CN101918593B - 抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测 - Google Patents

抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于抗甲氧西林金黄色葡萄球菌检测改良的检测方法。所述检测方法具体用于去除假阳性结果，所述假阳性结果源于病人样品中存在混合的细菌种群。

Description

抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测
技术领域
本发明涉及抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子检测。本发明更具体涉及减少假阳性结果的改良的MRSA检测方法。
背景技术
抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种主要的医院和社区获得性病原体，它能引起严重的感染，如手术伤口感染，肺炎，心内膜炎及败血症。针对甲氧西林的抗性是由于mecA基因的存在，所述基因能编码修饰的青霉素结合蛋白，PBP2a或PBP2′，对B-内酰胺药物具有降低的亲和性。mecA基因由名为SCCmec的盒(葡萄球菌盒染色体mec)携带(Ito etal.，2001，Antimicrob.Agents Chemother.45(5)：1323-1336；Hiramatsu，et al.，2001，Trends Microbiol.Oct；9(10)：486-93)，这个能移动的元件，能够整合到金黄色葡萄球菌和其它凝固酶阴性葡萄球菌(主要是表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌)的染色体中。SCCmec的特征是有末端反向和同向的重复序列，一组位点特异性的重组酶基因(ccrA和ccrB)，和mecA基因复合体(Ito et al.，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43：1449-1458；Katayama et al.，2000，Antimicrob.Agents Chemother.44：1549-1555)。所述mecA基因盒SCCmec***到金黄色葡萄球菌基因组的***位点是已知的，并且是保守的序列(Ito etal.，2001，Antimicrob.Agents Chemother.45：1323-1336)。***到金黄色葡萄球菌染色体后，SCCmec有左末端连接区和右末端连接区(见图1)，在此SCCmec序列和金黄色葡萄球菌染色体序列相连。之前已分析了包围SCCmec DNA左右边界的区域(即，各自为attL和attR)的核苷酸序列和包围SCCmec DNA整合位点的区域(即attBscc，SCCmec DNA的细菌染色体结合位点)的序列。所述整合位点的序列分析表明attBscc位于新的开放阅读框(ORF)，orfX的3′端。orfX编码推定的159-氨基酸多肽，所述多肽和一些先前鉴定的未知功能的多肽有序列同源性(Ito et al.，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43：1449-1458)。此外也已研究了SCCmec的mecA区域的组织结构(Oliveira，D.C.，et al.，2000，Antimicrob.AgentsChemother.44(7)：1906-1910)。
MRSA能被健康的人群携带而不引起任何疾病，但当这些健康的携带者进入医院，能够感染住院的病人。此外，病人可以感染自己，例如，如果一个人经受外科手术，感染的风险就会增加。MRSA健康携带者构成了MRSA的储存体，必须对这些携带者进行筛选以通过局部净化根除所述株。现在MRSA筛选被认为是在世界范围内减少MRSA株流行的主要方法。通常，在病人的MRSA检测中，从病人身上得到鼻拭子并反复培养，以鉴定MRSA株是否存在。可以通过从鼻拭子上直接鉴定检测而取消培养的需要。培养物鉴定方法通常需要最少24小时，更通常的是72小时，以获得结果。新的显色培养基(培养基中含有基质，一般是抗生素(如头孢西丁)来选择抗甲氧西林的株)能够潜在地减少所述时间而导致24～48小时的时间周期。然而，在MRSA感染的病例中，需要在几小时内得到结果，因为病人应该被隔离直到得知结果。因此，极需一种能在2～4小时内得到结果的可靠的MRSA的分子检测方法。
扩增是一种熟知的技术，并且各种扩增方法已被发展，包括基于转录的扩增，如转录介导的扩增(TMA；美国专利No.5,766,849、5,399,491、5,480,784、5,766,849和5,654,142)和基于核酸序列的扩增(NASBA；5,130,238、5,409,818、5,654,142和6,312,928)和循环核酸扩增技术(热循环)(如聚合酶链式反应(PCR；美国专利No.4,683,195、4,965,188、4,683,202)和连接酶链式反应(LCR；美国专利No.5,792,607))。已知的扩增方法也包括链置换扩增(SDA)、自我维持的序列复制(3SR)和Q-β复制，级联滚环扩增(CRCA)。
利用核酸的检测方法也为本领域内熟知。核酸经常被标记用于各种检测目的。例如，报道于美国专利No 4,486,539(Kourlisky)、4,411,955(Ward)、4,882,269(Schneider)和4,213,893(Carrico)的方法，举例说明了用于检测特异性核酸序列的标记的检测探针的制备。设计用于不同检测方法的探针(如靶标-捕获，HPA，TAQman，分子信标和夹心杂交)也已见报道(例如美国专利No.4,486,539和美国专利No.4,751,177、5,210,015、5,487,972、5,804,375、5,994,076)。核酸杂交技术和条件为本领域技术人员所了解并被报道于例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold SpringLab.Press，Dec.1989；美国专利No 4,563,419(Ranki)和4,851,330(Kohne)和在许多其它出版物中尤其于Dunn，et al.，Cell12，pp.23-26(1978)。设计用于不同检测方法的探针(如靶标-捕获，HPA，TaqMan，分子信标和夹心杂交)也已知道(例如美国专利No.4,486,539及美国专利No.4,751，177、5,210,015、5,487,972、5,804,375、5,994,076)。
早期的基于mecA基因和金黄色葡萄球菌染色体序列的检测来检测和鉴定MRSA的分子方法已被报道。(Saito et al.，1995，J.Clin.Microbiol.33：2498-2500；Ubukata etal.，1992，J.Clin.Microbiol.30：1728-1733；Murakami et al.，1991，J.Clin.Microbiol.29：2240-2244；Hiramatsu et al.，1992，Microbiol.Immunol.36：445-453)。然而在mecA基因和金黄色葡萄球菌染色体序列样品中存在的阳性结果并不能保证存在MRSA，因为，例如，在基于检测mecA和金黄色葡萄球菌特异性标记物的试验中，能在含有mecA基因的MSSA和抗甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌中观测到假阳性。此外，在基于仅检测盒连接区的试验中，在易感甲氧西林的金黄色葡萄球菌分离物中也观测到假阳性，所述金黄色葡萄球菌分离物含有SCCmec的右末端小片段(见Rupp，J.et al.，J.Clin.Microbiol.44(6)：2317(2006))。此外，Ramakrishnan和Riccelli报道了利用寡核苷酸探针检测MRSA的方法，所述探针具有和SCCmec盒***位点的左连接处附近的区域互补的序列，在***区(左末端连接区)包括SCCmec盒序列的一部分和金黄色葡萄球菌序列的一部分(美国专利申请No.US20060057613)。
然而，先前的通过分子方法检测MRSA的尝试困扰于假阳性结果。所述结果已被推定是以下任一情况的结果：拭子上存在混合的菌群，在mecA基因缺失和/或非特异性扩增后MSSA中存在残留的SCCmec右末端片段。至今，两种定义金黄色葡萄球菌特异性携带的甲氧色西林抗性的概念已被公布：
●SCCmec右末端连接区扩增概念(Hiramatsu et al.WO97/31125、EP 0887424、美国专利No.6,156,507及Huletsky and Rossbach WO02/099034(2002)、Huletsky etal.J.Clin.Microbiol.42(5)：1875-1884(2004))；
●和其合作者报道的免疫-富集概念(，P et al.J.Clin.Microbiol.41(1)：254-260(2003)、WO02/082086)，其中所述免疫-富集后，三个标记物(mecA基因、金黄色葡萄球菌特异性标记物和表皮葡萄球菌特异性标记物)的扩增。
SCCmec右末端连接区概念基于覆盖SCCmec整合位点的右末端连接区域的区域的扩增。原理如下：SCCmec盒总是整合到金黄色葡萄球菌特异性开放阅读框(叫做orfX)的金黄色葡萄球菌染色体上游；PCR检测联用位于所述盒右部的多个正向引物，一个反向引物和一个信标探针，都位于金黄色葡萄球菌染色体的orfX内，也就是带orfX的SCCmec右末端连接区的下游(orfX的“右末端连接区”)。Hiramatsu等人报道了一种试验，用盒右末端连接区上两个正向引物来扩增当时描述的主要SCCmec类型(一个引物用于I型和II型SCCmec，另一引物用于III型SCCmec)。Huletsky等人提出如果只用报道于Hiramatsu的两种正向引物，一些MRSA株不能被检测到，并且他们定义了盒的新类型，命名为MREJ类型，其在SCCmec盒的右部序列有变异。可商购的(Infectio Diagnostics Inc.)检测联用(参考图1)五个位于盒右部的正向引物(一个引物设计用以检测I型和II型MREJ，四个引物设计用以检测III型、IV型、V型和VII型MREJ)，一个反向引物位于orfX内，三个通用的信标覆盖orfX区域的相同部分，并且要能鉴定已鉴定的orfX变体。用实时PCR进行所述检测。然而，报道的所述检测的特异性(Huletsky et al.2004)显示4.6％的MSSA(569个检测中有26个)被误检。假阳性结果也报道于另一个用单座位(SCCmec盒-orfX的右末端连接区)PCR测定法的商用试验(Rupp，J，et al.，J.Clin.Microbiol.(44)6：2317(2006))。
因此假阳性仍是一个问题，并极需一种改进的MRSA检测方法来减少现行检测中存在的假阳性结果。这种检测方法的挑战在于，由于在鼻拭子上存在混合的菌群，可以存在下列混合物：(1)MRSA、(2)甲氧西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌(如，甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌(MSSE))、(3)甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)和(4)抗甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌(MR-CNS)(主要是抗甲氧西林的表皮葡萄球菌(MRSE))中的一种或多种。此外，有保留没有mecA基因的SCCmec元件的临床MSSA分离物的报道(Donnio，P.-Y.，et al.，JClin Microbiol.2005 August；43(8)：4191-4193)。因为只有MRSA的存在才引起对携带者消毒，所以所述检测必须保证甲氧西林的抗性是由金黄色葡萄球菌携带而不是由表皮葡萄球菌(或凝固酶(-)葡萄球菌)携带的。因此，同样地，直接对拭子上混合群进行mecA基因(结合或不结合金黄色葡萄球菌特异标记物)的扩增和检测是不合适的；的确在两种情况(MRSA+MSSE或MSSA+MRSE)下，两种标记物(mecA和金黄色葡萄球菌特异性标记物)都会被检测到，然而只有含有MRSA的第一种情况才是临床医生想特异性检测的。本发明确定了MRSA假阳性的主要来源，并以此提供了一种非常需要的，改良的检测方法，用于还没有被现行检测方法解决的MRSA的检测。
发明概述
本发明提供了检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述MRSA在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
利用下列物质对样品进行扩增和检测反应：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(c)探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，并且，其中如果样品中含有MRSA，则检测到探针的杂交。如前文所述，在所述方法中，引物、探针等可以表示一个或多个引物或探针，除非另有说明或文中另有指示。
本发明还提供了检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
