JP6410878B2 - アシル補酵素a:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(alcat1)の調節物質およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明の実施形態は、なかんずく、リゾカルジオリピン、詳細にはアシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能および/または活性を調節する組成物に向けられている。詳細にはALCAT1の阻害薬は代謝性疾病、心臓疾患、ミトコンドリア機能不全に伴う一般的な疾病の治療に有用である。新規のALCAT1阻害物質の同定のための検定法が提供される。
ここに使用される語彙は特定の実施形態のためだけであり、本発明を制限するためではない。ここで使用される「1つの」「その」は、そうでないと明示される場合を除き、複数形を包含する。さらに本明細書または請求項で使用される「を含む」「有する」「備える」またはその変化形は、「からなる」と同様に包含する意味である。
スプライスバリアントは参照分子に対し有意の同一性を持ち、しかしmRNAプロセス中のエクソンの交互スプライシングに起因して、通常それより大きなまたは小さな数のポリヌクレオチドを持つ。その対応するポリペプチドは追加の機能ドメインを有するか、またはドメインがない。
種バリアントは種の間で異なるポリヌクレオチド配列である。本発明で特に使用されるバリアントは、野生型遺伝子産物のバリアントである。バリアントは核酸配列における少なくとも1回の置換変異に起因し、変化したmRNAをもたらすかまたは構造または基が変化するか変化しないポリペプチドをもたらす。任意の所定の天然または組換え遺伝子はゼロ、1、または多くの対立遺伝子形態を持ってよい。バリアントを引き起こす一般的な突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然的欠乏、追加、または置換に起因する。これらのタイプの変化のそれぞれは、単独でまたは他と組み合わせて、所定の配列において1回以上発生する。
診断検定法の「無病正診率」は1マイナス偽陽性率である。ここで、「偽陽性」率は陽性反応を示す罹患していない個人の割合と定義される。特定の診断法が状態の決定的な診断を提供しないので、その方法が診断を補助するポジティブな徴候を提供するならば十分である。
「被験者から得られる生体試料」は、後で詳述されるように、被験者から物理的に取り除かれなかったサンプルを選択肢として含む点に留意する必要がある。
腫瘍(例えば、ガン)治療において、治療剤は直接腫瘍細胞の病理を減少させるかもしれないか、他の治療剤(例えば、放射線や化学療法)による処置に対し、腫瘍細胞をより感受性にする可能性がある。したがって、病状、障害または状態の「処置する」または「処置」は、以下を含む:(1)病状、障害または状態に罹患するか、罹患し易い素質を持つが、まだ病状、障害または状態の臨床的または準臨床的兆候を経験または示さないヒトまたは他の哺乳類において発現する病状、障害または状態の臨床的兆候の発現を防止するか、遅らせる;(2)病状、障害または状態を抑制する、すなわち、病気の進展または再発(維持治療の場合)または少なくとも1つの臨床的または準臨床的兆候を停止し、減少させ、または遅らせる;または(3)疾病の軽減、すなわち、病状、障害または状態または少なくとも1つの臨床的または準臨床的兆候の退縮をおこさせる。処置される個人への利益は、統計的に有意であるか、少なくとも患者または医者に認識できるか、のいずれかである。
「予防的に効果的な量」は患者において代謝性疾病または障害の再発または拡大、または発生を防止するのに十分な薬剤の量を意味してもよい、ここで患者には限定されないが、代謝性疾病に罹患し易い患者、例えば遺伝子的に罹患し易い、または以前にアルコールのような環境要因に暴露されていた患者を含む。「予防的に効果的な量」はまた、疾病の防止において予防的利益を提供する予防薬の量を意味してもよい。さらに本発明の薬剤に関する「予防的に効果的な量」は、疾病の防止に予防的利益を提供する薬剤単独の量、または他の薬剤と組み合わせた量を意味してもよい。
好ましい実施形態において、医薬組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つの阻害剤を含む。別の好ましい実施形態において、医薬組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の1つまたはそれ以上の用量濃度の複数の阻害剤を含む。別の好ましい実施形態において、組成物は、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の阻害剤と少なくとも1つの他の治療剤を含む。例えば、第二の治療剤は、特定の兆候を治療するものであってもよい。別の例では、薬剤は、例えば、異常な細胞増殖のような疾患の別の態様を標的とする。この場合、薬剤は、癌患者の治療に使用される化学療法剤であろう。
ALCATlの標的不活化は食事性肥満およびその関連する代謝合併症の発症を防ぐ。
増加した酸化ストレスは心臓の肥大と機能不全に関与していると思われる。酸化ストレスの減衰は、左室のリモデリングと機能障害を防ぐことができる。酸化ストレスは、心筋症および心機能不全の病因に関連付けられてきたミトコンドリアの機能障害およびインスリン抵抗性の主要な原因因子であると考えられている。すべてのリン脂質の中でも、豊富な多価不飽和脂肪酸における含有量とROS産生部位の近くの位置に起因して、CLは反応性酸素種(ROS)によるCLの二重結合の酸化的損傷、それは脂質過酸化反応として知られているが、に非常に敏感である。したがって、CLはアポトーシスの間に早期に酸化を受ける、ミトコンドリアにおける唯一のリン脂質である。CL過酸化の根底にある分子メカニズムは未解明のままであるが、増加したDHAはCLを酸化的損傷に高感度にし、それは脂質過酸化およびミトコンドリア機能障害の悪循環をもたらすことが示されている。その結果、DHA含有量はCL欠乏と同時に高齢者の心臓において増大する。心筋細胞の虚血再灌流障害は、CLの過酸化を引き起こし、それはチトクロームcオキシダーゼ活性の有意な減少につながり、それは外部から追加されたCLによってのみ回復し、他のリン脂質または過酸化CLによっては回復しない。詳細には、ヒトにおける甲状腺機能亢進症の発症は、高レベルの酸化ストレスおよびCLの過酸化と関連し、それは甲状腺機能正常によって軽減することができる。甲状腺機能亢進症はげっ歯類においてCLリモデリングを刺激し、それは多価不飽和脂肪酸と過酸化可能指数の有意な増加をもたらす。
