JP6422344B2 - 同種抗原反応性の制御性t細胞を増大させる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所により授与されたP30 DK063720の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は、2012年3月2日に出願された米国仮特許出願第61/606,329号の恩典を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本開示は、概して、免疫療法において使用するための制御性T細胞(Treg)の製造に関する。特に、本開示は、同種抗原反応性Tregをエクスビボで増大させるための強固なアプローチに関する。このようにして作製された同種抗原反応性Tregは、同種異系移植のレシピエントにおける免疫寛容の誘導および/または維持に適している。
免疫抑制療法の現行の改善により、固形臓器移植後の急性拒絶反応の発生率は大幅に低下した。しかし、長期的な成果は、一部には免疫抑制に関連した罹患率および死亡率のために、伸び悩んでいる。免疫抑制への従来のアプローチは、T細胞応答の非特異的抑制に重点をおいてきた。
本開示は、概して、免疫療法において使用するための制御性T細胞(Treg)の製造に関する。特に、本開示は、同種抗原反応性Treg(alloTreg)をエクスビボで増大させるための強固なアプローチに関する。このようにして作製されたalloTregは、同種異系移植のレシピエントにおける免疫寛容の誘導および/または維持に適している。
[本発明1001]
ヒトのドナー反応性制御性T細胞(Treg)を作製するための方法であって、以下の段階を含む方法:
(a)ヒトドナーのCD19+ B細胞を、放射線照射済みのCD40L+ヒト白血病フィーダー細胞と共に、刺激されたB細胞(sBc)を作製するのに有効な条件下で共培養する段階;および
(b)ヒトレシピエントのCD4+、CD25+、CD127-/lo T細胞を該sBcと共に、ヒトのドナー反応性制御性T細胞(Treg)を選択的に増大させるのに有効な条件下で共培養する段階。
[本発明1002]
再刺激されたドナー反応性Tregを作製するのに有効な条件下で、前記ドナー反応性TregのCD3およびCD28を架橋することによって、該ドナー反応性Tregを再刺激する段階(c)をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
段階(b)を開始してから9〜12日後に段階(c)を開始する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記ドナー反応性TregがCD4+、Helios+およびFoxp3+である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
段階(a)の前に、前記ヒトレシピエントから得られた凍結保存末梢血単核細胞(PBMC)からCD4+、CD25+、CD127-/lo T細胞を単離する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
段階(a)が、前記B細胞と前記フィーダー細胞とを、インスリン、トランスフェリン、インターロイキン-4およびシクロスポリンAを含む培地中で共培養することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
段階(b)が、前記sBcが放射線照射された後で、該sBcおよび前記CD4+, CD25+, CD127-/lo T細胞を、インターロイキン-2を含む培地中で共培養することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記再刺激されたドナー反応性Tregが、段階(b)の開始時の前記CD4+, CD25+, CD127-/lo T細胞よりも200倍〜2000倍多い細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
本発明1002〜1008のいずれかの方法を用いて作製された再刺激されたドナー反応性Treg、および生理学的に許容される緩衝液を含有する、組成物。
[本発明1010]
本発明1002〜1008のいずれかの方法を用いて作製された107〜1011個の再刺激されたドナー反応性Tregを含有する、ヒトレシピエントによる固形臓器同種移植片の拒絶反応を治療または予防するための薬剤。
[本発明1011]
前記固形臓器同種移植片が、心臓、肺、心臓/肺、腎臓、膵臓、腎臓/膵臓、肝臓、腸、および皮膚の同種移植片からなる群より選択される、本発明1010の薬剤。
[本発明1012]
急性および/または慢性の移植拒絶反応の可能性を低減させるのに有効である、本発明1010の薬剤。
[本発明1013]
ベースラインを超えてTregの割合を増加させること、ドナー反応性Tregの頻度を増加させること、ドナー反応性Tregの活性を増加させること、ならびにPBMCおよび/または移植組織において寛容遺伝子発現プロファイルを誘導すること、からなる群の1つまたは複数を達成するのに有効である、本発明1010の薬剤。
[本発明1014]
