ES2373832T3 - Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf. - Google Patents

Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf. Download PDF

Info

Publication number
ES2373832T3
ES2373832T3 ES08862011T ES08862011T ES2373832T3 ES 2373832 T3 ES2373832 T3 ES 2373832T3 ES 08862011 T ES08862011 T ES 08862011T ES 08862011 T ES08862011 T ES 08862011T ES 2373832 T3 ES2373832 T3 ES 2373832T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
pdgf
binding
variants
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES08862011T
Other languages
English (en)
Inventor
Malin Lindborg
Elin Gunneriusson
Christofer Lendel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Affibody AB
Original Assignee
Affibody AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US12/002,972 external-priority patent/US8937047B2/en
Priority claimed from EP07150394A external-priority patent/EP2077272A1/en
Application filed by Affibody AB filed Critical Affibody AB
Application granted granted Critical
Publication of ES2373832T3 publication Critical patent/ES2373832T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Polipéptido de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-Rß), que comprende un motivo de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en la secuencia de aminoácidos seleccionada de i) EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16X17X18QW NAFIX25X26LX28X29, en la que, de forma independiente entre sí, X2 se selecciona de L, R y I; X3 se selecciona de R, I, L, V, K, Q, S, H, y A; X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T, W, F y V; X7 se selecciona de A, R, D, Q, E, G, K y S; X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S, T y Q; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de R y K; X18 se selecciona de A, R, N, D, C, Q, E, G, L, K, M, S, T, W y V; X25 se selecciona de K, R, Q, H, S, G y A; X26 se selecciona de S y K; X28 se selecciona de V, R, I, L y A; X29 se selecciona de D y K; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia definida en i), y en la que el polipéptido de unión a PDGF-Rß se une a PDGF-Rß de modo que el valor de KD de la interacción es como máximo 1 x 10 -6 M.

Description

Polipéptido derivado de proteína A y capaz de unirse a PDGF.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos que se unen a receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1). También se refiere a nuevos procedimientos y usos de tales polipéptidos en el tratamiento y diagnóstico de diferentes afecciones relacionadas con PDGF-R1.
Antecedentes
El receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1) es una tirosina quinasa que atraviesa la membrana. El ligando de PDGF se compone de combinaciones de las cadenas homólogas A, B, C y D, combinadas con homo o heterodímeros. PDGF-R1 se une a PDGF-BB con alta afinidad y PDGF-AB con baja afinidad. La unión a ligando conduce a dimerización y transfosforilación de tirosinas en el dominio quinasa intracelular de los receptores.
PDGF es un factor importante para regular la proliferación celular, diferenciación celular, crecimiento celular y desarrollo. PDGF-R1 está implicado en angiogénesis y en las etapas tempranas de fibrosis. Este receptor representa unan diana atractiva y potencialmente valiosa, por ejemplo para el tratamiento y formación de imágenes moleculares en por ejemplo enfermedades oncológicas y fibróticas.
Están en desarrollo clínico anticuerpos que bloquean el efecto de PDGF-R1 y la provisión continuada de agentes con una afinidad comparable por este receptor sigue siendo un tema de interés sustancial dentro del campo. También es de gran interés la provisión de usos de tales moléculas en el tratamiento y diagnóstico de enfermedad. Es un objeto de la invención proporcionar nuevos agentes de unión a PDGF-R1, que podrían por ejemplo usarse para diagnóstico, formación de imágenes in vitro o in vivo y aplicaciones terapéuticas.
Sumario de la invención
De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido de unión a receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1), que comprende un motivo de unión a receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en una secuencia de aminoácidos seleccionada de
i) EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16X17X18QW NAFIX25X26LX28X29,
en la que, de forma independiente entre sí,
X2 se selecciona de L, R y I;
X3 se selecciona de R, I, L, V, K, Q, S, H, y A;
X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T, W, F yV;
X7 se selecciona de A, R, D, Q, E, G, K y S;
X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S, T y Q;
X16 se selecciona de N y T;
X17 se selecciona de R y K;
X18 se selecciona de A, R, N, D, C, Q, E, G, L, K, M, S, T, W yV;
X25 se selecciona de K, R, Q, H, S, G y A;
X26 se selecciona de S y K;
X28 se selecciona de V, R, I, L y A;
X29 se selecciona de D y K; y
ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia definida en i),
y en la que el polipéptido de unión a PDGF-R1 se une a PDGF-R1 tal de modo que el valor KD de la interacción es como máximo 1 x 10-6 M.
