JP6396305B2 - 粒子の変形及び分析システム及び方法 - Google Patents

Description

[関連出願のクロスリファレンス]
本出願は、２０１２年１０月２４日に出願した米国暫定特許出願第６１／７１８，０７７号、２０１２年１０月２４日に出願した米国暫定特許出願第６１／７１８，０９２号、２０１２年１０月２６日に出願した米国暫定特許出願第６１／７１９，１７１号の優先権を主張する。優先権は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９に基づいて主張する。上述の特許出願は、この出願に完全に記載されているかのように引用により組み込まれる。

[連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載]
本発明は、全米科学財団による政府支援第１１５０５８８号、及び、ネィビィ／スペース及び海上戦システムコマンドによる第Ｎ６６００１−１１−１−４１２５号によりなされた。政府は、本発明における権利を有する。

本発明は、一般的には、サイトメータの分野に関連し、特に、サイトメータ分野において細胞などの粒子を変形させて分析するシステムに関する。

細胞変形能が異常細胞骨格の変化の有益な指標であり、転移能、細胞周期段階、分化の程度、及び白血球活性化といった、細胞の状態又は特性を決定する無標識バイオマーカを提供する証拠が増えてきている。臨床的には、一定の転移能は、治療法の決定を導くことができ、あるいは一定の分化の度合いは再生療法における未分化の発がん性幹細胞の移植を防止できる。創薬と患者の遺伝体質に合わせた医療を行うために、一定の骨格細胞整合性により一定の骨格細胞作用薬のスクリーニング又は生検サンプル中の骨格細胞薬剤耐性の評価が可能となる。細胞の転移能は更に、様々な細胞株の機械的信号伝達路を理解するうえでの手がかりとなり、細胞生物力学に新しい開発の道を開いている。現在、これらの技術と分析の実現は桁違いの費用がかかると共に多大な労力を要し、このことが臨床及び研究のアプリケーションの実質的な制限要因となっている。細胞変形能技術及び分析の現在のプラットフォームは、限られたスループット、矛盾、サンプルの不均一性による制限された特性評価、速度、労働集約性のうちの一またはそれ以上を含む多大な制限に悩まされている。特に、生物物理学の研究用に最適化されたプラットフォームは、約１分間あたり１細胞の速度で動作しており、これが多大な数の不均一粒子の処理及び分析能力を大きく妨げている。

このように、粒子を変形して分析する新規かつ改良されたシステムと方法を作り出すことが血球計算器の分野で求められている。本発明は、このような新規かつ改良されたシステムと方法を提供するものである。

一実施例では、検体量に担持された複数の粒子を変形させ分析させるシステムが、検体量を受けるように構成された入口と出口を規定する基体と；入口及び出口に流体連通しており、複数の粒子中の一またはそれ以上の粒子を変形させるように構成した変形領域の上流側に位置する送達領域を規定する流体経路であって、検体量の第１の部分を第１フローに送達する第１の枝路と、検体量の第２の部分を第１フローに対向する第２フローに送達する第２の枝路とを具え、第１フローと第２フローの交差部分が変形領域を規定しており、送達領域が第１及び第２の枝路の少なくとも一方と流体連通している流体経路と；複数の粒子中の一またはそれ以上の粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するように構成されたセンサを具え、複数の粒子中の一またはそれ以上の粒子の蛍光性を特徴づける蛍光データセットを生成するように構成された光検出器を具える検出モジュールと；複数の粒子についての形態データセットと蛍光データセットの少なくとも一部に基づいて複数の粒子の分析を出力するように構成したプロセッサと；を具える。

別の実施例では、検体量に担持された複数の粒子を変形させて分析するシステムが記載されており、このシステムは、入口と出口と、これらの間に配置した流体経路を規定する基体と；流体経路中に配置されその下流側で、中央枝、第１の側枝、及び第２の側枝をもつ三分流に連結された集束領域と；中央枝、第１の側枝、第２の側枝の間に形成された交差部分を具える三分流の下流側に配置された変形領域であって、第１の側枝と第２の側枝の中央枝とが中央枝に対してほぼ直交する方向にある変形領域と；複数の粒子中の一またはそれ以上の粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するように構成されたセンサを具え、複数の粒子中の一またはそれ以上の粒子の蛍光性を特徴づける蛍光データセットを生成するように構成された光検出器を具える検出モジュールと；複数の粒子についての形態データセットと蛍光データセットの少なくとも一部に基づいて複数の粒子の分析を出力するように構成したプロセッサと；を具える。

別の実施例では、検体量中に担持された複数の粒子を変形させて分析する方法が記載されており、この方法は、複数の粒子を含む検体量を受け取るステップと；第１フローにおいて検体量の第１の部分を及び第２フローにおいて検体量の第２の部分を、第１フローと逆に方向転換して、第１及び第２フローの交差部分が、変形領域を規定するようにするステップと；複数の粒子を変形領域に送達するステップと；変形領域内の複数の粒子の位置まあはそれ以上の粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するステップと；変形領域内で複数の粒子の一またはそれ以上の粒子の蛍光性を特徴づける蛍光データセットを生成するステップと；複数の粒子の変形データセットと蛍光粒子セットの少なくとも一部に基づいて複数の粒子の分析を出力するステップと；を具える。

別の実施例では、検体量中に担持された複数の粒子を変形させて分析するシステムが記載されており、このシステムは：検体量を受けるように構成した入口と、出口とを規定する基体と；入口と出口に流体連通した流体経路とを具える。流体経路は、入口から複数の粒子を受けて、複数の粒子をランダムな分布から集束状態にするように構成した送達領域と；送達領域の下流側に位置する交差部分を規定して出口に連結された変形領域とを具えており、変形領域が送達領域から複数の粒子を受け取って複数の粒子中の各粒子を単一方向からその交差部分に送るように構成されている変形領域と；変形領域に流体連通されており第１フローを交差部分に送るように構成された第１の枝と；変形領域に流体連通されており第１フローにほぼ対向する第２フローを交差部分に送るように構成された第２の枝であって、第１フローと第２フローが複数の粒子中の一またはそれ以上の粒子のエクステンションを誘発するように構成されている。

別の実施例では、検体量中に担持された複数の粒子を変形させて分析するシステムが記載されており、このシステムは：検体量を受けるように構成した入口と、出口とを規定する基体と；入口と出口に流体連通した流体経路とを具える。流体経路は、入口から複数の粒子を受けて、複数の粒子をランダムな分布から集束状態にするように構成した送達領域と；出口に連結されて、複数の粒子の一またはそれ以上の粒子を受けて変形するように構成された交差部分と；送達領域変形領域の交差部分と第１の枝路と第２の枝路によって流体連通されている三分流と；を具え、送達領域が複数の粒子のほぼすべての粒子を第１フローにおける第１の枝路の中に交差部分に向けるように構成されており、第２の枝路が複数の粒子の粒子を持たない第２フローを伝送するように構成されており、交差部分における第１フローと第２フローが、複数の粒子の一又はそれ以上の粒子の伸長を誘発する。

図１は、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例を示す図である。 図２Ａ及び２Ｂは、粒子を変形させて分析するシステムの一部の実施例を示す図である。 図３Ａ及び３Ｂは、粒子を変形させて分析する実施例の送達領域の変形例を示す図である。 図４Ａ及び４Ｂは、粒子を変形させて分析するシステムの実施例の送達領域の変形例を示す図である。 図５は、粒子を変形させて分析するシステムの実施例の変形領域の変形例を示す図である。 図６Ａ乃至６Ｃは、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例における変形領域の変形例を示す図である。 図７は、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例における流体経路の一例を示す図である。 図８Ａは、粒子を変形させて分析するシステムの流体経路の一例を示す図であり、図８Ｂは、粒子を変形させて分析するシステムの一例における流体経路の別の例を示す図である。 図９Ａは、粒子を変形させて分析するシステムの一実施における変形領域の代替例を示す図、図９Ｂは、図９Ａに示す変形領域を使用した、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例における流体経路の一例を示す図、図９Ｃは、図９Ｂに示す流体経路を様々な枝と入口チャネルに抵抗ラベルを付けて示す図、図９Ｄは、第１の変形領域における軸外絞りを、その後の粒子を対向する流れの交差部分での変形にさらす二次変形領域と組み合わせた流体経路の一実施例を示す図、図９Ｅは、図９Ｄの組み合わせたＨＡ−ＤＣデバイスの単純化した抵抗図、図９Ｆは、サンプルの作成と分析を一体にするためのハイドロピペット吸引を急速慣性溶液交換と組み合わせた流体経路の別の実施例を示す図、図９Ｇは、図９Ｆのデバイスの選択された領域の一連の拡大された画像を示す。 図１０Ａ乃至１０Ｃは、粒子を変形して分析するシステムの実施例における検出モジュールの変形例を示す図である。 図１１Ａ乃至１１Ｃは、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例における検出モジュールの代替の変形例を示す図である。 図１２Ａ乃至１２Ｃは、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例における検出モジュールの代替の変形例を示す図である。 図１３Ａ乃至１３Ｃは、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例を用いて抽出した粒子特性の例を示す図である。 図１４は、粒子を変形させて分析するシステムの一実施例についての同期方法の例を示す図である。 図１５は、粒子を変形させて分析する方法の一実施例のフローチャートである。 図１６は、粒子を変形させて分析する方法の一実施例のフローチャートである。

本発明の実施例の以下の記載は、発明をこの好ましい実施例に限定することを意図するものではなく、むしろフローサイトメータ分野の当業者が本発明を製造し使用できるようにするためのものである。

１．システム
図１に示すように、検体液中に担持された複数の粒子を変形させて分析する一実施例に係るシステム１００が開示されている。ここで使用されているように、用語「粒子」とは、流体フロー内に含まれ得る小さい物体を包含することを意味する。粒子には、細胞や細胞小器官などの生体が含まれる。本実施例によれば、システム１００は、入口１０４と出口１０６を規定する基体１１０と；入口１０４と出口１０６に流体連通しており、変形領域１４０の上流側に位置する送達領域１３０を規定して、変形領域１４０に入る一またはそれ以上の粒子を変形させるように構成した流体経路１２０と；システム１００を通って流れる複数の粒子中に含まれる一またはそれ以上の粒子の変形を特徴づけるデータを生成するように構成されたセンサ１５５と、この複数の粒子中の各粒子の蛍光を特徴づけるデータを生成するように構成された光検出器１６０とを具える検出モジュール１５０と；この一またはそれ以上の粒子の変形と蛍光に基づく分析を行うように構成したプロセッサ１８０と；を具える。

システム１００は、高スループット及び一貫した方法で、単一粒子を特徴づける複数のデータタイプを同時に生成して分析する能力をもって、単一粒子を変形するよう機能する。好ましくは、システム１００は更に、表現型の表面バイオマーカを単一粒子レベルでの機械的特性に直接関連付けるデータを生成できるよう機能する。これによって、生物分子特性と機械的特性とを直接的定量的に比較することができる。好ましくは、システム１００を用いて、細胞などの生物学的粒子を処理して分析し、特別なアプリケーションでは、システム１００を用いて、蛍光アッセイを利用して細胞の変形と生体分子表現型を相関づけることによって、白血球活性化、幹細胞分化、薬物に対する細胞反応、及びがん細胞の悪性度を分析することができる。生体分子表現型を相関づける一方で、生体分子と変形能ベースのデータを組み合わせることで。さらに分類精度を上げることができる。しかしながら、代替的に、システム１００はその他の適切な生物学的粒子又は非生物学的粒子を処理し、変形させ、分析することができる。

１．１ システム−基体
基体１１０は、対象となる粒子を変形させて分析できるプラットフォームを提供するよう機能する。この基体は、好ましくは、対象となる粒子を変形させるマイクロ流体エレメントを具え、システム１００のその他の要素（例えば、ポンプ、検出モジュール、廃液チャンバ）に関連するマイクロ流体要素の適切な構成を規定することによって、変形した対象となる粒子からのデータ生成を容易にする。一変形例では、基体のマイクロ流体エレメントが、基体１１０から検体量を受けて処理済み検体量を伝送する入口１０４と出口１０６を具える。第１の特定例では、図２Ａ及び２Ｂに示すように、基体１１０は、基体１１０の一方の端部の第１面に規定されている単一入口１０４と、基体１１０の反対側端部に規定されている２つの出口１０６を具える。しかしながら、基体１１０のその他の変形例は、エレメントの基体１１０への外付けを容易にする適宜の構成のおいて、その他の適宜のエレメントを具えており、対象となる粒子を含む検体量を変形させ、処理し、分析してもよい。例えば、基体１００は、複数の入口１０４と複数の出口１０６を具えていてもよい。基体１１０の入口１０４と出口１０６は、適宜の端部、適宜の表面、及び／又は基体１１０の適宜の領域内に規定することができる。更に、入口１０４は、適宜の処理用流体（例えば、シース流体、試薬、バッファ、洗浄液、その他）を受けて、サンプルの処理を容易にするように構成できる。

いくつかの変形例では、基体１１０を再使用可能なエレメントとして構成することができ、その他の変形例では、基体１１０を使い捨てエレメントとして構成することができる。基体１１０が再使用可能な変形例では、基体１１０の使用後、基体１１０を基体１１０を洗浄する又は洗い流す（例えば、入口又は出口を通して）モジュールに連結するよう構成することができる。代替的に、再使用可能なこれらの変形例では、基体１１０をセルフクリーニング又はセルフ洗浄する（例えば、表面コーティングを使用して、流体経路の幾何学的形状によって、その他）ように構成することができる。その他の変形例では、基体を、所定の使用回数の間、あるいは故障（例えば、詰まりによる故障）が生じるまで再使用できるようにして、その後、廃棄して交換するように構成することができる。これらの変形例のいずれにおいても、基体１１０はアライナ（例えば、スロット、ピン、ガイド、その他）を具えて、システム１００内での、また、システム１００のその他のエレメントに対する基体１１０のアラインメントを容易にすることができる。基体１１０は、モノリシックな基体であってもよく、あるいは、結合された、又は、互いに固定された複数の層から形成して、基体１１０内に適切なマイクロ流体エレメントを形成するようにしてもよい。