リンパ球枯渇を達成するのに有効な量でウサギ抗胸腺細胞グロブリンを含むTreg支持的免疫抑制療法をヒトレシピエントが受けた後に、該ヒトレシピエントに投与される、本発明1010の薬剤。
[本発明1015]
標準治療より低い用量のプレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチルおよびタクロリムスと同時にヒトレシピエントに投与される、本発明1010の薬剤。
[本発明1016]
シロリムスと同時にヒトレシピエントに投与される、本発明1010の薬剤。
本開示は、概して、免疫療法において使用するための制御性T細胞(Treg)の製造に関する。特に、本開示は、同種抗原特異的Tregをエクスビボで増大させるための強固なアプローチに関する。このようにして作製された同種抗原特異的Tregは、同種異系移植のレシピエントにおける免疫寛容の誘導および/または維持に適している。
ドナー反応性制御性T細胞の作製
この実施例では、エクスビボで、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)から最大数十億(109)個の同種抗原特異的Tregを約2週間で選択的に増大させるための、例示的なGMP準拠の方法を提供する(図1参照)。
レシピエントT細胞の精製およびバンク保存
フィコール密度遠心分離を用いて参加者由来の全血または白血球搬出産物からPBMCを精製した。細胞を2回洗浄し、細胞1億〜2億個/ml/低温バイアルで氷冷CS10冷凍保存液(BioLife Solutions社)中に再懸濁した。細胞を速度制御フリーザー内で凍結し、さらなる使用まで液体窒素の蒸気相中で保存した。
死体ドナー由来のドナー脾臓もしくはリンパ節または生存ドナー由来のPBMCを採取し、単一細胞懸濁液へと処理するためのGMP施設に輸送した。B細胞を、CliniMACS装置でCD19陽性選択を用いて精製した。精製されたCD19+ B細胞を、Tregの増大のために必要となるまで冷凍保存によってバンクに保存した。
ヒト骨髄赤芽球性(erythromyeloblastoid)白血病細胞K562(ATCC番号CCL-243)を、ヒトCD40L、CD64およびHLA-DR0401を発現させるためにレンチウイルスでトランスフェクトした(K562-hCD40LまたはK40L)。これらの細胞は免疫不全マウスにおいて腫瘍形成性ではない。K40Lフィーダー細胞に10,000ラドのγ線を照射し、さらなる使用までバンクに保存した。
改変されたGMP準拠のプロトコル(Zand et al., Am J Transplant, 5:76-86, 2005)を用いて、刺激されたB細胞(sBc)を生成した。具体的には、CliniMACS(Miltenyi社)上で常磁性抗CD19マイクロビーズにより精製された約1〜100×106個のドナーB細胞を、10%ヒトAB血清、インスリン、トランスフェリン、ヒト組換えIL-4、およびシクロスポリンAを含有する培地中で、バンク保存されたGMP準拠のγ線照射済みのK40L細胞により比率1〜2:1(B:K40L)で7日間刺激した。7日目に、この混合培養物をK40Lフィーダー細胞により比率1〜10:1(B:K40L)で3日間再刺激した。平均増大は10〜20倍であった。このsBcを、死滅したK40L細胞を含む死細胞を除去するために、フィコールを通過させた。一連の品質保証アッセイをsBcに対して実施し、これにはqPCRに基づいたEBV再活性化試験(Viracor社)、ならびにHLA-DR、CD80およびCD86の発現だけではなく純度も測定するフローサイトメトリーが含まれていた。このsBcを、γ線照射(1000ラド)して、さらなる使用までバンクに保存した。
レシピエントPBMCを解凍し、計数し、臨床グレードの蛍光結合抗体(CD4-PerCP Ab、CD25-APC Ab、およびCD127-PE Ab)で染色した。染色されたPBMCからFACSによってCD4+CD127lo/-CD25+細胞を精製した(図2A)。FACS精製されたTregを、サプリメントGlutaMAX-1 CTSを含有するGMPグレードのOptimizer Medium(Invitrogen社)および2%ヒトAB血清を含む増殖培地中で、バンク保存された放射線照射済みのsBcとsBc:Treg比4:1で混合した。2日目に、培地容量を2倍にするときヒト組換えIL-2を300IU/mlの総濃度で培養物に添加した。細胞2〜3×105個/mlの細胞濃度を維持するために、IL-2を含有する新鮮な培地を5、7および9日目に培養物に供給した。培養の11日目に、細胞を、抗CD3および抗CD28モノクローナル抗体を比率1:1で結合させたビーズにより、残りの培養期間再刺激した。培養物は1日目に供給されて、16日目に回収された。Tregは、16日間の培養期間中に200〜1600倍に増大する。
Tregリリースの前に以下のアッセイおよび基準が用いられる:生存率>99%、フローサイトメトリーでCD4>90%、CD8<5%、CD19<5%、Foxp3>60%、およびTSDR>80%。培養12日目の細菌、真菌、マイコプラズマ、およびエンドトキシンについて陰性の微生物試験。採用したTSDRアッセイは、現在、Tregの純度と安定性に関する最も正確で信頼性の高い試験である。メチル化アッセイは、フローサイトメトリーで測定されたFoxp3+細胞の割合を確認するものである。さらに、Foxp3は活性化されたTconv細胞で発現され得るという強力な証拠がある。しかし、Foxp3 TSDR遺伝子座は活性化されたTconv細胞においてメチル化されているのに対して、真のTregではそれが脱メチル化されている。
