JP6433480B2 - Hlaを修飾するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月12日に出願された米国仮出願第61/777,627号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照によって本明細書により
(連邦政府による支援を受けた研究の下でなされた発明に対する権利の陳述)
適用されず
したがって、いくつかのまたはすべての古典的HLA発現を欠くが、溶解のためにNK細胞によって標的化されない細胞を開発するための組成物および方法が依然として必要とされている。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
1種または複数種の非古典的クラスIヒト白血球抗原(HLA)タンパク質を含む、単離されたナチュラルキラー(NK)細胞であって、さらに、該細胞内の少なくとも1種の古典的内因性HLA遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって不活化されるNK細胞。
(項目2)
前記非古典的クラスI HLAタンパク質は、HLA−E、HLA−F、HLA−G、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目1に記載のNK細胞。
(項目3)
前記非古典的クラスI HLAタンパク質は、内因性遺伝子から発現される、項目1または項目2に記載のNK細胞。
(項目4)
前記非古典的クラスI HLAタンパク質は、外因性配列から発現される、項目1〜3のいずれかに記載のNK細胞。
(項目5)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、表1の単列に示される認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を含む、項目1〜4のいずれかに記載のNK細胞。
(項目6)
前記細胞は、1または複数の追加のゲノム修飾を含む、項目1〜5のいずれかに記載のNK細胞。
(項目7)
項目5または項目6に記載の細胞に由来する細胞。
(項目8)
項目1〜7のいずれかに記載の細胞のフラグメント。
(項目9)
項目1〜8のいずれかに記載のNK細胞を含む医薬組成物。
(項目10)
項目1〜9のいずれかに記載の細胞を提供することを含む、細胞のナチュラルキラー(NK)細胞溶解を減らす方法であって、該細胞のNK媒介細胞溶解が減らされる方法。
(項目11)
処置を必要とする対象におけるHLA関連障害を処置する方法であって、項目1〜9のいずれかに記載のNK細胞を、該対象に投与することを含む方法。
(項目12)
前記HLA関連障害は、移植片対宿主病(GVHD)である、項目11に記載の方法。
本明細書に開示される方法の実施、ならびに本明細書に開示される組成物の調製および使用は、別段の記載がない限り、分子生物学、生物化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNAおよび関連分野における従来の技術を使用し、これらは当業者の力量の範囲内である。これらの技術は、文献に充分に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年および第3版、2001年、Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、ニューヨーク、1987年および定期的更新、シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、サンディエゴ、Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press、サンディエゴ、1998年、METHODS IN ENZYMOLOGY、第304巻、「Chromatin」(P.M.WassarmanおよびA.P.Wolffe編)、Academic Press、サンディエゴ、1999年、およびMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第119巻、「Chromatin Protocols」(P.B.Becker編)Humana Press、トトワ、1999年を参照。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、直鎖または環状構造の、1本鎖または2本鎖形態のどちらかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。本開示の解釈上、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的に解釈されない。該用語は、天然のヌクレオチドの既知の類縁体、および塩基、糖および/またはリン酸塩部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において修飾されているヌクレオチドを包含しうる。一般に、特定のヌクレオチドの類縁体は、同じ塩基対特異性を有し、すなわち、Aの類縁体は、Tと塩基対を形成するであろう。