(a)利用下列物质对样品进行扩增和检测反应，所述反应检测***的SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区的存在：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，并且
(b)对样品进行扩增和检测反应，所述反应检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有MRSA，则在样品中检测到靶连接区和mecA二者的存在。
本发明进而提供了检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
对样品进行多重扩增反应，其中扩增反应包括：
(a)利用下列物质扩增和检测***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区的存在：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，并且
(b)扩增和检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有MRSA，则在样品中检测到靶连接区和mecA二者的存在。
另外，本发明提供了检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
(a)对样品进行扩增反应，所述反应能同时扩增以下二者：
(1)***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区，和
(2)mecA区域，
(b)在扩增产物中，检测各连接区和mecA的有无，
其中如果样品中含有MRSA，则在样品中检测到连接区和mecA二者的存在。
本发明进而提供了鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)存在的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括以下步骤：
在单个容器内使生物样品与下列物质接触：
(a)第一寡核苷酸集，其含：
(1)第一寡核苷酸，其具有与SCCmec盒的末端连接区特异性杂交的核酸序列，和
(2)第二寡核苷酸，其具有与所述SCCmec盒侧翼的金黄色葡萄球菌染色体DNA区域特异性杂交而形成所述生物样品与所述第一和第二寡核苷酸的第一反应产物的核酸序列，和
(b)第二寡核苷酸集，其含：
(3)第三寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第一区域特异性杂交的核苷酸序列，和
(4)第四寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第二区域特异性杂交而形成所述生物样品与所述第三和第四寡核苷酸的第二反应产物的核苷酸序列；及
通过检测第一和第二反应产物二者来鉴定MRSA的存在。
在一实施方式中，所述鉴定步骤可包括：使所述第一和第二反应产物与下列物质接触：
(1)第一探针，其能与第一反应产物特异性杂交，和
(2)第二探针，其能与第二反应产物特异性杂交。
另外，本发明提供在所述方法中使用的试剂盒。本发明特别提供用于检测抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在末端连接区内在金黄色葡萄球菌染色体DNA内特异性杂交，及
(c)探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增。此外，本发明提供用于鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)存在的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
(a)第一扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在末端连接区内在金黄色葡萄球菌染色体DNA内特异性杂交，和
(3)第一探针，其选自：
(1)第一探针，其能主要在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
(2)第一探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，及
(b)第二扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(4)第三引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交，
(5)第四引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交，和
(6)第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交，
其中各第三引物和第四引物取向为：使在扩增条件下，mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域被扩增。
附图简述
图1大体显示具有***的SCCmec盒的MRSA染色体区域，指示了左和右末端连接区。
图2大体表示在SCCmec/orfX的右末端连接区中引物和探针的位置，其中5种引物2(“5P2”，箭头)位于盒的右部，一个通用的引物1(“P1T7”)位于金黄色葡萄球菌orfX上，一个通用的信标(“MB”)位于金黄色葡萄球菌orfX上(“方法1”)。
图3大体表示用于本发明方法的引物和探针的位置，所述方法用于MRSA中SCCmec***物的右末端连接区的检测：位于SCCmec的右末端连接区的5种引物2(“P2”，箭头)，位于orfX的引物1(“P1”，折线)，位于SCCmec盒右部的5种特异性探针(直线)被使用(“方法2”)。
图4表示使用下列引物和探针的mecA和右末端连接区的多重扩增，所述引物和探针：在mecA上，引物1(“P1”)、引物2(“P2”)和探针(“信标”)；在“右SCCmec-染色体连接区”，右末端连接区，引物1(“1P1”，折线)，5种引物2(“5P2”，箭头)和5种SCCmec-特异性探针(“5种特异的信标”，直线于两端转折)。
发明详述
正如本文所讨论的，本发明提供用先前的分子方法检测到的假阳性可以用以下事例解释：在MSSA株中，在含有mecA的染色体区域缺失后，存在残留的SCCmec右末端片段，或不含mecA的SCC的存在。另外，正如本文进一步揭示的，本发明提供一部分假阳性归因于非特异性扩增；的确，(如图2所示)由于反向引物和信标位于orfX，而orfX由MRSA和MSSA共有，在MSSA染色体上正向引物的非特异性退火将导致MSSA的扩增和检测到。本发明确证了两种假阳性的来源并提供一个改良的检测方法。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义和本发明所属的领域内本领域技术人员普遍理解的含义相同。尽管任一和本文所报道的那些方法和材料类似或等同的方法和材料都能用于本发明的实践或检测中，但优选的方法、设备、和材料如本文报道。
本文和随附的权利要求中提到的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数含义，除非文中另有明确指示。
如上文所述，本发明提供用于减少用先前报道的方法的MSSA检测导致的特异性缺乏的解决方法，所述方法能被单独使用或(理想情况是)在同一检测中使用。因此，本发明报道了特异信标(特异于SCCmec盒)而不是通用信标的使用；这一配置将抑制由于非特异性扩增而检测到扩增的MSSA。此外，本发明报道了和检测仅盒***区相比，在多重反应中联用mecA基因检测和盒***区(如右SCCmec-染色体连接区)检测的优点；本发明的这一方面可以降低MSSA的检测，其由下列所致：在含有mecA的染色体区域缺失后，存在残留的SCCmec右末端片段，或不含mecA的SCC的存在。
在一优选的实施方式中，本发明提供检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
利用下列物质对样品进行扩增和检测反应：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(c)探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，并且其中如果样品中含有MRSA，则检测到探针的杂交。
MRSA基因组的结构已被前文描述。如实施方式中所用，所述“SCCmec盒”(有时称为″mecDNA″，如见于Hiramatsu的美国专利No.6,156,507)的定义如本领域内人员所知，即是在MRSA或MR-CNS染色体上存在的整合的外来DNA，包括mec基因复合物，一组位点特异的重组酶基因(ccrA和ccrB)，末端反向和同向重复序列(在3′和5′端)。“mecA基因”包括编码赋予甲氧西林抗性的PBP2a或PBP′所必需的所有序列。
如本领域内所知，SCCmec盒向金黄色葡萄球菌染色体的***生成两个连接，及SCCmec DNA与金黄色葡萄球菌染色体DNA的两个相应的连接区，其中SCCmec序列和金黄色葡萄球菌染色体序列相连。因此，所述连接区位于SCCmec盒的左末端和右末端(见图1)。这两个区域被Ito等人命名为“右SCCmec-染色体连接区”和“左SCCmec-染色体连接区”(Antimicrob.Agents Chemother.May 200145(5)：1323-1336，″Structural Comparisonof three Types of Staphylococcal Cassette Chromosome mec Integrated in thechromosome in Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus″)。在右末端连接区，与SCCmec盒邻接的金黄色葡萄球菌基因组序列是基因orfX，orfX在一些文献中称作“IntM”。实施方式中所述“末端连接区”是在右和左末端连接区或者***位点的间距之内的SCCmec盒或金黄色葡萄球菌染色体核酸的区域，以便引物可在引物延伸反应或转录类型(如NASBA或TMA)的反应中穿过连接区延伸，如在连接区的600nt、550nt、500nt、450nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt，100nt或50nt内(在任一方向上)。根据使用的扩增技术，有用的间距可变化(如发展出新技术，可为更长的间距)。因此，根据文章交待，“末端连接区”可指所述SCCmec DNA内的区域或是金黄色葡萄球菌染色体DNA内的区域；两种使用都涉及这些在连接区间距内的DNA，以使在合适的标准延伸或扩增条件下，适当选择的引物可以被延伸或转录，从此向连接区的方向延伸穿过连接区。即，“SCCmec盒的末端连接区”应该是和金黄色葡萄球菌染色体DNA接界(或整合位点)附近的SCCmec DNA内的区域；“orfX的末端连接区”应该是和SCCmec DNA接界附近的金黄色葡萄球菌染色体DNA内的区域。同样地，“金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区”应该是和SCCmec DNA接界(SCCmec整合位点)附近的金黄色葡萄球菌染色体内的区域。另外，所述区域也可称为“在SCCmec末端连接区内的金黄色葡萄球菌染色体DNA”。因此，“右末端连接区”是指包围SCCmec盒右侧上的连接区的区域，“左末端连接区”是指围绕SCCmec盒左侧上的连接区的区域(见图1)。
为了进一步提供一种有用的方法来检测MRSA，本发明提供检测SCCmec***连接区和mecA序列二者存在的扩增和检测方法。此外本发明更具体地提供检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
(a)利用下列物质对样品进行扩增和检测反应，所述反应能检测***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区的存在：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，并且
(b)对样品进行扩增和检测反应，所述反应能检测到mecA基因的存在，
其中如果样品中含有MRSA，则在样品中检测到靶连接区和mecA二者的存在。
所述方法特别有助于从那些有些罕见的MSSA中区分MRSA，所述MSSA中的mecA(而不是整个SCCmec盒)被删除。
有利的是，可进行多重扩增反应以检测SCCmec***连接区和mecA序列二者的存在。因此本发明提供检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
对样品进行多重扩增反应，其中所述扩增反应包括：
(a)利用下列物质扩增和检测***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区的存在：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，并且
(b)扩增和检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有MRSA，则在样品中检测到靶连接区和mecA二者的存在。