細胞の表現型と機能性を完全に文書で証明するために、各製品に対して以下のアッセイを行う:1) CD4/Foxp3/CD27/CD62LおよびCD4/Foxp3/CD25/Heliosからなる2つのパネルを用いる、拡大されたフローサイトメトリー解析;2)ドナー特異的抑制アッセイ;3)ドナー特異性アッセイ;4)長期的な14日間の微生物試験;ならびに5)ドナーsBcとPMAとイオノマイシンにより誘導されるサイトカイン(IL-2、IFN-γおよびIL-17)。
ドナー反応性Tregの増大。抗原提示細胞(APC)としてCD40L刺激されたドナーB細胞(sBc)を用いる上記の方法は、レシピエントPBMCからFACS精製されたCD4+CD127lo/-CD25+Tregを用いて開始するドナー反応性制御性T細胞の選択的増大に適している。広範な試験は、刺激の8〜10日後に培養物中に残っている事実上すべての生存細胞がドナー反応性であることを示した。これらの細胞を、その後、抗CD3および抗CD28結合ビーズを用いたポリクローナル再刺激によってさらに増大させた。Tregを、以前に記載されたように(Putman et al., Diabetes, 58:652-662, 2009)、CD4+CD127lo/-CD25+細胞表面表現型に基づいて、FACSを用いてPBMCから精製した。ドナーB細胞を、抗CD19 CliniMACSビーズ(Miltenyi社)を用いて精製し、ヒトCD40Lを発現するGMP準拠の放射線照射済みのK562細胞を用いて刺激した。死滅したK540L細胞をフィコール密度勾配遠心分離によってsBcから除去し、精製されたsBcを、放射線照射してから、精製されたTregに添加した。このプロトコルを用いて、最大で約1600倍のTreg増大が達成された。≦10%のTregが完全にHLAミスマッチのドナーに対して反応性であることを考えると、1600倍の全体的な増大は、16日間の培養期間でドナー反応性Tregの≧16,000倍の増加になる。
ドナー反応性TregおよびTreg支持的免疫抑制を用いた肝移植
この実施例では、肝移植(Ltx)レシピエントにおける自己のドナー反応性Treg治療の安全性を評価するための用量漸増臨床試験について記載する。しかし、本開示の方法および組成物はこの状況に限定されない。実際に、本開示の方法および組成物は、移植片対宿主病の治療または予防においてだけでなく、他の固形臓器の同種移植片の文脈においても有用であると期待される。ドナー反応性TregおよびTreg支持的免疫抑制は、心臓、肺、心臓/肺、腎臓、膵臓、腎臓/膵臓、腸および肝臓の同種移植片からなる群より選択されるがこれらに限定されない同種移植片の寛容性を誘導または維持するのに適していると期待される。
以下の結果がデノボLtx成人レシピエントについて評価される:1年間の急性拒絶反応率("Banff schema for grading liver allograft rejection: an international consensus document," Hepatology, 25:658-663, 1997);1年間の慢性拒絶反応率("Liver biopsy interpretation for causes of late liver allograft dysfunction," Hepatology, 44:489-501, 2006);Treg注入3ヶ月後の≧グレード3の感染症率;≧グレード3の創傷合併症率;≧グレード3の貧血、好中球減少症、および/または血小板減少症の率。
以下の結果もまた評価される:ベースラインを超えるTregの割合の増加;ドナー反応性Tregの頻度の増加;ドナー反応性Tregの活性の増加;ならびにPBMCおよび/または肝組織における寛容遺伝子発現プロファイルの検出。
臨床試験には、参加者の安全性を最大限に高めるため、各フェーズの具体的な選択/除外基準を設けた3つのフェーズが含まれる。
患者は、20〜70歳の間で末期肝疾患を有しかつ25以下の算出MELDスコアを有するLtx待機リストから選択される(Kamath et al., Hepatology, 33:464-470, 2001)。このテストにより、具体的には、急性拒絶反応および再発疾患のリスクが高いLtxレシピエントが除外され、かつ肝疾患の重症度ならびに門脈圧亢進症および/または脾機能亢進症が制限される。いくつかの態様では、TregがPBMC中に10個/μlより多く存在している患者のみを選択する。
Ltxレシピエントは、ICUから出ており、かつtx後3日目までにrATG誘導を開始する必要がある。該レシピエントは、CD3カウント数<50個/mm3と定義されるリンパ球枯渇を達成するために、3〜4.5mg/kgのrATGの総用量を受ける。この用量範囲は、免疫抑制を最小にしつつ、十分なデバルキング(Wong et al., Transpl Int, 19:629-635, 2006)を達成するために選択された。rATG投与のタイミングおよび設定は、医学的に不安定なレシピエントにおける過剰な免疫抑制および/またはサイトカイン放出症候群/血液学的毒性の可能性を回避するように選択された。患者はシロリムス(SRL)に基づいた免疫抑制に切り替えるための適格性について評価され、かつLtx後4〜6週の間、適切な腎機能、血液学的パラメータ、創傷治癒、および肝動脈の開存性だけでなく、正常な同種移植片機能を有している必要がある。