本明細書では、HLA遺伝子またはHLA制御因子を含む任意の遺伝子内の標的部位に特異的に結合するDNA結合ドメインを含む組成物を記載する。いかなるDNA結合ドメインも、本明細書に記載される組成物および方法において使用することができる。
本明細書に記載するようなDNA結合タンパク質(例えば、ZFPまたはTALE)と、異種制御(機能的)ドメイン(またはその機能的フラグメント)とを含む融合タンパク質も提供する。一般的なドメインとして、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子)、サイレンサー、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバー等);DNA修復酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子;DNA再編成酵素ならびにそれらの関連因子および修飾因子;クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ);およびDNA修飾酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファタ−ゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)ならびにそれらの関連因子および修飾因子が挙げられる。DNA結合ドメインおよびヌクレアーゼ開裂ドメインの融合に関する詳細は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第20050064474号、第20060188987号および第2007/0218528号。
もう一方の非タンパク質DNA結合ドメイン(例えば、抗生物質、干渉物質、小溝結合剤、核酸)との間の融合は、当業者に既知の生化学的結合方法により構築される。例えば、Pierce Chemical Company(Rockford、IL)Catalogueを参照。小溝結合剤とポリペプチドとの間の融合を造る方法および組成物は、Mappら(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:3930−3935に記載されている。
ある実施形態では、融合タンパク質は、DNA結合性の結合ドメインと、開裂(ヌクレアーゼ)ドメインとを含む。したがって、遺伝子修飾は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子工学的に操作されたヌクレアーゼを使用して達成することができる。遺伝子工学的に操作されたヌクレアーゼ技術は、天然起源のDNA結合タンパク質の遺伝子工学的操作に基づく。例えば、目的に合わせたDNA結合特異性を持つホーミングエンドヌクレアーゼの遺伝子工学的操作が、記載されている。Chamesら(2005)Nucleic Acids Res33(20):e178、Arnouldら(2006)J.Mol.Biol.355:443−458。また、ZFPの遺伝子工学的操作も、記載されている。例えば、米国特許第6,534,261号、第6,607,882号、第6,824,978号、第6,979,539号、第6,933,113号、第7,163,824号、および第7,013,219号参照。
タンパク質(例えば、ヌクレアーゼおよび非古典的HLA分子)、それをコード化するポリヌクレオチド、および本明細書に記載するタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、例えば、タンパク質および/またはmRNAの注入を始めとする任意の適切な手段によって、標的細胞に送達されてもよい。
開示する組成物および方法は、HLA調節が望まれる治療および研究適用を始めとする(これらに限定されない)、HLA発現および/または機能を調節することが望まれるあらゆる適用に使用することができる。
ZFN
米国特許公開公報第20120060230号に記載するような、実証済みの2−フィンガーおよび1−フィンガーモジュールの確立されたアーカイブを使用して、5または6本のフィンガーを含有するHLA−A結合ZFNを設計し、組み立てた。使用してもよい代表的なZFNを、以下の表1に示す。この表の第1欄は、ZFPの内部参照名(番号)であり、表2の第1欄の同じ名前に対応する。「F」はフィンガーをいい、「F」の後ろに付く数字は、どのジンクフィンガーかをいう(例えば、「F1」はフィンガー1をいう)。
10%の熱不活化ウシ胎児血清(FBS:Lonza)および2mmol/LのL−グルタミン(Glutamax−1:Invitrogen、カールスバッド、CA)を補ったダルベッコ修飾イーグル培地(Lonza、バーゼル、スイス)中に、HEK293細胞を維持した。10%熱不活性化FBSおよび2mmol/LのL−グルタミンを補ったRPMI1640(Lonza)中に、EBV−LCL、721.221およびEL−4細胞株を維持した。これらの細胞株の同一性を、STR DNAフィンガープリンティングにより確認した。mHAgについて特異的なCD8+CTLクローンは、HLA−A*0301において、PANE1転写物によってコード化されたペプチドRVWDLPGVLK(配列番号1)を認識するクローン7A7(Bricknerら(2006)Blood107(9):3779−3786)、およびC19ORF48中でORF+2/48からHLA−A*0201制限CIPPDSLLFPA(配列番号2、NM_199250.1の代替オープンリーディングフレーム)ペプチドを認識するクローンGAS2B3−5(Tykodiら(2008)Clin Cancer Res.14(16):5260−5269)であった。CTLクローンを、51クロム放出アッセイの1日前に解凍し、10%ヒトアルブミン血清、2mmol/LのL−グルタミン、20ng/mLのIL−15(PeproTech、ロッキーヒル、NJ)、および20IU/mLのIL−2(Chiron、エメリービル、CA)を補ったRPMI1640に維持した。
