JP6427512B2 - メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出 - Google Patents

Description

本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａ
ｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）の分子検出に関する。
より具体的には、本発明は、偽陽性の結果を減少させるＭＲＳＡの改良された検出に関す
る。

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、主な院内病原体であるが、また、市中
感染病原体でもあり、重大な感染、例えば外科的創傷感染症、肺炎、心内膜炎および敗血
症を引き起こす可能性がある。メチシリンへの耐性は、Ｂ−ラクタム薬に対する親和性の
低下した、修飾ペニシリン結合タンパク質である、ＰＢＰ２ａまたはＰＢＰ２’をコード
するｍｅｃＡ遺伝子の存在による。ｍｅｃＡ遺伝子は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕ
ｓ）およびその他のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、主に表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅ
ｒｍｉｄｉｓ）およびＳ．ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）の染色体の
中に組み込むことのできる可動性エレメントである、ＳＣＣｍｅｃと名付けられたカセッ
ト（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍｅｃ
；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒ．４５（５）：１３２３−１３３６；Ｈｉｒａｍａｔｓｕ，ｅｔ ａｌ．，２０
０１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｏｃｔ；９（１０）：４８６−９３）により
運ばれる。ＳＣＣｍｅｃは、末端の逆位配列および直接反復配列の存在、一組の部位特異
的なリコンビナーゼ遺伝子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびにｍｅｃＡ遺伝子複合体
により特徴付けられる（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ
ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４４９−１４５８；Ｋａｔａｙａｍａ ｅｔ
ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：
１５４９−１５５５）。このｍｅｃＡ遺伝子カセットＳＣＣｍｅｃの黄色ブドウ球菌ゲノ
ムへの挿入部位は公知であり、配列が保存されている（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１
，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：１３２３−１３３
６）。黄色ブドウ球菌染色体への挿入後、ＳＣＣｍｅｃは左端部連結領域（ｌｅｆｔ ｅ
ｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）および右端部連結領域（ｒｉｇｔ
ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）を有し（図１参照）、ここで
ＳＣＣｍｅｃ配列は、黄色ブドウ球菌染色体配列に隣接している。ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡ
の左右の境界を取り囲んでいる領域のヌクレオチド配列（すなわち、それぞれ、ａｔｔＬ
およびａｔｔＲ）、ならびにＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡ組込み部位の周囲の領域のヌクレオチ
ド配列（すなわち、ａｔｔＢｓｃｃ、ＳＣＣｍｅｃ ＤＮＡに対する細菌染色体付着部位
）は、これまでに分析されている。組込み部位の配列分析により、ａｔｔＢｓｃｃが、新
規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端、ｏｒｆＸに位置することが明
らかとなった。ｏｒｆＸは、一部の既に同定されている未知の機能を持つポリペプチドと
配列相同性を示す、推定１５９アミノ酸ポリペプチドをコードする（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ
．，１９９９，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４３：１４
４９−１４５８）。ＳＣＣｍｅｃのｍｅｃＡ領域の組織は、その上すでに研究されている
（Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇ
ｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４（７）：１９０６−１９１０）。

ＭＲＳＡは健康な人によって何ら疾患を引き起こさずに保有される可能性があるが、こ
れらの健康な保因者が病院に入ると、入院患者を汚染する可能性がある。その上、患者は
自分自身を汚染する可能性があり、例えば、手術を受けると、感染のリスクは増大する。
ＭＲＳＡの健常保因者はＭＲＳＡの貯蔵所を構成するので、これらの保因者のスクリーニ
ングを行って、局所的な汚染除去により菌株を根絶する必要がある。ＭＲＳＡスクリーニ
ングは現在、世界中でＭＲＳＡ菌株の蔓延を低減するための主な手段として認識されてい
る。一般に、患者におけるＭＲＳＡアッセイでは、患者から鼻腔のスワブを採取し、反復
培養して、ＭＲＳＡ菌株が存在するかどうかを決定する。ＭＲＳＡを直接に鼻腔スワブか
ら同定するアッセイにより、培養の必要性を除去することができるかもしれない。培養に
よる同定法は、結果を得るために一般的に最低で２４時間、より一般的には７２時間を要
する。新しい発色培地（その培地内にメチシリン耐性菌株を選択するための基質（複数で
も可）および一般に抗生物質（例えば、セフォキシチン）を有する）は、培養の時間を２
４〜４８時間という結果に抑える可能性があり得る。しかし、ＭＲＳＡ感染の場合、結果
が得られるまで患者を分離する必要があるので、結果はすぐに必要とされる。そのため、
２〜４時間のうちに結果をもたらすことのできる、信頼できる分子ＭＲＳＡ試験が非常に
望ましい。

増幅は周知の技術であり、様々な方法が開発されていて、それには、転写に基づく増幅
、例えば転写介在増幅（ＴＭＡ；米国特許第５，７６６，８４９号；同第５，３９９，４
９１号；同第５，４８０，７８４号；同第５，７６６，８４９号；および同第５，６５４
，１４２号）ならびに核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；同第５，１３０，２３８号；
同第５，４０９，８１８号；同第５，６５４，１４２号；および同第６，３１２，９２８
号）、ならびにサイクリング核酸増幅技術（サーモサイクリング）、例えばポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，９６５，１８８号；同第
４，６８３，２０２号）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；米国特許第５，７９２，６０
７号）が含まれる。また、公知の増幅法としては、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、自家持続配列
複製法（３ＳＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、およびカスケードローリングサークル増幅（Ｃ
ＲＣＡ）も含まれる。

核酸を利用する検出法も当分野で周知である。核酸は、様々な検出目的のために標識さ
れる場合が多い。例えば、米国特許第４，４８６，５３９号（Ｋｏｕｒｌｉｓｋｙ）；同
第４，４１１，９５５号（Ｗａｒｄ）；同第４，８８２，２６９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
）および４，２１３，８９３号（Ｃａｒｒｉｃｏ）に記載される方法は、特定の核酸配列
を検出するための標識された検出プローブの調製を説明する。異なる検出法、例えば標的
捕捉、ＨＰＡ、ＴＡＱｍａｎ、分子ビーコンおよびサンドイッチハイブリダイゼーション
のためのプローブ設計も記載されている（例えば、米国特許第４，４８６，５３９号、お
よび米国特許第４，７５１，１７７号；同第５，２１０，０１５号；同第５，４８７，９
７２号；同第５，８０４，３７５号；同第５，９９４，０７６号）。核酸ハイブリダイゼ
ーション技法および条件は、当業者に公知であり、例えば、多くのその他の刊行物の中で
も、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂ．Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｄｅｃ．１９８９；米国特許第４，５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉ）および同第
４，８５１，３３０号（Ｋｏｈｎｅ）ならびにＤｕｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １２
，ｐｐ．２３−２６ （１９７８） に記載されている。異なる検出法のためのプローブ
設計、例えば標的捕捉、ＨＰＡ、ＴＡＱｍａｎ、分子ビーコンおよびサンドイッチハイブ
リダイゼーション（例えば、米国特許第４，４８６，５３９号、および同第４，７５１，
１７７号；同第５，２１０，０１５号；同第５，４８７，９７２号；同第５，８０４，３
７５号；同第５，９９４，０７６号）も公知である。

ｍｅｃＡ遺伝子および黄色ブドウ球菌特異的染色体配列の検出に基づいてＭＲＳＡを検
出および同定するために開発されたもっと以前の分子的方法が記載されている（Ｓａｉｔ
ｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３：２４９８−２
５００；Ｕｂｕｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．３０：１７２８−１７３３；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：２２４０−２２４４；Ｈｉｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ
．，１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：４４５−４５３）。しかし
、サンプル中にｍｅｃＡ遺伝子と黄色ブドウ球菌染色体配列の両方が存在することに対し
て陽性であるという結果は、例えば、ｍｅｃＡおよび黄色ブドウ球菌特異的マーカーの検
出に基づく試験では、ＭＳＳＡおよびｍｅｃＡ遺伝子を保有するメチシリン耐性コアグラ
ーゼ陰性ブドウ球菌が存在することに対して偽陽性が観察される可能性があるので、ＭＲ
ＳＡが存在することを保証することはできない。さらに、カセット連結部位のみの検出に
基づく試験において、ＳＣＣｍｅｃの右端部の小さい断片を含有するメチシリン感受性黄
色ブドウ球菌分離株に関して偽陽性が観察されている（Ｒｕｐｐ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４（６）：２３１７ （２００６）を参照のこと）
。その上、ＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎおよびＲｉｃｃｅｌｌｉは、ＳＣＣｍｅｃカセット
配列の一部および挿入領域（左端部連結領域）中の黄色ブドウ球菌配列の一部を含む、Ｓ
ＣＣｍｅｃカセット挿入部位の左連結部位の近くの領域と相補的な配列を有するオリゴヌ
クレオチドプローブを利用する、ＭＲＳＡを検出するための方法を記載している（米国特
許出願公開第２００６００５７６１３号）。

しかし、分子的方法によりＭＲＳＡを決定するこれまでの試みは、偽陽性の結果を伴う
という困難があった。このような結果は、次のうちのいずれかの結果を前提としてきた：
スワブ中の混合集団の存在、ＭＳＳＡ中のｍｅｃＡ遺伝子の欠失の直後の残留ＳＣＣｍｅ
ｃ右端部断片の存在および／または非特異的増幅。これまで、黄色ブドウ球菌により特異
的に保有されるメチシリンに対する耐性を決定するための以下の２つの概念が発表されて
いる：
（ｉ）ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位増幅概念（Ｈｉｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．国際公
開第９７／３１１２５号；欧州特許第０８８７４２４号；米国特許第６，１５６，５０７
号；およびさらに、Ｈｕｌｅｔｓｋｙ ａｎｄ Ｒｏｓｓｂａｃｈ 国際公開第０２／０
９９０３４号（２００２）；Ｈｕｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．４２（５）：１８７５−１８８４ （２００４））；
（ｉｉ）Ｆｒａｎｃｏｉｓおよび共同研究者により記載される免疫選択菌培養（ｉｍｍｕ
ｎｏ−ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）概念（Ｆｒａｎｃｏｉｓ，Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１（１）：２５４−２６０ （２００３）；国際公開第０２／
０８２０８６号）、免疫選択菌培養の後に続いて３種類のマーカー（ｍｅｃＡ遺伝子、黄
色ブドウ球菌特異的マーカー、および表皮ブドウ球菌特異的マーカー）が増幅される。

ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位概念は、ＳＣＣｍｅｃ組込み部位の右端部連結領域を網羅
する領域の増幅に基づく。原則は以下のとおりである：ＳＣＣｍｅｃカセットは、ｏｒｆ
Ｘと呼ばれる黄色ブドウ球菌特異的オープンリーディングフレームの上流の黄色ブドウ球
菌染色体に組み込まれ；ＰＣＲアッセイは、該カセットの右部分に位置する複数の正方向
プライマー、１つの逆方向プライマーおよびビーコンプローブを組み合わせるものであり
、両方とも黄色ブドウ球菌染色体ｏｒｆＸ、すなわちｏｒｆＸを含むＳＣＣｍｅｃの右端
部連結部位の下流（ｏｒｆＸの「右端部連結領域」）に位置する。Ｈｉｒａｍａｔｓｕ
ｅｔ ａｌ．は、カセットの右端部連結領域で２つの正方向プライマーを用いて、その当
時にいわれていた主なＳＣＣｍｅｃの型を増幅する試験を記載している（１つのプライマ
ーはＳＣＣｍｅｃＩ型およびＩＩ型のためのものであり、２番目のプライマーＩＩＩ型の
ためのものである）。Ｈｕｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．は、Ｈｉｒａｍａｔｓｕに記載さ
れる２つの正方向プライマーのみを使用した場合に数種類のＭＲＳＡ菌株が検出されなか
ったこと、およびかれらがＳＣＣｍｅｃカセットの右部分に配列多様性を有する、ＭＲＥ
Ｊ型と名付けられた新しい型のカセットを決定したことを示す。市販されている（Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）試験は、（図１参照）カセットの右部
分に位置する５つの正方向プライマー（１つのプライマーはＭＲＥＪ ｉ型およびｉｉ型
の検出用に、その他の４つのプライマーはＭＲＥＪ ｉｉｉ型、ｉｖ型、ｖ型およびｖｉ
ｉ型用に設計された）、ｏｒｆＸに位置する１つの逆方向プライマー、ならびに、ｏｒｆ
Ｘ領域の同じ部分を網羅し、同定されたｏｒｆＸ変異体を同定するために必要な３種の一
般的なビーコンを組み合わせたものである。この試験は、リアルタイムＰＣＲで行われる
。しかし、報告されるように（Ｈｕｌｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．２００４）、この試験の
特異性により、４．６％のＭＳＳＡ（試験した５６９例の中の２６例）が誤認されたこと
が示される。偽陽性の結果は、単一遺伝子座（右端部ＳＣＣｍｅｃカセット−ｏｒｆＸ連
結部位）ＰＣＲアッセイを用いる別の市販の試験でも報告されている（Ｒｕｐｐ，ｅｔ
ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（４４）６：２３１７（２００６））。

従って、偽陽性が依然として問題であり、現行の試験で得られる偽陽性の結果を減らす
ための、改良されたＭＲＳＡ用の試験が強く必要とされている。そのような試験のための
課題は、鼻腔スワブ中の混合集団の存在に起因し、次の混合物が存在する可能性がある：
１以上の（１）ＭＲＳＡ、（２）メチシリン感受性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（例えば
、メチシリン感受性表皮ブドウ球菌（ＭＳＳＥ））、（３）メチシリン感受性黄色ブドウ
球菌（ＭＳＳＡ）、および（４）メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＭＲ−Ｃ
ＮＳ）（主にメチシリン耐性表皮ブドウ球菌（ＭＲＳＥ））。さらに、ｍｅｃＡ遺伝子を
含まないＳＣＣｍｅｃエレメントを保持する臨床ＭＳＳＡ分離株が報告されている（Ｄｏ
ｎｎｉｏ，Ｐ．−Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５
Ａｕｇｕｓｔ；４３（８）：４１９１-４１９３）。ＭＲＳＡが存在する場合のみ保因者
の除染が必要となるので、試験は、メチシリンへの耐性が、表皮ブドウ球菌（またはコア
グラーゼ陰性ブドウ球菌株）ではなく黄色ブドウ球菌によって保有されていることを保証
しなければならない。従って、また、スワブに存在する混合集団について直接（黄色ブド
ウ球菌特異的マーカーに関連するまたはしない）ｍｅｃＡ遺伝子を増幅および検出するこ
とは適当でなく、実際に、両方の状況において（ＭＲＳＡ＋ＭＳＳＥまたはＭＳＳＡ＋Ｍ
ＲＳＥ）、両方のマーカー（ｍｅｃＡおよび黄色ブドウ球菌特異的マーカー）が検出され
るが、ＭＲＳＡを含む最初の状況だけが、臨床医によって特異的に検出されることが望ま
しい。本発明は、ＭＲＳＡ偽陽性の主な原因（ｓｏｕｒｃｅｓ）に対応し、従って、現在
利用可能な試験によって対応されてきていない、非常に必要とされている、ＭＲＳＡを検
出するための改良された試験を提供する。

本発明は、サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に
挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供し、そ
の方法は、
ａ．ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることのできる
第１のプライマーと、
ｂ．黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることの
できる第２のプライマーと、
ｃ．第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある
ＳＣＣｍｅｃカセット領域に対して特異的にハイブリダイズすることのできるプローブと
を利用して、サンプルにおいて増幅及び検出反応を行うことを含み、
第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下において、連結部位が
増幅されるように方向付けられ、かつ
サンプルがＭＲＳＡを含む場合、プローブのハイブリダイゼーションが検出される。本
明細書において示されるこのような方法において、「ａ」プライマー、プローブ、などは
、特に指定のない限りまたは文脈で別に指示されていない限り、１以上のプライマーまた
はプローブを意味し得る。

本発明は、さらに、サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮ
Ａの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法をさ
らに提供し、その方法は、
ａ）１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることので
きる第１のプライマーと、
２）黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域において特異的にハイブリダイズする
ことのできる第２のプライマーと、
３）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある
ＳＣＣｍｅｃカセット領域に対して特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプロ
ーブと
を利用して、挿入されたＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの連結部位
の存在を検出する増幅及び検出反応をサンプルにおいて行うステップと、ここで、第１の
プライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が増幅されるように
方向付けられており、
ｂ）ｍｅｃＡ遺伝子の存在を検出する、増幅および検出反応をサンプルにおいて行うス
テップと、ここで、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、サンプル中の標的連結部位およびｍ
ｅｃＡ遺伝子の両方の存在が検出される、
を含む。

本発明は、サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に
挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供し、そ
の方法は、
該増幅反応が、
ａ．１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることので
きる第１のプライマーと、
２）黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることの
できる第２のプライマーと、
３）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある
ＳＣＣｍｅｃカセット領域に対して特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプロ
ーブと
を利用して、挿入したＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの連結部位の
存在を増幅および検出するステップと、ここで、第１のプライマーおよび第２のプライマ
ーの各々は、増幅条件下、連結部位が増幅されるように方向付けられており、
ｂ．ｍｅｃＡ遺伝子の存在を増幅及び検出するステップと、ここで、サンプルがＭＲＳ
Ａを含む場合、サンプル中の標的連結部位とｍｅｃＡの両方の存在が検出される、
を含む、マルチプレックス増幅反応をサンプルに行うステップを含む。

その上、本発明は、サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮ
Ａの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提
供し、その方法は、
ａ．サンプルにおいて（１）挿入されたＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体
ＤＮＡの連結部位および（２）ｍｅｃＡ領域の両方を同時に増幅することのできる増幅反
応を行うステップと、
ｂ．増幅産物の中で、連結部位とｍｅｃＡの各々の存在又は不在を検出するステップと
、ここで、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、サンプル中の標的連結部位とｍｅｃＡの両方
の存在が検出される、
を含む。

本発明は、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されている
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のサンプルの存在を同定する方法をさらに提
供し、その方法は、
単一容器中で、生体サンプルを、
ａ）（１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域と特異的にハイブリダイズする核酸配
列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
（２）ＳＣＣｍｅｃカセットに隣接する黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ領域と特異的に
ハイブリダイズする核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと
を含む、生体サンプルならびに該第１および第２のオリゴヌクレオチドの第１の反応産物
を形成するための第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）（３）ｍｅｃＡ核酸の第１の領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列
を有する第３のオリゴヌクレオチドと、
（４）ｍｅｃＡ核酸の第２の領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を
有する第４のオリゴヌクレオチドと
を含む、生体サンプルならびに該第３および第４のオリゴヌクレオチドの第２の反応産物
を形成するための第２のオリゴヌクレオチドセットと
に接触させるステップと、
第１および第２の反応産物の両方を検出することによりＭＲＳＡの存在を同定するステ
ップとを含む。同定する段階は、一実施形態では、第１および第２の反応産物を、（１）
第１の反応産物と特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプローブおよび（２）
第２の反応産物と特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプローブと接触させる
ステップを含み得る。

本発明は、上記のような方法で使用するためのキットをさらに提供する。具体的には、
本発明は、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されているメ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出のためのキットを提供し、このキットは
、
（ａ）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることのでき
る第１のプライマーと、
（ｂ）端部連結部位の領域において黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダ
イズすることのできる第２のプライマーと、
（ｃ）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にあ
るＳＣＣｍｅｃカセット領域内において完全に特異的にハイブリダイズすることのできる
プローブとを含み、
この際、第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が
増幅されるように方向付けられている。さらに、本発明は、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色
ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ
）のサンプルの存在を同定するためのキットを提供し、このキットは、
ａ）１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域において特異的にハイブリダイズするこ
とのできる第１のプライマーと、
２）端部連結部位の領域に黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズする
ことのできる第２のプライマーと、
３）（１）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間
にあるＳＣＣｍｅｃカセット領域内において主に特異的にハイブリダイズすることのでき
る第１のプローブ、および、（２）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる
領域と連結部位との間にあるＳＣＣｍｅｃカセット領域内において完全に特異的にハイブ
リダイズすることのできる第１のプローブからなる群より選択される第１のプローブとを
含み、
第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が増幅され
るように方向付けられている、第１の増幅および検出オリゴヌクレオチドセット、ならび
に
ｂ）４）ｍｅｃＡの第１の領域と特異的にハイブリダイズすることのできる、第３のプ
ライマーと、
５）ｍｅｃＡの第２の領域と特異的にハイブリダイズすることのできる第４のプライマ
ーと、
６）ｍｅｃＡの第１の領域と第２の領域との間のｍｅｃＡ領域と特異的にハイブリダイ
ズすることのできる第２のプローブとを含み、
この際、第３のプライマーおよび第４のプライマーの各々は、増幅条件下、前記ｍｅｃ
Ａの第１の領域と前記ｍｅｃＡの第２の領域の間のｍｅｃＡ領域が増幅されるように方向
付けられている、第２の増幅および検出オリゴヌクレオチドセットを含む。