La definición anterior de una clase de polipéptidos de unión a PDGF-R1 relacionados con secuencia de acuerdo con la invención se basa en un análisis de varias variantes polipeptídicas aleatorias de un armazón parental, que se seleccionaron por su interacción con PDGF-R1 en experimentos de selección. El motivo de unión a PDGF-R1 identificado, o “PBM”, corresponde a la región de unión a diana del armazón parental, constituyendo dicha región dos hélices alfa dentro de un dominio proteico de conjunto de tres hélices. En el armazón parental, los restos aminoacídicos variados de las dos hélices PBM constituyen una superficie de unión para interacción con la parte Fc constante de anticuerpos. En la presente invención, la variación aleatoria de restos de superficie de unión y la selección posterior de variantes han reemplazado la capacidad de interacción con Fc con una capacidad de interacción con PDGF-R1.
Como entenderá el experto en la materia, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión de PDGF-R1 de los polipéptidos de acuerdo con la invención, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Es por lo tanto posible realizar pequeños cambios en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido sin afectar a la función
del mismo. Por lo tanto, la invención abarca variantes modificadas del PBM de i), que son tales que la secuencia resultante es la menos 90 % idéntica a una secuencia que pertenece a la clase definida por i), tal como al menos 93 % idéntica, tal como al menos 97 % idéntica. Por ejemplo, es posible que un resto aminoacídico que pertenezca a un cierto grupo funcional de restos aminoacídicos (por ejemplo, hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) pudiera intercambiarse
5 con otro resto aminoacídico del mismo grupo funcional. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X17 es R. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S y T. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X2 se selecciona de L y R. En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X3 se selecciona de R, I, L, V y S.
10 En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T y
W.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X25 se selecciona de K, R, Q, H y S.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X28 se selecciona de V, R, I y L.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X29 es D.
15 En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X25 es K.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X28 es V.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X3 se selecciona de I y V.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X4 se selecciona de A, R, E y K.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X7 se selecciona de A, R y E.
20 En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X11 se selecciona de A, R, N y E.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X18 se selecciona de R, E, K y V.
En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X2 es L.
Como se describe en detalle en la sección experimental a continuación, la selección de variantes de unión a PDGF-R1 ha conducido a la identificación de secuencias de motivo de unión a PDGF-R1 (PBM) individuales. Estas 25 secuencias constituyen realizaciones individuales de la secuencia de PBM i) en la definición de polipéptidos de unión a PDGF-R1 de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Las secuencias de motivos de unión a PDGF-R1 individuales se presentan en la Figura 1 y como SEC ID Nº: 1-179. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, la secuencia de PBM i) se selecciona de una cualquiera de SEC ID Nº: 2-3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 11-12, SEC ID Nº: 18-19, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 60
30 62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 67-68, SEC ID Nº: 71-72, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80-81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 91-92, SEC ID Nº: 94-97, SEC ID Nº: 101-103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 133, SEC ID Nº: 137, SEC ID Nº: 139-140, SEC ID Nº: 149, SEC ID Nº: 153, SEC ID Nº: 160, SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 170, SEC ID Nº: 174 y SEC ID Nº: 179.
En una realización, el polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención comprende un motivo de unión a 35 receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en la secuencia de aminoácidos seleccionada de
EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16RX18QW NAFIX25X26LX28D,
en la que, independientemente entre sí,
X2 se selecciona de L y R;
40 X3 se selecciona de R, I, L, V, Q y S; X4 se selecciona de A, R, D, E, K y V; X7 se selecciona de A, Q y K; X11 se selecciona de A, R, E y S; X16 se selecciona de N y T;
45 X18 se selecciona de R, G, K, S, T y V; X25 se selecciona de K, R, S y A; X26 se selecciona de S y K; X28 se selecciona de V, R, I y A.
La secuencia de aminoácidos del PBM puede por ejemplo seleccionarse de una cualquiera de SEC ID Nº: 2-3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 60, SEC ID Nº: 72, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 111 y SEC ID Nº:
153.