入口１０４は、対象となる複数の粒子を含む検体量を受けて、基体１１０内の粒子の処理と分析を開始するよう機能する。好ましくは、図１に示すように、入口１０４が、検体量とポンプ１１２を具える流体送達モジュールからの複数の粒子を受けるように構成されている。しかしながら、入口は、その他の適宜の方法で検体量を受けるように構成することができる。その他の変形例では、ポンプ１１２が、検体量と複数の粒子を入口１０４に送達するための、検体量と複数の粒子を含むシリンジポンプであってもよく、あるいは正圧と負圧の少なくとも一方を提供するように構成したその他の流体ポンプであってもよい。更に、ポンプ１１２は手動であるいは自動で動作するものでよいが、検体量を入口１０４に調整可能な均一のフローレートで送れるように構成することが好ましい。更に、ポンプ１１２は、検体量を（例えば、基体にしっかりくっついたサンプルから）入口１０４へ送り込むように構成された適宜の管（例えば、チューブ、管、マニフォールド）に連結できるとともに、フローパラメータを制御及び検出できるようにバルブ及び／又は圧力センサを具えていてもよい。一の特別な例では、ポンプ１１２が自動制御されており、粒子の集束させて、所望の粒子変形を達成できる調整可能なフローレートを提供するように構成されている。代替的に、ポンプ１１２は、特定の粒子スループットを達成するように制御できる。更に、別の代替例では、ポンプ１１２を、２００，０００細胞／ｍＬと８百万細胞／ｍＬの間の密度で細胞（すなわち、対象となる粒子）を含む検体量を送達するように構成できる。

生物学的粒子を伴う特定のアプリケーションでは、基体１１０の入口１０４に送達する前に蛍光ベースのアッセイ用に複数の粒子（例えば、細胞）を用意することができる。好ましくは、未知の及び／又は予測できない方法での粒子の変形に影響する固化をなくすアプローチを用いて、複数の粒子を準備する。細胞は、蛍光データとして抽出できる生体分子マーカの認識を容易にする細胞表面たんぱく質あるいはその他のバイオマーカに結合した、少なくとも一の蛍光的にラベル化した生化学プローブ（例えば、ＳＳＥＡ４プローブ、Ｏｃｔ４プローブ、ＴＲＡ−１−６０プローブ、ＣＤ３４プローブ、ＣＤ３８プローブ、ＨＬＡ−ＤＲプローブ、ＣＤ６４プローブ、その他）でラベル化されてることが好ましい。細胞は、更に、細胞透過性ステインで処理を行ない認識を容易にすることができる。しかしながら、複数の粒子を、入口１０４に送達する前に、及び／又はシステム１００のエレメント（例えば、流体経路、その他）を移送する間に、その他の適宜の方法で処理するようにしてもよい。

好ましくは、入口１０４は、流体送達モジュール及び／又はポンプ１１２の周りに密封シールを形成して、検体量が入口１０４から漏れないように構成する。更に、入口１０４は、流体送達モジュール及び／又はポンプ１１２に可逆的に連結するように構成することが好ましい。しかしながら、入口１０４流体送達モジュール及び／又はポンプ１１２にその他の適宜の方法で連結するように構成できる。一の変形例では、入口１０４がねじ付オス−メスカップリングでポンプ１１２に接続して、密封シールを作るように構成されている。別の変形例では、入口１０４が追加であるいは代替的に、密封シールの形成を容易にするように構成されたＯ−リングを具えていてもよい。さらに別の変形例では、入口１０４が追加であるいは代替的に、密封シールの形成のためのその他の適宜のシーラント（例えば、差異シール可能な隔壁、シリコーンシーラント、密封パテ）を具えていてもよい。

出口１０６は、検体量を処理した後、対象となる複数の粒子を含む検体量を基体１１０から移送するよう機能する。好ましくは、出口１０６は、処理済み検体量を基体１１０から廃液として移送するように構成されている。しかしながら、代替的に、出口１０６は処理済み検体量を基体１１０から移送して更なる処理及び分析に移送するように構成することができる。一の変形例では、図２Ａに示すように、出口１０６を、廃液チャンバに連結して出口１０６から廃液流体を受けるように構成できる。この変形例では、廃液チャンバが基体１１０と一体になっており（例えば、一体構造、物理的同延）、出口１０６が廃液流体を基体１１０の廃液チャンバに送達するように構成されている。別の変形例では、出口１０６を、処理済み検体量を別のモジュールに送達する流体導管に連結して更なる処理を行なうように構成されている。入口１０４と同様に、出口１０６は好ましくは連結点（例えば、廃液チャンバ、更なる処理用のモジュール）周囲に密封シールを形成するように構成することが好ましく、出口は、オス−メスねじ付カップリング、Ｏ−リング、隔壁、及び密封シールの生成を容易にするシーラントのうちの一またはそれ以上を具えていてもよい。しかしながら、その他の変形例では、出口１０６は例えば、一またはそれ以上のマイクロ流体導管又はチャネルを用いて、その他の適宜のエレメントへ、その他の適宜の方法で接続するように構成できる。

基体１１０は、好ましくは、自己発光のない光学的に透明な材料でできており、基体１１０からの光学的な干渉がない状態でサンプル粒子特性（例えば、変形特性、機械的特性、蛍光特性）の検出を容易にしている。しかしながら、基体１１０は十分に透明であり、及び／又は、自己発光が十分にない材料でできており、粒子特性を検出することができる。更に、基体１１０は、基体１１０を通過する粒子に向けて光を反射するように構成した構造又はエレメントを具えており、検出モジュール１５０による粒子特性とパラメータの検出を強化するようにしてもよい。更に、基体１１０は、ガラス構造体、ポリマ構造体、又はコンポジット構造体を含めて、マイクロ流体アプリケーション用の適宜の構造を具えていてもよい。一の変形例では、基体１１０は、入口１０４、出口１０６、及び／又は、基体１１０のその他の適宜のエレメントを形成する処理ができるポリマ材料でできていてもよい。本変形例の特定の例では、基体１１０は、ガラスなどの光学的に透明な固体表面上に含まれるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）でできており、入口１０４、出口１０６、及び、米国特許公開第２０１３／０１７７９３５号に記載されているプロセスなどのリソグラフィ処理（例えば、ホトリソグラフィ）で規定したマイクロ流体エレメントを具える。この米国特許公開の名称は、「高スループット細胞変形能測定用方法及びデバイス」であり、引用により全体が本明細書に組み込まれている。本例のその他の変形例では、基体の特徴が追加であるいは代替的に、その他の適宜のプロセス（例えば、マイクロマシーニング、成型、エッチング、３Ｄプリンティング、その他）で規定されている。代替的に、基体１１０は、その他の適宜の材料を含む、あるいはこの材料で構成されていてもよく、その他の適宜の方法で処理を行なって、基体１１０の特徴（例えば、入口、出口、流体経路、その他）を形成してもよい

１．２ システム−流体経路
流体経路１２０は、図１及び２Ａ−２Ｂに示すように、好ましくは基体１１０の入口１０４と出口１０６に流体連通しており、検体量の複数の粒子を集束容易に集束させて変形する。流体経路１２０は、また、入口１０４と出口１０６の間に構成されていることが好ましく、流体経路１２０に沿った圧力差（例えば、ポンプ１１２によって生じる）が、流体経路１２０の少なくとも一部を通る流体フローを容易にしている。好ましくは、流体経路１２０は基体１１０の内部に少なくとも部分的に規定されている（例えば、リソグラフ処理により、エッチングにより、マイクロマシニングにより、３Ｄプリントにより、その他）が、流体経路１２０を部分的に又は完全に、基体１１０の外側に規定することもできる。好ましくは、流体経路１２０は、変形領域１４０の上流側に位置する送達領域１３０を具え、検体量中の複数の粒子が入口１０４から移送され、送達領域１３０内で集束されて、変形領域１４０に送られて変形及び分析を行う。この構成では、送達領域１３０が入口１０４と変形領域１４０の間に挟まれている。

送達領域１３０は、少なくとも複数の粒子のサブセットを、共通の平衡点又はストリームラインに沿って変形領域１４０に集束させて、複数の粒子中の各粒子が実験的に不規則性を制限するやり方で、十分に均一なフローと変形条件を経験するように機能する。更に、送達領域１３０は、好ましくは、ポンプ１１２が提供する条件と共働するように構成されており、複数の粒子がほぼ均一な速度（例えば、粒子サイズに依存する５−１０％の範囲の速度変動で）で単一ファイル内を変形領域１４０へと流れるようにする。代替的に、送達領域１３０及びポンプ１１２は、非単一ファイル内の複数の粒子を、及び／又は適宜の速度プロファイル（例えば、変形可能な速度プロファイル）で、変形領域１４０へ移送するように構成してもよい。好ましくは、送達領域１３０は、慣性集束を提供し、変形領域１４０への複数の粒子の慣性集束を提供するように構成した少なくとも一の湾曲した閉じ込められたチャネル１３２を具えていてもよい。送達領域の第１の変形１３０’では、図３Ａに示す一例で、曲がったチャネル１３２を、例えば、Ｄ．Ｒ．Ｇｏｓｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｃｕｒｖｉｎｇ ｃｏｎｆｉｎｅｄ ｆｌｏｗｓ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８１，８４５９（２００９）で述べられているプロファイルによって特徴づけることができる。この文献は、全体が引用によりこの明細書に組み込まれている。この湾曲チャネル１３２は、対象でも非対象でもよいが、非対象湾曲チャネル１３２が一般的に好ましい。更に、この変形例では、送達領域１３０は、図３Ａに示すように、複数の湾曲した閉じ込めチャネル１３２が直列に示されており、これによって、変形領域１４０への粒子の集束が可能である。送達領域１３０の第１変形例では、湾曲チャネル１３２の構成が、図３Ｂに示すように二つの集束閉円のうちの一方の中に配置した各粒子と共に、単一突出ラインに沿って複数の粒子を集束させている。この実施例は、図３Ｂに示すように二つの集束平面で粒子を集束させているが、両位置における粒子を、比較的低い倍率で作動する単一の検出モジュール１５０を用いて撮像することができる。より高い倍率では、変形分析用に二つの集束平面において画像を抽出する画像処理が必要である。

送達領域の第２の変形例１３０”では、図４Ａ及び４Ｂに示すように、送達領域が、直線的なチャネル１３３を具える。このチャネルは、高さにおいて複数の直列に並べられた狭窄部分１３４が散在しており、フロー方向に対して直交するように配置され、慣性集束と幾何学的に誘発された二次フローによる集束を提供している。第２変形例の直線的チャネル１３３は、好ましくは、低いアスペクト比（幅で割った高さによって規定される）で規定されており、慣性集束アップストリームと高さの狭窄１３４によって生じる一対の局所的ならせん状二次フローの組み合わせが、複数粒子中の各粒子を順次、単位置に集束させる。送達領域のこの変形例１３０”では、有限レイノルズ数（Ｒｅ）で、二つの慣性揚力であるせん断勾配（ＦＳＬ）揚力と、ウォール効果（ＦＷＬ）揚力のバランスによって、直線的チャネル１３３における粒子移動が生じる。粒子伴流と送達領域１３０の壁との間の相互作用によって、チャネル中央線に向けたＦＷＬが生じる一方、放物線速度プロファイルによって、チャネル中央線上でゼロであるところを除いてそのチャネルを通じてチャネル壁に向けてせん断勾配で誘発されたＦＳＬが生じる。ＦＳＬ力及びＦＷＬ力は、このように、しっかり規定された平衡粒子位置に仕向ける（例えば、図４Ｂに示すように、矩形断面を有するチャネル用のチャネル壁の中央線に沿って）。次いで、複数の高さ狭窄１３４が、慣性引き上げ力と競合する横方向の動きを誘発して、図４Ａ及び４Ｂに示すように、複数の高さ狭窄に対向するチャネル壁上の単一粒子位置へ複数の粒子を導く、一対のらせん状二次フローを誘発する。

送達領域１３０の第２の変形例の特別な例では、直線チャネル１３３が幅８４μｍ、高さ４１．５μｍでアスペクト比が約０．５であり、長さ６ｃｍの矩形チャネルである。この例では、送達領域が、高さ方向に３０の狭窄部を有しており、この狭窄部は高さ２１μｍ、長さ４０μｍで、１ｍｍの幅でスペースを空けて配置されている。上述した特定の寸法は、例示的なものであり、このチャネル及び狭窄部についてその他の寸法を使用できると考えるべきである。更に、ここに開示されているように、様々な数の狭窄部（例えば、３０より少ない）を用いて、複数の粒子に集束することができる。高さ狭窄部１３４を入れる前に、アスペクト比によっては、直線チャネル１３３の２乃至４の各壁近傍の中央線に沿って複数の粒子に集束する。次いで、各高さ狭窄部１３４を複数の高さ狭窄部１３４にうまく入れた後、複数粒子の粒子が、強いＦＳＬ力とより弱いＦＷＬ力の間のバランスに基づいて単一平衡位置に向けてずれる。特定の例では、単一平衡位置を規定している単一ストリームへの集束で、複数の粒子が複数の高さ狭窄部１３４のうちの約２５の高さ狭窄部１３４に入ったのち、９９．７７％の集束効率（平衡位置に達する粒子のパーセンテージ）を達成した。高さ狭窄部１３４は下側ベースから上の方へ突出していてもよく、代替的に、上側表面から下側へ突出していてもよい。更に、集束タイトネスは、直径１０μｍの粒子について送達領域において１０．９９５μｍであり、これは、十分に狭い粒子合焦を表している。更に、第２の変形例の特定の例における集束は、Ｒｅ＝８３．３３といったＲｅによって改善され、複数の粒子の中の全粒子が、単一平衡位置で集束され、検出モジュール１５０（例えば、単一焦点深度を規定するモジュール）による測定が容易になる。第２の変形例の代替例では、直線チャネル１３３が、上述した送達領域の第１変形例で述べた曲線チャネルのような曲線チャネル１３２で置き換えられている。曲線チャネル１３２を用いた変形例では、送達領域１３０に使用される総チャネル長さを短くできる。