1:1の比(T細胞:2mmol/LのL−グルタミンおよび50IU/mLのIL−2を含む10%FBSを補ったRPMI1640中のγ−照射(100Gy)aAPC)(aAPCの添加の次の日から始め、1日おきに添加)のaAPC(クローン#4:CD19、CD64、CD86、CD137Lを安定に共発現するように遺伝的に修飾されたK562細胞、およびEGFP17で同調的に発現されたインターロイキンIL−15の膜結合型突然変異タンパク質(O’Connorら(2012)Sci Rep2:249、Manuriら(2010)Hum Gene Ther21(4):427−437)参照)上に前負荷されたOKT3(eBioscience、サンディエゴ、CA)でPBMCを刺激することによって、インビトロでCD3を架橋することにより、T細胞(CARneg)を持続的増殖のために活性化した。OKT3負荷aAPCを、14日毎に再添加し、T細胞増殖を持続させた。
臨床グレードのCAR+T細胞を製造する我々のアプローチを、CD19特異的T細胞を生成するように適合させた(例えば、Singhら(2008)Cancer Res.68(8):2961−2971参照)。SBトランスポゾンCD19RCD28およびSB機能亢進トランスポゼースSB11をコード化するDNAプラスミドを、ヌクレオフェクターIIデバイス(Lonza)を使用して、PBMC由来のT細胞に、同時に電気泳動転写した(ヒトT細胞ヌクレオフェクター溶液、プログラムU−014)。50IU/mLのIL−2(aAPCの添加の次の日から始め、1日おきに添加)の存在下、γ−照射(100Gy)aAPC(OKT3負荷のないクローン#4)を、エレクトロポレーションを行った日に加え、14日毎(T細胞:aAPCの比1:2)に再添加することによって、CAR+T細胞の集団を、選択的に数値的に拡張した。
インビトロで転写されたmRNA種を、先にTorikaiら(2012)Blood119(24):5697−5705に記載されるように調製した。簡単にいうと、ZFN−LおよびZFN−Rをコード化するDNAテンプレートプラスミドを、XhoIで直線化した。製造者の指示に従って、インビトロで転写(RiboMAX(商標)Large Scale RNA Production System−T7、Promega、マディソン、WI)およびキャッピング(ARCAキャップ類縁体、Ambion、オースチン、TX)の後、ポリアデニンを、ポリAテーリングキット(Ambion)を使用して加えた。mRNA種の完全性を、3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液を用いて、変性1%アガロースゲル上で検証し、分光光度計(BioRad、Hercules、CA)によってOD260で濃度を測定した。mRNAを、1回の使用のためにバイアルに入れ、−80℃で保存した。
HEK293細胞の修飾のために、HLA−A標的ZFNをコード化する発現ベクターを、製造者のプロトコルを使用して、ヌクレオフェクション(Lonza)により導入した。最初の刺激から6日後、またはγ−照射aAPCによる再刺激から2〜3日後にT細胞を採取した。500万個のT細胞を、100μLのヒトT細胞ヌクレオフェクター溶液(Lonza)中のZFN−LおよびZFN−R mRNA種のそれぞれ2.5〜10μgと予備混合し、プログラムT−20で、ヌクレオフェクターIIデバイスを用いてキュベットでエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの後、予備的に暖めた、2mmol/LのL−グルタミンおよび10%FBSを補ったRPMI1640に細胞を直ちに置き、37℃および5%CO2で4〜6時間培養し、この時点で、さらなる培養のために50IU/mLのIL−2を加えた。「低温ショック」実験で、37℃−5%CO2インキュベーターでの一晩の培養の後、T細胞を30℃、5%CO2インキュベーターに移し、3日間培養し、次いで、分析前に37℃、5%CO2インキュベーターに戻した。
2%FBSおよび2mMのEDTAを補ったリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄した後、4℃で15分間、該細胞を、PE結合モノクローナル抗体(mAb)特異的抗HLA−A2(BD Biosciences、サンノゼ、CA)で標識化し、洗浄し、10分間、抗PEマイクロビーズ(Miltenyi Biotec、オーバーン、CA)で標識化した。洗浄後、標識化細胞をLDカラム(MiltenyiBiotec)に通し、通過画分を集め、培養した。T細胞を、γ−照射OKT3負荷aAPCで増殖させ、2mmol/LのL−グルタミンおよび50IU/mLのIL−2(1日おきに添加)を含む10%FBSを補ったRPMI1640中、CD19+aAPC(OKT3を負荷せず)で、CAR+T細胞を増殖させた。