好ましい実施形態では、アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCATl)の調節物質を同定する方法は、試験薬剤と生体試料を接触させるステップと、および生体試料中のマイトフュージン分子の発現、機能または活性を測定するステップとを有する。好ましい実施形態において、試験薬剤が、マイトフュージン分子、例えばMFN2の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増大させる場合、試験薬剤はALCATlの阻害剤として同定される。
別の好ましい実施形態では、ALCATl分子、ALCATl調節物質等は、放射性の標識化をすることができる。用途には、診断および予後目的のための治療およびイメージングが含まれる。標識は、放射性原子、酵素又は発色団基であってもよい。抗体を標識するための方法は、例えば、ハンターとグリーンウッド著、ネイチャー、144:945(1962)およびデビッドら著、生化学13:1014−1021(1974)に記載されている。抗体を標識するためのさらなる方法は、米国特許第3,940,475と3,645,090に記載されている。オリゴヌクレオチドプローブを標識化するための方法は、例えばリアリーら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:4045;レンツとクルツ著、Nucl.Acids Res.(1984)12:3435;リチャードソンとグムポート著、Nucl.Acids Res.(1983)11:6167;スミスら著、Nucl.Acids Res.(1985)13:2399;および Meinkothおよびウォール著、Anal.Biochem.(1984)138:267に記載されている。
薬剤の別の例は、小分子である。 ALCATlの調節物質として、小分子を同定するために、小分子試験化合物は、最初は有機又は無機の化学ライブラリの構成物であってよい。本明細書で使用する「小分子」は、分子量約3,000ダルトンを下回る小さな有機または無機分子を指す。小分子は、天然物またはコンビナトリアルケミストリーライブラリの構成物でもよい。多様な分子の1組が、電荷、芳香族性、水素結合、柔軟性、サイズ、側鎖の長さ、疎水性、及び剛性などのさまざまな機能をカバーするために使用されるべきである。小分子を合成するのに適したコンビナトリアル技術は、当該技術分野で知られており、例えばObrechtとVillalgordo著、小分子重量化合物ライブラリの固体支持コンビナトリアルおよびパラレル合成、ペルガモン・エルゼビア・サイエンス社(1998)で例示され、「スプリットプール」または「パラレル」合成技術、固相および溶液相技術、および符号化技術を含む(Czarnik著、Curr.Opin.Chem.Bio.,1:60(1997)参照)。また、多くの小分子ライブラリは、市販されている。
コンビナトリアルケミストリーの発展は数百、数千の、個別の化合物の迅速かつ経済的な合成を可能にする。これらの化合物は、典型的には、効率的なスクリーニングのために設計された小分子の中規模のライブラリに配置されている。コンビナトリアル法は、新規化合物の同定に適した偏らないライブラリを生成するために使用することができる。また、以前に決定された生物学的活性を持つ単一の親の化合物由来のより小さく、多様性のより少ないライブラリを生成可能である。いずれの場合においても、重要な酵素の阻害剤のような、コンビナトリアル化学により産生される治療的に関連する生物学的分子、を特異的に標的とする効率的なスクリーニングシステムの欠如は、これらのリソースの最適な使用を妨げる。
ライブラリは好ましくは、少なくとも48の多様な化合物、より好ましくは96以上の多様な化合物、さらにより好ましくは384以上の多様な化合物、より好ましくは10,000以上の多様な化合物、好ましくは100,000以上の多様なメンバーであり、最も好ましくは1,000,000以上の多様なメンバー化合物を含む。「多様な」とは、ライブラリ中の50%を超える化合物が、ライブラリの他のメンバーと同一ではない化学構造を有することを意味する。好ましくは、ライブラリ中の75%以上の化合物がコレクションの他のメンバーと同一ではない化学構造を有し、より好ましくは90%、最も好ましくは約99%以上。
製造の詳細な方法は、当業者に公知の多数の技術を用いて得ることができる。例えば、siRNAは、Tuschiら著の米国特許出願公報2002/0086356に記載のショウジョウバエin vitroシステムのような当技術分野で公知の方法を用いて化学合成または組み換えにより生成可能であり、この公報の全体は参照により本明細書に採り入れられる。
本発明に従って、当業者は、mRNAが、翻訳開始コドンおよび停止コドンを含む、三文字遺伝子コードを用いてタンパク質をコードするための情報を伝送するコード領域のみならず、5′非翻訳領域、3′非翻訳領域、5′キャップ領域、イントロン領域および、イントロン/エクソンまたはスプライスジャンクションリボヌクレオチドとして当業者に既知の領域を形成する、関連するリボヌクレオチドを含んでいることを理解するであろう。したがってコードするリボヌクレオチドのみならず、これら関連するリボヌクレオチドを完全にまたは部分的に標的とするオリゴヌクレオチドが本発明に従って製剤化することができる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)またはコード領域内の配列、5′非翻訳領域、または3′非翻訳領域を標的とする。干渉されるべきメッセンジャーRNAの機能は、タンパク質翻訳部位へのRNAの転座、RNAからのタンパク質の実際の翻訳、RNAのスプライシングまたは成熟化、およびRNAが関わる独立した触媒活性も可能性として含む、全ての重要な機能を含む。RNA機能に対するこのような干渉の総合的効果は、タンパク質発現に対する干渉を引き起こすことである。
これらには、任意の合成または天然のペプチド、糖タンパク質、酵素、シグナル伝達の調節物質、転写または翻訳因子複合体、有機または無機分子等の形成の阻害剤、を含むことができる。
ALCAT1および関連分子に結合することができる核酸配列の同定は、それぞれのユニークな核酸が規定された位置に配置されて1つの配列を形成するように、基板表面上に核酸の1つのライブラリを固定化することによって達成することができる。一般に、固定化された核酸のライブラリは、核酸への生体分子の結合に有利な条件下で、生体分子または候補薬剤に曝露される。非特異的に結合する生体分子は、所望の結合特異性のレベルに応じて、軽度からストリンジェントな緩衝液条件を使用して洗い流される。核酸配列は、次いで、どの核酸配列が生体分子に結合しているかを判定するために分析される。好ましくは、生体分子は、結合した核酸の位置の検出に使用するための蛍光タグを有している。
このような検定法には自動化、半自動化検定法およびHTS(ハイスループットスクリーニング)検定法が含まれる。