Ltxから約10〜12週間後、参加者はドナー反応性Tregを受けるための適合性について評価される。rATG後のT細胞回復の動態に関するデータは、tx後4〜12週の間に安定したT細胞数を示す。したがって、tx後10〜11週でのTreg注入は、デバルキングされた免疫系という状況にある。参加者は、安定したSRLに基づいた免疫抑制という状況のもとで正常な同種移植片機能を有している必要がある。
適格患者は、Treg注入を受けないか、または5000万、2億、および8億個の3用量レベルのドナー反応性Tregの単回注入を受けるかのいずれかである。あるグループから次のグループへの進行は用量制限毒性の発生に基づいている。
免疫学的分析
この実施例では、同種免疫応答に対するTreg支持的免疫抑制とTreg治療の効果を評価するために末梢血および肝臓組織で行われる解析について説明する。Treg支持的免疫抑制を伴ったドナー反応性Treg治療は、ドナー反応性Tregの頻度と抗ドナーT細胞応答性とに対して測定可能な影響を及ぼすことが期待される。また、実施例2に記載された例示的な治療レジメンは、従来の(SOC)免疫抑制療法によって生じるよりも早期に免疫寛容の特徴の発生をもたらすことが期待される。解析には以下の1つまたは複数が含まれる:1)T細胞の機能的なおよび表現型の解析;2)PBMCおよびプロトコル生検サンプルにおける寛容遺伝子発現の特徴;ならびに3)プロトコル生検のサンプルだけでなく正当な理由による生検の組織学的解析。
マルチパラメータフローサイトメトリー(MFC)を用いて、白血球の亜集団をプロファイリングし、ドナー反応性T細胞の頻度を測定し、Tregによるドナー特異的抑制を評価し、ドナー抗原誘発遺伝子およびサイトカイン発現をプロファイリングする。これらのアッセイは全体として、4つの既知の免疫寛容機構 - 消失、偏向、不応答/消耗、および制御- の寄与の評価を可能にする。
このアッセイは、ドナー反応性CD4+ Tconv細胞、CD8+ T細胞、およびTregの頻度を測定するために使用される。移植前/移植、Treg前/SRL切り替え後、Treg注入後1、3、7および28日目、ならびに移植後1年の時点からのバンク保存されたPBMCサンプルを比較する。注入直後のドナー反応性Tregの増加は、特に200〜800×106個のdsRegを受けているコホートにおいて予想される。
このアッセイは、移植前、Treg注入前/SRL切り替え後、Treg注入後1日目および28日目、ならびに肝移植後1年の時点から単離されたTregによる抑制を評価するために使用される。移植前の白血球搬出されたPBMCを、さまざまな時点から単離されたTregと混合してレスポンダーとして使用する。この培養物を、ドナー特異的抑制を評価するために放射線照射済みのドナーPMBCで刺激するか、または非特異的抑制を評価するために抗CD3および抗CD28で刺激する。
MFCは、本発明者らの研究室で開発された抗体のパネルを用いて、末梢血中の白血球サブセットの割合を測定するために使用される。パネルから採取されたサンプルおよび使用されたマーカーを表3-1にまとめた。
移植前、Treg前/SRL切り替え後、Treg注入後1、3、7および28日目、ならびに移植後1年からのCD4+ Tconv細胞とCD8+ T細胞を、ドナーsBcを用いて3.5日間刺激する。移植前、Treg前/SRL切り替え後、Treg注入後1、3、7および28日目の時点で採取されたサンプルは、qPCRアレイを用いてサイトカイン遺伝子発現について、および、42-plex Luminexアッセイを用いて上清へのサイトカイン分泌について、解析される。移植前および移植後1年で採取されたサンプルは、遺伝子アレイを用いて遺伝子発現プロファイルを解析するために使用され、上清中のサイトカインは42-plex Luminexアッセイを用いて解析される。qPCRアッセイを用いて、肝移植患者では、ドナーsBcで刺激された遺伝子発現の変化が観察されると予想される。このアッセイでは、ドナー抗原で刺激された遺伝子発現プロファイルの変化を測定することが可能となる。
末梢血サンプルを、肝移植後の操作上の寛容(operational tolerance)を検出するために現在利用可能である最も有望なバイオマーカーを表す遺伝子のうち以前に同定された限られたサブセットに関して、マイクロアレイを用いて解析する(Martinez-Llordella et al., J Clin Invest, 118:2845-2867, 2008)。
移植前および肝移植後1年で取得されたプロトコル生検サンプルの広範な組織学およびmIHC解析を実施する。組織学的解析では、表3-2に示すように組織の完全性および炎症の程度を判定するための40種の組織病理学的特徴を評価する。
移植における同種抗原反応性のヒト制御性T細胞の臨床グレードの製造および治療上の利点