代替の変形例では、送達領域１３０が、以下の集束タイプのうちのいずれか一つ以上に合うように構成されている。流体力学的集束、シース流体を用いた集束、誘導泳動集束、超音波集束、磁気集束、及びその他の適宜の集束方法。一例では、送達領域１３０は、複数の粒子を流体経路１２０の枝へ共通のストリームラインに沿って導くと同時に、検体量の複数の粒子を含まない部分を流体経路１２０の別の枝路に導くように構成することができる。このように、送達領域１３０を用いて、検体量から複数の粒子を分離して、後続の使用のために検体量の一部を利用することができる。例えば、粒子を含まない検体量の続いての使用は、方向転換した検体量を用いて粒子をスクイーズすることである。これは、例えば、図７の三分流構造に見ることができ、ここでは、二つの枝路１２１’と１２３’が、後に変形領域１４０で使用する粒子を含まない流体を方向転換させる。更に、送達領域１３０は、複数の粒子を流体経路１２０のチャネルの中央線に沿って方向付けるように構成して、検出モジュール１５０による測定を容易にすることが好ましい。しかしながら、送達領域１３０は、追加で又は代替的に、流体経路１２０のチャネルの適宜な部分に沿って、あるいは流体経路１２０の枝に沿って複数の粒子を方向づけて、複数の粒子を特定の領域に方向づけて処理するようにしてもよい。

図５に示すように、一実施例によれば、変形領域１４０は、複数の粒子の内の一またはそれ以上を、対向流を用いて変形させるよう機能する。この実施例では、変形領域１４０が対向流の交差部分に形成されており、これによって、対向流の交差部分に入る粒子は速度が低下して、逆流によって一方の軸に沿って圧縮され、及び他方の軸に沿って各粒子が延びる。しかしながら、変形領域の代替の変形例は、その他の適切な機構を用いて複数の粒子を機械的に変形させることができる。図５に示す実施例では、対向流が実質的に同軸上に整列しており、互いに非並行に流れている。しかしながら、対向流は、整列しなくてもよく、及び／又は非並行方向に流れなくてもよい。図５に示す実施例では、粒子が延長領域１４０の一方の側からのみ入る。好ましくは、対向流中の第１フローと第２フローは、検体量から生じ（すなわち、自己シース法で）、検体量の第１部分を用いて第１フローを作り、検体量の第２部分を用いて第１フローと逆の第２フローを作る。これは、分化及び／又は集束するように構成された流体経路１２０の枝（例えば、二分流、三分流）で達成される。これは、例えば、図１，２Ａ、７、８Ａ、８Ｂ、９Ｂ、９Ｃ及び９Ｄに示す実施例に見られる。

好ましくは、変形領域１４０は、ポンプ及び送達領域１４０によって提供されるフロー状態と共動して、同じ機械的特性を持ち、飽和測定の結果ではない複数の粒子を横切るほぼ均一な適切な量の変形を作る。例えば、ポンプによって生じた低い流速は、変形領域１４０で非均一変形となり、ポンプによって生じた高い流速は、撮像窓を超えて変形する粒子及び／又は粒子溶解となり、飽和測定を引き起こす。変形領域１４０における複数粒子を変形させる流速は、流体経路１２０の少なくとも一部（例えば、枝、送達領域、変形領域）の断面寸法（例えば、直径、幅）に関連していることが好ましく、より大きな断面には高い流速が求められる。一の変形例では、ポンプによって提供されるフロー条件は、少なくとも部分的に断面寸法に従属している、チャネル抵抗（例えば、フロー枝間の抵抗比）の分析に基づいて管理することができる。この変形例の一例では、図６Ａ乃至６Ｃに示すように、対向流中の第１フローと第２フローが、適切な対向流プロファイルを作る抵抗比を持つ一方、第１フローと第２フローの一方内に十分な数の粒子‘例えば、複数粒子の９５％）を維持するように設計されている。例えば、図６Ａに関しては、第１フローが複数粒子のほぼすべてを含んでおり、対向する流れにはほぼ粒子を含まない。別の例では、対向流中の第１フローと第２フローが、合致したあるいは非合致した抵抗を有しており、複数の粒子の各粒子の所望の変形を作ることができる。例えば、図６Ｂを参照すると、Ｒ_{ｏｕｔｌｅｔ２}の抵抗は、Ｒ_{ｏｕｔｌｅｔ１}の抵抗より大きく、より高いパーセンテージの粒子が、Ｒ_{ｏｕｔｌｅｔ１}を介して変形領域１４０から出て行く。

一実施例では、変形領域１４０が、片影領域１４０に入る逆流中の一のフローのみから複数の粒子を受けて、第１のフローが集束した複数の粒子（すなわち、送達領域１３０から）を提供し、少なくとも一のその他のフローが交差部分において第１のフローと対向し、変形領域１４０を作る。複数の粒子は、従って、単一方向から変形領域１４０に入るように構成される。この単一方向の設計態様は、蛍光検出と共に使用する場合に重要である。なぜなら、蛍光測定を、粒子が入る速度がほぼ均一である変形領域１４０の下流側の単一位置で行うことができるからである。しかしながら、複数の粒子は代替的に、逆流の複数フローに分割して、少なくとも二つの方向から逆流の交差部分（すなわち、変形領域１４０）に入るように構成することもできる。複数の粒子が複数のフローに分割される変形例では、複数のフローの各々が送達領域１３０を具え、変形を行う前に共通のストリームラインに沿って粒子を集束させることが好ましい。しかしながら、複数のフローのどの部分でもその他の変形例では送達領域１３０を除くことができる。

一変形例では、流体経路１２０が、第１フロー中の検体量の第１部分と第２フロー中の検体流の第２部分とを送達するように構成した第１枝路とを具え、検体量を、複数粒子を集束させて変形するよう共働する少なくとも二つのフローに分割している。この変形例の第１の例では、図７に示すように、流体経路１２０’は、検体量を第１フロー中の第１の枝路１２１’と、第２フロー中の第２の枝路１２２’と、第３フロー中の第３の枝路１２３’に分ける三分流１２５’を具える。第１例では、送達領域１３０’が、複数の粒子のほぼすべてを三分流の第２の枝路１２２’に集束させるように、三分流１２５’の第１の枝路１２１’、第２の枝路１２２’、及び第３の枝路１２３’に連結されている。更に、第１例では、第１フロー及び第３フローは、複数の粒子中の粒子を実質的に欠いており、第１及び第３の枝路１２１’、１２３’は、第１フローと第３フローをそれぞれ、第２枝路１２２’の第２フローに対向する方向（図７に矢印で示す）に向けるように構成されている。第１例では、第１、第２及び第３のフローの対向するポイントにおける交差部分が、複数の粒子を変形させる変形領域１４０を形成している。更に、第１例では、変形領域１４０が、第１出口１０６と第２出口１０６’に連結するように構成されており、基体１１０の外に処理したサンプル流体を伝送するようにしている。第１例の変形例では、送達領域１３０’を複数の粒子を、第１、第２、及び第３の枝路１２１’、１２２’、１２３’のうちの位置またはそれ以上に迂回させるように構成してもよく、流体経路１２０’は、適宜の数の入口１０４及び出口１０６に連結して、検体量（又はその他の流体）を受けるとともに、基体１１０から流体を伝送する。

図６Ｃは、図７の三分流の実施例の流体抵抗を示す図である。Ｒ１は、第２の枝路１２２’の流体抵抗である。Ｒ２は、変形領域１４０に入るリターンシースフロー中の流体抵抗である。Ｒ３は、第１及び第３の枝路１２１’と１２３’の流体抵抗である。この実施例では、設計事項として、Ｒ１＝Ｒ３／２＋Ｒ２である。

別の実施例では、図８Ａに示すように、流体経路１２０”は、検体量を第１のフロー中の第１枝路１２１”と、第２のフロー中の第２枝路１２２”に分ける二分流１２４”を具えており、第１のフローと第２のフローは、各々検体量の複数の粒子サブセットを含む。第２の例では、送達領域１３０”が二分流１２４”の下流で第１枝路１２１”に連結されており、第２の送達領域１３１”が二分流１２４”の下流で第２の枝路１２２”に連結されて、複数の粒子サブセットが、送達領域１３０”と第２の枝路１２２”内で集束されている。更に、第２の例では、第１枝路１２１”と第２枝路１２２”が、第１のフローと第２のフローを、それぞれ、送達領域１３０”と１３１”の下流の反対方向に向けるように構成されており、第１フローと第２のフローの交差部分が変形領域１４０”を規定するようにしている。第２の例の変形領域１４０”は、第１出口１０６と第２出口１０６’に連結するように構成されて、基体１１０の外に処理したサンプル流体を伝送するようにしている。一代替例では、流体経路１２０”を検体量の第１部分を複数粒子のほぼ全粒子と共に、第１枝路１２１”へ迂回させて（例えば、慣性集束によって、複数入口を使用して）、第２枝路１２２”が第２のフロー中の複数粒子のいずれの粒子も受け取らないように、あるいはその逆にできる。第２の例のこの変形例では、第２送達領域１３１”をなくして、第１枝路を、複数の粒子を第１及び第２枝路１２１”、１２２”の交差部分に形成した変形領域１４０”に集束させるように構成できる。第２例のこの変形例では、複数の粒子がこのように、単一方向から変形領域１４０に入るように構成される。

図８Ｂは、上述した代替の実施例を示す図であり、複数の粒子の内のほぼすべての粒子が第１枝路１２１’’’に迂回する一方で、第２枝路１２２’’’には実質的に粒子がない。この例では、二分流１２４’’’が、上流側集束領域１２７の曲線部分から始まっており、これによって粒子が好ましいことに、第１枝路１２１’’’に分岐される流体ストリームラインに沿って整列する。粒子は、次いで、変形領域１４０’’’のすぐ上流側に位置する撮像領域１２９に入る前に送達領域１３０’’’を通過する。粒子は、一方の又は両方の出口１０６”、１０６’’’を介して変形領域１４０’’’が残る。フィルタ１９０が、集束領域１２７の上流側に連結されて示されている。

更に、代替の変形例では、複数の粒子中の各粒子を、粒子を含むフローの支配的方向に斜めに延びる方向成分を持つ逆流によって変形することができる。これらの代替の変形例では、少なくとも一の逆流が、検体量のいずれかの部分を使用して又は使用することなく（例えば、逆流を発生するために注入した又は組み上げた外部フローによって）発生する。代替の変形例では、複数の粒子の少なくとも一部に同軸に整列しているが、非並行である逆流が、入口から搬送される外部フローによって発生する。別の代替変形例では、複数粒子の少なくとも一部を含むフローと同軸に整列していない方向に少なくとも一の逆流が生じ、この逆流が粒子を含むフローの支配的方向に斜めに延びる方向成分を持つ。この代替変形例では、逆流が、粒子を含むフローの支配的方向にほぼ直交していることが好ましいが、逆流は代替的に粒子を含むフローに対して非直交であり、非並行であってもよい。

代替の変形例の一例では、図９Ａに示すように、複数の粒子を含む第１フローが、上述の送達領域１３０の一実施例で集束した後、中央枝路チャネル１２２”を介して第１の方向に沿って変形領域１４０に入るように構成されている。変形領域１４０における第１入口１３５と第２入口１３５’は、第１の逆流と、第１の逆流に対して非並行（すなわち、軸外）である第２の逆流を提供するように構成されている。一実施例では、第１の逆流と第２の逆流が両方とも、複数の粒子を含む第１フローにほぼ直交している。第１の逆流と第２の逆流は、この例では、等しくかつ対向しているが、第１の逆流と第２の逆流は、本例の変形例において、代替的に、等しくなく、及び／又は対向していなくともよい。更に、第１の入口１３５と第２の入口１３５’は、別の代替実施例では、複数の粒子を含む第１フローの軸にほぼ直交しているように記載されているが、第１の入口１３５と第２の入口１３５’は、第１フローの軸にほぼ直交しない軸外態様で、変形領域１４０において交差してもよい。

図９Ａに示す一実施例では、第１の入口１３５と第２の入口１３５’に入る流体が、図９Ｂに示すように集束した粒子を含む上流側チャネルから吸い上げられる。粒子は集束によってチャネルの中央に整列しているので、主流から再度ストリームが吸い上げられ、一方で、集束した粒子を中央枝路チャネル１２２”に残す。この特定の実施例は、ハイドロピペット吸引（ｈｙｄｒｏｐｉｐｅｔｔｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ；ＨＡ）と呼ばれる。枝路チャネル１３５、１３５’は、実質的に戻って変形領域１４０にピンチフローを与える。次いで、細胞を含まない（いくつかの実施例において）「シース」流体粒子を再度加えることによって、粒子が変形される。細胞が正面フローにさらされ、急激に遅くなって横断方向に加速される変形能血球計算（ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ＤＣ）と対照的に、ＨＡデバイス及び方法では、より高い粒子スループットを達成できる。例えば、本設計を用いることによって、ＤＣ設計を用いて達成される訳２，０００細胞／秒のスループットに比べて、６５，０００細胞／秒のスループットが達成された。

図９Ｂは、図９Ａに示す軸外構造を利用した流体経路の一例を示す図である。図９Ｂに示すように、複数粒子を含む流体は、まずフィルタ１９０を通過する。フィルタ１９０の出口は、ここに示すように送達領域１３０に連結されており、複数の粒子を、流体経路中のポイントｃの差し込み図に見られるように共通の軸に沿って、実質的に集束させている。次いで、粒子は三分流１２５”に入る。粒子は、中央枝路チャネル１２２”に沿って連続する一方で、ほぼ粒子を含まない流体の一部が、変形領域１４０において中央枝路チャネル１２２”と再度組み合わさる入口１３５、１３５’にそれて、図に示すように粒子を絞り変形させる。この粒子は、同じ方向で出口１０６に続く。

更に、第１の逆流と第２の逆流は、検体量の一部を（例えば、変形領域における三分流又は二分流へ）吸い上げることによって、又は検体量から作られないフロー（例えば、注入されたシースフロー）によって、検体量から作ることができる。この例では、従って、粒子が流れる方向にほぼ直交する方向に粒子が圧縮され、粒子が流れる方向に沿って延びる。本例における構成では、粒子は変形領域１４０に入ったときに、減速（例えば、速度を落とす又は停止する）せず、複数の粒子中の多数粒子が変形量１４０に同時に入ることができるので、システム１００のスループットが改善される。更に、複数の粒子の粒子を変形させるのに使用する力の可変範囲は、第１の逆流と第２の逆流によって生じ、第１フロー、第１逆流、及び第２の逆流の内の一又はそれ以上のフローパラメータを変えることによって、生じる。粒子を変形させるのに使用する小さな力は、特に、固有の粒子特性及び／又はより小さな粒子（例えば、粒径＜１０μｍ）の特性を証明するのに用いることができ、メンブレイン弾性、粒子の弛緩挙動、及び、大きい変形力で試す異なるその他の粒子特性に目を向けることができる。

