JP2018529354A - L−トレオニンを生産する組み換え微生物及びそれを用いてl−トレオニンを生産する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
微生物を用いたトレオニン生産方法において、収率を向上させるためにトレオニン生合成遺伝子(例えば、ppc、aspC、thrABC)の強化とともにトレオニン分解経路を遮断する方法が知られている(Kwang−Ho Lee,et al.,Molecular System Biology 2007)。トレオニン分解経路上の遺伝子には、tdh、tdcB、glyA、ilvAなどがあるが、これらの中でilvA(トレオニンデアミナーゼ、Threonine deaminase)が最も主要なトレオニン分解遺伝子として知られている。分解遺伝子のうち、ilvA遺伝子を欠損した場合、トレオニンの収率は大幅に向上するが、高価なイソロイシン(isoleucine)に対する要求性が示されるという問題があるため、一般的にはilvA活性弱化及びイソロイシンに対する高敏感性の変異を適用することが知られている(Akhverdian Valery Z,et al.)。
本出願の他の一つの目的は、前記微生物を用いてトレオニンを生産する方法を提供することにある。
また、本出願で用語、「不活性化」とは、該当酵素をコードする遺伝子の発現が野生菌株に比べて低いレベルに減少するか、全く発現されない場合及び発現されてもその活性がないか、減少されたことを意味する。前記酵素の活性の減少または不活性化は、当業界に知られている任意の方法によって行うことができる。
本出願で用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願で、微生物、例えば、コリネバクテリウム属微生物やエシェリキア属微生物を培養する段階は、当業界に知られている任意の培養条件及び培養方法を用いてもよい。前記方法において、本出願による微生物、例えば、コリネバクテリウム属微生物やエシェリキア属微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。
また、培養培地に適切な前駆体が使用されてもよい。また、前記した原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加されてもよいが、これに限定されるものではない。
トレオニンデアミナーゼ酵素(threonine deaminase、IlvA)の活性が減少または不活性化され、シトラマレートシンターゼ酵素(citramalate synthase)の活性を有する組み換え微生物のトレオニン生産用途を提供する。
以下、実施例を通じて本出願をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本出願を例示するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解釈されない。
1−1.遺伝子導入用プラスミドとヘルパープラスミド(helper plasmid)の製作
野生型大腸菌W3110(寄託番号ATCC9637)からトレオニンを生産するために、mini‐Muトランスポゾンベースのゲノム挿入方法(Akhverdyan VZ,Gak ER et al.,Appl Microbiol Biotechnol.2011)を用いた。mini‐Mu挿入方法を用いるためにpCJ−MuABと命名したヘルパープラスミド(helper plasmid、図1)とpMu−R6Kと命名した導入用プラスミド(integrative plasmid、図2)を製作した。pCJ1‐MuAB、ヘルパープラスミドは、アラビノースによって発現が誘導される(arabinose−inducible)ParaBプロモーターを用いて、トランスポジション因子、MuAとMuBが発現され、感温敏感性レプリコンを含み、容易にプラスミドを除去できるように製作された。pMu−R6K、導入用プラスミドは、mini‐MuユニットであるMu‐attL/Rとの両方の側面にloxP66とloxP71(Oleg Tolmachov,et al.,Biotechnol.2006)を含むcat遺伝子を有する。そしてR6Kレプリコンを有していてpir遺伝子を有してない一般的な大腸菌内では、増殖されない自殺ベクター(suicidal vector)の特徴を有する(Xiao−Xing Wei,Zhen−Yu Shi.et al.,Appl Microbiol Biotechnol.2010)。
前記実施例1−1で製作したプラスミドを用いてトレオニン生合成遺伝子の発現を強化するために、3つの導入用プラスミドを製作した。
前記実施例1−1で製造された導入用pMu−R6KプラスミドをSmaI制限酵素を処理した後、DNAを精製して切断された線形クローニングベクターを用意した。W3110ゲノム DNAを鋳型として、配列番号8及び配列番号9をプライマーとしてPCRし、pntAB遺伝子を増幅した。具体的に、SolGentTM Pfu‐X DNAポリメラーゼ(solgent、DNA)を用いて、変性(denaturation)段階は、94℃で30秒、アニーリング(annealing)段階は、55℃で30秒、延長(extension)段階は、72℃で3分間行い、これを30回行った。
前記実施例1−1で製造した導入用pMu−R6Kプラスミドを、前記1−2−1と同様の方法でpMu−R6KプラスミドをSmaI制限酵素処理した後、DNAを精製して切断された線形クローニングベクターを用意した。W3110ゲノムDNAから配列番号18及び配列番号19をプライマーとしてPCRしてgdhA遺伝子を増幅し、配列番号20及び配列番号21をプライマーとしてPCRしてaspC遺伝子を増幅した。thrO(トレオニンオペロン)はKCCM10541ゲノムDNAから配列番号14及び配列番号15をプライマーとしてPCRしてthrO(トレオニンオペロン)を増幅した。前記に用意されたそれぞれの3種類のDNAとベクターDNAをギブソンアセンブリ方法を介してpMu−R6K_gdhA aspC thrOプラスミドを製作した。
前記実施例1−1で製造した導入用pMu−R6Kプラスミドを、前記1−2−1と同様の方法でpMu−R6KプラスミドをSmaI制限酵素処理した後、DNAを精製して切断された線形クローニングベクターを用意した。W3110ゲノムDNAから配列番号22及び配列番号23をプライマーとしてPCRしてppc遺伝子を増幅し、配列番号24及び配列番号25をプライマーとしてPCRしてaspA遺伝子を増幅した。KCCM10541ゲノムDNAから配列番号26及び配列番号27をプライマーとしてPCRしてthrO(トレオニンオペロン)を増幅した。前記に用意されたそれぞれの3種類のDNAとベクターDNAをギブソンアセンブリ方法を介してpMu−R6K_ppc aspA thrOプラスミドを製作した。