“扩增连接区”指进行产生扩增产物的扩增反应，所述产物包括相应于邻近连接区的SCCmec内核酸的序列和邻近同一连接区的金黄色葡萄球菌染色体DNA内核酸的序列。“扩增和检测mecA基因的存在”指在样品中扩增和检测mecA基因的任一部分，例如，含SEQ IDNO：15和16所示的核酸序列的引物之间的区域(其可利用例如含有SEQID NO：14所示的核酸序列的探针检测到)。引物和探针可被容易地设计用于和已知的mecA序列杂交。
术语“多重扩增反应”指用于多于一种靶扩增的特异性试剂接触在一起，以使多于一种扩增能在同一反应容器中进行。此外，可包括用于多于一种靶的检测试剂。因此，可通过与用于多于一种靶的扩增和检测的所有特异性试剂接触来进行多重扩增和检测反应。因此，在多重反应中，可在同一反应中扩增多个靶区域。“同时扩增”其中使各个反应在同一时间进行，但是用于多于一种扩增反应的试剂不必要全部放在同一反应容器或试管中，相反，如果多重反应是不期望的或不可行的，也可以使多于一个反应在分开的反应容器中进行。即使在多重扩增反应中，需知在所提供的条件下各反应以其各自的任意速度进行。检测也可以是“同时的”指如果在反应容器中含每个反应的合适探针，在合适的条件下，可进行多个靶检测，或在单个反应容器(多重反应)内进行或在多于一个反应容器内进行(分发给相关反应容器合适的探针)。所述检测可在需要时，在同一反应容器内作为多重扩增反应或同时扩增反应反应，并且还可在扩增反应持续时(即，实时)进行。
因此，本发明提供检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
(a)对样品进行多重扩增反应，所述反应可扩增以下二者：
(1)***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区，和
(2)mecA区域，及
(b)在扩增产物中，检测各连接区和mecA的有无，
其中如果样品中含有MRSA，则在样品中检测到连接区和mecA二者的存在。
***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接区的扩增可利用下列物质有利地实现：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的末端连接区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增。所述探针选择为能完全在SCCmec盒区域内特异性杂交。连接区或mecA的有无可以被鉴定，通过进行任意分析来提供产物的检测，例如，如果使用标记的探针，用合适的检测设备来检测杂交的标记物。可检测信号的缺少表示没有靶产物，发现可检测的信号表示存在靶产物。
本发明反应中使用的引物和探针能和靶核酸特异性杂交。特异性杂交为本领域技术人员所知，并且，通常，特异性杂交是通过引物/探针和靶核酸的核酸同一性或高度相似性和/或通过使用严格的杂交条件(如严格的温度和/或盐条件)来实现的。特异性杂交可使和反应中的靶选择性杂交。
“取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增”的引物包括这样取向的引物，以使与其特异性靶核酸杂交后，及含该引物的扩增反应起始后，形成含连接区的扩增子。设计所述反应用于扩增穿过连接区(即，要足够地接近连接区以使通常的扩增反应可以延伸穿过连接区)。因此用于扩增连接区的引物对通常和包围连接区的两个区域杂交，且各引物这样取向，以使以5′到3′方向朝向连接区的方向杂交。通常，引物被设计为在连接区的600nt、500nt、400nt、350nt、300nt、250nt、200nt、150nt、100nt、50nt、30nt、25nt、20nt等之内杂交。因此用于检测扩增产物的探针选择为，使之能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交。在某些实施方式中，所述探针能完全或主要在SCCmec盒内特异性杂交。在一实施方式中，探针主要在SCCmec盒内特异性杂交，因此探针杂交的区域还额外包括连接区和由此邻接连接区的orfX的至少1、2、3个或一些核苷酸。然而，如果探针的1、2、3个或一些核苷酸和邻接连接区的orfX区域杂交，探针(其核苷酸的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，优选连续)能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交。因此，对于右末端连接区的扩增，所述探针选择为与SCCmec盒区域特异性杂交，所述SCCmec盒区域在SCCmec盒引物(杂交时的)的3′端的3′或下游，及连接区的上游。通常，引物选择为使用它合成的扩增产物和第二引物(位于金黄色葡萄球菌基因组序列中)的长度达到约200～350nt。尽管PCR扩增可被设计为产生更长的扩增子(如250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000nt)，基于转录(如，MASBA或TMA)得到的或PCR-类型反应得到的扩增子的长度优选在约200～300nt的范围内(如，150、200、250、300nt)。此外，对于多重扩增反应，无论基于转录还是基于PCR的，优选在200～300nt范围内或更短的扩增子，以提高检测的灵敏性。
实施方式中所述的“扩增条件”是适用于选定的扩增反应的条件，如本领域的那些技术人员所知道的这些用于各种扩增反应的条件。所述条件可优化用于特定反应、引物等，这为本领域技术人员所了解。众所周知，所述扩增条件包括与扩增所需的试剂(如，核苷酸和酶)接触，及合适的选定温度、盐和pH条件等。此外，实施方式中的引物或探针可以是引物或探针集，即多个引物或探针。所述引物/探针集可用于反应，所述反应中期望扩增和/或检测对于一种MRSA类型或亚型，且其中选择为和引物和/或探针杂交的靶MRSA区域的核酸序列在各种类型和/或亚型中有所变化。各引物/探针可被设计用于各类型或亚型，如本文例示。
根据本文教导，用于扩增末端连接区域的特异性引物可被容易地设计。和SCCmec右末端区域杂交的引物可以包括SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6所示的引物，及含有这些序列的引物和基本上由这些序列构成的引物。和orfX杂交的特异性引物可以包括SEQ ID NO：13所示的引物，含有所述序列的引物和基本上由所述序列构成的引物。和SCCmec右末端区域杂交的探针可以包括SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12所示的探针，及含有这些序列的探针和基本上由这些序列构成的探针。和mecA杂交的引物可以包括SEQ ID NO：15和16所示的引物，及含有这些序列的引物和基本上由这些序列构成的引物。均可以容易地用于P1-型或P2型(用于NASBA-类型扩增)。和mecA杂交的探针可以包括SEQ ID NO：14所示的探针，含有这些序列的探针和基本上由这些序列构成的探针。
本发明进而提供了鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)存在的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括一下步骤：
在单个容器内使生物样品与下列物质接触：
(a)第一寡核苷酸集，其含：
(1)第一寡核苷酸，其具有与SCCmec盒的末端连接区特异性杂交的核酸序列，和
(2)第二寡核苷酸，其具有与所述SCCmec盒侧翼的金黄色葡萄球菌染色体DNA区域特异性杂交而形成所述生物样品与所述第一和第二寡核苷酸的第一反应产物的核酸序列，及
(b)第二寡核苷酸集，其含：
(3)第三寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第一区域特异性杂交的核苷酸序列，和
(4)第四寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第二区域特异性杂交而形成所述生物样品与所述第三和第四寡核苷酸的第二反应产物的核苷酸序列；及
通过检测第一和第二反应产物二者来鉴定MRSA的存在。能通过扩增反应形成第一和第二反应产物。试剂和样品接触的条件可以是适于选定的扩增反应的条件。
在一实施方式中，所述鉴定步骤可包括使所述第一和第二反应产物与下列物质接触：
(1)第一探针，其能与第一反应产物(如果存在)特异性杂交，和
(2)第二探针，其能与第二反应产物(如果存在)特异性杂交。
如本文所述，“具有”包括在靶DNA的一部分的核酸序列的寡核苷酸指与靶DNA序列或其互补链有足够的同一性的序列，以在严格的杂交条件下特异并选择性地和靶DNA杂交。它含有和靶序列有全部序列同一性的核酸序列。在单个容器中可以含反应混合物的所有成分，以适合所用的特定扩增和检测方法。因此，“反应混合物”可以包括进行反应的必要试剂，这些试剂包括但不限于，在反应过程中维持pH在选定水平的缓冲剂、盐、辅因子、净化剂等。
通常，生成扩增子(多核苷酸扩增反应的产物)的扩增反应是“模板-驱动”，其中反应物(产生反应产物所需的具有模板寡核苷酸的互补链的核苷酸或寡核苷酸)碱基配对。一方面，模板驱动的反应是指引物随着核酸聚合酶延伸或指寡核苷酸随着核酸连接酶连接。扩增可以包括任一已知或新设计的扩增方法，包括那些公开的方法中所使用的扩增方法(例如，基于转录的扩增(如转录介导的扩增(TMA))和基于核酸序列的扩增NASBA(如本文例示)，循环核酸扩增技术(热循环)(如聚合酶链式反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)和连接酶链式反应(LCR))，和任何扩增方法(例如，自我维持的序列复制(3SR)、链置换扩增(SDA)、分支DNA(bDNA)、循环探针技术(CPT)、固相扩增(SPA)、滚环扩增技术(RCA)、固相RCA、锚定SDA和核酸酶依赖的信号扩增(NDSA)，本领域技术人员知道的所有这些扩增方法。如果检测化学可行，扩增反应可以为“实时”扩增，这能在扩增反应进行时检测反应产物，例如实时PCR或实时NASBA。因此，本发明包括使用任意核酸扩增方法或任意其它程序，所述程序可用于提高基于核酸诊断检测的灵敏性和/或快速性。本发明也包括使用任一检测技术，这些检测技术包括扩增后检测技术，任何结合检测的扩增技术，任何杂交核酸芯片或阵列技术，任何扩增芯片或扩增和杂交芯片技术的组合。用任何核苷酸测序方法的检测和鉴定也包含于本发明。
尽管任何合适的扩增方法都能用于本检测，但需知利用限制性内切酶的扩增反应(如DNA-NASBA)可贡献于测定的额外特异性水平。例如，如果选择具有能在金黄色葡萄球菌orfX区内杂交的P1的DNA-NASBA扩增反应，要求正确的限制性位点位于金黄色葡萄球菌基因组区域上，以使扩增以大大减少或排除抗甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(如抗甲氧西林表皮葡萄球菌)扩增的可能性的方式进行，因为其不应该有所需的限制性位点。这在本发明的“方法2”反应中特别有用，其中检测细菌基因组DNA和SCCmec DNA之间连接区的探针被设计为和SCCmec DNA杂交(或主要和SCCmec DNA杂交，在一实施方式中，1、2、3个或一些探针核苷酸穿过连接区和orfXDNA杂交)，而不是和细菌基因组DNA杂交。这些特性的组合提供了高度特异性的MRSA检测。此外，可通过增加引物杂交条件的严格度用PCR类型反应获得附加的特异性。因此，通过增加所选扩增反应的严格度，用任何选定的方法，可增加MRSA检测的总体特异性，所述MRSA检测包括使用SCCmec-杂交探针的检测反应。
此外，可用其它方式进行扩增来增强扩增，例如，对于基于转录的扩增反应(如TMA，NASBA)，需要时可使用阻断的“P1”(即是启动子-耐受)引物。所述阻断的引物通常在引物延伸的3′端通过化学部分(如dabsyl和本领域内所知的其它化合物)被阻断。
各种检测方法可用于本发明中。使用核酸探针的检测方法为本领域内所熟知。本试剂盒和/或本方法中使用的探针可用任何适合于所选检测方法的选定标记物标记，其中许多为本领域内所知，如磷酸酶(例如碱性磷酸酶)、生物素、亲和素、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)、地高辛配基、荧光染料(如Cy3和Cy5染料、荧光黄、FAM、ROX)、化学发光标记物、发色标记物、放射性标记物(如放射性同位素)和配体。可使用用于不同检测方法的探针(如靶标-捕获、HPA、TaqMan、分子信标和夹心杂交)设计。可根据探针的类型和选择的检测反应的类型选择杂交条件。
本发明还提供用于所述扩增和检测方法的有用的试剂盒。
具体提供的试剂盒是用于检测抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
第二引物，其能在末端连接区内与金黄色葡萄球菌染色体DNA特异性杂交，及
探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增。
在一优选实施方式中，所述末端连接区是右末端连接区。在另一实施方式中，末端连接区是左末端连接区。在一实施方式中，所述第一和第二引物提供于单个容器中。另一实施方式中，第一引物和第二引物和探针提供于单个容器中。
因此，本发明的试剂盒可含：
●第一容器，其含：
■第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，和
■第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端连接区内特异性杂交，及