更なる変形例では、送達領域１３０及び変形領域１４０は、適宜の数の枝路を用いて適宜の方法で、複数の粒子を集束させ複数の粒子を変形できるように構成できる。例えば、流体経路１２０の変形例は、変形領域１４０の上流側と下流側に構成した複数の送達領域１３０を具え、複数の粒子が変形の前後に集束するようにしている。その他の例では、複数枝路（例えば、２又はそれ以上の枝路）を形成して、変形領域１４０に集めるようにして、代替の変形モードを提供することができる。更なる例では、複数の粒子が、複数の粒子を搬送しているフロー方向に直交するフローから変形を提供するように構成した第１の変形領域１４０に入るように構成し、次いで、複数の粒子を搬送しているフローに非平行なフローから変形力を提供するように構成した第２の変形領域１４０’にほぼ入るように構成することができる。加えてあるいは代替的に、複数の粒子を積極的に保存するか、あるいは特定の出口１０６に向ける（チャンネル抵抗に基づいて、例えば、集束により、フローの迂回により）ことができる。この例では、追加の送達領域１３０内の均一なフロー条件及び／又は変形領域１４０下流の積極的保存により可能であるように、複数の粒子を更に処理することができる。

図９Ｃは、図９Ｂの流体経路を、中央枝路チャネル１２２”にラベルを付した抵抗と、一設計に基づく変形領域１４０の入口１３５、１３５’と共に示す図である。図９Ｃに示すように、Ｒ２＝１．７^＊Ｒ１である。これは、中央枝路チャネル１２２を”伝わって流れる画分の低下を引き起こすが、有効な慣性集束のために十分なレイノルド数が得られる。外側の枝路は、抵抗が低くより高い流速と速度となる。これによって、フローが変形領域１４０を通過するので、より大きなねじれフローが可能となる。

図９Ｄは、第１の変形領域１４０における軸外ねじりをその後の第２の変形領域１４０’と組み合わせた流体経路を示す図であり、ここでは、粒子が対向するフローの交差部分において変形する。この実施例では、複数の粒子を含む流体がまずフィルタ１９０を通過する。フィルタ１９０の出口は、ここに述べたように、共通軸に沿って複数の粒子を実質的に集束させるのに用いられる送達領域１３０に連結されている。この粒子は、次いで、５つの枝路チャネル１４１、１４１’、１４１’’、１４１’’’、１４１’’’’の結合箇所１２５’’’に入る。中央枝路チャネル１４１は、実質的にすべての粒子を含む。外側枝路チャネル１４１’、１４１’’、１４１’’’、１４１’’’’は、ほぼ粒子がなく、結合箇所１２５’’’からそれた龍倍部分を含む。内側枝路１４１’、１４１’’’は、軸外の態様で中央枝路チャネル１４１と再結合しており、第１の変形領域１４０において粒子を絞る。粒子は、枝路チャネル１４１’’、１４１’’’’からの流体が中央枝路チャネル１４１と再結合し、対向するフロー中で交差する第２の変形領域１４０’に流れる。この第２の変形領域１４０’を通過する粒子は、次いで、一方又は両方の出口１０６’、１０６’’を介して流体経路を出る。

図９Ｅは、図９Ｄに示す粒子の軸外ひねり（ヒドロピペット吸引又はＨＡ）を、変形サイトメトリ（ＤＣ）と共に用いた、組み合わせた設計の単純化した抵抗ダイアグラムを示す図である。抵抗の調整を行って、延長フロー（ＲＤＣ及びＲＨＡ）を作るチャンネルの
二本の枝路を同じフローが通るようにする。
この実施例では、

である。

図９Ｆは、ヒドロピペット吸引を急速慣性溶液交換と組み合わせて、サンプル作成と分析を一体化した流体経路の別の実施例を示す図である。図９Ｆの実施例では、複数の流体を含む溶液が入口１０４に送達され、ついで、フィルタ１９０を通過する。フィルタ１９０の出口は、二分流１４２で終端しており、次いで、非並行、軸外連結部Ｊにおいて、洗浄液入口１０４’に流体連通して連結された中央チャネル１４３と再結合している。図９Ｆに見られるように、フィルタ１９０’は、洗浄液入口１０４’と中央チャネル１４３との間に配置されている。中央チャネル１４３は、もう一つの三分流１４４につながっており、第１の枝路チャネル１４５、第２の枝路チャネル１４６、及び中央チャネル１４３の連続部分となり、これらがここで述べたような集束又は送達領域を具えている。第１及び第２の枝路チャネル１４５、１４６は、中央チャネル１４３内の流体フローの一部を吸い上げるように構成されている。図９Ｆの実施例では、第１及び第２の枝路チャネル１４５、１４６が、出口１０６に流体連通した廃液チャネルとして作動する。変形領域１４０は、中央チャネル１４３、並びに第１及び第２のサイドチャネル１４７、１４８の交差部分によって三分流１４４の下流側に形成されている。第１及び第２のサイドチャネル１４７、１４８は、中央チャネル１４３にほぼ直交する方向にあり、流体圧力源に流体連通されるように構成した入口１５９に連結されている。この点に関して、シース流体が入口１５９に入り、チャネル１４７、１４８を通過して、変形領域１４０において中央チャネル１４３に再度連結する。この流体フローは、ここに示すように、粒子のサイドひねり又はシースを達成する。変形領域１４０を通過した後、粒子は、出口１０６’を介してデバイスを出る。

図９Ｇは、図９Ｆに示すデバイスの選択された領域を拡大して示す一連の画像である。図９Ｆ及びＧに示すように、特定の例では、細胞混合物を含む溶液（例えば、細胞混合物を含む血液サンプル）を、入口１０４に送達する。洗浄液を洗浄液入口１０４’に送達する。洗浄液は、例えば、リン酸バッファ食塩水（ＰＢＳ）を含む。結合部分Ｊにおいて、外側チャネルは中央チャネル１４３とつながっている。結合部分Ｊの後、中央チャネル１４３で、サイズに応じた持ち上げ力がより大きな細胞（例えば、がん細胞）に働き、これらの細胞を、中央チャネル１４３に含まれる中央洗浄液へ運ぶ。更に図９Ｆを参照すると、細胞が三分流１４４に届くと、より小さい血液細胞（例えば、白血球）が第１及び第２の枝路チャネル１４５、１４６に仕込まれる。がん細胞は、中央チャネル１４３に流れ、三分流１４４を通過する。一方、デバイスが動作している間、ポンプ又はそのようなものを用いてＰＢＳなどの溶液が入口１５９に送達され、変形領域１４０においてひねるシースフローを作る。変形領域１４０において又はその近傍で、検出モジュール１５０（以下により詳細に説明する）を用いて細胞を撮像して、細胞の形態データセット及び／又は蛍光データセットを作ることができる。

１．３ システム−検出モジュール
図１に示すように、検出モジュール１５０は、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５６を具えており、複数の粒子中の各粒子の変形を特徴づける形態データセットと、各粒子の蛍光を特徴づける蛍光データセットを生成するように機能する。好ましくは、変形領域１４０が、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５６の少なくとも一つの視野とほぼ同心であり、更に、検出モジュール１５０が変形領域１４０を超えて延在する視野をとらえるように構成されている。このように、撮像モジュール１５１と蛍光モジュール１５５は、変形領域を含み、変形領域の前又はこれを超えて延在する適宜の領域上で集束するように構成することができる。例えば、いくつかの実施例では、変形領域１４０に粒子が入る前に蛍光画像を取得することができる。検出モジュール１５０が、形態データセットと蛍光データセットを同時に生成することが好ましいが、検出モジュール１５０は代替的に、形態データセットと蛍光データセットを非同時に（例えば、順次）生成するように構成してもよい。検出モジュール１５０が形態データセットと蛍光データセットを同時に生成する変形例では、検出モジュール１５０を、形態データセットの生成に使用する光（例えば、白光）が蛍光データセットの生成を干渉しないように構成することが好ましい。干渉は、蛍光データセットを生成する間に、望ましくない蛍光レベルの励起、及び／又は、蛍光検出器（例えば、光検出器）の飽和の形をとることがある。

撮像サブシステム１５１は、粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するよう機能する。図１０Ａを参照すると、撮像サブシステム１５１は好ましくは、第１光源１５２と、第１光源１５２からの光を変形領域１４０を通って対物レンズ１５４へ伝送するように構成した第１フィルタ１５３とを具える。対物レンズは、変形領域からの光を画像センサ１５５上で拡大して形態データセットを生成するように構成されている。撮像サブシステム１５１は、更に、例えば第１光源１５２からの光を第１フィルタ１５３を介して集束させ、第１フィルタ１５３からの光を変形領域１４０上で集束させ、及び対物レンズ１５４からの光を画像センサ１５４上に集束させる適当な数のレンズを具えている。このように、レンズは、光学エレメントの回収および集光として機能し、好ましくは非点収差レンズを具えている。しかし、これらのレンズは、代替的に平凸レンズ及び／又はその他の適宜の光回収及び集光レンズを具えていてもよい。

第１光源１５２は、複数の粒子における蛍光ラベルの望ましくない励起及び／又は蛍光検出器（例えば、光検出器）の飽和を生じさせることなく、画像センサ１５５に形態データセットを生成するのに十分な照明を提供するよう機能する。このように、第１光源１５２は、蛍光サブシステム１５６に応答して発生する蛍光放射の波長範囲との重なりが最小である特定範囲の波長を提供することが好ましい。第１光源１５２は、従って、高速画像データ捕捉に使用する短い露出期間中に適正な照明に十分な光強度を提供する。このように、第１光源１５２は、第１フィルタ１５３によってフィルタにかけられ、蛍光サブシステム１５６の光検出器における干渉を低減しつつ、画像センサ１５５においては十分な照明を提供している。第１変形例では、第１光源１５２がキセノン光源であり、これは、高速撮像アプリケーション及び蛍光撮像に使用することができる。代替的に、その他の変形例において、第１光源１５２は、ハロゲン光源及び／またはその他の適切な光源を具えていてもよい。更に、検出モジュール１５０の変形例は、相互交換可能な／調整可能な光源を具え、光波長範囲を変えたり、光強度を変えたり、及び／又は、その他の光パラメータの適宜の変更が可能である。

第１フィルタ１５３は、第１光源１５２からの光をフィルタにかけて、フィルタにかけた光を変形領域１４０に対して伝送し、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５６との間のスペクトルの重なりを防止している。このように、第１フィルタ１５３は、第１光源１５２と同軸上で整列して、第光源１５２からの光を適切にフィルタにかけることが好ましい。好ましくは、第１フィルタ１５３は複数の粒子において蛍光色素分子を励起させない光のみを通過させ、更に、蛍光サブシステム１５６の光検出器によって検出されない光のみを通過させるように構成した帯域通過フィルタである。特定の例では、第１フィルタが５３２ｎｍ付近及び５８０ｎｍ付近の波長を除去して、粒子に結合した蛍光レベルを励起させることなく、蛍光サブシステム１５６の光検出器において光干渉が生じないように構成されている。代替の変形例では、第１フィルタ１５３がローパスフィルタ、ハイパスフィルタ、及び／又は干渉する光波長を除去するその他の適宜のフィルタを具えていてもよい。更に、検出モジュール１５０の変形例は、第１光源１５２からの光を除去する相互交換可能なフィルタを具えていてもよい。

対物レンズ１５４は、第１フィルタ１５３からの光を受けて、変形領域１４０を通過させ、画像センサ１５５上に光を拡大して、複数の粒子中の各粒子の変形を特徴づける形態データセットの生成を容易にしている。対物レンズ１５４は、第１フィルタ１５３と画像センサ間にほぼ整列していることが好ましいが、対物レンズ１５４は、代替的に検出モジュール１５０のその他のエレメントに関連するその他の適宜の構造を有していてもよい。対物レンズは、複数の粒子の全体が変形した粒子を、画像センサ１５５によって規定されたウインドウ内に捕捉できる倍率で特徴づけられていることが好ましい。所望の倍率は、対物レンズの焦点距離及び／又は追加の光学エレメント（例えば筒型レンズ）の焦点距離、及び対物レンズ及び／又は光学エレメントに対する画像センサ１５５の一に依存する。特別な例では、対物レンズは１０倍の倍率であるが、その他の変形例では、対物レンズはその他適宜の代替の倍率であってもよい。変形例では、検出モジュール１５０が、相互交換可能な／調整可能な対物レンズ１５４を具えており、倍率を調整可能にしている。レベルの異なる倍率により、画像センサ１５５で生成される形態データセットを、例えば、すべての倍率レベルで見られない特徴の倍率を提供することによって、強化することができる。

画像センサ１５５は、変形領域１４０からの光を受けて、対物レンズ１５４を通過させ、複数の粒子中の各粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するよう機能する。好ましくは、画像センサ１５５は、対物レンズ１５４とほぼ整列しているが、画像センサ１５５は、検出モジュール１５０の「その他のエレメントに対してその他の適宜の構成を持つものでもよい。画像センサ１５５は、高速／高フレームレート撮像モジュール（例えば、カメラ）に内蔵してもよく、複数の粒子中の各粒子についての複数の変形ステージを捕捉する画像データを生成するように構成できる。このように、画像センサ１５５と光源のスペックは、共依存しており、画像データの生成に十分な光パラメータ（例えば、強度）を提供することが好ましい。画像センサ１５５は、米国特許公開第２０１３／０１７７９３５号、“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”に記載されている画像センサの変形例を具えていてもよい。この公報は、引用により全体が本明細書に組み込まれている。しかしながら、画像センサ１５５は、形態データセットを生成するその他の適宜の画像センサを具えていてもよい。

蛍光サブシステム１５６は、複数の粒子中の各粒子の蛍光（又は蛍光の欠如）を特徴づける蛍光データセットを生成するよう機能する。蛍光サブシステム１５６は、従って、第２光源１５７と、第２光源１５７からの光を、光ファイバーユニット１５９を介し、流体経路１２０の一部を介し、対物レンズ１５４へ伝送するよう構成された第２フィルタ１５８を具え、対物レンズ１５４は蛍光データセットを生成する流体経路１２０から光検出器１６０への光を拡大するよう構成されている。流体経路１２０からの光は、更に、光検出器１６０で受ける前に第３フィルタ１６１を通過して、光の干渉波長の効果を低減又は除去する。