以下の抗体を使用した。フィコエリトリン(PE)抗HLA−A2(クローンBB7.2)、FITC抗CD4(クローンRPA−T4)、FITC抗CD8(クローンHIT8a)、PEおよびAPC抗CD3(クローンSK7)、PE抗CD56(クローンB159)、PE抗HLA−DR(クローンG46−6)、PEマウスIgG2bγ、PEマウスIgG2aκ、FITC非特異的マウスIgG1、第2試薬ストレプトアビジンPE(すべてBD Biosciencesから)、ビオチン結合抗HLA−A3(クローン4i153)、APC抗HLA−G(クローンMEMG19)、PE抗HLAクラスI(クローンW6/32、Abcamから、ケンブリッジ、MA)およびPE抗HLA−E(クローン3D12、Biolegend、サンディエゴ、CA)。Alexa488結合抗CD19RCD28 CAR抗体(クローン番号136−20−1)を我々の実験室で生成した。ヨウ化プロピジウム(Sigma−Aldrich)を加え、分析物から死んだ細胞を除外した。CellQuestバージョン3.3(BD Biosciences)を使用してFACS Calibur(BD Biosciences)でデータを取得し、FlowJoバージョン7.6.1(Tree Star,Inc.、アシュランド、OR)によって分析した。
ZFNトランスフェクト細胞における、HLA−A遺伝子配列の修飾のレベルを、Guschinら(2010)Methods Mol Biol649:247−256に記載するような、Surveyor(商標)ヌクレアーゼアッセイによって測定した。簡単にいうと、ZFN修飾細胞からのゲノムDNAを、HLA−A2およびHLA−A3遺伝子座内のZFN標的領域を増幅するように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるPCRに供した。変性および再アニーリング後、Surveyorエンドヌクレアーゼ(Cel−1)(Transgenomic、オマハ、NE)を使用してヘテロ2本鎖DNA生成物を切断し、突然変異事象の証拠であると解釈された、ポリアクリルアミドゲル上の高速バンドを明らかにした。標的修飾のパーセントを、デンシトメトリーにより定量した。標的遺伝子座の増幅のために使用したPCRプライマーは、以下の通りであった。
HLA−A3 Forward;5’−GGGGCCGGAGTATTGGGACCA−3’;(配列番号7)
HLA−A3 Reverse;5’−CCGTCGTAGGCGTCCTGCCG−3’(配列番号8)
HLA−A2 Forward;5’−GGGTCCGGAGTATTGGGACGG−3’(配列番号9)
HLA−A2 Reverse;5’−TTGCCGTCGTAGGCGTACTGGTG−3’(配列番号10)
HLA−A2およびHLA−A3配列は、IMGT/HLAデータベース、例えば、IMGT/HLA受入番号;HLA−A2:HLA00005、HLA−A3:HLA00037から得た。
標的細胞を、0.1mCiの51Crで2時間標識化した。10%FBSを補った氷冷RPMI1640で標識化細胞を3回洗浄した後、これを希釈し、96ウェルv字型底プレートの各ウェルに、100μL中103個の標的細胞で分配した。標的細胞を、ペプチド滴定アッセイで、室温で30分、ペプチドの10倍の段階希釈でインキュベートした。CTLを、示されたエフェクターで標的比で加えた。5%CO2中37℃での4時間のインキュベーションの後、50μLの細胞のない上澄みを集め、TopCountデバイス(Perkin Elmer、シェルトン、CT)で計数した。すべてのアッセイは、3回行った。あるアッセイでは、アッセイの前に、親HEK293細胞株およびHLA−A修飾HEK293クローンを、600IU/mLのインターフェロン−γ(IFN−γ、R&D systems、ミネアポリス、MN)および10ng/mLの組織壊死因子−α(TNF−α;R&D systems)で48時間処理した。特異的溶解パーセントを以下のように計算した。
((実験cpm−自然cpm)/(最大cpm−自然cpm))×100
721.221細胞上での非古典的HLAのNK細胞単離および強制発現
hESC株WIBR3(Whitehead Institute Center for Human Stem Cell Research、ケンブリッジ、MA)22を、先に記載するように(Soldnerら(2009)Cell136(5):964−977)、hESC培地[15%FBS、5%KnockOut(商標)Serum Replacement(Invitrogen)、1mMのグルタミン(Invitrogen)、1%の非必須アミノ酸(Invitrogen)、0.1mMのβ−メルカプトエタノール(Sigma、セントルイス、MO)および4ng/mlのFGF2(R&D systems)を補ったDMEM/F12(Invitrogen)]中のマイトマイシンC不活化マウス胚線維芽細胞(MEF)支持細胞層上に維持した。標的化hESCを、先に記載するように(Hockemeyerら(2008)Cell Stem Cell3(3):346−353)線維芽細胞様細胞に分化させた。簡単にいうと、15%ウシ胎児血清を補ったDMEM培地中の非付着性懸濁培養皿(Corning、コーニング、NY)で5日間、胚様体(EB)形成により、分化を誘発した。続いてEBを付着組織培養皿に載せ、実験を始める前に、初代線維芽細胞プロトコルに従って、トリプシンを使用して少なくとも4つの通路に関して通過させた。
