JP6427106B2 - 非電導性抗菌シートの製造方法 - Google Patents
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Description
円周600mm、面長1100mmの版母材(アルミ中空ロール)を準備し、New−FX(株式会社シンク・ラボラトリー製全自動レーザーグラビア製版ロール製造装置)を用いてパターニングロールの製造を行った。まず、版母材(アルミ中空ロール)を銅メッキ槽に装着し、中空ロールをメッキ液に全没させて20A/dm2、6.0Vで40μmの銅メッキ層を形成した。メッキ表面はブツやピットの発生がなく、均一な銅メッキ層を得た。この銅メッキ層の表面を2ヘッド型研磨機(株式会社シンク・ラボラトリー製研磨機)を用いて研磨して当該銅メッキ層の表面を均一な研磨面とした。上記形成した銅メッキ層を基材としてその表面にフォトレジスト(サーマルレジスト:TSER−NS(株式会社シンク・ラボラトリー製))を塗布(ファウンテンコーター)、乾燥した。得られたフォトレジストの膜厚は膜厚計(FILLMETRICS社製F20、松下テクノトレーデイング社販売)で計ったところ、7μmであった。ついで、画像をレーザー露光し現像した。上記レーザー露光は、Laser Stream FXを用い露光条件300mJ/cm2で所定のパターン露光を行った。また、上記現像は、TLD現像液(株式会社シンク・ラボラトリー製現像液)を用い、現像液希釈比率(原液1:水7)で、24℃90秒間行い、所定のレジストパターン部と非レジストパターン部を形成した。
次に、図10と同様にして、パターニングロールの表面に紫外線硬化型のアクリル系樹脂を供給し、前記パターニングロールの表面に合成樹脂フィルムとしてPETフィルムを連続的に搬送し当接せしめることで前記PETフィルムにアクリル系樹脂を転写した。そして、前記PETフィルムに転写された前記アクリル系樹脂に、紫外線を照射して紫外線硬化せしめ、図1〜図4に示したような4種類の微細凹凸表面を有する非電導性抗菌シートを製造した。
[非電導性抗菌シートの微細凹凸表面]
実施例1〜4では、非電導性抗菌シートとして、上述のように製造し、下記のような4種類の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなポリアクリレートプレートを用いた。また、比較例1として、PETフィルムにアクリル系樹脂を塗布して紫外線硬化させただけの平滑表面を有するポリアクリレートプレートを用いた。
実施例2: ポリアクリレートプレートの微細凹凸表面は、図2に示すような平面視が略四角形状であり長さの異なる複数の溝部が規則的に形成された微細凹凸表面とした。シート表面から溝部の底までの深さが0.4μm、溝部の開口幅が2μm、x方向スペースの幅が2μm、y方向スペースの幅が4μm。
実施例3: ポリアクリレートプレートの微細凹凸表面は、図3に示すような平面視が略四角形状であり長さ16μmの複数の突起部が規則的に形成された微細凹凸表面とした。シート表面から突起部の頂上までの高さが0.4μm、突起部の裾幅が2μm、x方向スペースの幅が2μm、y方向スペースの幅が6μm。
実施例4: ポリアクリレートプレートの微細凹凸表面は、図4に示すような平面視が略四角形状であり長さ16μmの複数の溝部が規則的に形成された微細凹凸表面とした。シート表面から溝部の底までの深さが0.4μm、溝部の開口幅が2μm、x方向スペースの幅が2μm、y方向スペースの幅が6μm。
Hassett et al.(非特許文献10)の方法に従い、緑膿菌(およそ108cells/ml)をL-タイプガラスチューブ(直径1.5cm、水平長さ13.5cm、高さ8cm)中で、5mlのグルコース(0.4%)VBMM最小培地(9)中で37℃で120rpmで撹拌しながら培養した。緑膿菌の細菌細胞増殖は540nmでの吸光度を測定することによって観察された。培地の量に対するプレートの領域の比率を調整するために、異なる表面形状を備えた25ピースのポリアクリレートプレート(1cm x 2cm)をL-タイプガラスチューブに加えた。
非特許文献11に記載された方法に準じて、マイクロタイター静的バイオフィルムアッセイを行った。細菌細胞を一晩培養した液を初期吸光度(A540)が0.01〜0.02(およそ106 cell/ml)となるようにVBMM培地中で1:1000で希釈した。希釈した培養液(50μl)を撹拌せずに37℃で24時間96ウェルのマイクロタイタープレート中で培養し、細菌細胞密度を吸光度(A595)で測定して決定した。浮遊性細菌細胞を取り除いた後、室温で30分間0.1%クリスタルバイオレット溶液(0.2ml)でバイオフィルムを染色し、蒸留水で5回洗浄した。クリスタルバイオレット染色(Crystal violet stain)を20%酢酸(0.2 ml)で可溶化し、570nmでの吸光度を測定した。バイオフィルムの形成は、A570/A595で発現した。各々のウェルに、異なる表面形状のポリアクリレートプレート(直径6mm)を微細凹凸表面を上にして細菌がその上に静的に接するように敷設した。