第２光源１５７は、光の励起波長を提供し、流体経路１２０中の複数の粒子の各粒子に向けて励起波長で光を伝送するよう機能する。第２光源は、好ましくは、第２フィルタ１５８と光ファイバユニット１５９に向けて、流体経路１２０の一部に光を当て、流体経路１２０のその部分を通過する粒子に結合した蛍光ラベルを、光の励起波長によって励起させる。これに応じて、励起した蛍光ラベルが粒子の生体分子を表す光の発光波長を発し、これを光検出器１６０で検出できる。第２光源１５７は、光の特定の励起波長を提供する光源であることが好ましく、レーザ（例えば、５３２ｎｍのレーザ）であってもよい。しかしながら、第２光源１５７は代替的に、光の励起波長範囲を提供するように構成することができる。一変形例では、第２光源１５７が、広域スペクトル光源（例えば、白光ＬＥＤ）であり、少なくとも一の励起フィルタに光を伝送し、蛍光ラベルの励起に特定の波長又は波長レンジの光を生成することができる。励起フィルタと広域スペクトル光源を含む変形例では、励起フィルタが相互交換可能であり、調整可能な励起波長又は調整可能な励起波長範囲を提供している。

第２フィルタ１５８は、第２光源１５７から伝送された光のパラメータを変更して、第２光源１５８によって提供される光を調整するよう機能する。第２フィルタ１５８は、好ましくは、第２光源１５７と光ファイバユニット１５９の間に整列しているが、光ファイバ１５９がない変形例では、第２フィルタ１５８が第２光源５７と整列する、あるいは、その他の適宜の構成を有していてもよい。第２フィルタ１５８は、好ましくは、第２光源１５７から伝送された光強度を変更又は低減するように構成した、減光フィルタである。このように、減光フィルタは、高強度光による信号飽和を防止するよう機能し、更に、高強度光から検出モジュール１５０の高感度素子を保護するよう機能する。しかしながら、第２フィルタ１５８は、第２光源１５７から光を調整するその他の適宜のフィルタを具えていてもよい。

光ファイバユニット１５９は、第２光源１５７から第２フィルタ１５８を通って伝送された光を、システム１００のスペース要求を満足させるように再度方向づける。更に、光ファイバユニット１５９は、ビーム形状（例えば、よりスペースのある均一ビームを生成するファイバーコリメータによる）を変えるように機能し、一またはそれ以上の方向での高分解能変換用マウント（例えば、ｘ−ｙマウントによる二次元）に連結することによって変換を容易にすることができる。このように、光ファイバユニット１５９は、ファイバ光ファイバプローブアッセンブリに連結されたファイバカプラを具え、ファイバ光ファイバプローブアッセンブリを介して光を変換できる。ファイバープローブは、好ましくは、複数の粒子が通過する流体経路の一部に光を向けるように構成して、複数の粒子に結合した蛍光ラベルが正しく励起されるようにしている。流体経路のその部分は、変形領域１４０を具えていてもよく、検出モジュール１５０が同時にあるいはほぼ同時に、流体経路に沿った同じ位置で変形及び蛍光特性を捕捉するように構成されているが、流体経路のその部分は、代替的に、流体経路のその他の部分は、例えば、変形領域１４０の上流側領域と送達領域１３０の下流側領域、といった流体経路のその他の適宜の領域、又は流体経路のその他の適宜の領域を具えていてもよい。一変形例では、第２光源１５７からの光を、フロー条件が十分に均一である変形領域のすぐ上流側（例えば、１ｍｍの上流側に対して１００μｍ）の領域に向けることができる。スペースの制約が少ないいくつかの変形例では、蛍光モジュール１５６は、光ファイバーユニット１５９をなくして、第２フィルタ１５８を通る第２光源１５７からの光が、第２光源１５７からストレートラインで直接流体経路１２０のその部分に伝送される。しかしながら、蛍光サブシステム１５６のいくつかの変形例は、光ファイバーユニット１５９をなくして、代わりに、光ステアリングミラーを具え、第２光源１５７から提供されるビームを複数ディメンション及び／又は、一またはそれ以上の方向への光の伝送を容易にするように構成した移動可能なステージ（例えば、ｘ−ｙステージ）に伝送する。

撮像サブシステム１５１の対物レンズと同様に、対物レンズ１５４は、流体経路１２０の部分を通過する第２フィルタ１５８からの光を受けて、光検出器１６０上に光を拡大するように機能して、複数の粒子の各粒子の蛍光を特徴づける蛍光データセットの発生を容易にする。対物レンズ１５４は、光ファイバーユニット１５９のファイバープローブと光検出器１６１の間に、検出モジュール１５０のその他のエレメントに対して適切な構成で位置する。対物レンズは、好ましくは、複数の粒子の中の全体が蛍光している粒子を光検出器１６０で規定するウインドウ内に捕捉できるような倍率であり、所望の倍率は、対物レンズの焦点距離と対物レンズ１５４に対する光検出器１６０の位置に依存している。特定の例では、対物レンズは、１０倍の倍率であるが、その他の変形例では、対物レンズがその他の適宜の代替の倍率であってもよい。変形例では、検出モジュール１５０が、内部交換可能な／調整可能な対物レンズ１５４を具え、倍率を調整可能にしてもよい。

光検出器１６０は、複数の粒子の粒子に結合した蛍光ラベルの励起時に放射された光を受光するよう機能する。光検出器１６０は、更に、複数の粒子の各粒子の蛍光特性を特徴づける蛍光データセットの生成を容易にするよう機能する。このように、光検出器１６０は、励起した蛍光ラベルから放射された、紫外線、可視光線、及び赤外線を検出するように構成するのが好ましい。一変形例では、光検出器１６０は、入射光を受信したときの光電効果によって作動するように構成した光マルチプライヤを具えていてもよいが、その他の変形例では、光検出器１６０は、その他の適切な機構によって、光の適切な波長を検出するように構成したその他の適切な光検出器を具えていてもよい。

上述したように、蛍光モジュール１５０は、光検出器１６０で受光する前に光をフィルタにかけるように構成した第３フィルタ１６１を具えていてもよい。第３フィルタ１６１は、従って、何らかの光源（例えば、第１光源１５２）から発生した光の干渉効果を低減又は除去するよう機能する。好ましくは、第３フィルタ１６１は光検出器１６０にほぼ整列しており、光検出器１６０への入射光は第３フィルタ１６１を通過するように構成されている。追加で、あるいは代替的に、第３フィルタ１６１は、対物レンズ１５４から光検出器１６０への光路の適切な部分に沿って構成することができる。第３フィルタ１６１は好ましくは、帯域通過フィルタであるが、第３フィルタ１６１は代替的に又は追加で、低域通過フィルタ又は高域通過フィルタを具えていてもよい。

好ましくは、撮像サブシステム１５１及び蛍光サブシステム１５５は一体化されて、検出モジュール１５０のスペースおよびコストの要求を下げることが好ましい。このように、いくつかの変形例では、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５５が要素を共用することができる。このような変形例の一つでは、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５５は、単一光源を共用してもよく、対応してこの光源によって提供される照明スポット内にある時点で単一粒子のみが確実に存在するようにフローパラメータを調整する。その他の変形例では、サブシステム１５１、１５５間でその他のエレメントを追加で又は代替的に、共用できる。

一例では、図１０Ａに示すように、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５６が対物レンズ１５４を共用している。この対物レンズは、同時に、第１光源１５２と第２光源１５７から生じた光を受光し、画像センサ１５５と光検出器１６０へそれぞれ伝送する。この例では、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５６が更に、対物レンズ１５４からの光の特定波長を伝送し、対物レンズ１５４からの光のその他の波長を反射する（例えば、別の光検出モジュールへ）二色性ミラー１６２を共用している。この二色性ミラー１６２は、励起に反応して、蛍光ラベルによって放射された光を光検出器１６０に反射して、蛍光データセットを生成するとともに、第１光源からの光を画像センサ１５５に直接伝送して、形態データセットを生成するように構成することができる。代替的に、二色性ミラー１６２は蛍光ラベルで発光した光を光検出器１６０に伝送し、第１光源からの光を画像センサ１５５に反射するように構成してもよい。二色性ミラー１６２は、好ましくはショートパス二色性ミラーであるが、代替的にロングパス二色性ミラーあるいはその他の適宜の二色性ミラーをであってもよい。

別の例では、図１０Ｂに示すように、撮像サブシステム１５１と蛍光サブシステム１５５が、対物レンズ１５４を共用しており、このレンズは第１光源１５２と第２光源１５７から発した光を受けて、画像センサ１５５と光検出器１６０に、それぞれ伝送する。この例では、検出モジュール１５０が低域通過フィルタ１５３と、開口部と低域通過フィルタ１５３で分離されている複数のレンズを通って、流体経路１２０の変形領域１４０へ、及び１０倍の対物レンズを通って第１及び第２の二色性ミラー１６２，１６２’画像センサ１５５へ向けて反射されるように、光を伝送するように構成された第１キセノン光源１５２を具える。本例では、検出モジュール１５０が更に、第１の二色性ミラー１６２を通って第２の二色性ミラー１６２’から反射される光を１０倍の対物レンズに向けて伝送するように構成された第２の５３２ｎｍレーザ光源１５７を具える。第２光源１５７からの励起光は、変形領域１４０で集束するように構成され、変形領域で蛍光ラベルから放射された光は、第２二色性ミラー１６２’を通って、帯域通過フィルタ及びレンズ、及び帯域通過フィルタを通って、光検出器１６０に戻るように伝送されるように構成されている。本例の変形例では、変形領域１４０における蛍光ラベルから放射された光が、第２二色性ミラー１６２’を通り、追加の二色性ミラー１６２’’’、１６２’’’’、帯域通過フィルタ、及びレンズによって、追加の光検出器１６０’、１６０”に向けて伝送される。ここで、光検出器１６０、１６０’、１６０”は、波長が異なる（又は波長範囲が異なる）光を受光するように構成されている。

さらに別の例では、図１０Ｃに示すように、撮像サブシステム１５１と、蛍光サブシステム１５５が対物レンズ１５４を共用しており、このレンズは第１光源１５２と第２の光源１５７から発した光をそれぞれ受光して画像センサ１５５と光検出器１６０に伝送する。この例では、検出モジュール１５０が低域通過フィルタ１５３と、開口及び低域通過フィルタ１５３で分離されている複数のレンズを通って流体経路１２０の変形領域１４０へ、及び１０倍の対物レンズと第１ショートパス二色性ミラー１６２を通って画像センサ１５５へ、伝送するように構成された第１光源１５２を具える。この例では、検出モジュール１５０がさらに、ファイバープローブに連結され、平行光学素子を通り、ビームステアリング素子（例えば、図１０Ｃに示すようなミラーセット、又は、ｘ−ｙ変換ファイバーマウント）を通り、第２のショートパス二色性ミラー１６２を通り、第１のショートパス二色性ミラーから反射され、対物レンズ１５４を通る光を変形領域１４０に伝送するように構成された、第２の５３２ｎｍレーザ光源１５７を具える。変形領域において蛍光ラベルから発した光は、続いて対物レンズ１５４に入り、第１のショートパス二色性ミラー１６２と第２の二色性ミラー１６２で反射され、ロングパス二色性ミラー１６２’セットへ行くように構成される。ロングパス二色性ミラーセットは、図１０Ｃに示すように、特定の波長の光を反射して、帯域通過フィルタ１６１を通って、特定の光検出器１６０に伝送して、蛍光検出を行う。

その他の変形例では、検出モジュール１５０が、形態データセットと蛍光データセットを同時にあるいはほぼ同時に生成できるようなその他の適切な素子及び／又は構成を具えていてもよい。例示では、検出モジュールが、ビームスプリッタ、開口、追加の二色性ミラー、コリメータ、任意数のレンズ、及び光源からの光を操作するよう構成したその他の適切な要素のうちの一またはそれ以上を具えていてもよい。更に、いずれかの要素を光学素子の整列及び／又は焦点距離の調整を行うアクチュエータ（例えば、手動アクチュエータ、自動アクチュエータ）に接続することができる。一例では、対物レンズ１５４をリニアアクチュエータ（例えば、ｚ軸コントロール）に接続して、一またはそれ以上の軸に沿った調整を行うようにしてもよい。追加で又は代替的に、基体１１０自体をアクチュエータにつないで（多えば、ステージで）、一またはそれ以上の軸（例えば、ｘ−ｙコントロールによる）に沿ってリニア動作を提供することができる。

１．３．１ システム−検出モジュールの代替例
いくつかの実施例では、検出モジュール１５０は、追加で又は代替的に、データ取得レートを上げ、分析時間を短くするように構成した一次元検出モジュール１６３を具えていてもよい。この一次元検出モジュール１６３は、二次元又は三次元データを生成することなく、粒子変形特性を励起できるように機能して、形態データセットを生成する。

第１変形例では、図１１Ａに示すように、一次元検出モジュール１６３が、信号ノイズ比が高い粒子移送時間測定の生成を容易にするように構成したスリットセット１６４を具える光マスクを具える。第１の変形例では、この光マスクは好ましくは、変形領域１４０の上流側に位置する少なくとも一のスリットと、変形領域の下流側に位置する少なくとも一のスリットを具えており、粒子が変形する前後の粒子寸法（例えば、細胞長さ）の差を検出できるようにする。光マスクを通って光を受けて、光マスクのスリットを通過する粒子によって生じる入射光が変化する時に電気信号（例えば、電圧降下）を生成するように構成された光検出器１６９を用いて、電気信号（例えば電圧降下、電圧降下時間）と粒子寸法（例えば、細胞長さ）との間の相関関係を提供する。第１の変形例では、スリット幅が予想された粒子寸法によって決まり、特定の例では、最も小さい予測細胞サイズよりスリット幅が小さく、一次元検出モジュール１６３から細胞寸法を直接推定する。しかしながら、代替的に、光マスクは予測される粒子寸法より大きい幅のスリットを具え（例えば、光マスクの製造を容易にするため）、光マスクと共働している光検出器で生成された信号が、平均的な移行信号特性を用いた解析に基づいて、変形測定値を生成するように構成することができる。第１変形例の代替例では、一次元検出モジュール１６３は、パターンセットと、光マスクを通って光を受光するように構成した光検出器１６９を具える光マスクを具え、光マスクのパターンを通過する粒子によって生成される入射光が変化した時に、電気信号（例えば、電圧降下、電圧降下期間）を生成するように構成されている。この代替例では、光検出器によって生じる信号は、生成した信号ライブラリィと合致して、粒子の寸法パラメータ（例えば、細胞長さ）を抽出できる。しかしながら、光マスクは、代替的に、二次元又は三次元データを生成することなく、粒子寸法を検出できるように構成したその他の特徴を具えていてもよい。