En realizaciones particulares de la presente invención, el PBM forma parte de un domino proteico de conjunto de tres hélices. Por ejemplo, el PBM puede constituir esencialmente dos hélices alfa con un bucle de interconexión, dentro de dicho dominio proteico de conjunto de tres hélices. En estas realizaciones, el polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención puede comprender en particular una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
i) K-[PBM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLNDXdQ; en la que [PBM] es un motivo de unión a PDGF-R1 como se ha definido anteriormente; Xa se selecciona de A y S; Xb se selecciona de N y E; Xc se selecciona de A y S; Xd se selecciona de A y S; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente.
Dicha secuencia de aminoácidos puede tener al menos 82 %, tal como al menos 84 %, tal como al menos 86 %, tal como al menos 88 %, tal como al menos 90 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 98 % de identidad con las secuencias definidas anteriormente. La secuencia de aminoácidos puede por ejemplo seleccionarse de SEC ID Nº: 180-358. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos i) puede seleccionarse de una cualquiera de SEC ID Nº: 181-182, SEC ID Nº: 184, SEC ID Nº: 186, SEC ID Nº: 190-191, SEC ID Nº: 197-198, SEC ID Nº: 217, SEC ID Nº: 221, SEC ID Nº: 223, SEC ID Nº: 226, SEC ID Nº: 239-241, SEC ID Nº: 243, SEC ID Nº: 246-247, SEC ID Nº: 250-251, SEC ID Nº: 257, SEC ID Nº: 259-260, SEC ID Nº: 262, SEC ID Nº: 265, SEC ID Nº: 270-271, SEC ID Nº: 273-276, SEC ID Nº: 280-282, SEC ID Nº: 284, SEC ID Nº: 288, SEC ID Nº: 290, SEC ID Nº: 295, SEC ID Nº: 298, SEC ID Nº: 312, SEC ID Nº: 316, SEC ID Nº: 318-319, SEC ID Nº: 328, SEC ID Nº: 332, SEC ID Nº: 339, SEC ID Nº: 343, SEC ID Nº: 343, SEC ID Nº: 349, SEC ID Nº: 353 y SEC ID Nº: 358, y puede en particular seleccionarse de una cualquiera de SEC ID Nº: 181-182, SEC ID Nº: 184, SEC ID Nº: 186, SEC ID Nº: 190, SEC ID Nº: 239, SEC ID Nº: 251, SEC ID Nº: 257, SEC ID Nº: 290, SEC ID Nº: 332 y SEC ID Nº: 358.
En realizaciones particulares de la invención dicho domino proteico de conjunto de tres hélices se selecciona de dominios de proteínas receptoras bacterianas. Son ejemplos no limitantes de tales dominios los cinco dominios de tres hélices diferentes de proteína A de Staphylococcus aureus y derivados de los mismos.
Por lo tanto, un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
ADNNFNK-[PBM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK (PBM dentro del dominio A de proteína A estafilocócica); ADNKFNK-[PBM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (PBM dentro del dominio B de proteína A estafilocócica); ADNKFNK-[PBM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK (PBM dentro del dominio C de proteína A estafilocócica);
ADAQQNNFNK-[PBM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK (PBM dentro del dominio D de proteína A estafilocócica); AQHDE-[PBM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK (PBM dentro del dominio E de proteína A estafilocócica); VDNKFNK-[PBM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK (PBM dentro del derivado de proteína Z del dominio B de proteína A estafilocócica); VDAKFAK-[PBM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK (PBM dentro de una variante de un derivado de proteína Z del dominio B de la proteína A estafilocócica); AEAKYAK-[PBM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPS (PBM dentro de una variante de un derivado de proteína Z del dominio B de la proteína A estafilocócica); y una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente y en la que [PBM] es un motivo de unión a PDGF-R1 como se ha definido anteriormente. El polipéptido de la invención puede por ejemplo tener una secuencia que es al menos 81 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 86 %, al menos 88 %, al menos 90 %, al menos 91 % al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 98 % idéntica a la secuencia descrita en el presente documento. En algunas realizaciones de este aspecto de la invención, dicha secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEC ID Nº: 359-537. La secuencia de aminoácidos puede por ejemplo comprender una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 360-361, SEC ID Nº: 363, SEC ID Nº: 365, SEC ID Nº: 369-370, SEC ID Nº: 376-377, SEC ID Nº: 396, SEC ID Nº: 400, SEC ID Nº: 402, SEC ID Nº: 405, SEC ID Nº: 418-420, SEC ID Nº: 422, SEC ID Nº: 425-426, SEC ID Nº: 429-430, SEC ID Nº: 436, SEC ID Nº: 438-439, SEC ID Nº: 441, SEC ID Nº: 444, SEC ID Nº: 449-450, SEC ID Nº: 452-455, SEC ID Nº: 459-461, SEC ID Nº: 463, SEC ID
Nº: 467, SEC ID Nº: 469, SEC ID Nº: 474, SEC ID Nº: 477, SEC ID Nº: 491, SEC ID Nº: 495, SEC ID Nº: 497-498, SEC ID Nº: 507, SEC ID Nº: 511, SEC ID Nº: 518, SEC ID Nº: 522, SEC ID Nº: 528, SEC ID Nº: 532 y SEC ID Nº: 537, y puede en particular comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEC ID Nº: 360-361, SEC ID Nº: 363, SEC ID Nº: 365, SEC ID Nº: 369, SEC ID Nº: 418, SEC ID Nº: 430, SEC ID Nº: 436, SEC ID Nº: 469, SEC ID Nº: 511 y SEC ID Nº: 537.