この実施例では、GMP準拠の試薬を用いて短期培養で何十億個ものヒト同種抗原反応性の制御性T細胞(Treg)を生成することができる製造プロセスを実証する。このプロセスは、同種抗原反応性Tregを選択的に増大させるためにCD40L活性化同種異系B細胞を使用し、続いて収量を高めるためにポリクローナル再刺激を使用する。200〜1600倍に増大したTregは、高度に同種抗原反応性であって、安定したTregの表現型を発現した。同種抗原増大Tregは、インビトロでポリクローナル増大Tregよりも5〜25倍効力があり、かつ皮膚移植のヒト化マウスモデルにおいてインビボで同種移植片の傷害を抑制するのにより効果的であった。
細胞源
正常なドナーを募集し、全血の提供について同意を得た。多数の細胞が必要であった場合には、正常なドナー由来の非特定化されたアフェレーシス産物をUCSF血液センターから取得した。PBMCは、フィコール・パックPLUS密度勾配(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Pittsburgh, PA)を用いて単離され、新鮮なうちに使用されるか、またはCoolCell(登録商標)装置(BioCision社, Mill Valley, CA)を用いてCryoStor CS10凍結用培地(BioLife Solutions社, Bothell, WA)中に冷凍保存した後で使用された。脾臓を、研究の同意を得て死体臓器ドナーから取得した。すべての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のヒューマンリサーチ委員会(Committee on Human Research)およびキングス・カレッジ・ロンドンのガイズ病院(Guy's hospital)により承認された。
ヒトCD40L(NM_000074)、CD64(BC032634)、DRA(BC071659)およびDRB 0401をコードするレンチウイルスベクター33を、以前に記載されたように作製した34。これらのベクターを用いて、KT64-CD40L.HLADR0401細胞株を生成するためにK562細胞を形質導入し、FACSを用いて、以前に記載されたように35、単一細胞クローンを生成した。増大したクローンの安定した発現を、BD Biosciences社(San Jose, CA)からのCD40L、HLA-DRおよびCD64に対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより検証した。
B細胞を、untouchedヒトB細胞濃縮キット(Invitrogen社, Carlsbad, CA)を用いてPBMCまたは脾臓から濃縮した。濃縮B細胞を、前に記載されたように36、ヒトCD40Lを発現する放射線照射(40Gy)済みの3T3またはK562細胞と共に培養した。いくつかの実験では、解離させた脾細胞を、事前のB細胞の濃縮なしに、CD40L発現細胞と共に培養した。CD40L-sBcを放射線照射(30Gy)して、Tregを刺激するために使用した、または使用するまでCryoStor CS10凍結用培地中で冷凍保存した。GMPに準拠した増大の場合は、末梢血B細胞をCliniMACS(Miltenyi Biotech社, ドイツ)上でCD19陽性選択を用いて精製し、10%ヒトAB血清(Valley Biomedical社, Winchester, PA)、GMPグレードのIL-4(Miltenyi社)、およびシクロスポリンA(Teva Pharmaceuticals社, North Wales, PA)を補充したトランスフェリン含有X-VIVO15培地(Lonza社, Walkers ville, MD)中で放射線照射(100Gy)済みのK-CD40L細胞により刺激した。
1.25μMのCFSE(Invitrogen社)で標識したレスポンダーPBMCを、放射線照射済みの同種異系CD40L-sBc(PBMC1個あたり2個のsBc)で刺激するか、または放射線照射済みの同種異系PBMC(レスポンダー1個あたり5個のスティミュレーター)で刺激した。培養物を84〜96時間後に回収し、抗CD3 PerCP(BD社)、抗CD4 PE-Cy7(BD社)、抗CD8 APC-Cy7(BioLegend社, San Diego, CA)、efluor 506 fixable viability dye(eBioscience社, San Diego, CA)で染色した。次に細胞を固定し、FOXP3固定/透過処理用バッファーセット(eBioscience社)を用いて透過処理した後、抗FOXP3-Alexa Fluor 647(eBioscience社)および抗HELIOS PE(BioLegend社)で染色した。フローサイトメトリーをFortessa(BD社)で行い、FACSdiva(BD社)またはFlowJoソフトウェア(Treestar社, Ashland, OR)を用いて解析を行った。