実施例1−1で製作したpCJ−MuABを形質転換したW3110野生型大腸菌を100μg/Lアンピシリン(Ampicillin)と5mMアラビノースが添加されたLB培地を用いて、30℃でOD600 0.6まで培養した後、遠心分離機を介して滅菌蒸留水で1回、10%グリセロール(glycerol)で2回洗浄してコンピテント細胞を製作した(Sambrook and Russell 2001)。用意されたコンピテント細胞に導入用プラスミド、pMu−R6K_pntAB asd aspC−thrOに電気ショック(electroporation)を加え、1mL SOC培地を添加した後、37℃で1時間インキュベーションした。以後、25μg/Lクロラムフェニコール(Chloramphenicol)が含まれたLB平板培地に塗抹した後、クロラムフェニコール耐性菌コロニーを配列番号10と配列番号15でコロニーPCRを行い、pntAB asd aspC thrO遺伝子がゲノム上に導入されたことを確認した。以後、選別菌株でpJW168プラスミドを形質転換した後、0.1mM IPTGが添加されたLB平板培地に塗抹してクロラムフェニコール耐性マーカー(cat)を除去した(Beatri’z Palmeros et al.,2000,Gene)。前記のようなmini‐Mu integration方法で順次的にpMu−R6K_gdhA aspC thrOを導入して、配列番号18と配列番号15にコロニーPCRして導入したかどうかを確認し、pMu‐ppc aspA thrOを導入した後、配列番号22と配列番号27でコロニーPCRして導入したかどうかを確認した。このように製作された野生型大腸菌(W3110)ベースのトレオニン生産菌株をCJT1と命名した。
トレオニン代表分解経路であるilvA遺伝子を欠損させるために、FRT−one−step−PCR deletion方法を用いた(Kirill A,et al.,2000,PNAS)。pKD3ベクターを鋳型に、配列番号28と配列番号29番のプライマーを用いてPCR方法を通じた欠損カセット(deletion cassette)を製作した。SolGentTM Pfu−X DNAポリメラーゼ(solgent、Korea)を用いて、変性(denaturation)段階は、94℃で30秒、アニーリング(annealing)段階は、55℃で30秒、延長(extension)段階は、72℃で3分間行い、これを30回行った。
CJ1プロモーター(特許文献2)が含まれたメタノコッカス・ヤナシイ由来のcimA遺伝子をベースにコドン最適化(codon−optimization)して、PCJ1_cimA、PCJ1_cimA 2.0、PCJ1_cimA 3.7(Atsumi,Liao JC,Appl Environ Microbiol.2008)DNAを製作した。遺伝子合成時の両方の側面にBamHI部位を添加してCopyControl pCC1BAC(BamHI)(Epicentre、USA)にサブクローニングし、最終的にcimA遺伝子を発現するpCC1BAC:PCJ1_cimA、pCC1BAC:PCJ1_cimA 2.0、pCC1BAC:PCJ1_cimA 3.7プラスミドを製作した。そしてKCCM10541‐ilvA、CJT1‐ilvA菌株に前記の3種のプラスミドと対照群(Control)プラスミドであるpCC1BACを電気ショック(2500V)の方法で形質転換して、最終的に実験に使用する菌株を製作した。そして実験の比較のために、前記のような方法でKCCM10541、CJT1の両菌株にpCC1BACを形質転換した菌株も製作した。
前記実施例3で製作した菌株のトレオニン生産量を比較するためにフラスコの評価を行った。フラスコのテストは、それぞれの菌株を25μg/Lクロラムフェニコール(Chloramphenicol)のLBプレートににストリーキング(streaking)して33℃培養器に16時間培養した後、単一コロニー(colony)をLB培地2mLに接種した後、200rpm/33℃培養器で12時間培養した。そして250mLのフラスコに下記表3のトレオニン生産フラスコ培地25mLを入れて、先に培養した培養液を500μLずつ投入した。以後、フラスコを200rpm/33℃培養器で48時間培養した後、HLPCを用いて、それぞれの菌株から得られたトレオニン量を比較し、その結果を下記の表4に示した。
Claims (7)
- トレオニンデアミナーゼ酵素(threonine deaminase,IlvA)の活性が減少または不活性化され、シトラマレートシンターゼ酵素(citramalate synthase)の活性を有する、トレオニンを生産する組み換え微生物。
- 前記トレオニンデアミナーゼが、配列番号7のアミノ酸配列で構成される、請求項1に記載のトレオニンを生産する組み換え微生物。
- 前記シトラマレートシンターゼが、メタノコッカス・ヤナシイ(Methanococcus jannaschii)由来のシトラマレートシンターゼである、請求項1に記載のトレオニンを生産する組み換え微生物。
- 前記シトラマレートシンターゼが、配列番号1、配列番号2及び配列番号3で構成される群から選択されるアミノ酸配列で構成される、請求項1に記載のトレオニンを生産する組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、コリネバクテリウム属微生物またはエシェリキア属微生物である、請求項1に記載のトレオニンを生産する組み換え微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacteriumglutamicum)であり、前記エシェリキア属微生物が、大腸菌(Escherichia coli)である、請求項5に記載のトレオニンを生産する組み換え微生物。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の組み換え微生物を培地で培養する段階、及び前記微生物または培地からトレオニンを回収する段階を含む、トレオニンを生産する方法。
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