Un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier aspecto de la invención puede unirse a PDGF-R1 de modo que el valor KD de la interacción es como máximo 1 x 10-7 M, por ejemplo como máximo 1 x 10-8 M.
Los polipéptidos de acuerdo con la invención son ventajosos porque se unen bien a PDGF-R1. Los polipéptidos pueden en particular unirse al domino extracelular de PDGF-R1. Típicamente, los polipéptidos pueden ser relativamente cortos. En virtud de su tamaño pequeño, se espera que muestren una penetración más eficaz en tejido tumoral que los anticuerpos, así como que tengan mejores propiedades de circulación sistémica que los anticuerpos monoclonales (que con frecuencia tienen tiempos de circulación demasiado largos). Por lo tanto, se consideran candidatos adecuados para el desarrollo de agentes de formación de imágenes moleculares. Las posibles aplicaciones adicionales incluyen el uso en desarrollo de fármacos y en procedimientos de exploración cuando se desean agentes de formación de imágenes específicos para medir el resultado de tratamiento de modelos in vivo y posteriormente durante el desarrollo clínico. La formación de imágenes moleculares proporciona una eficacia de lectura directa de un agente farmacéutico dirigido a regular negativamente un receptor de factor de crecimiento, así como para evaluar el efecto antitumoral.
El experto en la materia apreciará que pueden realizarse diversas modificaciones y/o adiciones a un polipéptido de acuerdo con la invención para adaptar el polipéptido a una aplicación específica sin separarse del alcance de la presente invención. Por ejemplo, un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier aspecto de la invención puede extenderse por aminoácidos C terminales y/o N terminales. Dicho polipéptido extendido es un polipéptido que tiene restos aminoacídicos adicionales en la primera y/o la última posición de la cadena polipeptídica, es decir en el extremo N y/o C terminal. El polipéptido puede extenderse por cualquier número adecuado de restos aminoacídicos adicionales, por ejemplo al menos un resto aminoacídico. Cada resto aminoacídico adicional puede añadirse individualmente o en conjunto para, por ejemplo, mejorar la producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento o detección del polipéptido. Tales restos aminoacídicos adicionales pueden comprender uno o más restos aminoacídicos añadidos para el fin de acoplamiento químico. Un ejemplo de esto es la adición de un resto de cisteína. Tales restos aminoacídicos adicionales también pueden proporcionar un “marcador” para purificación o detección del polipéptido tal como un marcador His6 o un marcador “myc” (c-myc) o un marcador “FLAG” para interacción con anticuerpos específicos para el marcador.
Las extensiones de aminoácidos analizadas anteriormente también pueden proporcionar uno o más dominios polipeptídicos con cualquier función deseada, tal como la misma función de unión que el primer dominio de unión a PDGF-R1, u otra función de unión o una función enzimática, función tóxica (por ejemplo una inmunotoxina) o una función de señalización fluorescente o combinaciones de las mismas. En un polipéptido extendido tal de acuerdo con la invención, un polipéptido de unión a PDGF-R1 como se ha descrito anteriormente está presente como un dominio de unión a PDGF-R1 al que se acoplan péptido o proteínas adicionales u otros grupos funcionales en el extremo N y/o C terminal o a cualquier otro resto (específicamente o no específicamente). Un ejemplo es una extensión de aminoácidos que comprende el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína estreptocócica G o un derivado del mismo. Un polipéptido extendido con ABD tal se une a albúmina de suero in vivo y se beneficia de su semivida más larga, que aumenta la semivida neta del polipéptido en sí mismo (véase por ejemplo el documento WO91/01743). Como alternativa, la extensión de aminoácidos puede comprender cualquier otro polipéptido con afinidad por una proteína del suero.
