JP6412147B2 - L−スレオニン産生能を有する組み換えエシェリキア属微生物およびこれを用いたl−スレオニンの産生方法 - Google Patents
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Description
大腸菌においてガラクトースパーミアーゼはグルコースパーミアーゼの役割を果たし、コピー数を増加させて発現を増加させると、スレオニン産生能が増加されるという報告(WO2004/087937)を確認するために、L−スレオニン産生菌株である大腸菌KCCM10541にgalP遺伝子のコピー数の増加による組み換え菌株を製作してL−スレオニン産生性を評価した。
大腸菌由来galP遺伝子のオープンリーディングフレーム(open reading frame)を含む1.4kb断片を得るために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いて大腸菌野生型菌株W3110のゲノムDNAを抽出した。
母菌株としてL−スレオニン産生菌株である大腸菌KCCM10541に前記組み換えベクターpCC1BAC−galPを電気穿孔法を用いて取り込んでクロラムフェニコール15μg/mlが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。この方法と同様にして前記組み換えベクターpCL1920−galPをL−スレオニン産生菌株である大腸菌KCCM10541に電気穿孔法を用いて取り込んでスペクチノマイシン50μg/mlが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。
前記(2)において製造された組み換え菌株を下記表1のスレオニン力価培地を用いて三角フラスコにおいて後述する方法と同様にして培養してL−スレオニン産生性を確認した。
(1)大腸菌グルコースパーミアーゼgalPとの相同性の比較
コリネバクテリウムグルタミクムにおいてイノシトールパーミアーゼをコーディングするiolT1、iolT2遺伝子が大腸菌のグルコースパーミアーゼをコーディングするgalP遺伝子とほとんど同じ相同性を有することが報告されてきた。大腸菌由来のgalP遺伝子と相同性を有する遺伝子を野生型コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)のゲノムから見出して比較し、その結果を図1に示す。
配列番号3のiolT1遺伝子のオープンリーディングフレームを含む1.5kb断片を得るために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いてコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)のゲノムDNAを抽出した。
前記(2)において準備したiolT1断片を制限酵素HindIIIで処理した後、同じ制限酵素であるHindIIIで処理された線形pCC1BACベクターとベクター上のlacプロモーターと方向が一致するように結さつした。
配列番号4のiolT2遺伝子のオープンリーディングフレームを含む1.6kb断片を得るために、キアゲン社製のゲノミック−ティップシステムを用いてコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)のゲノムDNAを抽出した。
前記(4)において準備したiolT2断片を制限酵素EcoRIで処理した後、同じ制限酵素であるEcoRIで処理された線形pCC1BACベクターとベクター上のlacプロモーターと方向が一致するように結さつした。
前記(5)において製作されたpCC1BAC−iolT2ベクターを制限酵素HindIIIで処理した後、前記(2)において準備したiolT1断片とベクター上のlacプロモーターと方向が一致するように結さつした。
(1)野生型大腸菌を用いた組み換え菌株の製造
前記実施例1において製造した組み換えベクターpCC1BAC−iolT1、pCC1BAC−iolT2およびpCC1BAC−iolT1−iolT2をそれぞれスレオニンオペロンおよび発現ベクターpBRThrABCR3(Lee KH et al., Molecular Systems Biology (2007) 3:149)を含む野生型大腸菌MG1655に電気穿孔法を用いて取り込んでアンピシリン100μg/mlおよびクロラムフェニコール15μg/mlが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。
前記実施例1において製造した組み換えベクターpCC1BAC−iolT1、pCC1BAC−iolT2およびpCC1BAC−iolT1−iolT2をそれぞれ母菌株としてL−スレオニン産生菌株である大腸菌KCCM10541に電気穿孔法を用いて取り込んでクロラムフェニコール15μg/mlが含まれている固体培地に塗抹して単一コロニーを選別した。
寄託機関名:韓国微生物保存センター(海外)
受託番号:KCCM11370P
受託日:2013年02月05日
寄託機関名:韓国微生物保存センター(海外)
受託番号:KCCM11369P
受託日:2013年02月05日
寄託機関名:韓国微生物保存センター(海外)
受託番号:KCCM11371P
受託日:2013年02月05日
Claims (5)
- コリネ型細菌由来の配列番号1または配列番号2に記載のパーミアーゼを含むように形質転換された、向上したL−スレオニン産生速度を有する組み換えエシェリキア属微生物。
- 前記組み換えエシェリキア属微生物は、大腸菌である、請求項1に記載の向上したL−スレオニン産生速度を有する組み換えエシェリキア属微生物。
- 配列番号1および配列番号2のコリネ型由来のパーミアーゼが両方とも含まれるように形質転換された、請求項1に記載の組み換えエシェリキア属微生物。
- 前記組み換えエシェリキア属微生物が大腸菌である、請求項3に記載の組み換えエシェリキア属微生物。
- 請求項1から請求項3のうちのいずれか一項に記載の微生物を接種して培養するステップと、
前記培養物からL−アミノ酸を分離するステップと、
を含む、L−スレオニンを産生する方法。
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