第２の変形例では、一次元検出モジュール１６３は、光源１６８に連結された液状導波路１６７（例えば、光源に連結した光ファイバ）と検出器１６９を有するレンズセット１６６を具え、光源から液状導波路１６７と、レンズセット１６６を通過する光によってできる光リボンを用いて、光リボンを通過する粒子によって誘発される電圧降下から経過時間測定値を生成できる。液状導波路１６７とレンズセット１６６は、図１１Ｂに示すように、基体１１０と一体的（例えば、物理的に同延）であることが好ましいが、液状導波路１６７及び／又はレンズセット１６６は、代替的にその他の適宜の代替の方法で構成することもできる。更に、光リボンは、直接検出器１６９に向けられ、光源１６８が図１１Ｂに示すように検出器と正反対になるようにするか、あるいはその他の適宜の方法（例えば、位置的にオフセットした導波路を用いる）で光源１６８と検出器１６９の間に向けるようにしてもよい。第２変形例の特定の例では、液状導波路は、高屈折率オイル（例えば、屈折率１．６）を具え、レンズは、屈折率１であり、光リボンの生成を容易にするようにしてもよい。

第３の変形例では、図１１Ｃに示すように、一次元検出モジュール１６３が前及び／又は横散乱測定値を用いて変形する間の粒子寸法測定値を生成できるように構成した検出器１６９を具える。粒子が変形領域１４０に入って出る際の散乱光特性（例えば、プロファイル、パラメータ）粒子の変形特性を推測できる。例えば、検出器１６９で検出されるような光散乱は、図１１Ｃに示すように、大きな変形に伴ってマグニチュードが大きい電圧降下を生じる。一次元検出モジュール１６３の第３の変形例の少なくとも一部は、基体１６０と一体化することができるが、一次元検出モジュール１６３の第３変形例は、代替的に、基体１１０と物理的に区別できるものであってもよい。

更なるその他の実施例では、検出モジュール１５０が更に、及び／又は代替的に、データ取得速度を上げて分析時間の低減を容易にするように構成した二次元検出モジュール１７０を具えていてもよい。二次元検出モジュール１７０は、代替要素の組成及び／又は構成に基づいて粒子の変形特性の迅速な抽出ができるように機能して、形態データセットを生成する。例示的な二次元検出モジュール１７０が、図１２に示されている。

一実施例では、二次元検出モジュール１７０が、粒子が変形領域で変形されるときに第１の軸にそった粒子の変形（例えば、粒子のｘ軸変形）を検出するように構成した第１の位置検出素子１７１（ＰＳＤ）と、第１のＰＳＤ１７１に直交する方向にあり、粒子が変形領域１４０内で変形されるときに、第２の軸に沿った粒子変形（例えば、粒子のｙ軸変形）を検出するように構成した、ＰＳＤ１７２を具える。第１及び第２のＰＳＤｓ１７１、１７２は、各々、図１２Ａに示すように、変形領域１４０内で粒子が変形する間に、粒子寸法（例えば長さ）を表す電気信号（例えば、電圧降下、電圧降下期間）を生成するように構成されることが好ましい。第１のＰＳＤによって提供される信号が第１チャネルを通過して、第２ＰＳＤによって提供される信号は第２チャネルを通過できる、代替の変形例では、第１ＰＳＤ及び第２ＰＳＤ１７１、１７２で提供される信号が、単一チャネル内で多重化されて、信号処理を行なう間のリソース要求を低減することができる。第１変形例の特定例では、第１及び第２のＰＳＤｓが、１００ｋＨｚの帯域と２μｍの空間解像度で規定され、７０μｍ×７０μｍの変形領域１４０内で変形測定できるように構成されている。

第２実施例では、図１２Ｃに示すように、二次元検出モジュール１７０が画像センサ１７３と、画像センサ１７３と共働して粒子事象を認識し、その粒子事象の認識時に変形している粒子捕捉信号を選択的にトリガするように構成された、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）１７４を具える。画像センサ１７３は、好ましくは、変形領域１４０における画像データを捕捉するように構成されているが、その他の適宜の対応に構成してもよい。二次元検出モジュール１７０の第２変形例では、このように検出モジュール１５０が相当数のブランクフレーム（すなわち、粒子関連データを何ら提供しないフレーム）の回収を防止することができ、これによって、コンピュータによる作業負荷が有意に少なくなる。特定のアプリケーションでは、ＦＰＧＡは、変形領域１４０の上流側のトリガ領域１７５をスクリーニングするように構成することができ、トリガ領域１７５内の粒子（すなわち、粒子事象）の認識時に、撮像センサ１７３は制限時間ウインドウ（例えば３０フレーム）内に変形している粒子の画像データを捕捉するように構成できる。

第３実施例では、二次元検出モジュール１７０は、変形領域１４０内の粒子の変形を捕捉するように構成した画像センサ１７６と、変形領域の上流側位置で変形領域１４０に入る粒子に向けて光を発するように構成した光源１７７と、光源１７７からの光を受光するように構成した光検出器１７８と、を具え、変形領域１４０に入るほとんどの粒子の認識を容易にすると共に、変形領域１４０内の粒子の動きと同期して複数回フラッシュを当てるように構成したストロボ１７９を具える。ストロボ１７９のフラッシュにより、複数位置及び／又は単一画像フレーム内の粒子の変形の捕捉が可能となり、単一画像フレームは粒子変形特性に関連するより有益なデータを提供することができる。ストロボは複数回、そのストロボフラッシュ間に固定時間インターバルでフラッシュを当てるように構成してもよく、代替的に、光検出器１７８で案内されるように、ストロボフラッシュ間の固定時間インターバルなしでフラッシュを当てるように構成してもよい。第３変形例の特定の例では、画像センサ１７６は、１秒当たり２，０００−１０，０００フレームのフレームレート、及び１５０μｍ×１５０μｍの視野で特徴づけられる。本例の光源１７７は、変形領域１４０の上流側でレーザが合焦し、光検出器１７８は、粒子がレーザビームを通過するときにできる散乱レーザ光を検出するように構成した、ホトマルチプライヤ管（ＰＭＴ）か増幅した光ダイオードの内の少なくとも一方を具える。散乱光は、この特定の例では、光検出器１７８で検出されると、ストロボ１７９をトリガして、その粒子（すなわち、レーザからの粒子光を散乱させる粒子）に必要な時間に応じた固定時間インターバルで２回フラッシュを当てて（例えば、５００ｎｓ露出時間で）、変形領域１４０付近の２つの位置間を通過させている。特定の例では、従って、各画像フレームは、変形領域１４０で変形している粒子の二つの位置および二つの形態特性に関する情報を有する。

検出モジュール１５０のその他の代替変形例は、単寸法取得及び／又は複数寸法取得に基づいて変形を生じる粒子形態データの測定と検出を可能にするその他の適切な要素又は要素の組み合わせを具えていてもよい。

１．４ システム その他の要素
図１を参照すると、プロセッサ１８０は、形態データセットを、複数の粒子中の各粒子の変形を特徴づける変形特性セットに変換して、蛍光データセットを、複数の粒子中の各粒子の生体分子特性を特徴づける蛍光パラメータセットに変換して、この変形特性セットと蛍光パラメータセットに基づく分析を行う。好ましくは、形態データセットと蛍光データセットは、時間的に同期しており、複数の粒子中の特定の粒子と画像及び蛍光データとのマッチングを容易にするが、この画像及び蛍光データセットは、その他の測定基準によって同期させるようにしてもよい。このように、プロセッサ１８０は、形態データセットから変形データセットを抽出するように構成した第１モジュール１８１と、蛍光データセットから変形特徴セットを抽出するように構成した第２モジュール１８２と、形態データセット及び蛍光データセットを同期させるように構成した第３モジュール１８３と、変形特性セットと蛍光パラメータセットに基づいて分析を行うように構成した第４モジュール１８４と、を具えることが好ましい。いくつかの代替実施例では、モジュール１８１、１８２、１８３、１８４のいずれも、互いに組み合わせることができる。モジュール１８１、１８２、１８３、１８４は、プロセッサ１８０によって実行する指示又はアルゴリズムを具えていてもよい。これらのモジュール１８１、１８２、１８３、１８４は、メモリ、又は、プロセッサ１８０に動作可能に接続されたその他のデータ保存装置に保存することができる。更に、単一のプロセッサ１８０について言及したが、一又はそれ以上の追加のプロセッサを、単一の処理ユニットとして互いに機能させることができると解するべきである。

第１モジュール１８１は、形態データセットから変形特性セットを抽出するよう機能して、形態データセットを蛍光データセットと同期するのに使用することができ、第４モジュール１８４による分析を生成するのに使用できる。第１モジュール１８１は、変形特性セットを連続的に又はほぼ連続的に、およびリアルタイムで（例えば、粒子の変形がリアルタイムで追跡されるように）抽出することができるが、第１モジュール１８１は、代替的に、非連続的に及び／又は非リアルタイムで特性を抽出するように構成できる。変形特性セットは、好ましくは、核のサイズ、クロマチン脱凝縮、細胞骨格分解／液体化、及び膜破損／溶解など、表現型を表す形態学上及び／又は構造上の特性を提供する。変形特性セットは、従って、細胞膜及び／又は細胞核に関する情報を提供できる。いくつかの変形例では図１３Ａ−１３Ｃに示すように、変形特性セットが、粒子変形能（例えば、粒子の長さ対幅の比）、粒子弾性係数（例えば、シミュレーション流体誘発ストレス及び粒子径のライブラリで提供されるストレスに対する初期高周波数変形レジーメで測定した歪の比率）、粒子粘度（例えば、低周波数変形レジーメにおける歪レートの測定値）、粒子の流体力学的粘度（例えば、粒子の慣性平衡位置に基づく）、粒子真円度（例えば、粒子の突出した周辺部に対する粒子の突出領域の比に基づく）、粒子粒度（例えば、粒子半径測定値からの標準偏差）、粒子サイズ（例えば、体積、面積、直径、その他）、粒子位相特性、粒子非対象性、及び、その他の適宜の形態学上又は構造上の特性、の一またはそれ以上を具えていてもよい。第１モジュール１８１が、ベースライン形態粒子特性を抽出するように構成されていてもよく、これは、初期粒子体積、初期粒子径、初期粒子非対象性、及びその他の適切なベースライン特性の一またはそれ以上を具える。粒子特性の抽出は、米国特許公開第２０１３／０１７７９３５号、“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”に記載されているように行う、あるいはその他の適切な方法で行うことができる。第１モジュール１８１が、ベースラインの形態粒子特性を抽出するように構成されている様々な変形例では、そのベースライン特性を用いて、複数の粒子中の各粒子の変形特性セットを正規化することができ、及び／又は、第４モジュール１８４によって、その他の適切な方法で分析を行うことができる。一実施例では、第１モジュール１８１は、複数の粒子中の各粒子について抽出した少なくとも一の変形特性と共に、配列表示（例えば、変形特性の抽出に用いた画像のフレーム数、時間スタンプ、その他）を出力するが、第１モジュールは、その他の適宜の出力を提供することができる。特定の例では、第１モジュール１８１が、変形能の抽出に使用した画像のフレーム数と共に、粒子変形能を出力するように構成されている。

第２モジュール１８２は、蛍光データセットから蛍光パラメータセットを抽出するように機能し、これは、蛍光データセットを形態データセットと同期させて、第４モジュール１８４による分析を作成するのに使用できる。第２モジュール１８２は、連続的に、又はほぼ連続的、及びリアルタイム（例えば、粒子の蛍光をリアルタイムで追跡する）抽出することができるが、第モジュール１８１は、代替的に、非連続的に及び／又は非リアルタイムで特性を抽出するように構成してもよい。蛍光パラメータセットは、好ましくは、生体分子表現型（例えば、表面マーカ、核酸成分、メンブレイン完全性、レセプタ特性）を表す特性を提供し、発光強度（例えば、平均強度、ピーク強度）、発光波長、蛍光の運動パラメータ、及びその他の適切な蛍光パラメータの一またはそれ以上を具えている。第２モジュール１８２は、また、ベースライン蛍光パラメータ（すなわち、粒子の変形前）を抽出するように構成できる。このパラメータには、初期強度（初期平均強度又はピーク強度）、変形前の初期発光波長、変形前の初期運動パラメータ、及びその他の適宜のベースラインパラメータが含まれる。第２モジュール１８２がベースライン蛍光パラメータを抽出するように構成した変形例では、ベースラインパラメータを用いて、複数の粒子中の各粒子についての蛍光パラメータセットを正規化することができ、及び／又は、第４モジュール１８４を使用してその他の適宜の方法で分析を作成することができる。好ましくは、第２モジュール１８２がシーケンス表示（例えば、時間スタンプ、蛍光パラメータの抽出に用いた画像のフレーム番号、その他）を、複数の粒子中の各粒子について抽出した少なくとも一の蛍光パラメータと共に出力するが、第１モジュールがその他の適切な出力を提供するようにしてもよい。特定の例では、第２モジュールが強度と時間についての連続した信号を出力するように構成されている。例えば、この信号は、ここに述べるように、ＰＭＴからの連続電圧信号を含むものでもよい。検出した蛍光粒子に対応するピークは、第２モジュール１８２を用いて生成したデータセットから抽出することができる。

