 표 또는 다른 곳에서 제공되는 수탁 번호 및/또는 바이오마커 서열(예를 들어, 단백질 및/또는 핵산)을 포함하는 본 명세서에 제공된 각각의 수탁 번호와 연관된 서열은 그 전체가 참고로 포함된다.
청구범위의 범주는 바람직한 실시형태 및 실시예에 의해 제한되어서는 안되며, 전체적으로 설명과 일치하는 가장 넓은 해석이 주어져야 한다.
<110> The University of British Columbia ProMIS Neurosciences Inc. <120> TAU ANTIBODIES THAT TARGET MISFOLDED TAU <130> 27108-P56738PC00 <150> 62/853,121 <151> 2019-05-27 <150> 62/915,931 <151> 2019-10-16 <160> 186 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Lys Leu Asp Phe Lys 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Lys Leu Asp Phe 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 3 Leu Asp Phe Lys 1 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Cys Gly Lys Leu Asp Phe Lys Gly 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Cys Gly Lys Leu Asp Phe Lys Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Cys Gly Gly Lys Leu Asp Phe Lys Gly 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Cys Gly Lys Leu Asp Phe Gly 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> 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gtctctgcag 340 <210> 156 <211> 322 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 156 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtc gagcaagtgg gaatattcac aattatttag catggtatca gcagaaacag 120 ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat gcaaaaacct tagcagatgg tgtgccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc aggaacacaa tattctctca agatcaacag cctgcagcct 240 gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat ttttggtata ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa gc 322 <210> 157 <211> 361 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 157 caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctattgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttatcctg gagatggtga tactaactac 180 aatggaaagt tcaagggtaa agccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct atttatgtgc aagccagatc 300 tatgatggtt actacacatt tacttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 g 361 <210> 158 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 158 gacattgtga tgtcacaatc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gtatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 ataagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctg 300 tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaagc 337 <210> 159 <211> 358 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 159 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acagtggaga gccaacatat 180 gttgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtgc aagaagcccg 300 ggcgcctact atactctgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag 358 <210> 160 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 160 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagcagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactactga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctc 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaac 337 <210> 161 <211> 358 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 161 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct acactggaga gccaacatat 180 actgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtgg aagaggaata 300 cgggattact atactatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag 358 <210> 162 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 162 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacaatagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactactga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaaacaatc ttataatctt 300 tacacgttcg gcggggggac caagctggaa ataaaac 337 <210> 163 <211> 361 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 163 gatgtgcagg ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggacctg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtag cactagctac 180 aacccatctc tcaaaagtcg actgtctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc agcctactat 300 aggtacggcc ttgcctactt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 g 361 <210> 164 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 164 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc 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cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaac 337 <210> 167 <211> 343 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 167 gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc agctactgga tgtactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctagagtg gattggtgct atttatcctg gaaatagtga tactatctac 180 aaccagaggt tcaagggcaa ggccacactg actgctgtca catccgccag cactgcctac 240 atggagctca gcagcctggc aaatgaggac tctgcggtct atttctgcac acgcccctac 300 tttgactcct ggggccaagg caccactctc acagtctcct cag 343 <210> 168 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 168 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaac 337 <210> 169 <211> 361 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 169 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggctt ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc ttcataaggt acagtggtaa tactaggttc 180 aacccatctc tcaaaggtcg aggctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccactt attactgtgc aagcacgtta 300 gaagactctt actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 g 361 <210> 170 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 170 gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catactaatg gaaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac 337 <210> 171 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 171 caggtccaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactata tgttctgggt gaagcagagg 120 cctggacagg gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtgg ttctaacttc 180 aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcatac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagaggggct 300 ttctggggcc aagggactct ggtcactgtc tctgcag 337 <210> 172 <211> 337 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 172 gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgata gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180 tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaagttac acattttccg 300 cacacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaac 337 <210> 173 <211> 379 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 173 caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180 tataacccat ccctgaagaa ccgcctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggta 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgca gatactgcca cttactactg tgttcgaagt 300 atttattact acgatagtag cccttattac tatgttatgg actactgggg tcaaggaacc 360 tcagtcaccg tctcctcag 379 <210> 174 <211> 322 <212> DNA <213> Mus Musculus <400> 174 gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60 atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt attgctgtag cctggtatca acagaaacca 120 ggacaatctc ctaaactact gatttactcg gcatcctacc ggaacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta gtccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa ac 322 <210> 175 <211> 20 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 175 Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln 20 <210> 176 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 176 Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 177 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 177 Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 178 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 178 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser <210> 179 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 179 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 180 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 180 Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser <210> 181 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 181 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 182 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 182 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys <210> 183 <211> 26 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 183 Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser 20 25 <210> 184 <211> 22 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 184 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys 20 <210> 185 <211> 22 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis H37Rv <400> 185 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 186 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 186 Gly Gly Cys Gly 1