一般に、挿入されたＳＣＣｍｅｃカセットを含むＭＲＳＡ染色体の領域（左および右端部連結部位を示す）を示す図である。 一般に、ＳＣＣｍｅｃ／ｏｒｆＸの右端部連結領域中のプライマーおよびプローブの位置を示す図である。図中、５つのプライマー２（「５Ｐ２」、矢印）はカセットの右部分に位置し、１つの一般的なプライマー１（「Ｐ１Ｔ７」）は、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに位置し、１つの一般的なビーコン（「ＭＢ」）は、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに位置する（「アプローチ１」）。 一般に、ＭＲＳＡ中のＳＣＣｍｅｃ挿入の右端部連結部位の検出のための本発明の方法のためのプライマーおよびプローブの位置を示す図である：ＳＣＣｍｅｃ右端部連結領域に位置する５つのプライマー２（「Ｐ２」、矢印）、ｏｒｆＸに位置するプライマー１（「Ｐ１」、角度の付いた線）、およびＳＣＣｍｅｃカセットの右部分に位置する５つの特異的プローブ（線）が使用される（「アプローチ２」）。 ｍｅｃＡおよび右端部連結部位の、次のプライマーおよびプローブ：ｍｅｃＡでは、プライマー１（「Ｐ１」）、プライマー２（「Ｐ２」）およびプローブ（「ビーコン」）；「右側のＳＣＣｍｅｃ−染色体連結領域」では右端部連結領域、プライマー１（「１Ｐ１、角度の付いた線）、５つのプライマー２（「５Ｐ２」、矢印）および５つのＳＣＣｍｅｃ特異的プローブ（「５つの特異的ビーコン」、両端に角度の付いた線）、を用いるマルチプレックス増幅を示す図である。

本明細書において考察されるように、本発明は、これまでの分子的方法による偽陽性の
同定が、場合によっては、ＭＳＳＡ中のｍｅｃＡを含有する染色体領域の欠失の直後の残
留ＳＣＣｍｅｃ右端部断片の存在、または、ｍｅｃＡを含有しないＳＣＣの存在により、
説明することができることを提供する。その上、本明細書においてさらに開示されるよう
に、本発明は、一部の偽陽性が非特異的増幅に起因する可能性を提供する（実際に（図２
に示されるように）、逆方向プライマーおよびビーコンは、ＭＲＳＡとＭＳＳＡの両方に
共通しているｏｒｆＸに位置するので、ＭＳＳＡ染色体での正方向プライマー（複数でも
可）の非特異的アニーリングは、ＭＳＳＡの増幅および検出をもたらす）。本発明は、偽
陽性の両方の原因に対応し、改良された試験を提供する。

別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語
は、開示される本発明の属する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明
細書に記載されるものに類似するかまたは同等であるあらゆる方法および材料を、本発明
の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料は
、記載されるとおりである。

本明細書および添付される特許請求の範囲において、単数形の「ａ」、「ａｎ」、およ
び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて、複数形への言及が含ま
れる。

上に述べたように、本発明は、これまでの検出方法に関して報告されたＭＳＳＡ検出に
起因する特異性の欠如を減少させるための解決策を提供し、その解決策は、個別に、また
は理想的には、同じ試験の中で利用することができる。従って、本発明は、一般的なビー
コンよりもむしろ（ＳＣＣｍｅｃカセットに特異的な）特異的ビーコンの使用を記載する
。この構成は、非特異的増幅が原因で増幅されたＭＳＳＡの検出を抑制する。さらに、本
発明は、マルチプレックス反応において、カセット挿入領域単独の検出と比較して、ｍｅ
ｃＡ遺伝子検出とカセット挿入領域（例えば、右ＳＣＣｍｅｃ染色体連結領域）検出を組
み合わせることの利点を記載する。本発明のこの態様は、ｍｅｃＡを含有する染色体領域
の欠失の直後の残留ＳＣＣｍｅｃ右端部断片の存在に起因するか、またはｍｅｃＡを含有
しないＳＣＣの存在に起因する、ＭＳＳＡの検出を減らすことができる。

好ましい実施形態では、本発明は、サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ
球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検
出する方法を提供し、この方法は、
ａ．ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることのできる
第１のプライマーと、
ｂ．黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることの
できる第２のプライマーと、
ｃ．第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある
ＳＣＣｍｅｃカセット領域と特異的にハイブリダイズすることのできるプローブと
を利用して、サンプルにおいて増幅及び検出反応を行うことを含み、
この際、第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が
増幅されるように方向付けられ、かつ、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、プローブのハイ
ブリダイゼーションが検出される。

ＭＲＳＡのゲノム構造は既に特性決定されている。本特許請求の範囲において用いられ
る、「ＳＣＣｍｅｃカセット」（例えば、Ｈｉｒａｍａｔｓｕの米国特許第６，１５６，
５０７号において、「ｍｅｃＤＮＡ」と呼ばれる場合もある）は、当分野で公知の定義を
有する、すなわち、ＭＲＳＡまたはＭＲ−ＣＮＳの染色体上に存在する組み込まれた外来
性ＤＮＡであり、それには、ｍｅｃ遺伝子複合体、一組の部位特異的リコンビナーゼ遺伝
子（ｃｃｒＡおよびｃｃｒＢ）、ならびに（３’および５’の両末端での）末端の逆位配
列および直接反復配列が含まれる。「ｍｅｃＡ遺伝子」には、メチシリン耐性を付与する
ＰＢＰ２ａまたはＰＢＰ’（ペニシリン結合タンパク質）をコードするために必要なすべ
ての配列が含まれる。

当分野で公知のように、ＳＣＣｍｅｃカセットを黄色ブドウ球菌染色体に挿入すること
により２つの連結部位、およびＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの２
つの対応する連結領域が作り出され、この際、ＳＣＣｍｅｃ配列は、黄色ブドウ球菌染色
体配列に隣接している。そのため、該連結部位は、ＳＣＣｍｅｃカセットの左および右端
部に位置する（図１参照）。これらの２つの領域は、Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．により「右Ｓ
ＣＣｍｅｃ−染色体連結部位」および「染色体−左ＳＣＣｍｅｃ連結部位」と名付けられ
ている（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｍａｙ ２００１
４５（５）：１３２３−１３３６，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
ｏｆ ｔｈｒｅｅ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ Ｃａｓｓｅｔｔ
ｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍｅｃ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍ
ｏｓｏｍｅ ｉｎ Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ」）。右端部連結部位では、ＳＣＣｍｅｃカセットに隣接する
黄色ブドウ球菌ゲノム配列は、遺伝子ｏｒｆＸであり、これは一部の文献では「ＩｎｔＭ
」と称される。特許請求の範囲において用いられる、「端部連結領域」は、プライマーを
、プライマー伸長反応または転写形式の（例えば、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ）反応におい
て、その連結部位の全域で、例えば、連結部位の（いずれかの方向に）６００ｎｔ、５５
０ｎｔ、５００ｎｔ、４５０ｎｔ、４００ｎｔ、３５０ｎｔ、３００ｎｔ、２５０ｎｔ、
２００ｎｔ、１５０ｎｔ、１００ｎｔ、または５０ｎｔ以内まで伸長させることのできる
ような、右または左のいずれかの端部連結部位または挿入部位の距離内の、ＳＣＣｍｅｃ
カセットかまたは黄色ブドウ球菌染色体核酸のいずれかの領域である。有用な距離は、使
用する増幅技術によって変化する可能性がある（例えば、新しい技術が開発されるにつれ
てその距離はもっと長くなる）。「端部連結領域」は、そのために、使用される状況によ
って、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡ内の領域または黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内の領域を意味
し得る。いずれの使用も、適切に選択されたプライマーが、適切で標準的な伸長または増
幅条件下で、プライマーから、連結部位の方向に、連結部位にわたって伸長されるか、ま
たは転写されることができるような、連結部位の距離内のＤＮＡをさす。つまり、「ＳＣ
Ｃｍｅｃカセットの端部連結領域」は、その接合点（ａｂｕｔｍｅｎｔ）の近くのＳＣＣ
ｍｅｃ−ＤＮＡ内部の領域、または黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡを含む組込み部位であり
、そして、「ｏｒｆＸの端部連結領域」は、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡを含む（ＳＣＣｍｅｃ
組込み部位）接合点の近くのｏｒｆＸ−ＤＮＡ内部の領域である。同様に、「黄色ブドウ
球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域」は、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡを含む接合点の近くの黄色
ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内部の領域である。あるいは、この領域は、「ＳＣＣｍｅｃ端部
連結部位の領域中の黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ」とも称され得る。従って、「右端部連
結領域」とは、ＳＣＣｍｅｃカセットの右側で連結部位を取り囲んでいる領域をさし、「
左端部連結領域」とは、ＳＣＣｍｅｃカセットの左側で連結部位を取り囲んでいる領域を
さす（図１参照）。

ＭＲＳＡを検出するために有用な方法をさらに提供するため、本発明は、ＳＣＣｍｅｃ
挿入連結部位およびｍｅｃＡ配列の両方の存在を検出する、増幅および検出を提供する。
より具体的には、本発明は、サンプル中で、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色
体ＤＮＡの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方
法をさらに提供し、この方法は
（ａ）次の１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズするこ
とのできる第１のプライマーと、
２）黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることの
できる第２のプライマーと、
３）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある
ＳＣＣｍｅｃカセット領域と特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプローブと
を利用して、挿入されたＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの連結部位
の存在を検出する増幅及び検出反応をサンプルに行うステップと、
ここで、第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々が、増幅条件下、連結部位が
増幅されるように方向付けられており、
（ｂ）ｍｅｃＡ遺伝子の存在を検出する、増幅および検出反応をサンプルにおいて行う
ステップと、
ここで、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、サンプル中の標的連結部位およびｍｅｃＡ遺
伝子の両方の存在が検出される、
を含む。
上記のような方法は、ＭＲＳＡを、ｍｅｃＡ（しかし完全なＳＣＣｍｅｃカセットでは
ない）が欠失している、やや希なＭＳＳＡと区別する際に特に役立つ。