第３モジュール１８３は、形態データセットと蛍光データセットを同期させるように機能する。好ましくは、形態データセットと蛍光データセットは、同じ時計を使用している画像センサ１５５と光検出器１６０から出力され、画像データと蛍光データに亘る時点が実質的に同期するようにする。同期は、粒子が蛍光識別領域から形態検出領域へ通過するときの時間遅延に対応する経過時間を差し引くことによって行われる。しかしながら、いくつかの変形例では、形態データセットと蛍光データセットは、同じ時計に関連しておらず、形態データセットと蛍光データセットを同期させない。第３モジュール１８３を適宜の信号調整ステップを実行するように構成してもよい（例えば、フィルタをかけてピークを見つけることによってノイズを除去する）。第１モジュール１８１が粒子の変形能を変形能を抽出するのに使用した画像のフレーム番号と共に出力するように構成されているとともに、第２モジュール１８２が強度と時間の連続信号を出力するように構成されている特定の例では、第３モジュール１８３が、信号をフィルタに掛けて信号ノイズを除去し、ピーク検出アルゴリズムを適用して、粒子の時間依存シーケンスを認識するように構成されている。シーケンスマッチング又は相互関係アルゴリズムは、一例が図１４に示されているが、形態データセットの事象対時間信号を、蛍光データセットの事象対時間信号に整列させるのに使用される。この例の変形では、認識可能な変形能及び蛍光シグネチュアによって特徴づけられるキャリブレーション粒子（例えば、変形可能な蛍光キャリブレーションマイクロスフェア）を用いて、時間スタンプに関係なく、形態データセットを蛍光データセットに同期させることができる。さらに別の変形例では、変形能（又はその他の適切な変形特性）と、放射された蛍光強度との関係を用いて、データセットを同期させるようにしてもよい。しかしながら、形態データセットと蛍光データセットは、その他の適切な方法で同期させることができる。

第４モジュール１８４は、変形特性セット及び蛍光パラメータセットに基づく分析を生成するよう機能する。この分析は、複数の粒子の粒子を特徴づけるのに有益な、機械的（例えば変形）特性、蛍光パラメータ、及び／又は機械的パラメータと蛍光パラメータの組み合わせを用いることができる、対象の粒子についての機械的及び生化学的／生体分子的マーカ間の相関関係を含む。特定のアプリケーションでは、第４モジュール１８４によって作成した分析を用いて、特定の細胞型の活性化状態（例えば、変形能と活性化マーカの表面発現によって認識されるような、マイトジェン又は炎症プロセスによる血液単核細胞活性化、サイトカイン又は血液感染を伴う顆粒球活性化）を、疾病のラベルフリーモニタリング、疾病の診断、疾病の治療、及び移植片拒絶反応の予測における重要な事項と共に、認識することができる。追加のアプリケーションでは、第４モジュール１８４で作成した分析を用いて、幹細胞とがん（例えば、ジャーカット細胞とＨＬ６０）との間の表現型つながりを認識する、幹細胞の分化表示を認識する、及び健康な患者又は病気の患者（例えば、休止期又は活性化白血球、ＰＢＭＣｓ、及び血中顆粒球）からの体液サンプル中の細胞母集団内の部分母集団を認識するのに使用することができる。このように、第４モジュール１８４を用いて、様々な生物学的粒子についての複数タイプの表現型マーカのデータライブラリ（例えば、機械的、変形、蛍光、その他）を高いスループットアプローチで集めることができる。

第４モジュール１８４は、統計的分析（例えば、相関関係、ｔ−テスト、ＡＮＯＶＡ、その他）を行うように構成することができ、これは、変形パラメータと蛍光パラメータ間の関係を調べるよう機能する。追加で又は代替的に、第４モジュールで作成した分類と回帰ツリー（ＣＡＲＴｓ）を、認識を強化するのに使用する変形及び蛍光パラメータと共に用いることができる。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、予測モデルを作成するために粒子を正しく認識する能力を評価することができる。更に、線形判別分析（あるいは、その他の機械学習アプローチ）を用いて、異なる検体量間の類似性及び／又は相違を認識し、これを用いて、例えば、異なる患者からのサンプルを階層化することができる。いくつかの変形例では、プロセッサ１８０は更に、ディスプレイ又はモニタなどのユーザインターフェース（例えば、単細胞のフローサイトメトリ２Ｄ又は３Ｄ密度プロット、その他）でこの分析を見るように構成できる。

図１に示すように、システム１００は更に、送達領域１３０の上流側に位置するフィルタ１９０を具える。フィルタ１９０は、対象の粒子を検体量中のその他の粒子又はデブリスから分離して、対象の粒子を流体経路１２０を通過させるように機能する。好ましくは、フィルタ１９０は、入口１０４と流体経路１２０の間で、検体量が流体経路１２０、送達領域１３０、及び／又は変形領域１４０に送達される前に、実質的にフィルタにかけられるように構成されている。追加で又は代替的に、システム１００は、システム１００のその他の適切な位置に配置したフィルタ１９０、及び／又は、その他の適切な構成で適切な数のフィルタ１を具えていてもよい。フィルタ１９０は、好ましくは、サイズによって粒子を分離する（例えば、多孔構造又はメッシュにおける適切なサイズの孔を用いて）が、フィルタ１９０は代替的に、検体量中のその他の粒子から対象の粒子を、その他の適切な分離機構（例えば、化学的、親和性モエティ、電気的、磁気的、その他）に基づいて分離するようにしてもよい。

図１にも示すように、システム１００は更に、処理を行なった検体量レシーバ１９５を具えており、これは、処理を行なった検体流体を基体１１０の出口１０６から受け取るよう機能する。簡単に上述した通り、処理を行なった検体量レシーバ１９５は、出口１０６に流体連結して、処理を行なったサンプル流体を廃液として回収するように構成した廃液チャンバであってもよい。更に、この廃液チャンバは、適切な方法で基体１１０と一体化（例えば、物理的同延、又は単一構造）することができる。代替的に、処理を行なった検体量レシーバ１９５は、複数の粒子を含む処理を行なった検体量を回収してその他のモジュールへ送り、追加のアッセイ及び分析を行うように構成してもよい。このように、処理を行なった検体量レシーバは、サンプルの位相を容易にする一又はそれ以上の導管及び／又はバルブを具えていてもよい。さらに別の変形例では、処理を行なった検体量レシーバ１９５は、検体量の一部を廃液として受け取るコンポジットレシーバであり、検体量の別の部分の回収を容易にして更なる分析を行うようにしてもよい。

いくつかの変形例では、システム１００がさらに、アクセス可能なメモリを伴うストレージモジュール１９７を具えており、これが、形態データセット、蛍光データセット、分析、システム１００のパラメータ（例えば、フローパラメータ、検出モジュールパラメータ、その他）、検体量識別子（例えば、名前、内容、日付）、及びモジュールのアルゴリズムの内の少なくとも一つを受け取って、及び／又は、保存するよう機能する。このアクセス可能なメモリによって、ユーザは、システム１００を用いたサンプルフロー、及びこれらフローの間に使用したシステムパラメータに関する保存情報にアクセスできる。保存情報はいずれも、ユーザ及び／又はその他の適切なものによってアクセス可能であることが好ましい。ストレージモジュールは、適切なコンピュータデバイス（例えば、デスクトップコンピュータ、ハードウエアストレージ装置、サーバ、クラウド）を用いて実装できる。

しかしながら、システム１００は、検体量の粒子の変形、アッセイ、及び／又は分析を容易にする、その他の適切なエレメント又はエレメントの組み合わせを具えていてもよい。当業者は、これまでの詳細な説明から、及び図面、特許請求の範囲から、システム１００の範囲から外れることなく、システム１００の実施例に変形、変更を行うことができることを認識する。

２．方法
図１５に示すように、検体量中に担持された複数粒子を変形させ分析する方法２００は： 複数の粒子を含む検体量を受け取るステップＳ２１０と；検体量の第１部分を第１フロー中で、及び検体量の第２部分を第１フローに対向する第２フロー中で迂回させるステップであって、第１及び第２フローの交差部分が変形領域を規定するステップＳ２２０と；変形領域内に複数粒子を集束するステップＳ２３０と；変形領域内の複数の粒子の各粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するステップＳ２４０と；変形領域内の複数の粒子の各粒子の蛍光を特徴づける蛍光データセットを作成するステップＳ２５０と；及び、複数の粒子についての形態データセットと蛍光データセットの少なくとも部分に基づいて複数の粒子の分析を出力するステップＳ２６０とを具える。

方法２００は、高スループットでかつ一致した方法で、単一粒子の変形を可能にし、単一粒子を特徴づける複数データタイプを同時に生成して分析できる。好ましくは、方法２００は、更に、表現型の表面バイオメーカを、単一粒子レベルにおける機械的特性と直接関連付けるデータの生成を可能にするよう機能する。これによって、生体分子特性と機械的特性との間の直接的な定量的比較を作ることができる。好ましくは、方法２００を用いて、細胞などの生物学的粒子を処理及び分析し、方法２００を、蛍光アッセイを使用して細胞の変形を生体分子表現型白血球の活性化と関連付けることで、幹細胞分化、及び、がん細胞の悪性度の分析に使用できる。しかしながら、システム１００は代替的に、その他の適切な生物学的粒子あるいは非生物学的粒子を、その他の適切な分析法を用いて、処理し、変形させ、分析させることができる。

ブロックＳ２１０は，複数の粒子を含む検体量を受け取るステップを記載しており、複数の粒子を含む検体量を受け取って、複数の粒子の処理と分析を開始するよう機能する。上述したシステム１００の実施例にあるように、検体量は、好ましくは、基体の入口で、ポンプを用いて受け取ることが好ましいが、検体量をその他の適切な方法で受け取って、及び／又は送達することができる。いくつかの変形例では、ブロックＳ２１０は更に、図１５に示すように、検体量Ｓ２１２をフィルタにかけるステップを具えており、これは、検体量中のその他の粒子から対象の粒子を分離して、対象の粒子が流体経路を通過して更なる処理と分析が行われるように機能する。ブロックＳ２１２は、上述のフィルタの適切な変形例を用いて、あるいは、検体量中のその他の粒子から対象粒子を分離するその他の適切な方法を用いて、実装することができる。

ブロックＳ２２０は、第１フロー中の検体量の第１部分及び第１フローと対向する第２フロー中の検体量の第２部分を迂回させるステップを記載しており、第１及び第２フローの交差部分が変形領域を規定している。ブロックＳ２２０は、複数の粒子中の各粒子を変形させるように構成した対向するフローを生成するよう機能する。ブロックＳ２２０は、上述したシステム１００の流体経路の実施例において実装されることが好ましく、ここでは流体経路に、検体量から第１及び第２のフローを生成するように構成した少なくとも二つ枝路を具える。更に、あるいは代替的に、検体量から取り出したのではなく、注入したフローを用いて、対向するフローの少なくとも一のフローを作ることができる。しかしながら、ブロックＳ２２０は、検体量から少なくとも部分的に、その他の適切な対向フローを生成する方法を用いて、実装することができる。いくつかの変形例では、ブロックＳ２２０は、第１フロー中の検体量の第１部分を迂回させるステップを具えていてもよく、ここで第１フローは対象の粒子のほぼすべてを含んでおり、また、第２フロー中の検体量の第２部分を迂回させるステップを具え、ここで、第２フローは、対象の粒子がほぼフリーである。しかしながら、その他の変形例では、第１フローと第２フローが、両方とも、複数の粒子のサブセットを具えていてもよい。

ブロックＳ２３０は、複数の粒子を変形領域に集束させるステップを記載しており、変形領域への少なくとも一のストリームラインに沿って複数の粒子を搬送し、複数の粒子の各粒子が、変形領域での変形前に統一したフロー条件を経験するように機能する。ブロックＳ２３０は、好ましくは、上述したシステム１００の実施例における送達領域で実装するが、粒子を集束するように構成した流体経路のその他の適切な部分に実装することができる。好ましくは、複数の粒子の粒子を含むフローであれば、ブロックＳ２３０の変形領域に集束することができる。しかしながら、代替の変形例では、ブロックＳ２３０は、複数の粒子の粒子を含まないフローのサブセットを集束する、及び／又は複数の粒子の粒子を含まないフローの集束をなくすことができる。一実施例では、ブロックＳ２３０における集束は、上述したように、閉じ込めた曲線チャネルと、最も高い制限セットを含むチャネルの少なくとも一方における慣性による集束を用いた集束を具えるが、ブロックＳ２３０における集束は、流体力学的集束、シース流体を用いた集束、誘電泳動集束、超音波集束、磁気集束、及びその他の適切な集束方法を用いた集束の、一またはそれ以上を具えていてもよい。

ブロックＳ２４０は、変形領域内の複数の粒子中の各粒子の変形を特徴づける形態データセットを生成するステップを記載しており、変形特性に基づいて分析を生成するための変形特性セットを抽出するのに使用できるデータセットを生成するよう機能する。この形態データセットは、好ましくは、上述した検出モジュールと撮像サブシステムの実施例を用いて、ブロックＳ２４０で作成されるが、形態データセットは、追加であるいは代替的に、変形している粒子についての画像データを捕捉するように構成した画像センサを具える適切なモジュールを用いて生成することができる。好ましくは、生成した形態データセットは、高フレームレートで特徴づけられ、形態データセットが、複数の粒子の各粒子についての複数の変形ステージを特徴づけるようにする。更に、形態データセットは、連続的にリアルタイムで生成することが好ましいが、形態データセットは代替的に、その他の適切な方法で生成することができる。

ブロックＳ２５０は、変形領域内の複数の粒子の各粒子についての蛍光を特徴づける蛍光データセットの生成を記載しており、蛍光パラメータに基づいて分析を生成するための蛍光パラメータセットを抽出するのに使用できるデータセットを生成するよう機能する。蛍光データセットは、上述した検出モジュールと蛍光サブシステムの実施例を用いてブロックＳ２５０で作成することが好ましいが、蛍光データセットは、追加であるいは代替的に、光の励起波長で励起されている蛍光ラベルによって発光している光を検出するように構成した光検出器を具える適切なモジュールを用いて生成することができる。好ましくは、蛍光データセットは、連続的に、リアルタイムで作成されるが、蛍光データセットは、代替的にその他の適切な方法で作成するようにしてもよい。更に、ブロックＳ２５０は、ブロックＳ２４０と同時に実行して、形態データセットと蛍光データセットが同時に又はほぼ同時に作成され、変形特性と蛍光パラメータが時間的に合致する、あるいは複数の粒子の各粒子に同期するようにしてもよい。