●第二容器，其含：
■探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交。
另外，本发明的试剂盒可含容器，所述容器含：
●第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
●第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的右末端连接区内特异性杂交，和
●探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交。
本发明还提供用于鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
a)第一扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在末端连接区内与金黄色葡萄球菌染色体DNA特异性杂交，和
(3)第一探针，其选自：
(a)第一探针，其能主要在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，和
(b)第一探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，及
b)第二扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(4)第三引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交，
(5)第四引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交，和
(6)第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交，
其中各第三引物和第四引物取向为：使在扩增条件下，mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域被扩增。
本发明还提供用于鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
(a)第一扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在右末端连接区内与金黄色葡萄球菌染色体DNA特异性杂交，和
(3)第一探针，其能主要或完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接区被扩增，及
(b)第二扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(4)第三引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交，
(5)第四引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交，和
(6)第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交，
其中各第三引物和第四引物取向为：使在扩增条件下，mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域被扩增。
能“完全”在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交的探针指在选择的特异性杂交条件下，只在SCCmec盒内杂交，而不穿过连接区杂交的探针。能“主要”在SCCmec盒内特异性杂交的探针指能在SCCmec盒内杂交，还能穿过连接区杂交，且因此包括邻接连接区的orfX的至少1、2、3个或一些核苷酸的探针。如果探针的1、2、3个或一些核苷酸和邻接连接区的orfX区域杂交，探针(其核苷酸的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，优选连续)能与第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域特异性杂交。“主要”在SCCmec盒内杂交的探针可包括完全在SCCmec盒区域内杂交的探针。
本发明的探针，包括这些试剂盒所含的那些探针，可被有益地标记用于检测，如本领域技术人员所知。可以适当地选择引物用于特定的设计和待进行的扩增反应类型。引物和探针试剂可被提供在几种状态的任意一种中，包括干燥状态，冻干状态，颗粒状，喷雾干燥状或液体中。
本发明的试剂盒可以包括其它组分，如用于所选的扩增方法的试剂(例如，扩增酶、缓冲液和/或限制性内切酶等)、对照、反应容器等。在一具体实施方式中，第一、第二、第三和第四引物可提供在单个容器中。在另一实施方式中，第一和第二扩增和检测寡核苷酸集可提供在单个容器中。因此，所述试剂盒可用于进行多重扩增反应。
在一实施方式中提供含容器的试剂盒，所述容器含：
●第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区(优选右末端连接区)内特异性杂交；
●第二引物，其能在末端连接区内在金黄色葡萄球菌染色体DNA(如果第一引物在右末端连接区内杂交，具体是右末端连接区)内特异性杂交；
●第三引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交；和
●第四引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交。
所述试剂盒还可含容器，所述容器含：
●第一探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，和
●第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交。
另外，在本发明的另一实施方式中，可提供含容器的试剂盒，所述容器含：
●第一引物，其能在SCCmec盒的末端连接区(优选右末端连接区)内特异性杂交；
●第二引物，其能在末端连接区内在金黄色葡萄球菌染色体DNA(如果第一引物在右末端连接区内杂交，具体是右末端连接区)内特异性杂交；
●第三引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交；
●第四引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交；
●第一探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交；和
●第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交。
能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交的引物可以是含选自以下的序列的核酸：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。此外，所述引物可基本上由或由选自以下的序列构成：SEQID NO：1、2、3、4、5和6。可选择一种或多种所述引物；在一优选实施方式中，几种引物(各特异于不同类型的MRSA)可被选择包括于试剂盒中。所述引物在本发明的所述方法中有用。
能在右末端连接区内在金黄色葡萄球菌染色体DNA内特异性杂交的引物可优选为能与orfX特异性杂交的引物。具体而言，在一实施方式中，所述引物可以包括SEQ ID NO：13所示的核酸。此外，所述引物可基本上由或由SEQ ID NO：13所示的核酸构成。所述引物在本发明的所述方法中有用。
在一实施方式中，能完全在第一引物能与之杂交的区域和连接区之间的SCCmec盒区域内特异性杂交的探针可包括5种或更多种探针，各能与不同类型的MRSA特异性杂交。在一具体实施方式中，所述探针可含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。此外，所述探针可基本上由或由选自以下的序列构成：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。所述探针在本发明的所述方法中有用。
在本发明的某些试剂盒中，包括用于mecA基因检测的引物和/或探针。
所述试剂盒含特异于mecA基因的引物集，具体而言，
●第一引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交，其中第一引物取向为：使在扩增条件下，mecA的第一区域和第二选定区域之间的mecA区域被扩增；
●第二引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交，其中第二引物取向为：使在第一引物的扩增条件下，mecA的第一区域和mecA的第二区域之间的mecA区域被扩增。
在一实施方式中，这些mecA引物可含SEQ ID NO：15和16之一或二者。所述试剂盒还可含特异于两个所选mecA引物之间的mecA区域的探针。在一具体实施方式中，所述mecA探针可含SEQ ID NO：14所示的核酸序列。此外，所述mecA探针可基本上由SEQ ID NO：14所示的核酸序列构成。通过在同一试剂盒(在同一反应容器中使用)中提供用来扩增和检测SCCmec盒和mecA的引物和探针集，可以提供用于检测MRSA的有用的多重试剂盒。
需知所提及的包括胸苷的引物和探针序列可以容易地调整用尿苷来替代胸苷，这对特定的检测有用。此外，核苷酸可被额外的化学基团修饰，或者个别残基用类似物(例如，2′-O-甲基化形式)替代。其它这些修饰的核苷酸为本领域内所知；一些例子中包括：羟甲基核苷酸、甲基化的核苷酸、氟化的核苷酸、α硫代磷酸核苷酸、胺修饰的核苷酸、甲氧基核苷酸、羧甲基核苷酸、硫代核苷酸、肌苷、二氢尿苷、假尿苷、wybutosine、喹啉、C7dGTP。其它修饰的核苷酸见于美国专利No.5,405,950和5,633,364(均由Mock and Lovern)。此外，探针可含DNA、RNA、修饰的DNA或RNA、PNA，其它合成的核酸或者用核苷酸碱基作为与靶标选择性杂交方式的核酸替代物。
在本申请通篇，特定的寡核苷酸可例示用作特定引物类型(例如，P1-型(在双链形成时连接提供启动子区的序列)或P2-型(单独或连接标签寡核苷酸使用)NASBA引物)；然而，这些使用不应限制寡核苷酸可使用的使用)。例如，例示为P1引物的引物也可用作P2-型引物。另外，引物可适于其它扩增方法(例如，移出P1(用于NASBA或TMA的)的T7聚合酶启动子区用于PCR)，这为本领域技术人员所知。
T7启动子的核酸序列为本领域技术人员所熟知，尽管本文例示了特定序列，也可选用本领域已知或新设计的具有稍微变异的功能等同物。在一优选的实施方式中，T7启动子的序列是SEQ ID NO：17所示的序列。
本方法可用于任何选定的样品，如直接的患者样品，例如鼻或腹股沟的拭子、咽喉拭子、直肠拭子、来自伤口的样品(都特别适合于筛选，也特别适合于诊断)、支气管肺泡灌洗液或血液(例如，败血症或血液培养物)。所述样品通常含混合的微生物种群。此外，需要时本方法可用于只含有单一细菌物种或株的样品，例如，用MRSA的分离、培养、捕获和/或富集的样品。
本发明由以下实施例例示。
实施例
使用NASBA作为扩增开始研究。研究了两个主要方法：方法1(通用的金黄色葡萄球菌(orfX)探针)和方法2(SCCmec-特异的探针)。“方法1”和先前检测使用的配置非常类似；基于使用5种位于盒右部的P2，1种位于金黄色葡萄球菌orfX的通用P1，1种位于金黄色葡萄球菌orfX的通用信标(图2)。本文描述的“方法2”使用与方法1相同的5种P2和P1，但是5种SCCmec-特异的信标位于SCCmec-盒右部以代替通用信标(见图3)。此外，本文也报道并表明用方法2进行mecA的扩增和检测的多重反应在检测MRSA的高度有效。
扩增条件
对所有实验而言，使用了下列DNA NASBA条件：染色体DNA用作用于扩增的输入原料。对各株而言，用光密度计(bioMerieux，Marcy l′Etoile，France)将细菌悬浊液标准化到0.5McFarland(1.5×108CFU/ml)。用玻璃珠和涡旋的机械裂解法使细菌细胞释放DNA，最终由裂解的悬浊液制备系列稀释液。
用标准的NASBA试剂(40mM Tris HCl pH 8.5、12mM MgCl2、90mM KCl、15％v/vDMSO、5mM DTT、1mM各种dNTP、2mM ATP、2mM CTP、2mM UTP、1.5mM GTP、0.5mM ITP)进行扩增；引物浓度(正向引物＝P1，反向引物＝P2)当单一测试时为0.2μM，当多重测试时为0.1μM；FAM标记的分子信标探针浓度为0.01μM，就Cy5标记的信标探针而言为0.1μM。
NASBA反应中限制性内切酶(Sau3A-I)的浓度为0.05单位/μl。41℃下混合物温育15分钟以使限制性内切酶切断DNA，随后95℃下5分钟使DNA变性和限制性内切酶降解，最后在添加NASBA酶(0.08单位RNase H、32单位T7RNA聚合酶、6.4单位AMV逆转录酶和2.1μgBSA)之前41℃下进行3分钟。通过温和涡旋和短时间离心混和反应混合物，然后开始扩增和实时检测。在NucliSens EasyQAnalyzer(NucliSens，BioMérieux)中41℃下温育反应混合物90分钟，每30秒监控荧光。对于FAM检测，在485nm处激发反应，并在518nm处检测发射信号。对于ROX，分别在578nm处和604nm处进行激发和发射；对于Cy5，分别在646nm处和678nm处进行激发和发射。