Claims (51)

  1. KLDFK (서열번호: 1)의 적어도 4개 잔기, 임의로 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 또는 KLDFK (서열번호: 1)를 포함하는 타우 펩티드; 및 링커를 포함하는 환형 화합물로서, 여기서 링커는 펩티드 N-말단 잔기 및 C-말단 잔기에 공유적으로 커플링되는, 환형 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 타우 펩티드는 KLDF (서열번호: 2), LDFK (서열번호: 3) 및/또는 KLDFK (서열번호: 1)로부터 선택되는, 환형 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 타우 펩티드는 KLDFK (서열번호: 1)이거나 이를 포함하는, 환형 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타우 펩티드는 KLDF (서열번호: 2) 및/또는 LDFK (서열번호: 3)로부터 선택되는, 환형 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 1-8개 아미노산 및/또는 하나 이상의 관능화가능한 모이어티를 포함하거나 이로 구성되는, 환형 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커 아미노산은 알라닌(A) 또는 글리신(G)으로부터 선택되고/되거나 관능화가능한 모이어티는 시스테인(C)인, 환형 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 GGCG (서열번호: 186 1,2 링커), GCGG(서열번호: 43 2,1), -GCG(1,1 링커), GCGGG(서열번호: 44; 3,1 링커), GGCGGG(서열번호: 45; 3,2 링커), GGGCG(서열번호: 46; 1,3 링커), GGGGCGG(서열번호: 65; 2,4 링커) 또는 GCGGGG (서열번호: 47; 4,1 링커)를 포함하거나 이로 구성되는, 환형 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 하나 이상의 PEG 분자를 포함하는, 환형 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 환형 화합물은 표 2 또는 4에 열거된 환형 화합물로부터 선택되고, 임의로 환형 화합물은 사이클로(CGGKLDFKG) (서열번호: 31; 링커 2,1을 가짐), 사이클로(CGKLDFKG) (서열번호: 27; 링커 1,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 39; 링커 4,1을 가짐), 사이클로(CGKLDFKGG) (서열번호: 28; 링커 1,2를 가짐), 사이클로(CGKLDFKGGGG) (서열번호: 34; 링커 3,2를 가짐), 사이클로(CGGGKLDFKG) (서열번호: 35, 링커 3,1을 가짐), 사이클로(CGKLDFG) (서열번호: 번호: 7; 링커 1,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 15; 링커 3,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFG) (서열번호: 19; 링커 4,1을 가짐), 사이클로(CGGGKLDFGG) (서열번호: 16; 링커 3,2를 가짐), 사이클로(CGGLDFKG) (서열번호: 52; 링커 2,1을 가짐) 또는 사이클로(CGLDFKGG) (서열번호: 49; 링커 1,2를 가짐)로부터 선택되는, 환형 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물, 임의로 환형 화합물을 포함하는 면역원.
  11. 제10항에 있어서, 상기 화합물, 임의로 환형 화합물은 담체 단백질 또는 면역원성 증진제에 커플링되고/되거나 다중항원 펩티드(MAP)인, 면역원.
  12. 제11항에 있어서, 상기 담체 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)이거나 면역원성-증진제는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)인, 면역원.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 면역원 및 임의로 희석제를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 아쥬번트를 포함하는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아쥬번트는 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄인, 조성물.
  16. 상응하는 선형 화합물 및/또는 타우 모노머와 비교하여 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 환형 화합물에서 타우 펩티드에서의 에피토프에 선택적으로 결합하고/하거나 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 면역원 또는 조성물을 사용하여 출현된 항체.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체는 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴에서 형태적 에피토프에 결합하고, 그리고 항체는 형태 선택적 항체인, 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 타우 펩티드는 KLDF (서열번호: 2) 또는 LDFK (서열번호: 3)를 포함하거나 이로 구성된, 항체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 타우 펩티드 및/또는 에피토프는 KLDFK (서열번호: 1)를 포함하거나 이로 구성된, 항체.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 상응하는 선형 화합물과 비교한 환형 화합물에 대해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배 또는 적어도 4배 더 선택적인 것인, 항체.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 모노머성 타우 폴리펩티드 및/또는 미세소관-결합된 타우 폴리펩티드와 비교하여 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴에 선택적으로 결합하는, 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체는 모노머성 타우 폴리펩티드 및/또는 미세소관-결합된 타우 폴리펩티드와 비교하여 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴에 대해 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배 또는 적어도 4배 더 선택적인 것인, 항체.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 상보적 결정 영역 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하고 상기 CDR의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함하는, 항체:
    Figure pct00029