Tregを、CD4+CD127lo/-CD25+の細胞表面表現型に基づいてBD FACSAria II(BD社)を用いて単離し、以前に記載されたように28、Tregのポリクローナル増大を行った。臨床的に準拠したソーティングには、Noel Warner氏(BD社)により生成され、供与されたcGMP mAbを利用した。同種抗原反応性Tregの増大のために、培養物を、1%GlutaMAX(Invitrogen社)、ペニシリン/ストレプトマイシン、および2%ヒトAB血清を補充したOpTmizer T細胞増大培地(Invitrogen社)、または10%ヒトAB血清を補充したX-VIVO15培地中に維持した。FACS精製されたTregとCD40L-sBcとをsBc対Treg比4:1で混合した。培養物を、300IU/mlのヒトIL-2を含有する培地で9または11日目まで維持し、この時点で、新たな放射線照射済みのsBcによりTreg 1個あたりsBc 4個の比率で、または抗CD3/抗CD28被覆ビーズによりビーズ対細胞比1:1で、細胞を再刺激した。培養物を3日後に供給し、再刺激後5日目に回収した。
増大したTregの表現型を、3つのフローサイトメトリーパネルを用いて評価した。第1のパネルは、抗CD8 FITC、抗CD4 PerCP、抗CD3 PE、および抗CD19APCから成っていた。第2のパネルは、抗CD4 PerCP、抗CD62L PE、抗CD27 APC、および抗FOXP3 Alexa Fluor 488(BioLegend社, クローン206D)から成っていた。第3のパネルは、抗CD4 PerCP、抗CD25 APC、抗HELIOS PE(BioLegend社)、および抗FOXP3 Alexa Fluor 488から成っていた。マウスIgG1 Alex Fluor 488およびマウスIgG1 PE(BioLegend社)は、それぞれ、FOXP3およびHELIOS染色を調節するために使用した。染色された細胞をFACSCaliburで解析し、データをFlowJoを用いて解析した。CD40L-sBcは、抗HLA-DR PE、抗CD80 FITC、抗CD86 PerCP-Cy5.5、および抗CD19 APCで染色した後、AccuriC6(BD社)フローサイトメーターで解析した。データをCflow PLUSソフトウェア(BD社)を用いて解析した。特に断りのない限り、すべての抗体はBD Biosciences社製であった。
増大したTregを、1.25μMのCFSEで標識し、同種異系もしくは自己のCD40L-sBcで刺激するか、抗CD3および抗CD28被覆ビーズで刺激するか、または30IU/mlのIL-2を含有する培地中で刺激しないとした。72時間後、細胞を採取して抗CD4 APC(BD社)およびヨウ化プロピジウムで染色し、AccuriC6フローサイトメーターで解析した。
滴定された数の増大TregをV底96ウェルプレート中に3連でTregドナー由来の3×104個のPBMCと混合した。細胞をsBcドナー由来の放射線照射済みPBMCで7日間刺激し、培養の最後の16〜20時間の間の3[H]チミジンの取り込みを用いて増殖を計測した。増大Tregを含まない培養物を対照として使用した。抑制パーセントを以下のように算出した:[1−(Treg含有PBMCの平均cpm/Treg不含PBMCの平均cpm)]×100。
ゲノムDNAは、Epiontis GmbH(ベルリン, ドイツ)からライセンスを受けた試薬を用いて、Epiontis GmbHによって確立されたプロトコルに従って、0.5×106個の増大Tregから単離された37。アッセイを三つ組で実施し、メチル化TSDRの割合を次のように算出した:[非メチル化DNAの平均コピー数/(非メチル化DNAの平均コピー数+メチル化DNAの平均コピー数)]×100。女性ドナーを用いて増大させた培養物では、X染色体の不活性化を補正するために上記の算出からの割合に2を乗じた。
BALB/c.Rag2-/-γc-/-マウス(Charles River社)をキングス・カレッジ・ロンドンのBiological Services Unitにおいて特定病原体除去条件下で飼育し維持した。非特定化されたヒト皮膚を、インフォームドコンセントと倫理的承認を得て、常用の腹部形成術および***縮小形成術を受けた患者から取得した。皮膚を8〜12週齢のBALB/c.Rag2-/-γc-/-マウスに移植し、6週間生着させた後、10×106個のHLAミスマッチCD25枯渇ヒトPBMCを注射した。一部のマウスには、エクスビボ増大させた2×106個のポリクローナルまたは同種抗原反応性Tregを同時注射した。移植片の視覚的および触覚的検査を毎週2回行った。移植片の組織学的解析を、PBMCを注射してから6週間後に行った。これらの実験の全期間中、100μgの精製抗マウスGr1 mAB(Bio X Cell社, West Lebanon, NH)を、マウス顆粒球を枯渇させるために4〜5日毎に腹腔内注射した。すべての手順は、施設のガイドラインと内務省(Home Office)のAnimals Scientific Procedures Act(1986)に従って実施した。ヒト皮膚移植片の凍結切片(6〜8μm)を5%パラホルムアルデヒドで固定し、ヒト抗原ki67(クローン4A1, Abcam社, Cambridge, MA)、CD45(クローンHI30, eBioscience社)、CD3(A0452, Dako社, デンマーク)、FOXP3(クローン259D/C7, eBioscience社)、インボルクリン(involucrin)(クローンSY5, Sigma社)およびCD31(ab28364, Abcam社)に対する抗体で染色し、続いて適切な蛍光色素結合二次抗体とインキュベートして、4-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含むProlong Gold褪色防止試薬(Invitrogen社)で封入した。サンプルは、4〜6の非重複視野を計数することによる蛍光顕微鏡を用いた定量解析に供した。スライドを読み取る人物は処理条件を知らされなかった。