使用的引物和探针如下所示。对于NASBA反应，在形成双链时，通常使用“引物1”或“P1”指在其5′端具有提供启动子区域(这里，用于T7聚合酶)的序列的引物。本文中，NASBA的第二引物(无启动子连接的引物)通常是标记的“引物2”或“P2”。
下列表1提供了实施例中使用的引物和探针的序列。
表1
功能 SEQ ID NO 描述 序列5′→3′
P2 1 SCCmec右末端连接区V型MREJ CTCTGCTTTATATTATAAAATTACGGCTG
P2 2 SCCmec右末端连接区III型MREJ ATTTCATATATGTAATTCCTCCACATCTC
P2 3 SCCmec右末端连接区I型和II型MREJ AAGACTGCGGAGGCTAA
P2 4 SCCmec右末端连接区VII型MREJ TATTCTTCAAAGATTTGAGC
P2 5 SCCmec右末端连接区IV型MREJ CAAATATTATCTCGTAATTTAC
P2 6 SCCmec右末端连接区V型SCCmec TCTAATTTATTTAACATAAAATCAATCCT
信标-FAM 7 SCCmec右末端连接区I型和II型MREJ FAM-CGGCGCGTCAAAAATCATGAACCTCATTACTTATGCGCCG-DabSyI
信标-FAM 8 SCCmec右末端连接区III型MREJ FAM-CGAGCGCAAATTATACACAACCTAATTTTTAGTGCGCTCG-DabSyl
信标-FAM 9 SCCmec右末端连接区VII型MREJ FAM-CGGAGCTAATTTAATAATTTTCTCATATTTTTTAGCTCCG-DabSyl
信标-FAM 10 SCCmec右末端连接区IV型MREJ FAM-CGTAACGGATAAAAAACCGCATCATTTGACGTTACG-Dabsyl
信标-FAM 11 SCCmec右末端连接区V型MREJ FAM-CGTAGCGGCTGAAATAACCGCATCATTTACGCTACG-Dabsyl
信标-FAM 12 SCCmec右末端连接区V型SCCmec FAM-CGTCACGTAAAATATATTATACACAATCCGTTTCGTGACG-Dabsyl
P1 13 OrfX右末端连接区 aattctaatacgactcactatagggagagTCAAACGGCCTGCACAAGGA
信标-Cy5 14 mecA基因 Cy5-CGTACGGGATCATAGCGTCATTATTCGTACG-Dabsyl
P1 15 mecA P1 aattctaatacgactcactatagggagagGTATTGGCCAATTCCACATTGTTTC
P2 16 mecA P2 CATTGATCGCAACGTTCA
T7聚合酶启动子序列 17 AATTCTAATACGACTCACTATAGGG
信标-FAM 18 Generic-orfX(SCCmec) FAM-CGTACGGTAGTTACTGCGTTGTAAGACGTACG-Dabsyl
实施例1：用方法1(通用信标NASBA)在21MSSA株上得到的NASBA结果
“方法1”基于使用5种位于盒右部的P2，1种位于金黄色葡萄球菌orfX的通用P1，1种位于金黄色葡萄球菌orfX的通用信标(图2)。使用5种SCCmec盒特异性引物2(P2)(SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5)，1种通用P1(SEQ ID NO：13)和1种通用的FAM-标记的信标(SEQ ID NO：18)进行DNA NASBA。得到MRSA(属于I型、II型、III型、IV型、V型和VII型MREJ的6种株)和MSSA的NASBA曲线。裂解物输入对应于105CFU/NASBA。最大信号比(终信号和初始背景之比)列于表2中。本实验显示阳性最大信号比为21种具有通用信标NASBA(方法1)的MSSA株中有5种(24％)。
表2：用通用信标NASBA就MSSA得到的最大信号比
(阳性信号为斜粗体)
株 最大信号比
MSSA10 1.01
MSSA11 1.69
MSSA12 1.02
MSSA13 1.07
MSSA14 1.08
MSSA15 1.00
MSSA16 2.06
MSSA17 2.38
MSSA18 1.52
MSSA19 1.00
MSSA23 1.02
MSSA24 1.00
MSSA25 1.00
MSSA26 1.00
MSSA27 1.38
MSSA28 1.00
MSSA29 1.00
MSSA30 1.00
MSSA31 1.05
MSSA32 1.00
MSSA1034 1.00
实施例2：用方法2(特异性信标NASBA)在6MRSA株和18MSSA株上得到的NASBA结果
为了克服MSSA的非特异性检测，确定并发开了“方法2”。具体而言，确定位于SCCmec盒右部而非orfX的信标。“方法2”使用5种特异性引物2(P2)和1种通用的P1，但使用位于盒右部的5种特异性信标而不是通用信标(见图3)。
使用5种SCCmec盒特异性引物2(P2)(SEQ ID NO：1～5)，一种通用(orfX)的引物1(P1)(SEQ ID NO：13)和5种SCCmec盒特异性FAM-标记的信标(SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11)进行DNA NASBA。使用裂解物作为对应于105CFU/NASBA的靶标来检测6种MRSA株和18种MSSA株。从MRSA和MSSA得到NASBA曲线。得到的最大信号比列于表3中。
本实验显示，用特异性信标方法(方法2)检测到18种MSSA中的仅1种；所检测到的MSSA株期望含有无mecA基因的盒右部。本实验显示，特异性信标的使用(方法2)显著降低用通用信标方法(方法1)非特异性检测的MSSA百分率。
表3：用特异性信标NASBA就MSSA和MRSA得到的最大信号比(阳性为粗斜体)
株 mecA PCR 最大信号比
阴性对照 不可应用 1.0
MSSA10 阴性 1.0
MSSA11 阴性 1.0
MSSA12 阴性 1.0
MSSA13 阴性 1.0
MSSA14 阴性 1.0
MSSA15 阴性 1.0
MSSA16 阴性 1.7
MSSA17 阴性 1.0
MSSA18 阴性 1.0
MSSA19 阴性 1.0
MSSA23 阴性 1.0
MSSA24 阴性 1.0
MSSA25 阴性 1.0
MSSA26 阴性 1.0
MSSA27 阴性 1.0
MSSA28 阴性 1.0
MSSA29 阴性 1.0
MSSA30 阴性 1.0
MRSA3 阳性 1.6
MRSA7 阳性 1.6
MRSA8 阳性 1.7
MRSA9 阳性 2.2
MRSA10 阳性 2.1
MRSA11 阳性 1.9
实施例3：mecA基因和盒***区的多重扩增和检测
使用方法2排除了一些假阳性，因此提供了改良的检测MRSA的方法。然而，含有无mecA基因的盒的MSSA株可被检测到，研究了进一步改良。如本实施例中所示，***盒区(使用方法2)和mecA基因(见图4)的同时扩增和检测能帮助减少所述株(假MRSA阳性)的检测。
所述实施例显示了在同一试管中，用于检测mecA基因和盒连接区(方法2，其具有SCCmec-盒特异性信标)的多重NASBA的可行性。所述NASBA使用对于盒连接区的5种SCCmec-盒特异性的P2(SEQ ID NO：1～5)、1种P1(SEQ ID NO：13)和5种FAM-标记的SCCmec盒-信标(SEQ ID NO：7～11)；及对于mecA的1种P1(SEQ ID NO：15)、1种P2(SEQ ID NO：16)和1种ROX-标记的信标(SEQ ID NO：14)。也进行在一个管中扩增的，只靶向SCCmec右末端连接区的NASBA反应(5种SCCmec-盒特异性P2(SEQ ID NO：1～5)，5种特异性SCCmec-盒特异性FAM-信标(SEQID NO：7～11)和1种orfXP1(SEQ ID NO：13))，以作为比较。
下表(表4)列出了就以下获得的最大信号比：(1)SCCmec右末端连接区NASBA(FAM信号)，当试管中仅SCCmec右末端连接区被扩增时(5种P2，5种特异性FAM-信标和1种P1)(“仅SCCmec连接区”)；(2)SCCmec右末端连接区NASBA(FAM信号)和mecANASBA(ROX信号)，当在同一试管中进行两种NASBA(“SCCmec连接区和mecA NASBA在一个试管中”)(当大于1.2时认为是最大信号比是阳性)。
表4
表4中粗斜体的数字表示阳性信号。
这些结果显示当SCCmec右末端连接区和mecA NASBA在同一试管中进行时，在除了V型和VII型之外的所有型株中，SCCmec右末端连接区和mecA基因的检测限低到5CFU/NASBA。因此，在含有无mecA基因的***盒区的MSSA的情况中，本检测将正确地提供“MRSA阴性”的结果(SCCmec连接区(+)加mecA(-))。
实施例4：mecA基因和盒***区的多重扩增和检测
进行MRSA的多重(同一试管)扩增和检测，随mecA检测(实施例3报道了相同的条件)使用方法2(SCCmec-盒特异性信标)，使用6种SCCmec盒特异性的P2(SEQ ID NO：1～6)，6种特异性SCCmec-盒特异性FAM信标(SEQ ID NO：7～12)和1种orfX P1(SEQ ID NO：13)。获得MRSA株的阳性检测。
本文引用的出版物和所述出版物所引用的材料通过引用具体并入本文。这方面的任何内容不应被理解为承认本发明不能因为是在先发明而先于这些揭示。。
需知报道的该发明不限于所描述的特定方法，程序和试剂，因为这些是可变的。也需知本文所用的术语仅旨在描述具体的实施方式，不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由随附的权利要求确定。
本领域技术人员应知道，或者能确定，仅使用常规实验，许多等同于本文报道的发明的具体实施方式。所述等同物旨在由下列权利要求所包含。
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<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>1
ctctgcttta tattataaaa ttacggctg 29
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>2
atttcatata tgtaattcct ccacatctc 29
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>3
aagactgcgg aggctaa 17
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>4
tattcttcaa agatttgagc 20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>5
caaatattat ctcgtaattt ac 22
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>6
tctaatttat ttaacataaa atcaatcct 29
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸探针序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>3’FAM修饰
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>5’Dabsy1修饰
<400>7
cggcgcgtca aaaatcatga acctcattac ttatgcgccg 40
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸探针序列
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<223>5’Dabsy1修饰
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cgagcgcaaa ttatacacaa cctaattttt agtgcgctcg 40
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸探针序列
<220>
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<222>(1)..(1)
<223>3’FAM修饰
<220>
<221>misc_feature
<222>(40)..(40)
<223>5’Dabsy1修饰
<400>9
cggagctaat ttaataattt tctcatattt tttagctccg 40
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<213>人工的
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cgtaacggat aaaaaaccgc atcatttgac gttacg 36
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cgtagcggct gaaataaccg catcatttac gctacg 36