本明細書に記載の方法によって同定された組成物または薬剤は、任意の適切な製剤においてヒトを含む動物に投与することができる。例えば、タンパク質分解を調節するための組成物は、生理食塩水又は緩衝塩溶液などの薬学的に許容される担体または希釈剤において製剤化することができる。適切な担体および希釈剤は、投与様式および投与経路および標準的薬務に基づいて選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体及び希釈剤および医薬製剤の説明は、レミントンの薬学、この分野の標準的テキスト、およびUSP/NFに記載されている。組成物を安定化および/または保存するために他の物質が組成物に添加されてもよい。
組成物は単独で投与することは可能であるが、医薬製剤として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与に対し、0.001−10重量%、例えば、薬剤の重量に対し1%−2%含んでいてもよい。10%程度を含んでもよいが、好適には5%を超えない、より好ましくは薬剤重量0.1%−1%である。本発明の局所製剤は、活性成分と共に一つまたはそれ以上の許容される担体および、必要に応じて任意の他の治療成分を含む。担体は、製剤の他の成分と両立でき、その受容者に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。
以下の限定されない実施例は本発明の選ばれた実施形態を説明するのに役立つ。比率の変化や組成物の要素の変更は当業者にとって自明であり、それらは本発明の実施形態の範囲内にあることを理解されたい。
本研究はALCAT1が、酸化ストレスに伴うミトコンドリア機能不全を調節する分子メカニズムの理解を深めることを目的としている。プロセスのなかでミトコンドリアの融合およびmtDNAの忠実性の調節における予期せぬALCAT1の役割、それは年齢関連疾病において、MFN2不足およびミトコンドリア***におけるALCAT1の重大な役割を意味する、が確認された。
ALCAT1ノックアウトマウスの生成および酸素消費速度(OCR)の測定は以前に記載されている通りであった(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。全ての実験は適合した年齢と性別の同腹子の対照を使用し、そして動物愛護機関の承認に従い、また国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
本研究に使用される抗体はプロヒビチンおよびカルネキシンに対するモノクローナル抗体を含み、それらはSanta Cruz Biotechnology社(カリフォルニア州サンタクルズ)より購入した。MNF1,MNF2,OPA1に対するモノクローナル抗体はAbcam社より購入した。ロバ抗ラビットおよびロバ抗マウスIgGホースラディッシュペルオキシダーゼ接合抗体はGEヘルスケア(ニュージャージー州、Piscataway)より購入した。ロバ抗ラビットおよびロバ抗マウス フルオレセインイソチオシアネート(FITC)接合抗体はSanta Cruz Biotechnology社より購入した。カルボニルシアニドp−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)、ロテノン、アンチマイシン、オリゴマイシン、およびジフェニレンヨードニウムサルフェート(DPI)はInvitrogenより購入した。
生後4−6週間のオスおよびメスのC57BL/6Jマウスをジャクソン・ラボラトリ(メイン州、Bar Harbor)より購入した。すべての動物には環境的に制御された施設内で、昼行性日照、自由な水へのアクセスのもと、餌は標準的な齧歯動物用食餌(ウィスコンシン州、マジソン、Harland Teklad 2018)か、Research Diets社(ニュージャージー州、New Brunswick;Cat. #D12492)からの高脂肪食餌を与えた。動物に関係する全ての実験は認可された機関の動物飼育に従い、かつ国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
免疫蛍光染色のため、細胞は4%パラホルムアルデヒドで10分間固定され、PBSで2度洗浄され、0.1%トリトンX−100で10分間透過処理された。固定された細胞は5%ウシ血清アルブミンを含むPBS内で室温でプリインキュベートされた。細胞は1次抗体(抗Mycモノクローナル抗体、1:500希釈)で3時間室温で染色され、その後FITC(1:1000希釈、Santa Cruz)と接合した2次抗体でインキュベートされた。ミトコンドリアの染色のため、細胞はミトトラッカーレッド(最終濃度100nM)で5分間37℃のインキュベーター内で染色され、PBSで3度、各洗浄5分で洗浄された。細胞はその後バイポーラー温度制御装置を備える共焦点顕微鏡法(ライカ TCS SP2 AOBS)で分析された。画像はアドビフォトショップ(登録商標)7.0を使用して処理され、そして定量分析がImageJ(国立衛生研究所)を使用して実施された。全ての実験は少なくとも3回行われ、類似の結果を得た。
細胞は4%パラホルムアルデヒドおよび5%グルタルアルデヒドで固定され、2%OsO4と1%酢酸ウラニルで逐次染色され、連続的なエタノール洗浄で脱水され、そして切片作成と分析のためEmbed−812レジンに埋め込まれた。サンプルはJEOL 1200EX 透過型電子顕微鏡を使用して分析された。
mtDNAの単離のため、MEFおよびC2C12細胞がホモジナイズされ、そしてミトコンドリア部分が前述のように(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)単離された。その後ミトコンドリアは0.5%SDSと10mMトリスHCl、0.15M NaCl、および0.005M EDTA内の0.2mg/mlプロテイナーゼKの存在のもとで溶解された。mtDNAはその後フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製された。ランダム変異捕獲検定法が以前に記載したように(Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)実施された。簡単に言うと、mtDNAはTaqIで5時間消化され、その後96穴フォーマット内で希釈され、TaqI制限サイトに変異を含むmtDNAゲノムを検知するためTaqI制限サイトに隣接するプライマーでプローブされた。プライマーの対照ペアが調査されるmtDNAの量を検知するために使用された。PCRがABI STEPONEPLUS(登録商標)および95℃ SYBR(登録商標)GREEN PCR Mster Mixを使用して20μl反応において実施された。量的PCR増幅が以下のプログラムを使用して実施された:ステップ1、95℃で10分;ステップ2、15秒;ステップ3、60℃で1分;ステップ4、ステップ2に40回戻る;ステップ5、65℃から95℃までのメルトカーブ。