統計解析は、プリズムグラフパッド(Prism GraphPad)ソフトウェアを用いて行った。
CD40L刺激されたB細胞は同種抗原反応性Tregの効力のあるスティミュレーターである
同種異系PBMC、樹状細胞(DC)、新鮮なB細胞、およびCD40L刺激されたB細胞(CD40L-sBcと呼ばれる)は、ヒト同種抗原反応性細胞の増大を選択的に刺激するために以前に使用されている13-16。しかし、Tregを刺激する上でのこれらの細胞サブセットの相対的能力についてはあまり知られていない。一方向混合リンパ球反応(MLR)における放射線照射済みのPBMC、新たに単離されたB細胞、およびCD40L-sBcの相対的効力の比較は、CD40L-sBcが最も効力のあるスティミュレーターであったことを実証した。CD4+およびCD8+ T細胞の増殖をモニターするためのCFSE色素希釈アッセイを用いて、CD40L-sBcによる3.5日間の刺激後に強固な増殖応答が検出され得ることが見出され、放射線照射済みのPBMCを用いて刺激した後では弱い応答が観察されたにすぎなかった(図6A)。CD4+FOXP3+HELIOS+ Tregにさらにゲーティングすることによって、CD40L-sBcは、これらのMLR培養物においてTregの活発な増殖を刺激したことが見出された(図6B)。新たに単離された末梢血B細胞は、以前の報告23と一致して、T細胞の増殖を刺激しなかった。増殖がCD40L-sBc上に発現された同種抗原に応答していたかどうかを判定するために、レスポンダーT細胞に対してさまざまな程度のHLAミスマッチを有する同種異系CD40L-sBcと自己CD40L-sBcの刺激能が比較された。同じ応答性PBMCでは、応答性CD4+通常T細胞(Tconv)およびTregの頻度はHLA-DRミスマッチの数と正に相関し、応答性CD8+ T細胞の頻度はHLA-ABミスマッチの数と正に相関したことが見出された(図6Cおよび6D)。驚くべきことに、応答性Tregの頻度は、CD4+ TconvおよびCD8+ T細胞のそれよりも一貫して高かった。これらの結果は、CD40L-sBcが同種抗原反応性Tregの効力のあるスティミュレーターであることを実証し、かつ、臨床用途のための同種抗原反応性Tregの選択的増大におけるCD40L-sBcの有用性の探究を促した。
臨床用途のためのTregの製造を可能にするため、GMPに適合したヒトCD40L発現細胞株、KT64-CD40L.HLADR0401 (K-CD40Lと略す)を生成した。癌ワクチンのためのビヒクルとして、および臨床応用のための治療用T細胞を製造する際の人工抗原提示細胞として使用されている24-27骨髄性白血病細胞株K562において、レンチウイルス形質導入を用いてCD40Lを発現させた。CD40Lの発現はCD40L-sBcの生成に不可欠である。CD64およびHLADR0401の発現は、抗原特異的およびポリクローナルなT細胞増大を含む他の応用のために該細胞株を使用することを可能にしつつ、CD40L活性を妨害しない。IL-4の一定供給と共に、0日目と7日目にK-CD40L細胞で2回刺激することが、末梢血または脾臓から精製されたB細胞の10〜50倍の増大につながった(図7A)。新たに単離されたB細胞と比較したとき、CD40L-sBcは、同種異系T細胞を刺激する際のそれらの効力増強と一致して、著しく多い量のHLADR、CD80、およびCD86を発現した(図7Bおよび7C)。CD40L-sBc上でのHLA-DR、CD80、およびCD86発現の一貫した増加が見られたが、それらのレベルはドナー間で変動した。しかし、複数のドナーから生成されたCD40L-sBcがMLRおよびTreg増大を誘導することができた。このことは、CD40L-sBcの効力は、閾値が満たされる限り、共刺激分子およびMHCクラスII分子の絶対レベルと厳密には相関していなかったことを示唆している。
CD40L-sBcを用いて同種抗原反応性Tregを最適に刺激するための条件が試験された。蛍光活性化セルソーティング(FACS)で精製されたCD4+CD127lo/-CD25+ Tregの、抗CD3および抗CD28被覆ビーズによる2回刺激(0日目と9日目)を用いるTregのポリクローナル増大プロトコルは、公知である28。同種抗原反応性Tregを増大させるために、同様のプロトコルに従ったが、0日目と9日目の前記ビーズを放射線照射済みのCD40L-sBcに置き換えた。このプロトコルを用いて14日目までに50〜300倍の増大が達成された(図8A)。培養終了時(14日目)、増大したTregは、Treg増大を刺激するために使用したのと同じCD40L-sBcには高度に応答性であったが、自己CD40L-sBcには応答しなかった(図8B)。この結果は、Treg増大を刺激するために使用された、CD40L-sBcにより発現された同種抗原反応性のTregの著しい強化を実証した。