有利には、マルチプレックス増幅反応を行って、ＳＣＣｍｅｃ挿入連結部位とｍｅｃＡ
配列の存在の両方を検出することができる。従って、本発明は、サンプル中の、ＳＣＣｍ
ｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブ
ドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提供し、その方法は、
サンプルにおいてマルチプレックス増幅反応を行うことを含み、この際、増幅反応は、
ａ．１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることので
きる第１のプライマーと、
２）黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすること
のできる第２のプライマーと、
３）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にあ
るＳＣＣｍｅｃカセット領域と特異的にハイブリダイズすることのできるプローブと
を利用して挿入したＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの連結部位の存
在を増幅および検出するステップと、
この際、第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々が、増幅条件下、連結部位が
増幅されるように方向付けられており、
ｂ．ｍｅｃＡ遺伝子の存在を増幅及び検出するステップと、
ここで、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、サンプル中の標的連結部位およびｍｅｃＡの
両方の存在が検出される、
を含む。

「連結部位を増幅する」とは、連結部位に隣接するＳＣＣｍｅｃ内の核酸と同じ連結部
位に隣接する黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ内の核酸の両方に相当する配列を含む増幅産物
を生じる増幅反応を行うことを意味する。「ｍｅｃＡ遺伝子の存在を増幅および検出する
こと」とは、サンプル内部でｍｅｃＡ遺伝子の任意の部分、例えば、配列番号１５および
１６に示される核酸配列を含むプライマー間の領域を増幅および検出することを意味する
（それは、例えば、配列番号１４に示される核酸配列を含むプローブを利用して検出する
ことができる）。プライマーおよびプローブは、公知のｍｅｃＡ配列に対するハイブリダ
イゼーション用に容易に設計することができる。

用語「マルチプレックス増幅反応」とは、複数の増幅が同一反応容器内で起こり得るよ
うに、複数の標的の増幅に特異的な試薬を一緒に接触させることを意味する。その上、複
数の標的のための検出試薬を含むことができる。従って、複数の標的の増幅および検出に
特異的な試薬を全て接触させることにより、マルチプレックス増幅および検出反応を行う
ことができる。従って、マルチプレックス反応では、同一反応内で複数の標的領域を増幅
することができる。個々の反応を同時に進行させることが可能であるが、複数の増幅反応
の反応体が必ずしも全て同一反応容器もしくは管内になく、むしろ、複数の反応が別個の
反応容器で行われ得る、「同時増幅」もまた、マルチプレックスが望ましくないかまたは
実現可能でない場合に利用することができる。マルチプレックス増幅反応においてでさえ
、提供された条件下で個々の反応がどのような速度で進行するとしても、各々の反応は起
こることは当然理解される。検出はまた、「同時」であっても良く、それは、反応容器に
各々の反応に適切なプローブが含まれている場合、適切な条件下、単一の反応容器（マル
チプレックス）で、または複数の反応容器（当該反応容器へ分配された適切なプローブ）
で、複数の標的の検出を達成することができることを意味する。このような検出は、所望
であればマルチプレックスまたは同時増幅反応と同一の反応容器内で行うことができ、そ
して、さらに、増幅反応が継続している間行うことができる（すなわち、リアルタイム）
。

従って、本発明は、サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮ
Ａの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法を提
供し、その方法は、
ａ．（１）挿入したＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡとの連結部位
および（２）ｍｅｃＡ領域の両方を増幅することのできるマルチプレックス増幅反応を、
サンプルにおいて行うステップと、
ｂ．増幅産物の中で、連結部位とｍｅｃＡの各々の存在又は不在を検出するステップと
を含み、
この際、サンプルがＭＲＳＡを含む場合、サンプル中の標的連結部位とｍｅｃＡの両方
の存在が検出される。

挿入されたＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの連結部位の増幅は、
有利には、
１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることのできる
第１のプライマーと、
２）黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることの
できる第２のプライマーと、
３）第１のプライマーが特異的にハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との
間にあるＳＣＣｍｅｃカセット領域に特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプ
ローブと
を利用することにより達成することができ、
この際、第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が
増幅されるように方向付けられている。このプローブは、ＳＣＣｍｅｃ領域内で完全に特
異的にハイブリダイズするように選択することができる。連結部位とｍｅｃＡのいずれか
の存在または不在は、産物の検出をもたらすあらゆる分析により決定することができ、例
えば、標識プローブを使用する場合、適切な検出装置によるハイブリダイズした標識の検
出により決定することができる。検出可能なシグナルがないことは、その標的が存在しな
いことを示し、検出可能なシグナルの認知は、その標的の存在を示す。

本発明の反応で使用されるプライマーおよびプローブは、標的核酸と特異的にハイブリ
ダイズすることができる。特異的ハイブリダイゼーションは当分野で公知であり、一般に
、特異的ハイブリダイゼーションは、核酸同一性またはプライマー／プローブと標的核酸
との高度な類似性によって、かつ／または、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件（例えば、ストリンジェントな温度および／または塩条件）の使用によって達成され
る。特異的ハイブリダイゼーションは、反応内部での標的への選択的ハイブリダイゼーシ
ョンをもたらす。

「増幅条件下、連結部位が増幅されるように方向付けられている」プライマーには、そ
の特異的標的核酸とのハイブリダイゼーションの際に、かつ、該プライマーを含む増幅反
応の開始の際に、連結部位を含むアンプリコンが形成されるように方向付けられているプ
ライマーが含まれる。そのような反応は、連結部位にわたって増幅するよう設計されてい
る（すなわち、典型的な増幅反応が連結部位にわたって広がるように連結部位に十分近接
している）。従って連結部位を増幅するために有用なプライマー対は、一般に、連結部位
を囲む２つの領域とハイブリダイズし、各々のプライマーは、連結部位に向かって５’−
３’方向にハイブリダイズするように方向付けられる。一般に、プライマーは、連結部位
の６００ｎｔ、５００ｎｔ、４００ｎｔ、３５０ｎｔ、３００ｎｔ、２５０ｎｔ、２００
ｎｔ、１５０ｎｔ、１００ｎｔ、５０ｎｔ、３０ｎｔ、２５ｎｔ、２０ｎｔなど以内でハ
イブリダイズするように設計される。増幅産物を検出するためのプローブは、そのため、
第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある、ＳＣ
Ｃｍｅｃカセット領域と特異的にハイブリダイズすることができるように選択される。あ
る種の実施形態では、そのようなプローブは、完全にＳＣＣｍｅｃカセット内でまたは主
にＳＣＣｍｅｃカセット内で特異的にハイブリダイズすることができる。プローブが主に
ＳＣＣｍｅｃカセット内で特異的にハイブリダイズする一実施形態では、該プローブがハ
イブリダイズする領域は、さらに連結部位を含んでもよく、そのために、連結部位に隣接
するｏｒｆＸの少なくとも１個、または２個または３個または数個のヌクレオチドを含ん
でもよい。該プローブの１、２、３または数個のヌクレオチドが連結部位に隣接するｏｒ
ｆＸの領域とハイブリダイズするならば、そのプローブは、しかしながら、好ましくは隣
接している、そのヌクレオチドの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５
％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少な
くとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、または少なくとも９９％が、第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる
領域と連結部位との間のＳＣＣｍｅｃカセットの領域に特異的にハイブリダイズすること
が可能である。従って、右端部連結領域の増幅のために、３’であるＳＣＣｍｅｃカセッ
トの一領域、またはＳＣＣｍｅｃカセットプライマーの３’末端の下流（ハイブリダイズ
する場合）および連結部位の上流と特異的にハイブリダイズするプローブを選択する。一
般に、プライマーは、そのプライマーおよび（黄色ブドウ球菌ゲノム配列中に位置する）
第２のプライマーを用いて合成された増幅産物が、約２００〜３５０ヌクレオチド長とな
るように選択される。ＰＣＲ増幅は、より長いアンプリコン（例えば、２５０、３００、
３５０、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｔ）を作製する
ために設計され得るが、転写に基づく反応（例えば、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ）またはＰ
ＣＲ型の反応のいずれかに好ましいアンプリコン長は、約２００〜３００ｎｔ（例えば、
１５０、２００、２５０、３００ｎｔ）の長さである。その上、マルチプレックス増幅反
応に関して、転写に基づくものであってもＰＣＲに基づくものであっても、２００〜３０
０ｎｔの範囲またはそれより短いアンプリコンが試験の感受性を促進するために好ましい
。

本特許請求の範囲において用いられる、「増幅条件」は、当業者に公知の、選択された
増幅反応に適切な条件、例えば様々な増幅反応で利用される条件などである。このような
条件は、これも当業者に公知のように、特異的反応、プライマーなどのために最適化する
ことができる。公知のように、このような増幅条件には、増幅に必要な試薬、例えば、ヌ
クレオチドおよび酵素との接触、ならびに、その他の局面の中でも、適切な選択温度、塩
およびｐＨ条件が含まれる。さらに、本特許請求の範囲において用いられる、プライマー
またはプローブは、プライマーまたはプローブセット、すなわち複数のプライマーまたは
プローブであってもよい。このようなプライマー／プローブセットは、ＭＲＳＡの複数の
型または亜型が増幅され、かつ／または検出されることが望まれる反応において利用する
ことができ、かつ、該プライマーおよび／またはプローブのハイブリダイゼーションのた
めに選択された標的ＭＲＳＡ領域の核酸配列は、型および／または亜型によって異なる。
個々のプライマー／プローブは、本明細書において例証されるように、各々の型または亜
型に対して設計することができる。