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<213>人工的
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<223>寡核苷酸探针序列
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<223>5’Dabsy1修饰
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cgtcacgtaa aatatattat acacaatccg tttcgtgacg 40
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<213>人工的
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<223>寡核苷酸探针序列
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<222>(31)..(31)
<223>5’Dabsy1修饰
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cgtacgggat catagcgtca ttattcgtac g 31
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<213>人工的
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<223>NABSA启动子
<400>15
aattctaata cgactcacta tagggagagg tattggccaa ttccacattg tttc 54
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<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>NABSA引物
<400>16
cattgatcgc aacgttca 18
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<212>DNA
<213>噬菌体T7
<400>17
aattctaata cgactcacta taggg 25
<210>18
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸探针序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>3’FAM修饰
<220>
<221>misc_feature
<222>(32)..(32)
<223>5’Dabsyl修饰
<400>18
cgtacggtag ttactgcgtt gtaagacgta cg 32

Claims (161)

1.下列(a)～(c)用于制备检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒的用途：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(c)探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，并且
其中所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，
其中所述检测通过包括下列步骤的过程实施：
利用所述(a)～(c)对样品进行扩增和检测反应，并且其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则检测到探针的杂交。
2.权利要求1的用途，其中所述探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
3.权利要求1的用途，其中所述探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
4.权利要求1的用途，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
5.权利要求4的用途，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
6.权利要求5的用途，其中所述NASBA是DNA NASBA。
7.权利要求1的用途，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
8.权利要求1的用途，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
9.权利要求1的用途，其中所述探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
10.权利要求1的用途，其中所述探针包括至少5种核酸，各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
11.权利要求1的用途，其中所述第一引物包含含有选自以下的序列的核酸：SEQ IDNO：1、2、3、4、5和6。
12.权利要求1的用途，其中所述第一引物包括至少5种核酸，各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
13.下列(a)～(c)用于制备检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒的用途：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(c)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，
其中所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，
其中所述检测通过包括下列步骤的过程实施：
(A)利用所述(a)～(c)对样品进行扩增和检测反应，所述反应检测***的SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接点的存在，并且
(B)对样品进行扩增和检测反应，所述反应检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则在样品中检测到靶连接点和mecA二者的存在。
14.权利要求13的用途，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
15.权利要求13的用途，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
16.权利要求13的用途，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
17.权利要求16的用途，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
18.权利要求17的用途，其中所述NASBA是DNA NASBA。
19.权利要求13的用途，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
20.权利要求13的用途，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
21.权利要求13的用途，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
22.权利要求13的用途，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
23.权利要求13的用途，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一引物来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
24.权利要求13的用途，其中扩增用至少5种核酸作为第一引物来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
25.权利要求13的用途，其中所述mecA扩增使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA引物。
26.权利要求13的用途，其中所述mecA检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
27.下列(a)～(c)用于制备检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒的用途：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(c)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，
其中所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，
其中所述检测通过包括下列步骤的过程实施：
对样品进行多重扩增反应，其中所述扩增反应包括：
(A)利用所述(a)～(c)扩增和检测***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接点的存在，并且
(B)扩增和检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则在样品中检测到靶连接点和mecA二者的存在。
28.权利要求27的用途，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
29.权利要求27的用途，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
30.权利要求27的用途，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
31.权利要求30的用途，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
32.权利要求31的用途，其中所述NASBA是DNA NASBA。
33.权利要求27的用途，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
34.权利要求27的用途，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
35.权利要求27的用途，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
36.权利要求27的用途，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
37.权利要求27的用途，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一引物来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
38.权利要求27的用途，其中扩增用至少5种核酸作为引物来进行，所述核酸各含SEQID NO：1、2、3、4、5和6之一。
39.权利要求27的用途，其中所述mecA扩增使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA引物。
40.权利要求27的用途，其中所述mecA检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
41.可扩增以下二者的扩增试剂用于制备检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒的用途：
(a)***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接点，和
(b)mecA区域，
其中所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，
其中所述检测通过包括下列步骤的过程实施：
(A)用所述扩增试剂对样品进行多重扩增反应，及
(B)在扩增产物中，检测各连接点和mecA的有无，
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则在样品中检测到连接点和mecA二者的存在。
42.权利要求41的用途，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
43.权利要求42的用途，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
44.权利要求43的用途，其中所述NASBA是DNA NASBA。
45.权利要求41的用途，其中所述连接点的扩增利用下列物质进行：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之特异性杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增。