実際、一次刺激後9日目までに、TregはすでにCD40L-sBcに対して高度に反応性であって、14日目に観察されたものと同様であった。このことは、再刺激の際に同種反応性についてさらに強化する必要がないかもしれなかったことを示唆している。抗CD3および抗CD28刺激を用いたPolyTregの強固な増大28ならびにビーズに基づいたプロトコルによる標準化および実施の容易さを考えると、再刺激の際のCD40L-sBcを抗CD3および抗CD28被覆ビーズに置き換えることは、同等の増大をもたらす可能性がある。しかし、結果は、sBc再刺激とビーズ再刺激との間で全体的なTreg増大に有意差がないことを示した(図8C)。したがって、一次sBc刺激と、これに続く抗CD3および抗CD28被覆ビーズによるポリクローナル再刺激のプロトコルが採用された。
CD40L-sBcプロトコルを用いて増大させたTregはCD3+CD4+であることが見出され、CD8+ T細胞とCD19+ B細胞の最小限の混入を伴っていた(図9A)。CD4+ T細胞の大多数はFOXP3+HELIOS+であって、かつCD27およびCD62Lを共発現し(図9B)、これは、同様に増大したTconv細胞上の発現パターンと異なっていた(図9B)。最後に、増大したTregは、>80%の脱メチル化Treg特異的な脱メチル化領域を有していた。まとめると、同種異系CD40L-sBcを用いて増大させたTregの表現型は、それらが安定した専門的な(committed)Tregであることを示唆した。
ヒト皮膚同種移植片の同種免疫介在性傷害のモデルを用いて(図11A)13、同種抗原反応性TregおよびPolyTregの保護機能を比較した。BALB/c.Rag2-/-γc-/-マウスにHLA-DR0401+ドナーからのヒト皮膚を移植し、その移植片を6週間治癒させた後で、CD25+細胞を枯渇させた同種異系PBMCを、単独で、または同系Tregの異なる調製物とエフェクター細胞:Treg細胞比5:1で組み合わせて、養子移入した。PBMCドナーはHLA-DR0401-であり、これらのドナーからの同種抗原反応性TregをHLA-DR0401+ CD40L-sBcを用いて増大させた。移植片を拒絶反応まで、またはPBMC再構成後最大6週間までモニターし、この時点で組織学的解析のため移植片を回収した。脾臓におけるヒト白血球生着のレベルは、ヒトPBMCを単独でまたはTregと組み合わせて受けたマウスの3つのグループにおいて類似していた(図11B)。いずれの動物も異種移植片対宿主病の症状を発症せず、これは、安定した体重の維持によって確認された(図11C)。
Claims (8)
- ヒトのドナー反応性制御性T細胞(Treg)を作製するための方法であって、
(a)ヒトドナーのCD19+ B細胞を、放射線照射済みのCD40L+ヒト白血病フィーダー細胞と共に、刺激されたB細胞(sBc)を作製するのに有効な条件下で共培養する段階;
(b)ヒトレシピエントのCD4+、CD25+、CD127-/lo T細胞を該sBcと共に、ヒトのドナー反応性制御性T細胞(Treg)を選択的に増大させるのに有効な条件下で共培養する段階;および
(c)CD4+、Helios+、およびFoxp3+であるドナー反応性Tregを作製するのに有効な条件下で、モノクローナル抗体を用いて、該ドナー反応性TregのCD3およびCD28を架橋することによって、該ドナー反応性Tregを再刺激する段階
を含み、該ドナーがヒトレシピエントに関してHLAミスマッチである、方法。 - HLAミスマッチは、HLA-DRにおけるミスマッチを含む、請求項1記載の方法。
- 段階(b)を開始してから9〜12日後に段階(c)を開始する、請求項1または2記載の方法。
- 前記ドナー反応性TregがCD27+、CD62L+である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 段階(a)の前に、前記ヒトレシピエントから得られた凍結保存末梢血単核細胞(PBMC)から蛍光活性化セルソーティング(FACS)によってCD4+、CD25+、CD127-/lo T細胞を単離する段階をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 段階(a)が、前記B細胞と前記フィーダー細胞とを、インスリン、トランスフェリン、インターロイキン-4およびシクロスポリンAを含む培地中で共培養することを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 段階(b)が、前記sBcが放射線照射された後で、該sBcおよび前記CD4+, CD25+, CD127-/lo T細胞を、インターロイキン-2を含む培地中で共培養することを含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 前記再刺激されたドナー反応性Tregが、段階(b)の開始時の前記CD4+, CD25+, CD127-/lo T細胞よりも200倍〜2000倍多い細胞を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
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