    Figure pct00030

    Figure pct00031

    Figure pct00032

    Figure pct00033

    Figure pct00034

    Figure pct00035

    Figure pct00036

    Figure pct00037

    Figure pct00038
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 75에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 76에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 95-97에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 76에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 76에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 98-100에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  25. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 77에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 77에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 101-103에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 78에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 78에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 104-106에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  26. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 79에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 79에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 107-109에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 80에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 80에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 110-112에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  27. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 81에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 81에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 113-115에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 82에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 82에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 116-118에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  28. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 83에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 83에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 119-121에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 84에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 84에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 122-124에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  29. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 85에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 85에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 125-127에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 86에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 86에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 128-130에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  30. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 87에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 87에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 131-133에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 88에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 88에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 134-136에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  31. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 89에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 89에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 137-139에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 90에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 90에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 140-142에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  32. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 91에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 91에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 143-145에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 92에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 92에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 146-148에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  33. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 i) 서열번호: 93에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 93에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 149-151에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 및/또는 여기서 상기 항체는 서열번호: 94에 제시된 아미노산 서열, ii) 서열번호: 94에 대해 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로서, 여기서 CDR 서열은 서열번호: 152-154에 제시된 바와 같은, 아미노산 서열, 또는 iii) i)의 보존적으로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체.