ALCAT1またはベクター対照を安定して発現するC1C12細胞が6cm2プレート当たり5x105で播かれ、そしてミトコンドリア標的緑色蛍光タンパク質(mtEGFP)またはミトコンドリア標的dsRED2(mtDsred2)をそれぞれ形質移入された。30時間後、それぞれmtEGFPとmtDsred2を発現する個々の細胞プールは1:1の比率で混合され13mm丸形カバースリップの上に一緒に蒔かれた。融合は6時間後、PBS内の50%(重量/容積)PEG−1500溶液(Sigma)での60秒の処置により誘導され、その後10%ウシ胎児血清(FCS)を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)内で広範に洗浄された。タンパク質合成を阻害するため、シクロヘキシミド(20μg/ml)が融合30分前に添加され、すべてが溶液とその後使用される細胞培養媒体で保存され、その後細胞はPBS内の氷温度の4%フォルムアルデヒドで10分間固定された。PBSで3回洗浄したのちカバースリップはスライドに搭載され、そして暗箱内において4℃で一昼夜保管された。
12.5胎生期のメスのマウスを安楽死させた。胎仔が切除されハンクス液(HBSS)と共に皿にのせられた。頭、手足、および内臓は取り除かれた。残りの胎仔はメスまたは剃刀の刃で分割され、そして4mlのコラゲナーゼ溶液の入った15ml管に送入され、その後4mlで皿を洗浄し全ての胚性部材を得た。管は37℃のインキュベーターの中で全ての組織塊がなくなるまで30−60分回転された。消化された溶液は100ミクロンメッシュで濾過されて冷たいDMEM(30ml)で満たされた50ml管に移された。サンプルは1200rpmで5分間遠心分離され、そして細胞ペレットは再び25mlのDMEMで洗浄された。その後細胞は完全培地で播種された。
酸素消費速度(OCR)がシーホースXF24分析器(Seahorse Bioscience)を使用して既に記載(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)のように測定された。平衡の後、検査薬は酸素センサーカートリッジの試験薬送達室に事前導入され、そしてXF呼吸測定器が基礎酸素消費速度を読んだ後にウェルに注入された。酸素消費速度(pmol/分)が得られた。ベースラインの測定の後、検定媒体中に調製された70μlの試験薬がそれぞれのウェルに注入され、所望の濃度に達した。その後化合物の細胞タンパク質に対する露出を促進するため2分間混合され、そしてOCR測定が実施された。
統計的比較が、2つのC2C12細胞の間およびALCAT1−/−と野生型マウスの差異を測定するため両側非対t検定を使用して行われた。データは平均±SEMで表示され、p<0.05は統計的に有意であるとみなされた。
ALCAT1はリゾカルジオリピン・アシル基転移酵素であって、病理学的にカルジオリピンのリモデリングを触媒し、それは糖尿病および肥満における活性酸素種(ROS)の生成およびミトコンドリア機能不全に繋がる。ROSはミトコンドリア***の原因となり、それは加齢に関連する疾病と考えられてきた。ここではALCAT1の過剰発現の役割が、フラッグタグ付けされたALCAT1cDNA(C2C12−A1)またはベクター対照(C2C12−V)を安定的に形質移入されたC2C12細胞系におけるミトコンドリアおよび小胞体(ER)形態の調節において研究された。C2C12−A1細胞におけるALCAT1のmRNA発現レベルがC2C12−V細胞より3倍だけ大きく(図8)、そして糖尿病または肥満の発症により誘導されたALCAT1発現レベルに適合する。図1A−1Iに示されるように(図1Cで定量化)、ALCAT1過剰発現はミトコンドリア***を引き起こし、それはC2C12−A1細胞における95%超の***したミトコンドリアにより証明される。さらにALCAT1過剰発現は、電子顕微鏡分析で分析されたように、C2C12−A1細胞において短小化したミトコンドリアおよびミトコンドリア膨化をもたらした(図1E、拡大図1G)。さらに、ALCAT1過剰発現はまた、ベクター対照と比較して小胞体拡大をもたらしたが(図1D、拡大図1F)、このことは以前報告されたALCAT1のミトコンドリア関連の膜(MAM)での局在に符合する。
アブノーマルなミトコンドリア形態を前提として、mtDNAコピー数と変異率を調節するALCAT1の役割がRT−PCR分析により研究された。驚くべきことに、ALCAT1過剰発現はC2C12―A1細胞において有意にmtDNAコピー数を枯渇させた(図1H)。さらにALCAT1過剰発現は有意にmtDNA変異率を増大させ(図1I)、このことがミトコンドリア質量とmtDNA安定性の調節におけるALCAT1の主要な役割の証明となった。
ALCAT1ノックアウトマウスを使用してALCAT1欠乏の影響、ミトコンドリア形態、mtDNA質量、およびmtDNA変異率への影響が単離マウス胚性線維芽細胞(MEF)および骨格筋において電子顕微鏡で研究された。C2C12細胞での発見を支持して、ALCAT1欠乏は培養MEFにおいて有意にミトコンドリア密度を増大させた(図2B,拡大図2D)。ALCAT1消失は前脛骨筋縦断面において有意に筋肉繊維の厚みを増大させ、それはそれぞれミオシンフィラメントとアクチンフィラメントを示す拡大図の暗いAバンドと明るいIバンドにより証明されている(図2F)。この結果はALCAT1欠乏がALCAT1ノックアウトマウスにおいて有意に除脂肪質量を増大させたというデータにより指示された。さらにALCAT1消失は有意にmtDNAコピー数を増大させた(図2G)。驚くべきことに、ALCAT1欠乏はまた、有意にmtDNA忠実性を改善した、それはALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおける有意に低い変異率により証明された(図2H)。
MFN2はミトコンドリアおよび小胞体の形態および繋留に機能性ブリッジとして必要である。MFN2−/−マウスからのマウス胎仔由来線維芽細胞(MEF)は***したミトコンドリアおよび拡張した小胞体槽を示し、それらはALCAT1過剰発現に起因する不全に似ている。つぎの疑問はALCAT1過剰発現および欠乏症がMNF2およびミトコンドリア融合プロセスの他の調節因子の発現に相反する影響を与えるかであった。図3Aに示すように、ALCAT1過剰発現はC2C12―A1安定細胞系においてベクター対照に比べて70%超のMFN2 mRNAの枯渇、およびMFN1とOPA1 mRNAの両方の50%の減少を引き起こした。逆にALCAT1欠乏は、ALCAT1ノックアウトマウスの単離MEFにおいて、劇的にMFN2 mRNAの転写と、同時にMFN1 mRNAレベルの有意な増大を示した(図3B)。しかしALCAT1欠乏はミトコンドリア内膜の融合に必要なOPA1のmRNA発現に対し、なにも影響を及ぼさなかった。