エレクトロポレーションの24時間前に、Rho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤(Stemolecule、Stemgent、ケンブリッジ、MA)で、HESCを培養した。0.05%トリプシン/EDTA溶液(Invitrogen)を使用して細胞を採取し、PBSに再懸濁した。HLA−A24の仮想ZFN結合領域に相同な5’および3’アームに隣接するホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーターのコントロール下、ピューロマイシン耐性遺伝子をコード化するドナープラスミド35μgおよび7.5μgの各ZFNコード化プラスミドで、または35μgのドナープラスミドおよび10μgの各ZFNコード化mRNAで、1000万個の細胞をエレクトロポレートした(Gene Pulser Xcell System、Bio−Rad:250V、500μF、0.4cmキュベット)。次いで、ROCK阻害剤を補ったhESC培地中のDR4 MEF支持細胞層で最初の24時間、細胞を平板培養した。エレクトロポレーションから72時間後、ピューロマイシン選択(0.5μg/ml)を開始した。エレクトロポレーションから10〜14日後に、個々のピューロマイシン耐性コロニーを選び取り、拡張した。正しい標的化および遺伝子破壊を、サザンブロット分析およびゲノム遺伝子座の配列決定によって検証した。
ZFNを、内因性ヒトHLA−A遺伝子のゲノムコード化配列(例えば、米国特許公開公報第2012/0060230号の表2参照)内の既定義の部位を開裂するように設計した。ヒト細胞におけるこれらのZFNの発現は、標的化HLA遺伝子座のリーディングフレームの破壊をもたらす、導入された2本鎖切断の謝りがちな修復によって、HLA−A分子の発現を排除するはずである。これらのZFNのHLA−A発現を妨害する能力を評価するため、我々は、最初に、HLA−A*03:01(HLA−A3)およびHLA−A*02:01(HLA−A2)を共発現する、ヒト胚腎臓細胞株HEK293を使用した。実施例1に記載したように、ZFNをコード化する発現プラスミドを用いてHEK293細胞をトランスフェクトした後、対立遺伝子特異的PCRおよびSurveyorヌクレアーゼアッセイを用いて、予測されるZFN標的部位で、遺伝子修飾のレベルを定量化した。
HLA−Aの発現を妨害する影響を査定するために、限界希釈を使用して、ZFN修飾HEK293細胞プールから単細胞クローンを得た。翻訳の早期終結に導くフレークシフトを起こす、HLA−A2、HLA−A3または両対立遺伝子における予測されるZFN結合部位内で小さな挿入または削除を持つクローンを、配列決定により明らかにした。HEK293細胞におけるHLA−A発現の定常レベルは、EBVトランスフォームリンパ芽細胞株(EBV−LCL)のような造血細胞と比べて低いので、HEK293細胞を、HLAレベルを増大させることが知られている前炎症性サイトカインに暴露した。例えば、Johnson(2003)J Immunol.170(4):1894−1902参照。
我々は、抗体系細胞選別を組み合わせたZFN標的HLAクラスI遺伝子を使用する本明細書で略述するアプローチを、最終的にはHLA−A、−Bおよび−C発現の排除に使用することができることを予想する。致死抑制受容体(KIR)の主リガンドとして知られている、古典的HLA発現のない細胞、とりわけHLA−BまたはHLA−Cは、KIRおよびそのリガンドの間の相互作用の欠失によって根絶されうる。Parhamら(2005)Nat Rev Immunol.5(3):201−214。NK細胞媒介細胞毒性を減らせるかどうかを試験するため、NK細胞媒介細胞毒性を減らすことが示され(Borregoら(1998)J Exp Med.187(5):813−818、Riteauら(2001)Int Immunol.13(2):193−201、Rouas−Freissら(1997)Proc Natl Acad Sci USA.94(10):5249−5254、Braudら(1998)Nature391(6669):795−799)、古典的HLA分子よりはるかに多形性の低い、非古典的HLA−EまたはHLA−G分子を、HLAクラスI低細胞株721.221(図3A)に導入し、NK細胞による殺害に対するこれらの感受性を評価した。
臨床的に関連する初代細胞に対する我々の結果を拡張するために、ヒトT細胞において、HLA−A特異的ZFNの活性を評価した。ZFNは、所望の標的遺伝子の安定な破壊を達成するために一時的発現しか必要としないので、ZFNをインビトロ転写mRNAから一時的に発現させた。HLA−A2ホモ接合ドナーからPBMCにZFNをコード化するmRNAの電気泳動転写(HLA−A2は、白人において最も一般的なHLA−A対立遺伝子である。例えば、Moriら(1997)Transplantation64(7):1017−1027参照)により、これらのT細胞HLA−A2の約19%をネガティブとした(図5A、上のパネル)。我々は、トランスフェクション後にインキュベーション温度を一時的に下げることでZFN活性を増加させることができることを先に実証した。米国特許公開公報第2011/0129898号参照。