También se abarcan por la presente invención modificaciones y/o adiciones al polipéptido de la invención tales como marcadores y/o agentes terapéuticos que se conjugan químicamente o se unen de otro modo al polipéptido.
Las extensiones, modificaciones y adiciones de aminoácidos como se ha analizado anteriormente pueden acoplarse al polipéptido de la invención por medio de conjugación química (usando procedimientos de química orgánica conocidos) o por cualquier otro medio, tal como expresión del polipéptido de acuerdo con la invención como una proteína de fusión.
En una realización específica de la presente invención, el polipéptido se une al mismo epítopo que PDGF-BB, o suficientemente cercano a él para bloquear la unión del ligando PDGF-BB a PDGF-R1. El polipéptido puede por ejemplo usarse para inhibir la señalización celular uniéndose a un PDGF-R1 en la superficie celular. Dicho bloqueo de la función receptora puede utilizarse para obtener un efecto terapéutico. Como alternativa, la unión del polipéptido a PDGF-R1 puede estimular la activación del receptor proporcionando dimerización del receptor.
En algunas realizaciones de la invención, el polipéptido está presente en forma multimérica, que comprende al menos dos unidades monoméricas polipeptídicas de unión a PDGF-R1, las secuencias de aminoácidos de las cuales pueden ser las mismas o diferentes. Las formas multiméricas del polipéptido pueden ser ventajosas porque pueden tener propiedades de unión potenciadas. Las formas multiméricas preferidas incluyen formas diméricas. Una forma dimérica tal del polipéptido de la invención puede por ejemplo usarse para estimular la activación del receptor.
Las formas multiméricas de los polipéptidos pueden comprender varios dominios adecuados, teniendo cada uno un motivo de unión a PDGF-R1 y formando cada uno un “monómero” dentro del multímero. Estos dominios pueden tener todos la misma secuencia de aminoácidos pero, como alternativa, pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos. Las unidades monoméricas de un polipéptido multimérico pueden unirse por acoplamiento covalente usando procedimientos de química orgánica conocidos o expresarse como uno o más polipéptidos de fusión, por ejemplo en un sistema para expresión recombinante de polipéptidos o unirse de cualquier otra manera, directamente
o mediante un engarce, por ejemplo un engarce de aminoácidos.
En aspectos relacionados de la invención se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido como se ha descrito anteriormente así como un procedimiento para producir un polipéptido tal, comprendiendo el procedimiento expresión del polinucleótido.
Puede usarse un polipéptido de la invención como una alternativa a anticuerpos convencionales o sustancias de bajo peso molecular en diversas aplicaciones médicas, veterinarias y de diagnóstico. El destinatario experto entenderá que los polipéptidos de la invención pueden ser útiles en cualquier procedimiento que se base en afinidad por PDGF-R1 de un reactivo. Por lo tanto, el polipéptido de la invención puede usarse como un reactivo de detección, un reactivo de captura o un reactivo de separación en tales procedimientos, pero también como un agente terapéutico o de diagnóstico en sí mismo o como un medio para dirigir a otros agentes terapéuticos o de diagnóstico, con efectos directos (por ejemplo moléculas tóxicas, toxinas) o indirectos (por ejemplo, vacunas de cáncer, moléculas inmunoestimuladoras) en la proteína de PDGF-R1. Las aplicaciones de diagnóstico incluyen por ejemplo formación de imágenes moleculares para revelar, diagnosticar y examinar la presencia de una enfermedad, tales como un tumor, in vivo en el cuerpo de un sujeto mamífero.
En un aspecto de la invención se proporciona por lo tanto un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención para su uso como un medicamento, por ejemplo para tratamiento de una afección relacionada con PDGF-R1. En este caso, el polipéptido de unión a PDGF-R1 de la invención se usa in vivo para obtener un efecto terapéutico, por ejemplo inhibiendo la señalización celular por unión a un PDGF-R1 en una superficie celular. Se proporciona también un polipéptido de unión a PDGF-R1 para su uso en diagnóstico, tal como en el diagnóstico de una afección relacionada con PDGF-R1.