端部連結領域を増幅するために有用な特異的プライマーは、本明細書において教示され
るように、容易に設計することができる。ＳＣＣｍｅｃ右端部領域とハイブリダイズする
ためのプライマーには、配列番号：１、２、３、４、５、および６に示されるプライマー
、ならびにこれらの配列を含むプライマーおよび本質的にこれらの配列からなるプライマ
ーが含まれ得る。ｏｒｆＸとハイブリダイズするための特異的プライマーには、配列番号
１３に示されるプライマー、ならびにこの配列を含むプライマーおよび本質的にこの配列
からなるプライマーが含まれ得る。ＳＣＣｍｅｃ右端部領域とハイブリダイズするための
プローブには、配列番号：７、８、９、１０、１１、および１２に示されるプローブ、な
らびにこれらの配列を含むプローブおよび本質的にこれらの配列からなるプローブが含ま
れ得る。ｍｅｃＡにハイブリダイズするためのプライマーには、配列番号：１５および１
６に示されるプライマーならびにこれらの配列を含むプライマーおよび本質的にこれらの
配列からなるプライマーが含まれ得る。いずれもＰ１型またはＰ２型（ＮＡＳＢＡ型増幅
用）として容易に適合させることができる。ｍｅｃＡにハイブリダイズするためのプロー
ブには、配列番号１４に示されるプローブ、ならびにこの配列を含むプローブおよび本質
的にこの配列からなるプローブが含まれ得る。

本発明は、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されている
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のサンプルの存在を同定する方法をさらに提
供し、その方法は、
単一容器中で、生体サンプルを、
ａ）（１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域と特異的にハイブリダイズする核酸配
列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
（２）ＳＣＣｍｅｃカセットに隣接する黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ領域と特異的に
ハイブリダイズする核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと
を含む、生体サンプルならびに第１および第２のオリゴヌクレオチドの第１の反応産物を
形成するための第１のオリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）（３）ｍｅｃＡ核酸の第１の領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列
を有する第３のオリゴヌクレオチドと、
（４）ｍｅｃＡ核酸の第２の領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を
有する第４のオリゴヌクレオチドと
を含む、生体サンプルならびに第３および第４のオリゴヌクレオチドの第２の反応産物を
形成するための第２のオリゴヌクレオチドセットと
に接触させるステップと、
第１および第２の反応産物の両方を検出することによりＭＲＳＡの存在を同定するステ
ップとを含む。第１および第２の反応産物は、増幅反応により形成することができる。試
薬をサンプルと接触させる条件は、選択された増幅反応に適した条件であってもよい。同
定段階は、一実施形態では、第１および第２の反応産物と（１）第１の反応産物が存在す
る場合、それに対して特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプローブ、および
（２）第２の反応産物が存在する場合、それに対して特異的にハイブリダイズすることの
できる第２のプローブを接触させることを含んでもよい。

本明細書において、標的ＤＮＡの一部分の中に含まれる核酸配列を「有する」オリゴヌ
クレオチドとは、その配列が、標的ＤＮＡ配列、またはその相補鎖に対してストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下でその標的ＤＮＡと特異的かつ選択的にハイブリダ
イズするために十分な同一性を有することを意味する。それには該配列に対して完全な配
列同一性を有する核酸配列が含まれる。単一の容器には、利用する特異的増幅および検出
法に合わせた反応混合物の全ての成分が含まれてもよい。従って、「反応混合物」には、
反応を行うために必要な全ての反応体が含まれてもよく、それには、限定されるものでは
ないが、反応の間ｐＨを選択されたレベルに維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベ
ンジャー、および同類のものを挙げることができる。

一般に、アンプリコン（ポリヌクレオチド増幅反応の産物）を生じる増幅反応は、反応
体（ヌクレオチドかまたはオリゴヌクレオチドである）の塩基対形成が、反応産物の形成
に必要とされる鋳型ポリヌクレオチド中に相補体を有するという点で、「鋳型主導（ｔｅ
ｍｐｌａｔｅ−ｄｒｉｖｅｎ）」である。一態様では、鋳型主導型の反応は、核酸ポリメ
ラーゼを用いるプライマー伸長または核酸リガーゼを用いるオリゴヌクレオチド連結であ
る。増幅には、あらゆる公知のまたは新規に設計された増幅法が含まれてもよく、それに
は、公開された方法で使用されるもの（例えば、転写に基づく増幅、例えば転写媒介性増
幅（ＴＭＡ）および核酸配列に基づく増幅（本明細書において例証される）ＮＡＳＢＡ、
およびサイクリング核酸増幅技術（サーモサイクリング）例えばポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）など
、ならびに任意の増幅法、例えば、持続配列複製法（３ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、
分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）、固相増幅（ＳＰＡ）、
ローリングサークル増幅技術（ＲＣＡ）、固相ＲＣＡ、アンカーＳＤＡおよびヌクレアー
ゼ依存性シグナル増幅（ＮＤＳＡ））が含まれ、それらはすべて当業者に公知である。増
幅反応が進行する時に反応産物を測定することを可能にする検出化学が利用可能であるな
らば増幅反応は、「リアルタイム」増幅、例えば、リアルタイムＰＣＲまたはリアルタイ
ムＮＡＳＢＡであってもよい。従って、本発明には、核酸に基づく診断検査の感受性およ
び／または迅速性を増大させるために使用することのできるあらゆる核酸増幅法またはあ
らゆるその他の手順の使用が含まれる。本発明はまた、増幅後検出技術、検出と組み合わ
せたあらゆる増幅技術、あらゆるハイブリダイゼーション核酸チップまたはアレイ技術、
およびあらゆる増幅チップまたは増幅とハイブリダイゼーションチップ技術の組合せを含
む、あらゆる検出技術の使用が含まれる。任意のヌクレオチド配列決定法による検出およ
び同定も本発明の範囲内である。

任意の適した増幅法をこのアッセイに利用することができるが、制限酵素、例えばＤＮ
Ａ−ＮＡＳＢＡなどを利用する増幅反応が、更なるレベルの特異性をアッセイに提供し得
ることは注目される。例えば、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸ領域においてハイブリダイズする
ことのできるＰ１を有するＤＮＡ−ＮＡＳＢＡ増幅反応を選択すると、増幅を起こすため
に黄色ブドウ球菌のゲノム領域に正確な制限部位が存在する要件は、それが必要な制限部
位を有するはずがないので、メチシリン耐性コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（例えば、メチ
シリン耐性表皮ブドウ球菌）の増幅の尤度を大いに減少させるかまたはなくす。これは、
本発明の「アプローチ２」反応において特に有用であり、この際、細菌ゲノムＤＮＡとＳ
ＣＣｍｅｃ−ＤＮＡとの間の連結部位を検出するためのプローブは、ゲノム細菌ＤＮＡよ
りもむしろ、ＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡと（または主にＳＣＣｍｅｃ−ＤＮＡと、一実施形態
では、ｏｒｆＸ ＤＮＡの連結部位にわたってハイブリダイズする１、２、３または数個
のプローブヌクレオチドを用いて）ハイブリダイズするように設計されている。これらの
特徴の組合せにより、ＭＲＳＡに対する高度に特異的なアッセイが提供される。さらに、
プライマーのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを増大させることにより
、ＰＣＲ型の反応を用いてさらなる特異性を達成することができる。従って、選択された
増幅反応のストリンジェンシーを増大させることにより、任意の選択された手段により、
ＳＣＣｍｅｃハイブリダイズプローブを利用する検出反応を含むＭＲＳＡアッセイの全体
的な特異性を増大させることができる。

さらに、増幅は、増幅を強化するさらなる方法で行うこともでき、例えば、転写に基づ
く増幅反応（例えば、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ）には、所望であれば、ブロックされた「Ｐ１
」（すなわち、プロモーターを有する）プライマーを利用することができる。このような
ブロックされたプライマーは、一般に、その３’末端でプライマーの伸長から、化学部分
、例えばダブシルなど、当分野で公知のその他の化学部分によってブロックされる。

多様な検出方法を本発明で利用することができる。核酸プローブを利用する検出法は当
分野で周知である。本キットの、かつ／または本方法で使用するためのプローブは、選定
された検出法に適した任意の選択された標識により標識することができ、その多くは当分
野で公知であり、例えば、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ビオチ
ン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ジゴキシゲ
ニン、蛍光染料（例えばＣｙ３およびＣｙ５染料、フルオレセイン、ＦＡＭ、ＲＯＸなど
）、化学発光標識、発色団標識、放射性標識（例えば、放射性同位元素）およびリガンド
などである。さまざまな検出方法のためのプローブ設計、例えば標的捕捉、ＨＰＡ、ＴＡ
Ｑｍａｎ、分子ビーコンおよびサンドイッチハイブリダイゼーションを利用することがで
きる。ハイブリダイゼーション条件は、選択するプローブの種類および検出反応の種類に
したがって選択することができる。

本発明の方法は、このような増幅および検出方法における使用に有用なキットをさらに
提供する。具体的には、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入
されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の検出のためのキットが提供され
、このキットは、ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域において特異的にハイブリダイズ
することのできる第１のプライマーと、端部連結部位の領域において黄色ブドウ球菌染色
体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプライマーと、第１のプライ
マーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にあるＳＣＣｍｅｃカセッ
トの領域内において完全に特異的にハイブリダイズすることのできるプローブとを含み、
第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が増幅される
ように方向付けられている。好ましい一実施形態では、端部連結領域は、右端部連結領域
である。もう一つの実施形態では、端部連結領域は、左端部連結領域である。一実施形態
では、第１および第２のプライマーは、単一の容器中に提供される。もう一つの実施形態
では、第１および第２のプライマーおよびプローブは、単一の容器中に提供される。従っ
て、本発明のキットは、ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域において特異的にハイブ
リダイズすることのできる第１のプライマーと、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの右端部連
結領域において特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプライマーとを含む第１
の容器、および第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との
間にあるＳＣＣｍｅｃカセット領域内において完全に特異的にハイブリダイズすることの
できるプローブを含む第２の容器を含み得る。その上、本発明のキットは、ＳＣＣｍｅｃ
カセットの右端部連結領域において特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプラ
イマーと、黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの右端部連結領域において特異的にハイブリダイ
ズすることのできる第２のプライマーと、第１のプライマーがハイブリダイズすることの
できる領域と連結部位との間にあるＳＣＣｍｅｃカセット領域内において完全に特異的に
ハイブリダイズすることのできるプローブとを含む１つの容器を含み得る。