HLA標的ZFNの臨床適用のために、ホモ2量体化33を妨げることによって、オフターゲット開裂事象の可能性を減少させるように設計された「ハイファイ」偏性ヘテロ二量体Fok IドメインEL/KKの使用を評価した。ZFN−LおよびZFN−RのEL/KK ZFN変異体をコード化するmRNAの使用により、mRNAの用量を制限(各ZFNで2.5μg)したにもかかわらず、52%までのT細胞集団でHLA−AnegT細胞が顕著に増加し、HLA−A発現が排除される結果となった(図5B)。
HLA編集の潜在的有用性を実証するために、次に、HLA発現の排除の後、同種異系設定において広く使用することができ、すなわち、HLA認識34とは無関係に腫瘍関連抗原に対して特異性を再指向する、「普遍的」キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝的に修飾された細胞障害性T細胞である、細胞の特異的クラスに焦点を当てた。実際、我々および他の者は、現在、CD19+悪性腫瘍の研究的処置のために、患者特異的CAR+T細胞に熱意を注いでいる(例えば、Kalosら(2011)Sci Transl Med3(95):95ra73、Porterら(2011)N Engl J Med365(8):725−733参照)。近年、我々は、内因性αβTCR発現を排除するためにZFNを使用すると、CAR+T細胞が、CD19に対する再指向特異性を保持することを発表した(Torikaiら(2012)Blood119(24):5697−5705およびProvasiら(2012)Nat Med18(5):807−15)。実際に、そのようなTCR編集T細胞は、インビボで、向上した効力および安全性の両方(GVHD)を示した。
組織再生を始めとする治療適用のための同種異系細胞の適用を広げるため、T細胞認識を回避しうるhESCを生成しようと試みた。当然、すべてのhESCは、潜在的レシピエントに関して同種異系であり、分化の際に、HLA40の発現を上方制御するであろう。HLA−AneghESCの生成のためのZFNの使用を試験するために、HLA−A遺伝子座を標的化するZFNをコード化するmRNAまたはDNAプラスミドのいずれかで、HLA−A2+/A24+hESC株WIBR3を遺伝的に修飾した。HLA−AneghESCの生成を促進するため、相同組換え修復によって標的組込みを媒介するZFN標的部位を取り巻く相同性の領域に隣接するピューロマイシン耐性遺伝子をコード化するドナーDNAプラスミドを共送達した。ドナー相同性アームの外側に位置するプローブを使用して、ZFN標的領域のPCR配列決定、および標的化領域のサザンブロット分析によって、ピューロマイシン耐性クローンを、HLA−A対立遺伝子の修飾についてスクリーニングした。これらのクローンは、両HLA−A対立遺伝子においてZFN標的領域内に突然変異を含有しており、非修飾親hESC株とともに線維芽細胞様細胞に分化した。HLA発現は、IFN−γおよびTNF−αを用いる処理によって誘発され、それぞれ、HLA−A2およびHLA−A24を認識する抗体を用いるフローサイトメトリーにより分析された。
Claims (9)
- 1種または複数種の非古典的クラスIヒト白血球抗原(HLA)タンパク質をコードする外因性配列を含む、単離されたナチュラルキラー(NK)細胞であって、さらに、該細胞内の少なくとも1種の古典的内因性HLA遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって不活化されているNK細胞。
- 前記非古典的クラスI HLAタンパク質は、HLA−E、HLA−F、HLA−G、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のNK細胞。
- 前記非古典的クラスI HLAタンパク質は、HLA−Eタンパク質およびHLA−Gタンパク質である、請求項1または請求項2に記載のNK細胞。
- 前記外因性配列は、1つまたは複数のプラスミドによって担持されている、請求項1〜3のいずれかに記載のNK細胞。
- 前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、以下の表
の単列に示される認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質を含む、請求項1〜4のいずれかに記載のNK細胞。 - 前記細胞は、1または複数の追加のゲノム修飾を含む、請求項1〜5のいずれかに記載のNK細胞。
- 請求項5または請求項6に記載の細胞に由来する細胞。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のNK細胞を含む医薬組成物。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の細胞を提供することを含む、細胞のナチュラルキラー(NK)細胞溶解を減らす方法であって、該細胞のNK媒介細胞溶解が減らされる方法。
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