46.权利要求45的用途，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
47.权利要求45的用途，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
48.权利要求45的用途，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
49.权利要求45的用途，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
50.权利要求45的用途，其中所述mecA区扩增使用mecA引物，所述mecA引物含选自SEQID NO：15和16的核酸。
51.权利要求45的用途，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
52.权利要求45的用途，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
53.权利要求45的用途，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一引物来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
54.权利要求45的用途，其中扩增用至少5种核酸作为第一引物来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
55.权利要求45的用途，其中所述mecA扩增使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA引物。
56.权利要求45的用途，其中所述mecA检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
57.下列(a)～(b)用于制备鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌存在的试剂盒的用途：
(a)第一寡核苷酸集，其含：
(1)第一寡核苷酸，其具有与SCCmec盒的右末端连接区特异性杂交的核酸序列，和
(2)第二寡核苷酸，其具有在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交而形成所述样品与所述第一和第二寡核苷酸的第一反应产物的核酸序列，和
(b)第二寡核苷酸集，其含：
(3)第三寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第一区域特异性杂交的核苷酸序列，和
(4)第四寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第二区域特异性杂交而形成所述样品与所述第三和第四寡核苷酸的第二反应产物的核苷酸序列，
其中所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmee盒的***，
其中所述鉴定通过包括以下步骤的过程实施：
在单个容器内使所述样品与所述(a)～(b)接触；及通过检测第一和第二反应产物二者来鉴定抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的存在。
58.权利要求57的用途，其中所述接触步骤还包括：使用寡核苷酸集(a)和(b)作为引物进行扩增反应，其中所述鉴定步骤包括：检测来自两个寡核苷酸集的扩增产物的有无。
59.权利要求58的用途，其中所述鉴定步骤包括：使所述第一和第二反应产物与下列物质接触：
(1)第一探针，其能与第一反应产物特异性杂交，和
(2)第二探针，其能与第二反应产物特异性杂交。
60.权利要求57的用途，其中所述第一寡核苷酸包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的寡核苷酸。
61.权利要求59的用途，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
62.权利要求59的用途，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
63.权利要求57的用途，其中所述第二寡核苷酸含SEQ ID NO：13所示的核酸。
64.权利要求57的用途，其中所述第三寡核苷酸含选自以下的核酸：SEQ ID NO：15和16。
65.权利要求57的用途，其中所述第四寡核苷酸含选自以下的核酸：SEQ ID NO：15和16。
66.权利要求59的用途，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
67.权利要求59的用途，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
68.权利要求58的用途，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一寡核苷酸来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
69.权利要求58的用途，其中扩增用至少5种核酸作为第一寡核苷酸来进行，所述寡核苷酸各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
70.权利要求58的用途，其中所述扩增反应使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mec4寡核苷酸。
71.权利要求57的用途，其中所述第二反应产物的检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
72.检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的非诊断目的的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
利用下列物质对样品进行扩增和检测反应：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(c)探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，并且
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则检测到探针的杂交。
73.权利要求72的方法，其中所述探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
74.权利要求72的方法，其中所述探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
75.权利要求72的方法，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
76.权利要求75的方法，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
77.权利要求76的方法，其中所述NASBA是DNA NASBA。
78.权利要求72的方法，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
79.权利要求72的方法，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
80.权利要求72的方法，其中所述探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
81.权利要求72的方法，其中所述探针包括至少5种核酸，各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
82.权利要求72的方法，其中所述第一引物包含含有选自以下的序列的核酸：SEQ IDNO：1、2、3、4、5和6。
83.权利要求72的方法，其中所述第一引物包括至少5种核酸，各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
84.检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的非诊断目的的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
(a)利用下列物质对样品进行扩增和检测反应，所述反应检测***的SCCmec盒与金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接点的存在：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，并且
(b)对样品进行扩增和检测反应，所述反应检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则在样品中检测到靶连接点和mecA二者的存在。
85.权利要求84的方法，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
86.权利要求84的方法，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
87.权利要求84的方法，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
88.权利要求87的方法，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
89.权利要求88的方法，其中所述NASBA是DNA NASBA。
90.权利要求84的方法，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
91.权利要求84的方法，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
92.权利要求84的方法，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
93.权利要求84的方法，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
94.权利要求84的方法，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一引物来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
95.权利要求84的方法，其中扩增用至少5种核酸作为第一引物来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
96.权利要求84的方法，其中所述mecA扩增使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA引物。
97.权利要求84的方法，其中所述mecA检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
98.检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的非诊断目的的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
对样品进行多重扩增反应，其中所述扩增反应包括：
(a)利用下列物质扩增和检测***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接点的存在：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，并且
(b)扩增和检测mecA基因的存在，
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则在样品中检测到靶连接点和mecA二者的存在。
99.权利要求98的方法，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
100.权利要求98的方法，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
101.权利要求98的方法，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
102.权利要求101的方法，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
103.权利要求102的方法，其中所述NASBA是DNA NASBA。
104.权利要求98的方法，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
105.权利要求98的方法，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
106.权利要求98的方法，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
107.权利要求98的方法，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