ブロックＳ２６０は、複数の粒子についての形態データセットと蛍光データセットの少なくとも一部に基づいて複数の粒子の分析の出力を記載しており、複数のパラメータタイプ（例えば、機械的、変形、蛍光、生化学的、その他）に基づいて対象の粒子を特徴づける分析を行うよう機能する。ブロックＳ２６０は、好ましくは上述したプロセッサの実施例に実装されるが、ブロックＳ２６０は、追加であるいは代替的に、形態データセットと蛍光データセットに基づいて分析を作成するように構成した適切な処理エレメントを用いて実行することができる。変形例では、ブロックＳ２６０は、形態データセットから変形特徴セットを抽出する第１モジュールと、蛍光パラメータセットから蛍光パラメータセットを抽出する第２モジュールと；形態データセットと蛍光データセットを、変形特性と蛍光パラメータに基づいて同期させるように構成した第３モジュールと；分析を行うように構成した第４モジュールと、を具えるプロセッサで実装できる。このように、図１６に示すように、ブロックＳ２６０はさらに、形態データセットから変形特性セットを抽出するステップＳ２６１と；蛍光データセットから蛍光パラメータセットを抽出するステップＳ２６２と；形態データセットと蛍光データセットを、変形特性と蛍光パラメータに基づいて事案的に同期させるステップＳ２６３を具えていてもよい。

ブロックＳ２６０及びＳ２６１では、変形特性セットが、核のサイズ、クロマチン脱凝縮、細胞骨格分解／流体化、及び膜障害／溶解といった、表現型を表示する形態特性を提供することが好ましい。変形特性セットは、このように、粒子変形能、粒子真円度、粒子サイズ（例えば、体積、面積、その他）、粒子非対象性、及びその他の適切な形態特性の一またはそれ以上を含む。図１６のブロックＳ２６０とＳ２６１に関連して、この方法は、追加で、ベースライン形態粒子特性を抽出するステップＳ２６４を具えていてもよく、これは、初期粒子体積、初期粒子径、初期粒子非対象性、及びその他の適切なベースライン特性の一またはそれ以上を具える。ブロックＳ２６４における粒子特性の抽出は、米国特許効果第２０１３／０１７７９３５号、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｃｅｌｌ Ｄｅｆｏｒｍａｂｉｌｉｔｙ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ」に記載されているように、あるいはその他の適切な方法で実行できる。ブロックＳ２６０、Ｓ２６１、及びＳ２６４を具える方法２００の変形例では、ベースライン特性を用いて、複数の粒子の各粒子についての変形特性セットを正規化する、及び／又は、その他の適切な方法で分析を作成することができる。

ブロックＳ２６０及びＳ２６２では、蛍光パラメータセットが、生体分子表現型を表す特性を提供することが好ましく、放射した光の強度（例えば、平均強度、ピーク強度）、放射した光の波長、蛍光の運動パラメータ、及びその他の適切な蛍光パラメータの一またはそれ以上を具えていてもよい。ブロックＳ２６４を具える方法２００の変形例と同様に、方法２００は、ベースライン蛍光パラメータＳ２６５（すなわち、粒子の変形前）を抽出するステップを具えていてもよく、これは、初期強度（例えば、初期平均又はピーク強度）、変形前の初期の放射した光の波長、変形前の初期運動パラメータ、及びその他の適切なベースラインパラメータの一またはそれ以上を具える。このベースラインパラメータは、複数の粒子の各粒子についての蛍光パラメータセットを正規化するのに使用することができ、及び／又は、その他の適切な方法で分析を作成するのに使用することができる。

ブロックＳ２６０及びＳ２６３では、形態データセットと蛍光データセットを同期させるステップが、形態データセットと蛍光データセットの少なくとも一つを調整するステップＳ２６６を具えていてもよい。ここで、調整ステップは、フィルタリングによるノイズ除去と、ピーク検出の少なくとも一つを具える。ブロックＳ２６６は、信号のフィルタを適用して、信号ノイズを除去するステップと、ピーク検出アルゴリズムを適用して、粒子の時間依存型シーケンスを認識するステップを具えていてもよい。ブロックＳ２６３は更に、シーケンスマッチングアルゴリズムを実装するステップＳ２６７を具え、形態データセットの事象対時間信号を、蛍光データセットの事象対時間信号と整列させることができる。この例は、図１４に示されている。変形例では、ブロックＳ２６３が更に、検体量のキャリブレーション粒子から作成したデータに基づいて形態データセットと蛍光データセットを同期させるステップＳ２６８を具えていてもよい。例示では、キャリブレーション粒子は、認識可能な変形能によって特徴づけられる硬質蛍光キャリブレーションマイクロスフェアを具えており、蛍光シグネチュアを用いて、時間スタンプに関係なく形態データセットを蛍光データセットに同期させることができる。さらに別の変形例では、変形能（又は、その他の適切な変形特性）と、放射した蛍光強度との関係を用いて、このデータセットをブロックＳ２６３で同期させることができる。しかしながら、形態データセットと蛍光データセットは、その他の適切な方法で同期させることができる。

ブロックＳ２６０で作成した分析には、対象の粒子についての機械的及び生化学的／生物分子マーカ間の相関関係が含まれる。これは、複数の粒子の粒子を特定するのに使用できる、機械的（例えば、変形）特性、蛍光パラメータ、及び／又は、機械パラメータと蛍光パラメータとの組み合わせを認識するのに使用できる。特定のアプリケーションでは、ブロックＳ２６０で作成した分析を用いて、特定の細胞株の活性化状態（例えば、変形能及び活性化マーカの表面発現によって同定される、マイトジェン又は炎症過程による血液単核細胞活性化、サイトカイン又は血液感染による顆粒球の活性化）を、疾病の無標識モニタリング、疾病の診断、疾病の治療、及び移植拒絶反応の予測における重要な関連事項を用いて、認識するのに使用できる。追加のアプリケーションでは、作成した分析を用いて、幹細胞とがん（例えば、ジャーカット及びＨＬ６０）との間の表現型結合性の認識、幹細胞についての分化インディケータの認識に、及び健康な患者又は疾病がある患者（例えば、休止期又は活性化白血球、ＰＢＭＣｓ、及び血中顆粒球、又は胸膜液）からの体液サンプル中の多様な細胞母集団の中の細胞の認識に、使用することができる。このように、ブロックＳ２６０は、更に、分析Ｓ２６９に基づいて複数タイプの表現型マーカのデータライブラリを集めるステップを具えていてもよく、ここでは、このライブラリが、高スループットアプローチを用いて、様々な生物学的粒子についての表現型マーカ（例えば、機械的、変形、蛍光、その他）を特徴づけている。

ブロックＳ２６０における分析を作成するステップは、従って、統計的分析（例えば、相関関係、ｔ−テスト、ＡＮＯＶＡ、その他）を行って、変形と蛍光パラメータ間の相関関係を調べることができる。追加で又は代替的に、ブロックＳ２６０は、分類と回帰ツリー（ＣＡＲＴ）を作成して認識を強化するステップを具えていてもよく、また、更に、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、粒子の正しい認識を評価するステップを具えていてもよい。更にブロックＳ２６０で線形判別分析を用いて、様々な検体量間の同一性及び／又は相違を認識でき、これは、例えば、様々な患者からのサンプルを分類するのに使用できる。

図１５に示すように、この方法は更に、形態データセット、蛍光データセット、及び分析の少なくとも一つを保存する旨を記載した、ブロックＳ２７０を具えていてもよい。ブロックＳ２７０は、複数の粒子の変形特性、複数の粒子の蛍光パラメータ、及び複数の粒子の各粒子についての変形及び蛍光パラメータ間の相関関係に関連するデータを受信するよう機能する。ブロックＳ２７０は、更に、データセット及び／又は分析を作成するのに使用するシステムパラメータを保存するよう機能し、更に、ユーザ又は分析に関連するその他の実態にデータの送信を可能にするよう機能できる。ブロックＳ２７０は、好ましくは、上述したストレージモジュールの実施例を用いて実装されているが、ブロックＳ２７０は、その他の適切なストレージモジュールを用いて実装するようにしてもよい。

当業者は、上述した詳細な説明、及び図面と特許請求の範囲から、本発明の好ましい実施例に、特許請求の範囲に規定した本発明の範囲から外れることなく、変形及び変更を行うことができる旨を認識する。

Claims (15)

1. 検体量中に担持された複数の粒子を変形させ分析するシステムにおいて、当該システムが：
   検体を受けるように構成された入口と、出口とを規定する基体と；
   前記入口と出口に流体連結された流体経路であって、
   前記入口に連結されて前記検体量中の複数の粒子の少なくともいくつかの粒子を共通のストリームラインに集束させるように構成した送達領域と；
   前記送達領域に連結された複数の枝路チャネルであって、前記複数の枝路チャネルのうちの１つが前記粒子のほぼ全てを担持し、残余の枝路チャネルが、ほぼ粒子を含まない流体を担持する、複数の枝路チャネルと；
   前記複数の枝路チャネルの交差部分によって形成された変形領域であって、当該変形領域内流体フローが、前記粒子に変形力を誘発する変形領域と；
   を具える流体経路と；
   前記変形領域を含む前記流体経路の一部を通って対物レンズへ光を伝送するように構成した第１光源を具え、前記対物レンズが前記変形領域からの光を拡大して、前記複数の粒子の内の一又はそれ以上の粒子についての形態データセットを生成するセンサに送るように構成されている、撮像サブシステムと；
   前記流体経路の一部へ光を集束させるように構成した第２光源を具える蛍光サブシステムであって、当該蛍光サブシステムにおいて、前記集束した光が前記複数の粒子上の蛍光ラベルからの放射された光を生成し、前記複数の粒子中の一又はそれ以上の粒子の蛍光を特徴づける蛍光データセットを生成するために、前記放射された光が前記対物レンズによって集められ、かつ光検出器上で合焦される、蛍光サブシステムと；
   前記複数の粒子についての前記形態データセットと前記蛍光データセットに基づいて、前記複数の粒子の表現型分析を出力するように構成したプロセッサと；
   を具えることを特徴とするシステム。
2. 請求項１に記載のシステムにおいて、前記交差部分が、ほぼすべての粒子を担持する粒子枝路チャネルと、実質的に粒子を持たず、実質的に対向する方向においてフローを交差させるよう方向づけられた流体枝路チャネルと、を具えることを特徴とするシステム。
3. 請求項１に記載のシステムにおいて、前記交差部分が、第１及び第２の流体枝路チャネル間に挟まれ、ほぼすべての粒子を担持する粒子枝路チャネルを具え、前記第１及び第２の流体枝路が、前記複数の粒子へピンチングフローを適用することを特徴とするシステム。
4. 請求項２又は３に記載のシステムにおいて、前記粒子枝路チャネルが、前記複数の粒子を、単一ファイル中で実質的に均一速度で、前記変形領域へ送達する集束手段を具えることを特徴とするシステム。
5. 請求項１に記載のシステムにおいて、前記送達領域が、複数の粒子を、慣性集束に基づいてほぼすべての粒子を担持している枝路チャネルに向けるように構成されていることを特徴とするシステム。
6. 請求項１に記載のシステムにおいて、ほぼすべての粒子を担持している前記枝路チャネルが、幅寸法と高さ寸法を有するチャネルを具え、当該幅寸法が高さ寸法より大きく、この高さ寸法に沿って配向され直列に配置された複数の狭窄部を有する、チャネルを具えることを特徴とするシステム。
7. 請求項１に記載のシステムにおいて、前記送達領域が、前記変形領域に入る前に前記複数の粒子を流体力学的に集束させる一又はそれ以上のシース流体を受けるように構成したシース流体入口を具えることを特徴とするシステム。
8. 請求項１に記載のシステムにおいて、前記撮像サブシステム及び蛍光サブシステムが同時に作用して、前記複数の粒子の一またはそれ以上の粒子についての前記形態データセットと前記蛍光データセットを生成するように構成されていることを特徴とするシステム。
9. 請求項１に記載のシステムにおいて、前記撮像サブシステムと蛍光サブシステムが同時に作用して、前記対物レンズとダイクロイックミラーを共用しており、前記ダイクロイックミラーが、前記第１光源と前記第２光源の少なくとも一方からの光を反射させて方向を変え、前記第１の光源と前記第２の光源の他方からの光を伝送するように構成されていることを特徴とするシステム。
10. 請求項１に記載のシステムが更に、前記形態データセットから変形特性セットを抽出するように構成された第１モジュールと、前記蛍光データセットから蛍光パラメータセットを抽出するように構成された第２モジュールと、前記変形領域を通過する各単一粒子について、変形特性と蛍光パラメータに基づいて前記形態データセットと前記蛍光データセットを一時的に同期させるように構成した第３モジュールとを具え、前記第１、第２、及び第３モジュールが、前記プロセッサによって実行するように構成されていることを特徴とするシステム。
11. 請求項１０に記載のシステムにおいて、前記第３モジュールが、前記撮像サブシステムと前記蛍光サブシステムをほぼ同時に電子トリガすることによって、前記形態データセットと前記蛍光データセットを同期させるように構成されていることを特徴とするシステム。
12. 検体量中に担持された複数の細胞を変形させて分析する方法において：
    前記複数の細胞を含む検体を受け取るステップと；
    前記検体量内の複数の細胞を共通のストリームラインに集束させるステップと；
    前記複数の細胞を粒子枝路フローに広げて、細胞を実質的に含まない流体を第１の流体枝路フローに広げるステップと；
    前記粒子枝路フローと前記第１流体枝路フローを変形領域に交差させるステップと；
    第１光源を具える撮像サブシステムを用いて、前記変形領域内の複数の細胞の一またはそれ以上の細胞の変形と形態を特徴づける形態データセットを生成するステップと；
    第２光源を具える蛍光サブシステムを用いて、前記変形領域の上流側又はその中の複数の細胞の一またはそれ以上の細胞の蛍光を特徴づける蛍光データセットを同時に生成するステップと；
    前記複数の細胞についての前記形態データセットと前記蛍光データセットに基づいて前記複数の細胞の表現型分析を出力するステップと；
    を具えることを特徴とする方法。
13. 請求項１２に記載の方法が更に、実質的に細胞を含まない流体を第２流体枝路フローへ広げるステップと、前記粒子枝路フローを前記第１流体枝路フローと前記第２流体枝路フローと交差させるステップであって、前記第１及び第２の流体枝路フローが、前記複数の粒子にピンチングフローを適用するステップを具えることを特徴とする方法。
14. 請求項１２に記載の方法が更に、前記形態データセットと前記蛍光データセットを一時的に同期させるステップを具えることを特徴とする方法。
15. 請求項１４に記載の方法が更に、前記形態データセット、前記蛍光データセット、及び前記表現型分析の少なくとも一つを表示するステップと、当該分析に基づいて、ユーザインターフェースにおいてレンダリングを生成するステップと；を具えることを特徴とする方法。

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