En otros aspectos de la invención, los polipéptido de unión a PDGF-R1 pueden usarse en la dirección de agentes terapéuticos o de diagnóstico, tanto in vivo como in vitro, a células que expresan PDGF-R1, particularmente a células que sobreexpresan PDGF-R1. Se proporciona por lo tanto una combinación de un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención y un agente terapéutico. En una realización, dicha combinación se usa como un medicamento, por ejemplo para el tratamiento de una afección relacionada con PDGF-R1. Se proporciona además, en un aspecto relacionado de la invención, una combinación de un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención y un agente de diagnóstico. Dicha combinación puede usarse en el diagnóstico de una afección relacionada con PDGF-R1, por ejemplo en formación de imágenes moleculares de células que sobreexpresan PDGF-R1. Además del desarrollo de agentes de formación de imágenes moleculares para la clínica, existe una aplicación para agentes de formación de imágenes preclínicas específicos para medir el resultado de tratamiento de modelos in vivo y posteriormente durante el desarrollo clínico. La formación de imágenes moleculares debería proporcionar una lectura directa de la eficacia de un agente farmacéutico dirigido a regular negativamente un receptor por ejemplo PDGF-R1, así como para evaluar el efecto antitumoral.
En un aspecto relacionado de la presente invención, se proporciona un procedimiento de tratamiento de una afección relacionada con PDGF-R1, que comprende administrar un polipéptido de unión a PDGF-R1 o combinación como se ha descrito anteriormente a un sujeto mamífero que lo necesite. Por lo tanto, en el procedimiento de tratamiento de la invención, el sujeto se trata con un polipéptido de unión a PDGF-R1 o una combinación de acuerdo con la invención. En una realización más específica de dicho procedimiento, dicha unión de dicho polipéptido de unión a PDGF-R1 o dicha combinación con un PDGF-R1 del sujeto inhibe o estimula la activación del receptor. Dicha unión puede por ejemplo inhibir la señalización del receptor. También se proporciona un procedimiento para diagnóstico de una afección relacionada con PDGF-R1 en un sujeto mamífero, que comprende administrar un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la invención o una combinación de diagnóstico como se ha descrito anteriormente, al sujeto para los fines de obtener un diagnóstico.
En realizaciones de los usos y procedimientos de tratamiento anteriormente descritos, dicha afección puede seleccionarse de enfermedad cancerosa, tal como gliomas, sarcomas y leucemias; enfermedades vasculares, tales como aterosclerosis, reestenosis, hipertensión pulmonar y enfermedades retinales; enfermedades fibróticas, tales como fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, esclerodermia, glomeruloesclerosis y fibrosis cardiaca.
Las expresiones “de unión a PDGF-R1” y “afinidad de unión por PDGF-R1” como se usan en la presente memoria descriptiva se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede ensayarse por ejemplo por el uso de tecnología de resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento Biacore (GE Healthcare). Por ejemplo como se describe en los ejemplos posteriores, la afinidad de unión a PDGF-R1 puede ensayarse en un experimento en el que PDGF-R1, o un fragmento de PDGF-R1 tal como el dominio extracelular, se inmoviliza en una microplaca sensora
del instrumento y la muestra que contiene el polipéptido a ensayar se pasa sobre la microplaca. Como alternativa, el polipéptido a ensayar se inmoviliza en una microplaca sensora del instrumento y una muestra que contiene PDGF-R1, o fragmento del mismo, se pasa sobre la microplaca. El experto en la materia puede interpretar después los resultados obtenidos por tales experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la unión del polipéptido a PDGF-R1. Si se desea una medida cuantitativa, por ejemplo para determinar un valor KD para la interacción, también pueden usarse procedimientos de resonancia de plasmón superficial. Los valores de unión pueden por ejemplo definirse en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). PDGF-R1 se inmoviliza en una microplaca sensora de la medición y se preparan muestras del polipéptido cuya afinidad va a determinarse por dilución en serie y se inyectan sobre la microplaca. Los valores de KD pueden después calcularse a partir de los resultados usando por ejemplo el modelo de unión de Langmuir 1:1 del software BIAevaluation 4.1 proporcionado por el fabricante del instrumento. El PDGF-R1 o fragmento del mismo puede por ejemplo comprender la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID Nº: 540 (domino extracelular de PDGF-R1) o SEC ID Nº: 539 (PDGF-R1). Puede usarse por ejemplo el dominio extracelular de PDGF-R1 humano recombinante (restos aminoacídicos 1-530, Gronwald y col, 1998, PNAS 85) proporcionado por R&D Systems, Nº 385-PR/CF.