108.权利要求98的方法，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一引物来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
109.权利要求98的方法，其中扩增用至少5种核酸作为引物来进行，所述核酸各含SEQID NO：1、2、3、4、5和6之一。
110.权利要求98的方法，其中所述mecA扩增使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA引物。
111.权利要求98的方法，其中所述mecA检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
112.检测样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的非诊断目的的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括：
(a)对样品进行多重扩增反应，所述反应可扩增以下二者：
(1)***的SCCmec盒和金黄色葡萄球菌染色体DNA的连接点，和
(2)mecA区域，及
(b)在扩增产物中，检测各连接点和mecA的有无，
其中如果样品中含有抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，则在样品中检测到连接点和mecA二者的存在。
113.权利要求112的方法，其中所述扩增反应选自：基于转录的扩增和PCR。
114.权利要求113的方法，其中所述基于转录的扩增是NASBA。
115.权利要求114的方法，其中所述NASBA是DNA NASBA。
116.权利要求112的方法，其中所述连接点的扩增利用下列物质进行：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之特异性杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增。
117.权利要求116的方法，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
118.权利要求116的方法，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
119.权利要求116的方法，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
120.权利要求116的方法，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
121.权利要求116的方法，其中所述mecA区扩增使用mecA引物，所述mecA引物含选自SEQ ID NO：15和16的核酸。
122.权利要求116的方法，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
123.权利要求116的方法，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
124.权利要求116的方法，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一引物来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
125.权利要求116的方法，其中扩增用至少5种核酸作为第一引物来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
126.权利要求116的方法，其中所述mecA扩增使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA引物。
127.权利要求116的方法，其中所述mecA检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
128.鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌存在的非诊断目的的方法，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述方法包括以下步骤：
在单个容器内使所述样品与下列物质接触：
(a)第一寡核苷酸集，其含：
(1)第一寡核苷酸，其具有与SCCmec盒的右末端连接区特异性杂交的核酸序列，和
(2)第二寡核苷酸，其具有在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交而形成所述样品与所述第一和第二寡核苷酸的第一反应产物的核酸序列，和
(b)第二寡核苷酸集，其含：
(3)第三寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第一区域特异性杂交的核苷酸序列，和
(4)第四寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第二区域特异性杂交而形成所述样品与所述第三和第四寡核苷酸的第二反应产物的核苷酸序列；及
通过检测第一和第二反应产物二者来鉴定抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的存在。
129.权利要求128的方法，其中所述接触步骤还包括：使用寡核苷酸集(a)和(b)作为引物进行扩增反应，其中所述鉴定步骤包括：检测来自两个寡核苷酸集的扩增产物的有无。
130.权利要求129的方法，其中所述鉴定步骤包括：使所述第一和第二反应产物与下列物质接触：
(1)第一探针，其能与第一反应产物特异性杂交，和
(2)第二探针，其能与第二反应产物特异性杂交。
131.权利要求128的方法，其中所述第一寡核苷酸包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的寡核苷酸。
132.权利要求130的方法，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
133.权利要求130的方法，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
134.权利要求128的方法，其中所述第二寡核苷酸含SEQ ID NO：13所示的核酸。
135.权利要求128的方法，其中所述第三寡核苷酸含选自以下的核酸：SEQ ID NO：15和16。
136.权利要求128的方法，其中所述第四寡核苷酸含选自以下的核酸：SEQ ID NO：15和16。
137.权利要求130的方法，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
138.权利要求130的方法，其中检测用至少5种核酸作为第一探针来进行，所述核酸各含SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12之一。
139.权利要求129的方法，其中扩增用含选自以下的序列的核酸作为第一寡核苷酸来进行：SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6。
140.权利要求129的方法，其中扩增用至少5种核酸作为第一寡核苷酸来进行，所述寡核苷酸各含SEQ ID NO：1、2、3、4、5和6之一。
141.权利要求129的方法，其中所述扩增反应使用含选自SEQ ID NO：15和16的核酸的mecA寡核苷酸。
142.权利要求128的方法，其中所述第二反应产物的检测使用含SEQ ID NO：14所示的核酸的mecA探针。
143.用于检测抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，及
(c)探针，其选自：
(1)能主要在第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域内特异性杂交的探针，和
(2)能完全在第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域内特异性杂交的探针
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增。
144.权利要求143的试剂盒，其中所述第一引物是含有选自以下的序列的核酸：SEQ IDNO：1、2、3、4、5和6。
145.权利要求143的试剂盒，其中所述第二引物含SEQ ID NO：13所示的核酸。
146.权利要求143的试剂盒，其中所述探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
147.权利要求143的试剂盒，其中所述探针是含选自以下的序列的核酸：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
148.用于检测抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
(a)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(b)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(c)探针，其选自：
(1)能主要在第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域内特异性杂交的第一探针，和
(2)能完全在第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域内特异性杂交的第一探针
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增。
149.用于鉴定样品中抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的存在的试剂盒，所述抗甲氧西林金黄色葡萄球菌在金黄色葡萄球菌染色体DNA内有SCCmec盒的***，所述试剂盒含：
(a)第一扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(1)第一引物，其能在SCCmec盒的右末端连接区内特异性杂交，
(2)第二引物，其能在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交，和
(3)第一探针，其能完全在第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域内特异性杂交，
其中各第一引物和第二引物取向为：使在扩增条件下，所述连接点被扩增，及
(b)第二扩增和检测寡核苷酸集，其含：
(4)第三引物，其能与mecA的第一区域特异性杂交，
(5)第四引物，其能与mecA的第二区域特异性杂交，和
(6)第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交，
其中各第三引物和第四引物取向为：使在扩增条件下，mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域被扩增。
150.权利要求149的试剂盒，其中所述第一、第二、第三和第四引物被提供在单个的容器中。
151.权利要求149的试剂盒，其中所述第一和第二扩增和检测寡核苷酸集被提供在单个的容器中。
152.权利要求149的试剂盒，其中所述第一引物包括多于一种能在SCCmec盒的右末端连接区内杂交的引物。
153.权利要求149的试剂盒，其中所述第一引物包含含有选自以下的序列的核酸：SEQID NO：1、2、3、4、5和6。
154.权利要求149的试剂盒，其中所述第一探针包括多于一种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
155.权利要求149的试剂盒，其中所述第一探针包括5种或更多种探针，各能与不同类型的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性杂交。
156.权利要求149的试剂盒，其中所述第一探针含选自以下的序列：SEQ ID NO：7、8、9、10、11和12。
157.权利要求149的试剂盒，其中所述第三引物含选自以下的核酸：SEQ ID NO：15和16。
158.权利要求149的试剂盒，其中所述第四引物含选自以下的核酸：SEQ ID NO：15和16。
159.权利要求149的试剂盒，其中所述第二探针含SEQ ID NO：14所示的核酸。
160.寡核苷酸组合物，其含：
(1)第一寡核苷酸，其具有与SCCmec盒的右末端连接区特异性杂交的核酸序列，
(2)第二寡核苷酸，其具有在金黄色葡萄球菌染色体DNA的orfX区内特异性杂交的核酸序列，和
(3)第一探针，其能与第一引物能与之杂交的区域和右末端连接点之间的SCCmec盒区域特异性杂交。
161.权利要求160的寡核苷酸组合物，其还含：
(4)第三寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第一区域特异性杂交的核苷酸序列，
(5)第四寡核苷酸，其具有与mecA核酸的第二区域特异性杂交的核苷酸序列，和
(6)第二探针，其能与mecA的第一区域和第二区域之间的mecA区域特异性杂交。
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