  34. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 면역접합체.
  35. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체, 항체 중쇄 가변 도메인, 또는 항체 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산.
  36. 제35항에 있어서, 상기 핵산은 i) 중쇄 가변 도메인을 인코딩하며, 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 서열번호: 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 또는 173 중 어느 하나의 서열, 또는 서열번호: 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169 또는 173 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며; ii) 경쇄 가변 도메인을 인코딩하며, 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 서열번호: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 또는 174 중 어느 하나의 서열, 또는 서열번호: 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172 또는 174 중 어느 하나에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하며; 또는 iii) 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 인코딩하며, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 각각 서열: 서열번호: 155 및 156; 서열번호: 157 및 158; 서열번호: 159 및 160; 서열번호: 161 및 162; 서열번호: 163 및 164; 서열번호: 165 및 166; 서열번호: 167 및 168; 서열번호: 169 및 170; 서열번호: 171 및 172; 또는 서열번호: 173 및 174, 또는 서열번호: 155 및 156; 서열번호: 157 및 158; 서열번호: 159 및 160; 서열번호: 161 및 162; 서열번호: 163 및 164; 서열번호: 165 및 166; 서열번호: 167 및 168; 서열번호: 169 및 170; 서열번호: 171 및 172; 또는 서열번호: 173 및 174에 대해 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 핵산.
  37. 제35항 또는 제36항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 임의로, 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스-연관 벡터, 또는 레트로바이러스 벡터, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인, 벡터.
  39. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제35항 또는 제36항의 핵산을 발현하거나, 또는 제37항 또는 제38항의 벡터를 포함하는 세포.
  40. 제39항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포, 임의로 CHO 세포 또는 HEK-293 세포, 또는 곤충 세포, 임의로 Sf9 세포, Sf21 세포, Tni 세포, 또는 S2 세포로부터 선택되는, 세포.
  41. 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체, 제34항의 면역접합체, 제35항 또는 제36항의 핵산, 제37항 또는 제38항의 벡터, 또는 제39항 또는 제40항의 세포를 임의로 희석제와 함께 포함하는 조성물.
  42. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 화합물, 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 면역원, 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체, 제34항의 면역접합체, 제35항 또는 제36항의 핵산, 제37항 또는 제38항의 벡터, 또는 제39항 또는 제40항의 세포를 포함하는 키트.
  43. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 환형 화합물의 면역원성 형태 또는 면역원, 또는 환형 화합물의 면역원성 형태 또는 면역원을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것 및 투여된 환형 화합물 또는 면역원에서 타우 펩티드에 대해 선택적인 항체를 발현하는 항체 및/또는 세포를 단리하는 것, 임의로 항체가 모노머성 타우 폴리펩티드 및/또는 미세소관-결합된 타우 폴리펩티드에 비해 상응하는 선형 펩티드 및/또는 잘못 접힌 올리고머성 타우 및/또는 가용성 피브릴과 비교하여 환형 화합물에 선택적으로 결합하는지를 확인하기 위해 항체를 시험하는 것을 포함하는, 항체를 제조하는 방법.
  44. 시험 샘플이 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드를 함유하는지 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 항체: 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 복합체 및/또는 항체: 가용성 피브릴 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에, 시험 샘플을 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 제34항의 면역접합체와 접촉시키는 단계; 및
    b. 임의의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하고;
    여기서 검출가능한 복합체의 존재는 샘플이 잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드를 함유할 수 있음을 나타내는 것인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 시험 샘플은 뇌 조직 추출물 및/또는 뇌척수액(CSF)을 포함하는, 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 상기 시험 샘플은 인간 샘플인, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체를 검출하는 단계는 상기 복합체를 팬 타우 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  48. 타우 응집/응집체 및/또는 증식을 감소 또는 억제하는 방법으로서,
    잘못 접힌 올리고머성 타우 폴리펩티드 및/또는 가용성 피브릴을 발현하는 세포 또는 조직을 제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체, 제34항의 면역접합체 제35항 또는 제36항의 핵산, 또는 제37항 또는 제38항의 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 세포 또는 조직은 대상체에서 생체내인 것인, 방법.
  50. 타우병증 치료를 필요로하는 대상체에서 타우병증을 치료하는 방법으로서,
    제16항 내지 제33항 중 어느 한 항의 항체 또는 상기 항체, 제34항의 면역접합체, 제35항 또는 제36항의 핵산, 또는 제37항 또는 제38항의 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 타우병증은 알츠하이머병(AD), 픽병, 전두측두엽 치매 또는 전두측두엽 변성, 진행성 핵상 마비, 피질기저 변성, 원발성 연령-관련 타우병증, 만성 외상성 뇌병증, 아급성 경화성 범뇌염, 17번 염색체와 관련된 전두측두엽 치매 및 파킨슨증으로부터 선택되는, 방법.
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