ALCAT1がMFN2を枯渇させ、ミトコンドリア***を引き起こすことの発見は、ミトコンドリア融合を調節するALCAT1の役割に関する研究を促進させた。ミトコンドリア マトリックス標的EGFP(mtEGFP)または赤色蛍光タンパク質(mtRFP)が個別にC2C12−A1およびC2C12−V2細胞に形質移入され、その後EGFPとRFPの重複の測定による共焦点顕微鏡を使用した融合分析が行われた。図4A−4Cに示すように、ベクター対照C2C12細胞内のミトコンドリアは正常なミトコンドリア融合を示し、それは図4C(拡大図4D)の統合図において完全な融合を証明する黄色により証明された。対照的にC2C12細胞内のALCAT1過剰発現は重大な融合不全をひき起こし(図4E−4H)、それは図4Gの統合画像(拡大図4H)におけるよく分離した緑色と赤色により証明された。融合不全におけるMFN2欠乏の原因となる役割の直接的サポートとして、C2C12−A1細胞におけるMFN2の一過性発現が融合不全を完全に救済した、それは統合図4K(拡大図4L)における黄色により証明される。MFN2発現はまたミトコンドリアのスーパー融合を引き起こした、それはMFN2を過剰発現するC2C12−A細胞における厚いミトコンドリア管状ネットワーク(図4I−4K)により証明された。
MNF2はALCAT1起因の融合不全を救済できるため、MFN1やOPA1のようなダイナミン関連ファミリーの他のメンバーが、C2C12−A1細胞内にミトコンドリアネットワークを回復することにより、融合不全を救済できるかが疑問となった。上記のように、ALCAT1過剰発現は、ベクター対照(図5A、5B)と比較した場合に、C2C12−A1細胞においてミトコンドリア***を引き起こした(図5C,5D)。対照的にC2C12−A1細胞における一過性MFN1発現はほとんど完全に融合不全を救済した、それは管状ミトコンドリアの回復によって示されている(図5E,5F)。繰り返すが、MFN2の一過性発現は融合不全を完全に救済し、ミトコンドリアのスーパー融合をもたらした(図5G,5H)。
次にC2C12−A1細胞においてMFN2発現がまたミトコンドリア呼吸機能を回復できるかが研究された。ALCAT1はミトコンドリアのプロトン漏出を増大させることによりミトコンドリアの機能不全をひき起こす。プロトン漏出に対するMFN2の役割が、異なるミトコンドリア阻害剤による処置に応答した酸素消費速度(OCR)をC2C12−A1細胞において分析することによって調査された。Seahorse Extracellular Flux(XF−24)分析器を使用して、ALCAT1過剰発現が有意にミトコンドリア最大容量を低下させたことが示され、それはミトコンドリア脱共役剤のFCCPによる処置に応答したOCRの減少により示された(図6A)。MFN2の一過性発現がミトコンドリア呼吸能力を完全に回復し、しかしEGFPベクター対照ではそうではないが、それはベクター対照に比較したOCRの回復により証明された(図6A)。活性酸素種(ROS)生成の主要サイトとしての呼吸鎖複合体Iと符合して、ALCAT1過剰発現は、呼吸鎖複合体I阻害薬(NADH CoQI 還元酵素)ロテノンでの処置に応答して有意にOCRを増大させた、これはミトコンドリアのプロトン漏出の証拠を提供した。MFN2欠乏が酸化ストレスにおいて原因となる役割を果たすことのサポートとして、C2C12−A1細胞においてMNF2の一過性発現が完全にOCRを正常化させた(図6B)。さらにALCAT1過剰発現がまたミトコンドリアのアデノシン三リン酸分解酵素(ATPase)阻害薬のオリゴマイシンでの処置に応答して有意にOCRを増大させた、このことはさらにプロトン漏出を示唆した。不全はまた、MNF2の一過性発現により完全に正常化した(図6D)。対照的に、ALCAT1発現もMFN発現も、呼吸鎖複合体III阻害薬であるアンチマイシンでの処置に応答して複合体IIIからのOCRに何の影響も及ぼさなかった。
酸化ストレスからのミトコンドリア融合不全はミトコンドリア透過性転位孔を開けることによりミトコンドリア膨化を引き起こす。損傷したミトコンドリアはしばしばより多くの活性酸素種(ROS)を生成し、それがさらにミトコンドリア機能不全を悪化させ、悪循環に至る。ALCAT1によるカルジオリピン(CL)リモデリングは酸化ストレスを引き起こすため、ALCAT1がその悪循環のなかである役割を果たすのかが疑問となり、それはALCAT1ノックアウトマウスおよび対照マウスからの単離MEFにおいてテストされた。図7A(拡大図7C)に示すように、対照マウスからのMEFはH2O2での処置に応答して激しいミトコンドリア膨化を示し、それは増大したミトコンドリアと損傷したクリステにより証明された。ALCAT1過剰発現は、ベクター対照に比べて最大のALCAT1発現を示すC2C12安定細胞系の1つにおいて激しいミトコンドリア膨化を引き起こした(図10)。この極端な特性のため、このC2C12細胞系は本発明の研究には使用されなかった。対照的にALCAT1欠乏は、単離MEFにおいてH2O2での処置に応答したミトコンドリア膨化(図7B、拡大図7D)およびミトコンドリア***(図9A−9D)を完全に防止した。
ALCAT1媒介融合欠陥の下流ターゲットとしてのMNF2に符合して、マウスにおける標的化MFN2不活化はALCAT1過剰発現を連想させる多重のミトコンドリア欠陥をひき起こし、それらにはmtDNAの高変異率、mtDNA枯渇、***したミトコンドリア、およびミトコンドリアと小胞体の繋留の重度な遺失を含む。MFN2欠乏はまた骨格筋委縮症を引き起こし、それはALCAT1欠乏がALCAT1ノックアウトマウスにおいて有意に骨格重量を増大させたという発見に符合する(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165;Chen氏他、2010、Cell 141(2):280−289)。ALCAT1の下流ターゲットとしてのMFN2の直接的サポートとして、ALCAT1起因の融合欠陥がMFN1またはMFN2の発現により救済可能であり、しかしOPA1ではそうではない。さらにMFN2の発現はまた、ミトコンドリア呼吸能力を回復し、C2C12細胞においてALCAT1過剰発現に起因するプロトン漏出を阻害した。これらの結果はMFN2欠乏が有意にプロトン漏出を増大させ(Bach D氏他著(2003)J Biol Chem278(19):17190−17197),一方MFN2過剰発現は高血糖症誘発活性酸素種(ROS)生成を阻害する(Yu T,Robotham JL,& Yoon Y(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103(8):2653−2658)という観察と符合した。