本発明は、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されている
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のサンプルの存在を同定するためのキットを
さらに提供し、そのキットは、
ａ）１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることので
きる第１のプライマーと、
２）端部連結部位の領域において黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイ
ズすることのできる第２のプライマーと、
３）（ａ）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間
にあるＳＣＣｍｅｃカセットの領域内において主に特異的にハイブリダイズすることので
きる第１のプローブ、および、（ｂ）第１のプライマーがハイブリダイズすることのでき
る領域と連結部位との間にあるＳＣＣｍｅｃカセットの領域内において完全に特異的にハ
イブリダイズすることのできる第１のプローブからなる群より選択される第１のプローブ
と
を含み、
第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々は、増幅条件下、連結部位が増幅され
るように方向付けられている、第１の増幅および検出オリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）４）ｍｅｃＡの第１の領域と特異的にハイブリダイズすることのできる、第３のプ
ライマーと、
５）ｍｅｃＡの第２の領域と特異的にハイブリダイズすることのできる第４のプライマ
ーと、
６）ｍｅｃＡの第１の領域と第２の領域との間のｍｅｃＡの領域と特異的にハイブリダ
イズすることのできる第２のプローブを含み、
第３のプライマーおよび第４のプライマーの各々が、増幅条件下、前記ｍｅｃＡの第１
の領域と前記ｍｅｃＡの第２の領域との間のｍｅｃＡの領域が増幅されるように方向付け
られている、第２の増幅および検出オリゴヌクレオチドセットと
を含む。

本発明は、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されている
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のサンプルの存在を同定するためのキットを
さらに提供し、そのキットは、
ａ）１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域に特異的にハイブリダイズすることので
きる第１のプライマーと、
２）端部連結部位の領域において黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイ
ズすることのできる第２のプライマーと、
３）第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にある
ＳＣＣｍｅｃカセット領域内において、主に、または完全に特異的にハイブリダイズする
ことのできる第１のプローブと
を含み、
第１のプライマーおよび第２のプライマーの各々が、増幅条件下、連結部位が増幅され
るように方向付けられている、第１の増幅および検出オリゴヌクレオチドセットと、
ｂ）４）ｍｅｃＡの第１の領域と特異的にハイブリダイズすることのできる第３のプラ
イマーと、
５）ｍｅｃＡの第２の領域と特異的にハイブリダイズすることのできる第４のプライマ
ーと、
６）前記ｍｅｃＡの第１の領域と前記ｍｅｃＡの第２の領域との間のｍｅｃＡの領域と
特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプローブと
を含み、
第３のプライマーおよび第４のプライマーの各々が、増幅条件下、ｍｅｃＡの第１の領
域と第２の領域との間のｍｅｃＡの領域が増幅されるように方向付けられている、第２の
増幅および検出オリゴヌクレオチドセットと
を含む。

第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にあるＳＣ
Ｃｍｅｃカセット領域「内で完全に」特異的にハイブリダイズすることのできるプローブ
とは、特異的ハイブリダイゼーションのために選択された条件下で、ＳＣＣｍｅｃカセッ
トの中でのみハイブリダイズし、連結部位を越えてハイブリダイズしないプローブを意味
する。ＳＣＣｍｅｃカセット「内で主に」特異的にハイブリダイズすることのできるプロ
ーブとは、ＳＣＣｍｅｃカセット内でハイブリダイズし、連結部位を越えてさらにハイブ
リダイズすることができ、その結果、連結部位に隣接するｏｒｆＸの少なくとも１個、ま
たは２個または３個または数個のヌクレオチドを含むプローブを意味する。該プローブの
１個、２個、３個または数個のヌクレオチドが、連結部位に隣接するｏｒｆＸの領域とハ
イブリダイズする場合、そのプローブは、しかしながら、そのヌクレオチド、好ましくは
隣接しているヌクレオチドの少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、
少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくと
も９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％
、または少なくとも９９％が、第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域
と連結部位との間のＳＣＣｍｅｃカセットの領域に特異的にハイブリダイズすることが可
能である。ＳＣＣｍｅｃカセットの領域内で主にハイブリダイズするプローブには、ＳＣ
Ｃｍｅｃカセットの領域内で完全にハイブリダイズするプローブが含まれ得る。

本発明のプローブは、このようなキットに含められるものを含めて、当業者に公知のよ
うに有利に検出用に標識することができる。標識は、特定の設計および行われる増幅反応
の種のために適切に選択されてもよい。プライマーおよびプローブ試薬は、いくつかの状
態のいずれかで提供されてもよく、それには乾燥状態、凍結乾燥状態、ペレット状態、噴
霧乾燥状態、または液体状態が含まれる。

本発明のキットには、選択された増幅法のためのさらなるエレメント、例えば試薬（例
えば、数ある中でも、増幅酵素（複数でも可）、バッファー（複数でも可）、および／ま
たは制限酵素（複数でも可））、対照（複数でも可）、反応容器（複数でも可）、および
同類のものなどが含まれ得る。具体的な実施形態では、第１、第２、第３および第４のプ
ライマーは、単一の容器中に提供される。もう一つの実施形態では、第１および第２の増
幅および検出オリゴヌクレオチドセットは、単一の容器中に提供される。従って、このよ
うなキットは、マルチプレックス増幅を行うために有用であり得る。

一実施形態では、ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域、好ましくは右端部連結領域に
おいて特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプライマー；端部連結部位の領域
において、具体的には第１のプライマーが右端部連結領域でハイブリダイズする場合には
右端部連結領域において黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡに特異的にハイブリダイズすること
のできる第２のプライマー；ｍｅｃＡの第１の領域と特異的にハイブリダイズすることの
できる第３のプライマー；およびｍｅｃＡの第２の領域と特異的にハイブリダイズするこ
とのできる第４のプライマーを含む１つの容器を含むキットが提供される。そのようなキ
ットは、第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にあ
るＳＣＣｍｅｃカセット領域内で完全に特異的にハイブリダイズすることのできる第１の
プローブ、およびｍｅｃＡの第１の領域とｍｅｃＡの第２の領域との間のｍｅｃＡの領域
と特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプローブを含む１つの容器をさらに含
んでもよい。その上、本発明のもうひとつの実施形態では、ＳＣＣｍｅｃカセットの端部
連結領域、好ましくは右端部連結領域において特異的にハイブリダイズすることのできる
第１のプライマー；端部連結領域の領域において、具体的には第１のプライマーが右端部
連結領域にハイブリダイズする場合には右端部連結領域において黄色ブドウ球菌染色体Ｄ
ＮＡに特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプライマー；ｍｅｃＡの第１の領
域と特異的にハイブリダイズすることのできる、第３のプライマー；ｍｅｃＡの第２の領
域と特異的にハイブリダイズすることのできる第４のプライマー；第１のプライマーがハ
イブリダイズすることのできる領域と連結部位との間の、ＳＣＣｍｅｃカセットの領域内
で完全に特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプローブ；およびｍｅｃＡの第
１の領域とｍｅｃＡの第２の領域との間のｍｅｃＡの領域と特異的にハイブリダイズする
ことのできる第２のプローブを含む１つの容器を含むキットが提供され得る。

ＳＣＣｍｅｃカセットの右端部連結領域において特異的にハイブリダイズすることので
きるプライマーは、配列番号１、２、３、４、５、および６からなる群より選択される配
列を含む核酸であってもよい。さらに、そのようなプライマーは、配列番号１、２、３、
４、５、および６からなる群より選択される配列から本質的になるか、または同配列から
なってもよい。１以上のこのようなプライマーを選択することができる。好ましい実施形
態では、各々が異なる種類のＭＲＳＡに特異的な数個のプライマーが、キットへ封入する
ために選択される。このようなプライマーは、本発明の方法において有用である。

黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの右端部連結部位の領域において特異的にハイブリダイズ
することのできるプライマーは、好ましくは、ｏｒｆＸに特異的にハイブリダイズするこ
とのできるプライマーであってもよい。より具体的には、一実施形態では、このプライマ
ーは、配列番号１３に示される核酸を含んでもよい。さらに、そのようなプライマーは、
配列番号１３に示される核酸から本質的になるか、またはそれからなる。このようなプラ
イマーは、本発明の方法において有用である。

第１のプライマーがハイブリダイズすることのできる領域と連結部位との間にあるＳＣ
Ｃｍｅｃカセット領域内で完全に特異的にハイブリダイズすることのできるプローブは、
一実施形態では、５以上のプローブを含み、各々が異なる種類のＭＲＳＡと特異的にハイ
ブリダイズすることができる。具体的な実施形態では、そのようなプローブは、配列番号
：７、８、９、１０、１１、および１２からなる群より選択される配列を含み得る。さら
に、そのようなプローブは、配列番号：７、８、９、１０、１１、および１２からなる群
より選択される配列から本質的になるか、またはその配列からなり得る。このようなプロ
ーブは、本発明の方法において有用である。

本発明の特定のキットには、ｍｅｃＡ遺伝子の検出のためのプライマーおよび／または
プローブが含まれている。そのようなキットには、ｍｅｃＡ遺伝子に特異的なプライマー
セット、具体的には、ｍｅｃＡの第１の選択された領域と特異的にハイブリダイズするこ
とのできる第１のプライマー（この際、該第１のプライマーは、増幅条件下、第１のｍｅ
ｃＡの領域と第２のｍｅｃＡの選択領域との間の領域が増幅されるように方向付けられて
いる）、および第２のｍｅｃＡの選択領域と特異的にハイブリダイズすることのできる第
２のプライマー（この際、第２のプライマーは、第１のプライマーを含む増幅条件下、第
１のｍｅｃＡの領域と第２のｍｅｃＡの領域との間のｍｅｃＡの領域が増幅されるように
方向付けられている）を含めることができる。一実施形態では、これらのｍｅｃＡプライ
マーには、配列番号：１５および１６の一方または両方を含めてもよい。このキットは、
２つの選択されたｍｅｃＡプライマー間のｍｅｃＡの領域に特異的なプローブをさらに含
むことができる。具体的な実施形態では、そのようなｍｅｃＡプローブは、配列番号１４
に示される核酸配列を含むことができる。さらに、そのようなｍｅｃＡプローブは、配列
番号１４に示される核酸配列から本質的になり得る。ＳＣＣｍｅｃカセットおよびｍｅｃ
Ａの両方を増幅および検出するためのプライマーおよびプローブセットを、同一反応容器
内で使用するための同一キット内で、提供することにより、ＭＲＳＡを検出するために有
用な多重キットを提供することができる。