de la Fuente-Nunez et al. (非特許文献12)の方法に従い、スウォーミング運動性の実験を行った。細菌細胞は一晩培養したものを、VBMM培地で吸光度(A540)が0.05となるまで希釈した。5 μlの希釈した細菌細胞を、Luria-Bertani (LB) 培地を含む0.5%寒天プレートの中央にスポットし、異なる表面形状を備えたポリアクリレートプレート(1cm x 1cm)で蓋をした。寒天プレートを37℃で24時間培養した。写真をとり、スウォーミングエリアを測定した。
Lamppa and Grieswold(非特許文献13)の方法に準じて、SEMで観察した。細胞は、“スウォーミング運動性”の項で記述したように培養され、ポリアクリレートプレートは、4℃で一晩2%グルタルアルデヒドで固定した。プレートの脱水を、50%, 70%, 80%, 90% 及び 95%アセトンでそれぞれ15分間行い、100%アセトンと100%第三ブチルアルコールでの15分間の脱水に3回ずつ変えて行った。プレートはその後、真空蒸発器(JFD-310, JEOL,Japan)で3時間空気乾燥し、溶かしたアピエゾンワックス層とともにSEMのスタブに装着した。装着したプレートをその後、金及びパラジウムでスパッタコーティングし、SEM (JSM-6060LV, JEOL, Japan)で観察した。
[非電導性抗菌シート上のバイオフィルムの形成の減少]
非電導性抗菌シート自体が緑膿菌のバイオフィルム形成の減少にとって重要であるか否かを調べるために、細菌細胞の成長及び緑膿菌のバイオフィルム形成について、比較例1の平滑な表面を有するプレート及び実施例1〜4の微細凹凸表面を有するプレートで比較した。
実施例1、実施例3及び比較例1の25ピースの種々のプレート (1 cm x 2 cm) を含む5mlのグルコースVBMM培地中で細菌細胞を撹拌培養した。また、プレートなしのものも比較のために同様に細菌細胞を撹拌培養した。図11に、撹拌しての緑膿菌の細胞成長における、種々のタイプの微細パターンプレートの効果を示す。細胞成長は種々のタイプのプレートの存在下で吸光度[A540]を測定することにより観察された。図11に示すように、細菌細胞を撹拌培養した場合には、どの種類のプレートでも緑膿菌の細胞成長は抑制されなかった。
それぞれのウェルに実施例1〜4及び比較例1の種々のプレートを微細凹凸表面を上にして細菌がその上に静的に接するように置いてマイクロタイター静的バイオフィルムアッセイを行った。撹拌での細菌細胞成長とは対照的に、平滑なプレート(比較例1)の代わりに、実施例1〜4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートを使用した場合、プレート上のバイオフィルム形成は著しく抑制された。実施例1〜4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートによるバイオフィルム形成の抑制率は、およそ70%であった。実施例3及び4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートを使用した場合でも、バイオフィルムの形成は抑制された。実施例3及び4のプレートによるバイオフィルム形成の抑制率は、およそ30%であった。また、バイオフィルム形成の減少は、突起部を設けた凸部タイプのプレート(実施例1及び実施例3)に対して、溝部を設けた凹部タイプのプレート(実施例2及び実施例4)が使用された場合であっても、バイオフィルム形成の抑制効果は、ほとんど同じであった。結果を図12に示す。図12は、撹拌なしで、種々のタイプのプレート上で培養後の緑膿菌のバイオフィルム形成を示すグラフである。バイオフィルム形成は上述の「材料及び方法」の項に記載したように評価した。実施例1〜4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートの存在下で得られた値に対する比較例1の平滑なプレートの存在下で得られた値に対して、スチューデントのt検定(Student’s t test)を行った。図12において、* p< 0.05; ** p< 0.01である。
それから、緑膿菌のスウォーミング運動性も非電導性抗菌シートによって抑制されるかどうかを検証した。何故ならば、細菌細胞のスウォーミングは細菌感染のための一つの重要な要素だからである。希釈した細胞を、柔らかい寒天面上にスポットし、実施例1〜4及び比較例1の種々のプレートを、寒天面上に静置した細菌の上に被せてカバーし、37℃で24時間の条件下で培養した。図13及び図14に、種々のタイプのプレートでカバーした0.5%寒天プレート上での緑膿菌のスウォーミングを示す。細胞のスウォーミングは、上述した「材料及び方法」の項に記載したように評価した。図13が細胞のスウォーミングの写真、図14が、実施例1〜4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートでカバーされた細胞のスウォーミング領域の相対幅を比較例1の平滑なプレートでカバーされた細胞と比較したパーセンテージで示したものである。実施例1〜4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートの存在下で得られた値に対する比較例1の平滑なプレートの存在下で得られた値に対して、スチューデントのt検定(Student’s t test)を行った。図14において、* p< 0.05; ** p< 0.01である。