甲状腺機能亢進症を患うマウスを酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全の齧歯(げつし)動物モデルとして使用して、本研究は甲状腺機能亢進症に伴う心筋症におけるALCAT1の役割を調査した。その結果は、酸化ストレスおよびマイトファジーを介した甲状腺ホルモン誘発心肥大におけるALCAT1の重要な役割を初めて示した。
本研究に使用された抗体はphospho−AKT(Thr308),AKT,Phopho−S6K1(Thr389),S6K1,phospho−S6(Ser240/244),S6,phospho−4E−BP1(Thr37/46),4E−BP1に対するポリクローナル抗体を含み、それらすべてはCell Signaling Technology社(Danvers,MA)から購入した。抗LC3抗体はNovus Biologicalsより、抗p62抗体はAmerican Research Products Inc(Belmont,MA)から購入した。PINK1ポリクローナル抗体(A01)はAbnova社より購入した。ロバ抗ラビットIgG西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗体はGE Healthcare(Piscataway,NJ)より購入した。L−チロキシン(T4)および3,3‘,5−トリヨード−L−チロニン ナトリウム塩(T3)はSigmaから購入した。
H9c2細胞が安定的にFLAG−タグ付きのALCAT1発現ベクターまたは対照としての空ベクターを形質移入された。安定的な形質移入体はG418(1mg/ml)により選別され、そしてダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Gibco社より)で培養され、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)、1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えられ、95%空気5%CO2中で、温度37℃で維持された。
ALCAT1遺伝子を標的化欠失したマウスが前述のとおり(Li氏他著、Cell Metab 12(2):154−165,2010)生成された。甲状腺機能亢進性心筋症の誘発のため、雄のALCAT1ノックアウトマウスと年齢適合野生型(WT)マウス(年齢8−9週)が2つのグループに分けられた。1つのグループは0.01N NaOHと0.9%NaClの溶媒内の甲状腺ホルモンで2日間または4週間処置された(レボチロキシン、Sigma CAS51−48−9,1mg/kg体重を毎日腹腔内注射により投与)。マウスの対照グループは同一の溶媒を同一の期間注入された。すべての動物には環境的に制御された施設内で、昼行性日照、自由な水へのアクセスのもと、食餌は標準的な齧歯動物用食餌(ウィスコンシン州、マジソン、Harland Teklad 2018)を与えた。動物に関係する全ての実験は認可された機関の動物飼育に従い、かつ国立衛生研究所(NIH)ガイドライン(NIH出版番号86−23、1985)に準拠したプロトコルを使用した。
4週間の甲状腺ホルモン処置の後、マウスはナトリウム・ペントバルビタールの腹腔内注射により軽く麻酔をかけられた(75μg/g体重)。経胸腔心エコー検査が14MHz線形変換器を備えるアキューソンセコイアモデル512心エコーシステムを使用して行われた(シーメンス、Malvern,PA)。以下のパラメータが測定された:拡張期の最後での心室間隔壁の厚み(IVSD)、左心室の拡張終末期寸法(LVEDD)、拡張期の最後での後壁の厚み(LVPWD)。
定量PCR分析が前述の通り(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)実施された。ベクターとALCAT1過剰発現H9c2細胞内のミトコンドリアコピー数の分析が、ミトコンドリアコード化NADH脱水素酵素1(ND1)をmtDNAマーカーとして、そしてシクロフィリンAを遺伝子マーカーとして使用して実施された。H9c2細胞は0.1,0.25,0.5mMのH2O2で2時間事前処理され、その後RT−PCR分析がND1に対するプライマー対(フォワード:5′−TGACCCATAGCCATAATATGATTT−3′(SEQ ID NO:1)とリバース:5′−TTCTACGTTAAACCCTGATACTAA−3′(SEQ ID NO:2))、およびシクロフィリンA(フォワード:5′−ACACGCCATAATGGCACTCC−3′(SEQ ID NO:3)とリバース:5′−CAGTCTTGGCAGTGCAGAT−3′(SEQ ID NO:4))を使用して実施された。バイオマーカーの定量PCR分析が、β−MHCに対するプライマー対(フォワード:5′−AGGGCGACCTCAACGAGAT−3′(SEQ ID NO:5)とリバース:5′−CAGCAGACTCTGGAGGCTCTT−3′(SEQ ID NO:6)),BNP(フォワード:5′−GCTGCTTTGGGCACAAGATAG−3′(SEQ ID NO:7)とリバース:5′−GGAGCTCTTCCTACAACAACTT−3′(SEQ ID NO:8)),ANP(フォワード:5′−GTGTACAGTGCGGTGTCCAA−3′(SEQ ID NO:9)とリバース:5′−ACCTCATCTTCTACCGGATC−3′(SEQ ID NO:10)),ACTA1(フォワード:5′−GTTCGCGCTCTCTCTCCTCA−3′(SEQ ID NO:11)とリバース:5′−GCAACCACAGCACGATTGTC−3′(SEQ ID NO:12)),コラーゲンI(フォワード:5′−GAGCGGAGAGTACTGGATCG−3′(SEQ ID NO:13)とリバース:5′−GTTCGGGCTGATGTACCAGT−3′(SEQ ID NO:14)),コラーゲンIII(フォワード:5′−ACCAAAAGGTGATGCTGGAC−3′(SEQ ID NO:15)とリバース:5′−GACCTCGTGCTCCACTTAGC−3′(SEQ ID NO:16)),およびGAPDH(フォワード:5′−AATGGTGAAGGTCGGTGTG−3′(SEQ ID NO:17)とリバース:5′−GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG−3′(SEQ ID NO:18))を使用して実施された。
心室組織内の脂質過酸化物およびH9c2細胞がTBARSキット(Cayman Chemical Company,Cat No.10009055)をメーカーの指示通り使用してチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)のレベルを測定することにより定量化された。
ミトコンドリアからの細胞内活性酸素種(ROS)生成が定量的に過酸化水素(H2O2)を測定することにより間接的に検知された。