注目されることは、チミジンを含むプライマーおよびプローブ配列への言及は、チミジ
ンの代わりにウリジンを利用することに容易に適合させることができ、それは特定のアッ
セイに有用であることである。さらに、ヌクレオチドは、化学基の付加、または類似体（
例えば、２’−Ｏ−メトキシ型）による個々の残基の置換により修飾することができる。
さらなるこのような修飾ヌクレオチドは当分野で公知である。一部の例としては、ヒドロ
キシメチルヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、フッ素化ヌクレオチド、αチオリン酸
ヌクレオチド、アミン修飾ヌクレオチド、メトキシヌクレオチド、カルボキシメチルヌク
レオチド、チオヌクレオチド、イノシン、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、ワイブ
トシン、キューオシン、Ｃ７ｄＧＴＰが挙げられる。さらなる修飾ヌクレオチドは、米国
特許第５，４０５，９５０号および同第５，６３３，３６４号（両方とも、Ｍｏｃｋ ａ
ｎｄ Ｌｏｖｅｒｎ）に見出される。さらに、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾された
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ＰＮＡ、その他の合成核酸または選択的に標的とハイブリダイズ
する手段としてヌクレオチド塩基を使用する核酸を含むことができる。

本願を通じて、特定のプライマー型（例えばＮＡＳＢＡ−Ｐ１型（二本鎖形態の場合に
プロモーター領域を提供する配列に連結される）またはＰ２型（単独で使用されるかまた
はタグオリゴヌクレオチドと連結される）プライマー）として使用される特定のオリゴヌ
クレオチドが例示され得る。しかし、このような使用により、オリゴヌクレオチドが有用
である可能性のある用途が制限されるべきでない。例えば、Ｐ１プライマーと例示される
プライマーは、Ｐ２型プライマーとして有用であり得る。その上、当業者に公知のように
、プライマーは、その他の増幅法に適合させることができる（例えば、ＰＣＲ用途のため
に取り出したＰ１のＴ７ポリメラーゼプロモーター領域（ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ用））
。

Ｔ７プロモーターの核酸配列は当業者に周知であり、本明細書において特定の配列が例
証されているとはいえ、当分野で公知または新しく設計された、わずかな変化を有する機
能同等物が選択されてもよい。好ましい実施形態では、Ｔ７プロモーターの配列は、配列
番号１７に示される。

本方法は、あらゆる選択されたサンプル、例えば直接的な患者サンプル、例えば、鼻腔
または鼠径部のスワブ、咽頭のスワブ、直腸のスワブ、総称からのサンプルで利用するこ
とができ、すべてがスクリーニングに特に適している、同様に診断、気管支肺胞洗浄また
は血液（例えば、敗血症または血液培養）に特に適している。このようなサンプルは、一
般に、生物体の混合集団を含む。その上、所望であれば、この方法を、単一の細菌種また
は株だけを有するサンプル、例えば、ＭＲＳＡの単離、培養、捕獲、および／または増菌
培養を利用するサンプルに適用することができる。

本発明を以下の実施例において例証する。

増幅としてＮＡＳＢＡを用いて研究を開始した。２つの主なアプローチを調査した。ア
プローチ１（一般的な黄色ブドウ球菌（ｏｒｆＸ）プローブ）およびアプローチ２（ＳＣ
Ｃｍｅｃ特異的プローブ）。「アプローチ１」は、これまでの試験で使用した構成に非常
に似ており、カセットの右部分に位置する５つのＰ２、黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに位置す
る１つの一般的なＰ１および黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに位置する１つの一般的なビーコン
の使用に基づく（図２）。本明細書において記載される「アプローチ２」は、アプローチ
１と同じ５つのＰ２およびＰ１を使用するが、カセットの右部分に位置する５つのＳＣＣ
ｍｅｃ特異的ビーコンが一般的なビーコンの代わりに使用されている（図３参照）。さら
に、本明細書には増幅を伴うアプローチ２を利用するマルチプレックス反応およびｍｅｃ
Ａの検出が、ＭＲＳＡを検出するのに非常に効果的であることが見出されたことも記載さ
れ、示されている。

＜増幅条件＞
すべての実験に関して、次のＤＮＡ−ＮＡＳＢＡ条件を用いた。
染色体ＤＮＡを増幅のための材料として使用した。各々の菌株について、デンシトメー
ター（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙ ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて
細菌懸濁液を０．５マクファーランド（１．５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ）に標準化した。Ｄ
ＮＡを、ガラスビーズおよびボルテックスによる機械的溶解技法を用いて細菌細胞から放
出し、最終的に段階希釈を溶解した懸濁液から調製した。

標準的なＮＡＳＢＡ試薬を用いて増幅を行った（４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８
．５、１２ｍＭのＭｇＣｌ_２、９０ｍＭのＫＣｌ、１５％ｖ／ｖのＤＭＳＯ、５ｍＭのＤ
ＴＴ；ｄＮＴＰ、２ｍＭのＡＴＰ、２ｍＭのＣＴＰ、２ｍＭのＵＴＰ、１．５ｍＭのＧＴ
Ｐ、０．５ｍＭのＩＴＰ各１ｍＭ、プライマーの濃度（正方向プライマー＝Ｐ１および逆
方向プライマー＝Ｐ２）は、モノプレックス（ｍｏｎｏｐｌｅｘ）で試験した時に０．２
μＭ、マルチプレックスで試験した時に０．１μＭであった；ＦＡＭ標識された分子ビー
コンプローブ（複数でも可）の濃度は０．０１μＭであり、Ｃｙ５標識されたビーコンプ
ローブに対しては０．１μＭであった。

制限酵素（Ｓａｕ３Ａ−Ｉ）の濃度は、ＮＡＳＢＡ反応において１μｌあたり０．０５
単位であった。４１℃にて１５分間の混合物のインキュベーションにより、制限酵素（複
数でも可）がＤＮＡを切断できるようになった、この段階の後に９５℃にて５分のＤＮＡ
変性および制限酵素（１または複数）分解が続き、最終的に４１℃にて３分の段階を行っ
た後にＮＡＳＢＡ酵素（０．０８単位のリボヌクレアーゼＨ、３２単位のＴ７−ＲＮＡポ
リメラーゼ、６．４単位のＡＭＶ逆転写酵素および２．１μｇ ＢＳＡ）を添加した。反
応混合物を穏やかにボルテックスすることにより混合し、短い遠心分離、および増幅およ
びリアルタイム検出を開始した。反応混合物を４１℃にてＮｕｃｌｉＳｅｎｓ Ｅａｓｙ
Ｑ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ，ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）において９０分間
インキュベートし、３０秒ごとに蛍光モニタリングした。ＦＡＭ検出のため、４８５ｎｍ
で反応を励起こさせ、発光シグナルを５１８ｎｍで測定した。ＲＯＸに関して、励起およ
び発光をそれぞれ５７８ｎｍおよび６０４ｎｍで行い、Ｃｙ５に関して、励起および発光
をそれぞれ６４６ｎｍおよび６７８ｎｍで行った。

利用したプライマーおよびプローブを下に示す。ＮＡＳＢＡ反応のため、「プライマー
１」または「Ｐ１」は従来（この場合のように）、二本鎖形態の場合にその５’末端にプ
ロモーター領域（この場合、Ｔ７ポリメラーゼに対する）を提供する配列を有するプライ
マーを示すために使用される。ＮＡＳＢＡの第２のプライマーである、プロモーターに連
結されていないプライマー（ｎｏｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）
は、従来、この場合のように、標識された「プライマー２」または「Ｐ２」である。

次の表１は、実施例で利用したプライマーおよびプローブの配列を提供する。

＜実施例１：２１のＭＳＳＡ菌株でアプローチ１（一般的なビーコンＮＡＳＢＡ）によっ
て得られたＮＡＳＢＡ結果＞
「アプローチ１」は、カセットの右部分に位置する５つのＰ２、黄色ブドウ球菌ｏｒｆ
Ｘに位置する１つの一般的なＰ１および黄色ブドウ球菌ｏｒｆＸに位置する１つの一般的
なビーコンの使用に基づく（図２）。ＤＮＡ ＮＡＳＢＡは、５つのＳＣＣｍｅｃカセッ
ト特異的プライマー２（Ｐ２）（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配
列番号５）、１つの一般的なＰ１（配列番号１３）および１つの一般的なＦＡＭ標識され
たビーコン（配列番号１８）を用いて行った。ＮＡＳＢＡ曲線を、ＭＲＳＡ（ＭＲＥＪ
ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉｉ型に属する６菌株）およびＭＳＳＡについて得
た。ライセートの投入は、ＮＡＳＢＡにつき１０^５ＣＦＵに相当する。最大シグナル比（
最終シグナルと初期バックグラウンドとの間の比）を表２に示す。この実験は、一般的な
ビーコンＮＡＳＢＡ（アプローチ１）を用いる、２１のＭＳＳＡ菌株のうち５について（
２４％）陽性の最大シグナル比を示す。

＜実施例２：６のＭＲＳＡ菌株および１８のＭＳＳＡ菌株でアプローチ２（特異的ビーコ
ンＮＡＳＢＡ）によって得られたＮＡＳＢＡ結果＞
ＭＳＳＡの非特異的検出を克服するため、「アプローチ２」を定義し、開発した。具体
的には、ｏｒｆＸの代わりにＳＣＣｍｅｃカセットの右部分に位置するビーコンを定義し
た。「アプローチ２」は、５つの特異的プライマー２（Ｐ２）および１つの一般的なＰ１
を使用するが、カセットの右部分に位置する５つの特異的ビーコンが一般的なビーコンの
代わりに使用される（図３参照）。