上述したスウォーミング運動性アッセイのために使用した実施例1〜4及び比較例1の種々のプレート上の細菌細胞の状態を、より詳細に走査型電子顕微鏡(SEM)で分析した(図15)。種々のプレートの表面の微細パターントポグラフィを図15Aに示す。図15は、撹拌なしで、種々のタイプのプレート上で培養後の緑膿菌の細胞の数を測定したものであり、Aが種々のタイプのプレートのSEM写真、Bが種々のタイプのプレート上の緑膿菌のSEM写真である。細菌細胞は、図13及び図14の説明中に記載したように培養し、SEM上の10μm2における細胞を20の異なるプレートにおいてカウントした。種々のタイプのプレート上の平均細胞数は、平滑なプレート上で培養した細胞と比較したパーセンテージで示した。パーセントの細胞数は、標準誤差の平均値(mean ± S. E.)である。実施例1〜4の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートの存在下で得られた値に対する比較例1の平滑なプレートの存在下で得られた値に対して、スチューデントのt検定(Student’s t test)を行った。* p < 0.05; ** p < 0.01である。
シリコンエラストマーからなる鮫肌トポグラフィプレート(sharklet(登録商標))(地形幅及び隙間が2μmで地形高さが3μm)が、黄色ブドウ球菌(7)及び大腸菌(8)のバイオフィルム形成及びスウォーミングを抑制したことが報告されている。このプレートはまた、ウスバアオノリの遊走子(15)の付着も抑制した。
本発明者らは、ポリアクリレートからなる浅い地形高さ(地形幅及び隙間が2μmで地形高さが0.4μm)の微細凹凸表面を有するトポグラフィカルなプレートでも緑膿菌のバイオフィルム形成を抑制することを確認した。本発明の非電導性抗菌シートによれば、バイオフィルム形成の抑制はまた、大腸菌でも観察された(データは非表示)。さらに、本発明の非電導性抗菌シートによれば、バイオフィルム形成の抑制はまた、黄色ブドウ球菌でも観察された(データは非表示)。したがって、グラム陰性菌及びグラム陽性菌のいずれの菌でも効果が確認された。バイオフィルム形成及びスウォーミング運動性の減少には幾つかのファクターが関連しているものと考えられる。
Claims (4)
- 平面視が略四角形状の複数の突起部がシート表面に形成されることで凹凸群を形成してなる合成樹脂製の微細凹凸表面を含む非電導性抗菌シートの製造方法であり、
前記突起部が、x方向及びそれに直交するy方向に、所定の幅のx方向スペース及びy方向スペースをあけて規則的に形成され、
前記シート表面から前記突起部の頂上までの高さが0.4μm〜1μmであり、
前記突起部の裾幅が2μm〜3μmであり、前記x方向スペースの幅と前記突起部の裾幅が同一幅であり、
前記微細凹凸表面に静的に接している細菌が、前記x方向スペースに細菌がトラップされることなしに抗菌作用を発揮してなり、
前記非電導性抗菌シートの前記微細凹凸表面が、パターニングロールで合成樹脂を合成樹脂フィルムに転写することにより作製されることを特徴とする非電導性抗菌シートの製造方法。 - 平面視が略四角形状の複数の溝部がシート表面に形成されることで凹凸群を形成してなる合成樹脂製の微細凹凸表面を含む非電導性抗菌シートの製造方法であり、
前記溝部が、x方向及びそれに直交するy方向に、所定の幅のx方向スペース及びy方向スペースをあけて規則的に形成され、
前記シート表面から前記溝部の底までの深さが0.4μm〜1μmであり、
前記溝部の開口幅が2μm〜3μmであり、前記x方向スペースの幅と前記溝部の開口幅が同一幅であり、
前記微細凹凸表面に静的に接している細菌が、前記溝部に細菌がトラップされることなしに抗菌作用を発揮してなり、
前記非電導性抗菌シートの前記微細凹凸表面が、パターニングロールで合成樹脂を合成樹脂フィルムに転写することにより作製されることを特徴とする非電導性抗菌シートの製造方法。 - 前記合成樹脂が紫外線硬化型のアクリル系樹脂であり、前記合成樹脂フィルムに転写された前記アクリル系樹脂が、紫外線硬化によって硬化せしめられてなることを特徴とする請求項1又は2記載の非電導性抗菌シートの製造方法。
- 平面視が略四角形状の複数の溝部及び/又は突起部が形成されてなる微細凹凸パターンを表面に備えてなるパターニングロールの表面に紫外線硬化型のアクリル系樹脂を供給する工程と、
前記パターニングロールの表面に合成樹脂フィルムを連続的に搬送し当接せしめることで前記合成樹脂フィルムにアクリル系樹脂を転写する工程と、
前記合成樹脂フィルムに転写された前記アクリル系樹脂に、紫外線を照射することで紫外線硬化せしめる工程と、
を有することを特徴とする請求項3記載の非電導性抗菌シートの製造方法。
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