マウス心筋細胞のミトコンドリアの超微細構造が電子顕微鏡写真を使用して評価された。心臓サンプルが各グループの3匹のマウスからの左心室の同じ場所において採取された。左心室の一部は0.05%のCaCl2を含む0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)内の5%グルタルアルデヒドと4%パラホルムアルデヒドで24時間固定された。0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄後、組織は1%OsO4および0.1Mカコジル酸緩衝液内で一晩中、後固定され、脱水され、そしてEmbed812に埋め込まれた。切片は2%酢酸ウラニルで、次に0.4%クエン酸鉛で染色され、Philips 400電子顕微鏡で観察された。
データは平均±SEMで表示された。統計的比較が、2つのH9c2細胞系の間およびALCAT1ノックアウトと野生型マウスとの間の差異を測定するため両側非対t検定を使用して行われた。より多くのグループ間の比較には、一元配置分散分析が使用され、統計的有意性はp<0.05において認められた。
心臓におけるALCAT1発現は酸化ストレスにより、また甲状腺機能亢進心筋症の発症により上方制御(発現増加)される。本願の研究はALCAT1異常発現が心筋症の発症において原因となる役割を果たすことを示している。第一に、H9c2心臓細胞系におけるALCAT1過剰発現の細胞形態およびミトコンドリア機能に対する役割が調査された。そのため安定的にフラッグタグ付きのALCAT1cDNA(ALCAT1)またはベクター対照を形質移入されたH9c2心臓細胞系が生成された。安定的H9c2心臓細胞系におけるALCAT1のmRNA発現レベルはベクター対照に比べて3倍だけしか高くなかった。それは単離された心筋細胞における、内在性ALCAT1の酸化ストレス誘発性の上方制御レベルに似ている(Li J他著(2010)、Cell Metab 12(2):154−165)。これら2つの安定的H9c2細胞系を細胞ベースモデルとして使用し、脂質過酸化およびmtDNAコピー数に対するALCAT1の影響が第一に分析された。図11Aに示すように、ベクター対照に比べて、ALCAT1過剰発現は脂質過酸化の副産物であるチオバルビツール酸反応性物質(TBARS)の細胞内レベルを有意に増加させた。TBARSの生成はH2O2による処置に応答して激化し、このことは心筋症の酸化ストレスにおけるALCAT1の原因となる役割を実証した。
酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全は心筋症に関連付けられてきた。次にノックアウトマウスを使用して甲状腺機能亢進心筋症の発症におけるALCAT1の役割が調査された。急性または慢性甲状腺機能亢進症の、心臓肥大に伴う心機能、ミトコンドリア機能不全および信号経路に対する影響を観察するため、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスが甲状腺ホルモン(T4)で2または28日連続して処置された。心機能は末期慢性処置において実施される心エコー検査により評価された。溶媒グループの中では、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスの間に心臓形態および、心室中隔欠損症(IVSD)、左室拡張末期径(LVEDD)および左室後壁寸法(LVPRWD)を含む心エコー検査パラメータに関して有意の差異は見られなかった。この結果はALCAT1が心臓の成長または通常心機能には必要でないことを証明する(図12A−12E)。しかし、4週間のT4処置後に野生型(WT)マウスに心臓肥大が発生した、これは心臓重量対体重比における明白な増加(図12B)、IVSD(図12C)、LVEDD(図12D)およびLVPWD(図12E)により実証されている。対照的に、ALCAT1欠乏はT4誘発心肥大およびそれに関連する心エコー検査パラメータの変化を防止した。この結果は甲状腺機能亢進症に誘発された心筋症の発症に、上方制御されたALCAT1発現が貢献することを証明する。
心肥大症は、種々の病理学的および病態生理学的な刺激に対する適応性応答としての高分化心筋細胞の増加した寸法により特徴づけられる。ALCAT1の過剰発現がH9c2細胞の肥大型成長を引き起こしたため、次にALCAT1欠乏がT4誘発の心筋細胞の肥大型生長を緩和するか否かが検証された。図13A−13Gに示すように、ALCAT1ノックアウトマウスおよび野生型(WT)マウスの間に甲状腺機能が正常な状態での心筋細胞の大きさに有意の差は見られなかった。肥大生長と合致して、野生型(WT)マウスでは心筋症の発症は有意に心筋細胞の大きさを増加させた(図13B)。対照的に心筋細胞の肥大生長は、ALCAT1ノックアウトマウスでは甲状腺機能亢進症の野生型(WT)マウスと比較した場合有意に減弱された(図13D)。これらの観察結果は心筋細胞の細胞面積(図13E)、直径(図13F)および寸法分布(図13G)の定量分析の結果によりさらに支持された。
心臓肥大の発生は心筋の構造的リモデリングを引き起こし、コラーゲンタイプIおよびタイプIII繊維の過剰蓄積につながる。心室線維症はまた心不全および他の心臓合併症の発症の主要リスク要因である。心筋症の媒介物としてのALCAT1のさらなる証拠を提供するため、左心室内のコラーゲンタイプIおよびタイプIIIの蓄積を調節するALCAT1の役割を検証した。心臓線維症は野生型(WT)およびノックアウト(KO)マウスからの左心室の切片のマッソン3色染色法により分析された。図14Bに示すように、野生型(WT)マウスの甲状腺ホルモンによる28日間処置は、青色染色の広い領域で示されるように、心筋症の結果として、溶媒対照(図14A)と比較して激しい心室線維症を引き起こした。対照的にALCAT1欠乏は有意に甲状腺機能亢進症に起因する線維症を減少させた(図14D)。このことは再度、甲状腺機能亢進症での心不全に対しALCAT1発現の役割を関連付けた。コラーゲン蓄積の発見と合致して、甲状腺機能亢進症は野生型(WT)マウスにおいて有意にコラーゲンタイプIおよびタイプIIIの両方のmRNA発現を増加させたが、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスでは増加させなかった(図14E,14F)。