５つのＳＣＣｍｅｃカセット特異的プライマー２（Ｐ２）（配列番号：１〜５）、１つ
の一般的な（ｏｒｆＸ）プライマー１（Ｐ１）（配列番号１３）および５つのＳＣＣｍｅ
ｃカセット特異的ＦＡＭ標識ビーコン（配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号
１０、配列番号１１）を用いて、ＤＮＡ ＮＡＳＢＡを行った。６のＭＲＳＡおよび１８
のＭＳＳＡ菌株を、ＮＡＳＢＡにつき１０^５ＣＦＵに相当する標的としてライセートを用
いて試験した。ＮＡＳＢＡ曲線をＭＲＳＡおよびＭＳＳＡに関して得た。得られた最大シ
グナル比を表３に示す。

この実験は、特異的ビーコンアプローチ（アプローチ２）を用いて、１８のＭＳＳＡの
中で１つだけしか検出されなかったことを示す。この検出されたＭＳＳＡ菌株は、ｍｅｃ
Ａ遺伝子を含まないカセットの右部分を保有すると予測される。この実験は、特異的ビー
コン（アプローチ２）の使用により、一般的なビーコンアプローチ（アプローチ１）によ
って非特異的に検出されるＭＳＳＡの割合が大幅に減少することを示す。

＜実施例３：ｍｅｃＡ遺伝子およびカセット挿入領域のマルチプレックス増幅および検出
＞
アプローチ２を用いて、一部の偽陽性は除去される、従ってＭＲＳＡを検出するための
改良された方法が提供される。しかし、ｍｅｃＡ遺伝子を含まないカセットを保有するＭ
ＳＳＡ菌株は検出され得、さらなる改良が調査された。この例に示されるように、挿入カ
セット領域（アプローチ２を使用）とｍｅｃＡ遺伝子の両方の同時増幅および検出（図４
参照）は、このような菌株（偽ＭＲＳＡ陽性）の検出を減らすのに役立ち得る。

この実施例は、同一チューブ内でｍｅｃＡ遺伝子とカセット連結領域（ＳＣＣｍｅｃカ
セット特異的ビーコンを有するアプローチ２）の両方の検出のためのマルチプレックスＮ
ＡＳＢＡの実現可能性を示す。このＮＡＳＢＡは、５のＳＣＣｍｅｃカセット特異的Ｐ２
（配列番号：１〜５）、１のＰ１（配列番号１３）および、カセット連結領域のための５
のＦＡＭ標識されたＳＣＣｍｅｃカセット−ビーコン（配列番号：７〜１１）および、ｍ
ｅｃＡのための１のＰ１（配列番号１５）、１のＰ２（配列番号１６）および１のＲＯＸ
標識されたビーコン（配列番号１４）を使用する。１つの管内で増幅される、ＳＣＣｍｅ
ｃ右端部連結領域のみを標的化するＮＡＳＢＡ反応（５のＳＣＣｍｅｃカセット特異的Ｐ
２（配列番号：１〜５）、５の特異的なＳＣＣｍｅｃカセット特異的ＦＡＭビーコン（配
列番号：７〜１１）および１のｏｒｆＸ Ｐ１（配列番号１３））も、比較のために行わ
れる。

次の表（表４）は、（１）ＳＣＣｍｅｃ右端部連結領域のみが１つの管内で増幅される
（５つのＰ２、５つの特異的ＦＡＭビーコンおよび１つのＰ１（「ＳＣＣｍｅｃ連結部位
のみ」）場合の、ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位ＮＡＳＢＡ（ＦＡＭシグナル）ならびに（
２）両方のＮＡＳＢＡを同一チューブ内で行った場合の（「同一チューブ内のＳＣＣｍｅ
ｃ連結部位およびｍｅｃＡ ＮＡＳＢＡ」）、ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位ＮＡＳＢＡ（
ＦＡＭシグナル）およびｍｅｃＡ ＮＡＳＢＡ（ＲＯＸシグナル）について得た最大シグ
ナル比を示す（最大シグナル比は＞１．２の場合に陽性とみなされる）。

これらの結果は、ＳＣＣｍｅｃ右端部連結部位およびｍｅｃＡ−ＮＡＳＢＡが同一チュ
ーブ内で行われる場合、ＳＣＣｍｅｃ右端部連結領域およびｖ型およびｖｉｉ型を除く全
ての菌株の型を含むｍｅｃＡ遺伝子の両方に関して、検出限界は５ＣＦＵ／ＮＡＳＢＡ程
度の低さであることを示す。従って、ｍｅｃＡ遺伝子を含まない挿入カセット領域を保有
するＭＳＳＡの場合、本試験は、「ＭＲＳＡ陰性」の結果（ＳＣＣｍｅｃ連結部位（＋）
に加えてｍｅｃＡ（−））を適切に提供する。

＜実施例４：ｍｅｃＡ遺伝子およびカセット挿入領域のマルチプレックス増幅および検出
＞
アプローチ２（ＳＣＣｍｅｃカセット特異的ビーコン）をｍｅｃＡ検出（実施例３に記
載されるものと同じ条件）と共に用いて、６つのＳＣＣｍｅｃカセット特異的Ｐ２（配列
番号：１〜６）、６つの特異的なＳＣＣｍｅｃカセット特異的ＦＡＭビーコン（配列番号
：７〜１２）および１つのｏｒｆＸ Ｐ１（配列番号１３）を利用して、ＭＲＳＡの多重
（同一反応チューブ）増幅および検出を行った。ＭＲＳＡ菌株の陽性の検出が得られた。

本明細書に引用される刊行物およびそれらに引用される材料は、参照により具体的に組
み込まれる。本明細書において、先行する発明のおかげでこのような開示に先立つ資格が
与えらないことの承認と解釈されるものは何もない。

開示される本発明が、変動する可能性のある、記載される特定の方法、プロトコール、
および試薬に限定されないことは当然理解される。また、本明細書において使用される用
語が特定の実施形態を説明するだけの目的のものであり、添付される特許請求の範囲によ
ってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図するものではないことも当然理解
される。

当業者は、所定の実験法だけを用いて、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形
態の多くの同等物を認識するか、または確定することができる。上記と同等の物は、以下
の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

Claims (21)

1. サンプル中の、ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を検出する方法であって、
   ａ）（１）挿入したＳＣＣｍｅｃカセットと黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの右端部連結部位および（２）ｍｅｃＡの領域のみを増幅することのできるマルチプレックス増幅反応をサンプルにおいて行うステップと、
   ｂ）増幅産物の中で、前記右端部連結部位とｍｅｃＡの各々の存在又は不在を検出するステップと、
   ここで、前記サンプルがＭＲＳＡを含む場合、前記サンプル中の標的右端部連結部位とｍｅｃＡの両方の存在が検出される、
   を含む方法。
2. 前記増幅反応が、転写に基づく増幅およびＰＣＲからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記転写に基づく増幅が、ＮＡＳＢＡである、請求項２に記載の方法。
4. 前記ＮＡＳＢＡが、ＤＮＡ−ＮＡＳＢＡである、請求項３に記載の方法。
5. ＳＣＣｍｅｃカセットが黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡの中に挿入されているメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のサンプルの存在を同定する方法であって、
   単一容器中で、前記生体サンプルを、
   ａ）（１）ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域と特異的にハイブリダイズする核酸配列を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
   （２）前記ＳＣＣｍｅｃカセットに隣接する黄色ブドウ球菌染色体ＤＮＡ領域と特異的にハイブリダイズする核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドと
   を含む、前記生体サンプルならびに該第１および第２のオリゴヌクレオチドの第１の反応産物を形成するための第１のオリゴヌクレオチドセットと、
   ｂ）（３）ｍｅｃＡ核酸の第１の領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する第３のオリゴヌクレオチドと、
   （４）ｍｅｃＡ核酸の第２の領域と特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する第４のオリゴヌクレオチドと
   を含む、前記生体サンプルならびに該第３および第４のオリゴヌクレオチドの第２の反応産物を形成するための、第２のオリゴヌクレオチドセットと
   からなるオリゴヌクレオチドセットに接触させるステップと、
   第１および第２の反応産物の両方を検出することによりＭＲＳＡの存在を同定するステップと
   を含む、方法。
6. 前記接触させるステップが、オリゴヌクレオチドセット（ａ）および（ｂ）をプライマーとして用いる増幅反応を行うステップをさらに含み、前記同定するステップが、両方のオリゴヌクレオチドセットからの増幅産物の存在または不在を検出するステップを含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記同定するステップが、前記第１および第２の反応産物を、（１）前記第１の反応産物と特異的にハイブリダイズすることのできる第１のプローブおよび（２）前記第２の反応産物と特異的にハイブリダイズすることのできる第２のプローブに接触させるステップを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記ＳＣＣｍｅｃカセットの端部連結領域においてハイブリダイズすることのできる複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
9. 前記第１のプローブが、複数のプローブを含み、各々が異なる種類のＭＲＳＡと特異的にハイブリダイズすることができる、請求項７に記載の方法。
10. 前記第１のプローブが５以上のプローブを含み、各々が異なる種類のＭＲＳＡと特異的にハイブリダイズすることができる、請求項７に記載の方法。
11. 前記端部連結領域が、右端部連結領域である、請求項５に記載の方法。
12. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、ｏｒｆＸの領域と特異的にハイブリダイズする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号１３に示される核酸を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記第３のオリゴヌクレオチドが、配列番号１５及び１６からなる群より選択される核酸を含む、請求項５に記載の方法。
15. 前記第４のオリゴヌクレオチドが、配列番号１５及び１６からなる群より選択される核酸を含む、請求項５に記載の方法。
16. 前記第１のプローブが、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２からなる群より選択される配列を含む、請求項７に記載の方法。
17. 検出が、前記第１のプローブとして、少なくとも５つの核酸を用いて行われ、各々が、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２のうちの１つを含む、請求項７に記載の方法。
18. 増幅が、前記第１のオリゴヌクレオチドとして、配列番号１、２、３、４、５、および６からなる群より選択される配列を含む核酸を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
19. 増幅が、前記第１のオリゴヌクレオチドとして少なくとも５つの核酸を用いて行われ、各々が配列番号１、２、３、４、５、および６のうちの１つを含む、請求項６に記載の方法。
20. 前記増幅反応が、配列番号１５及び１６からなる群より選択される核酸を含むｍｅｃＡオリゴヌクレオチドを利用する、請求項６に記載の方法。
21. 前記第２の反応産物の検出が、配列番号１４に示される該核酸を含むｍｅｃＡプローブを利用する、請求項７に記載の方法。

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