甲状腺機能亢進症のような病理学的症状に誘発された遷延性肥大症は最終的に心不全に至り、それは工業国では死の主要原因である。増加した脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)は心不全を示す特異的試験である。BNPは心室容積の拡大、圧力過負荷、およびその結果としての心室隔壁応力の増加に応答して心室から特異的に分泌される心臓神経ホルモンである。肥大性心筋症の発症はまた、心房性ナトリウム利尿因子(ANF),β−ミオシン重鎖(β−MHC)および骨格筋アルファアクチン1(ACTA1)を含む胎児遺伝子のサブセットの誘発を伴う。心臓肥大の進行におけるALCAT1の役割を同定するため、心臓肥大および心不全の特徴のRNA発現が分析された。遷延性甲状腺機能亢進症は野生型(WT)マウスにおいて有意に全ての肥大性バイオマーカーのRNA発現を増加させた(図15A−15D)。甲状腺機能亢進症はまたノックアウト(KO)マウスにおいてもバイオマーカーの発現を増加させたが、その影響は対照グループと比べて弱められた。対照的に溶媒で処置された場合は、野生型(WT)マウスとALCAT1ノックアウト(KO)マウスとの間に有意の差は無く、このことはさらに甲状腺機能亢進心筋症の病因論におけるALCAT1の役割を再確認した。
マイトファジーとも呼ばれる選択的ミトコンドリア自己貪食は、損傷したミトコンドリアを消滅させることによりミトコンドリアの品質維持に貢献している。マイトファジーはまた、ミトコンドリアの活性酸素種(ROS)生成およびミトコンドリアDNAの変異を減少させることによりミトコンドリアの量および質の維持に必須の役割を果たしている。従って心臓に特異的な自己貪食の欠乏は心筋症の原因となる。心室断面の顕微鏡分析を使用して、甲状腺機能亢進心筋症に伴うミトコンドリア機能不全および自己貪食におけるALCAT1の役割が検証された。甲状腺機能亢進症における激しい酸化ストレスに合致して、野生型(WT)マウスでは、甲状腺機能亢進心筋症の発症はミトコンドリア膨化、無秩序なクリステ、および異常なミトコンドリア構造を伴った(図16A,拡大図16B)。対照的にこれらのダメージはALCAT1欠乏により大幅に緩和された(図16C,拡大図16D)。損傷されたミトコンドリアへの補償的応答として、野生型(WT)マウスでは、心臓LC3、オートファゴソームマーカー、の発現レベルが甲状腺機能亢進症により有意に上方制御された(図16E,拡大図16F)。さらに、自己貪食と負の相関があるp62タンパク質の発現が野生型(WT)マウスでは有意に低かった。これらの観察結果を支持するものとして、甲状腺機能亢進症の発症に応答した自己貪食ミトコンドリアの数が、野生型(WT)マウスではALCAT1ノックアウト(KO)マウスに比べて有意に高かった(図20)。
甲状腺機能亢進症は心筋細胞においてタンパク質合成を刺激することにより心筋症を引き起こす。肥大型成長におけるALCAT1の役割の基礎となる分子メカニズムを同定するため、ALCAT1の過剰出現と欠乏の、Akt,Erk,S6Kおよび4E−BP1のリン酸化を含む、細胞成長と増殖にかかわる信号伝送経路に対する影響がH9c2細胞において、そして甲状腺機能亢進症のマウスにおいて分析された。増加した活性酸素種(ROS)レベルはインシュリン抵抗性につながり、それは心不全において原因となる役割を果たす。図17Aに示すようにベクター対照において、H9c2細胞のインシュリン処置は用量に依存してAktタンパク質と細胞外シグナル制御キナーゼ(Erk)のリン酸化を刺激した。対照的にALCAT1過剰発現はErkリン酸化の消失と同時にインシュリン刺激Aktリン酸化を有意に減少させ、このことは激しいインシュリン抵抗性の証拠を提供した(図17A)。
さらにALCAT1による慢性酸化ストレスもまたH9c2細胞においてT3−誘発Akt,S6Kおよび4E−BP信号経路の活性化を完全に防止した(図17B)。ALCAT1過剰発現に起因するH9c2細胞の肥大型生長と合致して、S6Kおよび4E−BPの基礎リン酸化はALCAT1発現H9c2細胞において有意に高かった。H9c2細胞における発見のサポートとして、マウスに対する甲状腺ホルモンによる短期処置は、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスと野生型(WT)マウスの両方において、心臓Akt−mTORリン酸化を刺激した(図20)。しかし、慢性甲状腺機能亢進症は心筋症の発症によりAkt−mTOR信号経路の有意な下方制御を引き起こし、それはAktと4E−BPの有意に低いリン酸化により実証された(図17C)。甲状腺機能亢進症もまたGsk3、その欠乏は心筋症を引き起こすが、のリン酸化を下方制御した。心臓肥大の不存在と合致して、ALCAT1不足は、慢性甲状腺機能亢進症により誘発されたこれらシグナルタンパク質のリン酸化の下方制御を完全に防止した。
驚くべきことに、ALCAT1欠乏は劇的にPINK1発現を増加させ、このことはPINK1の酸化ストレスおよび心筋症に対する防御的役割と合致した。これらの発見は、バース症候群においてTLCL欠乏の原因となるTAZ遺伝子を標的欠失されたマウスにおいて、マイトファジーおよび心筋症のレベルが増加したことによりさらにサポートされた。
したがって、ラパマイシン処置はT4−誘発心筋症を防止し、一方マウスにおけるmTORの標的化不活化はアポトーシス、マイトファジーおよびミトコンドリア膨化を特徴とする激しい膨張性心筋症を引き起こす。心筋症での酸化ストレスにおけるALCAT1の役割のさらなるサポートとして、ALCAT1過剰発現H9c2細胞において、そして甲状腺機能亢進症のマウスにおいて、慢性酸化ストレスがAktおよび、GSK−3β、mTORおよびS6キナーゼなどの下流信号要素、のT4−誘発リン酸化を有意に損なった。H9c2細胞におけるALCAT1による酸化ストレスもまた、心筋症において主要な役割を果たす激しいインシュリン抵抗性の原因となった。対照的に、ALCAT1ノックアウト(KO)マウスにおいて、ALCAT1欠失は心筋症の発症を防止し、そしてAkt−mTOR信号経路を回復した。
Claims (1)
- アシル補酵素A:リゾカルジオリピン・アシル基転移酵素1(ALCAT1)の発現、機能または活性の阻害物質を同定する方法であって:
生体試料を試験薬と接触させるステップと;
(a)脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、β−ミオシン重鎖(β−MHC)、心房性ナトリウム利尿因子(ANF),または骨格筋アルファアクチン1(ACTA1)からなる心筋症を示す肥大性マーカーの発現;
(b)PTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の発現、機能または活性;
を測定するステップと、
ここにおいて、ある試験薬が心筋症を示す肥大性マーカーの発現をベースライン対照と比較して減少させる場合、および/またはある試験薬がPTEN誘導推定キナーゼ1(PINK1)の発現、機能または活性をベースライン対照と比較して増加させる場合、当該試験薬がALCAT1の発現、機能または活性の阻害薬として同定され、;
それによりALCAT1の阻害物質を同定するステップと;
を有することを特徴とする方法。
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