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una lista de las secuencias de aminoácidos de los ejemplos de motivos de unión a PDGF-R1 comprendidos en polipéptidos de unión a PDGF-R1 de la invención (SEC ID Nº: 1-179), ejemplos de polipéptidos de unión a PDGF-R1 de 49 restos aminoacídicos de longitud de acuerdo con la invención (SEC ID Nº: 180-358) y ejemplos de polipéptidos de unión a PDGF-R1 de 58 restos aminoacídicos de longitud de acuerdo con la invención (SEC ID Nº: 359-537), así como las secuencias de proteína Z (SEC ID Nº: 538), la entrada de Swiss-Prot P09619 de PDGF-R1 humano (restos aminoacídicos 1-1106, SEC ID Nº: 539) y la entrada de Swiss-Prot P09619 del dominio extracelular de PDGF-R1 humano (restos aminoacídicos 33-531 de PDGF-R1, SEC ID Nº: 540). Las Figuras 2A-C muestran el resultado de análisis de unión realizado en un instrumento de Biacore para investigar la unión de diferentes variantes Z monoméricas a receptores de PDGF. Se inyectaron ocho variantes Z diferentes en duplicados sobre superficies de microplacas Biacore con receptores de PDGF inmovilizados. A) Muestra la inyección sobre PDGF-R1 humano, B) muestra la inyección sobre PDGF-R1 murino y C) muestra la inyección sobre PDGF-Ra humano. Las variantes Z se enumeran en dos grupos, las variantes Z individuales en cada grupo de variante Z que corresponden de arriba a abajo a curvas individuales en cada grupo de curvas. Las Figuras 3A-D muestran el resultado de un ensayo de epítopos de moléculas variantes Z en PDGF-R1. Se inyectaron analitos que contenían diversas concentraciones de moléculas variantes Z y una concentración constante de PDGF-R1 sobre PDGF-BB inmovilizado. A) Muestra Z01977, B) muestra Z01980, C) muestra Z01982 y D) muestra un control negativo (ZA1). Las concentraciones relativas de PDGF-R1 y variante Z se muestran en relación con cada grupo de curvas. Se ven analitos que contienen mayores concentraciones de molécula variante Z y tampón HBS-EP cerca de la línea basal. La Figura 4 es una visión de conjunto de las selecciones realizadas en el Ejemplo 1 (A) y en el Ejemplo 4 (B) que muestran concentraciones de diana (nM) y número de lavados (en paréntesis). La selección de la primera biblioteca, (A), se realizó en cuatro ciclos divididos inicialmente en dos pistas (I y II). En el segundo ciclo de selección, estas se dividieron adicionalmente en dos pistas (Ia y Ib, IIa y IIb), dando como resultado un total de cuatro pistas. Se realizaron selecciones de pista Ia y Ib frente a PDGF-R1 no biotinilado y se realizaron selecciones de pista IIa y IIb frente a PDGF-R1 biotinilado. Se realizó inicialmente selección de la biblioteca madura, (B), en cuatro pistas. Estas se dividieron adicionalmente en el ciclo dos, dando como resultado un total de seis pistas. La selección se realizó en cuatro ciclos. Las Figuras 5A-C muestran el resultado de un análisis de unión realizado en un instrumento Biacore. Se ensayaron diferentes variantes Z monoméricas de la biblioteca madura (Ejemplo 4) con respecto a su unión a receptores de PDGF. A) Muestra la unión a PDGF-R1 humano, B) muestra la unión a PDGF-R1 murino y C) muestra la unión a PDGF-Ra humano. Se inyectaron cinco variantes Z diferentes en duplicados o triplicados sobre superficies de microplaca de Biacore con receptores de PDGF inmovilizados; Z02558, Z02516, Z02483, Z02477 y Z02465. Se ejecutaron dos variantes Z de la selección en el Ejemplo 1 como referencias (Z01977 y Z01982), así como una inyección de tampón de ejecución HBS-EP. Las Figuras 6A-C muestran sensogramas de experimentos cinéticos realizados en un instrumento Biacore con ajuste de curva en un modelo de unión de Langmuir 1:1. Se inyectaron diversas concentraciones de las diferentes variantes Z A) Z01982, B) Z02465 y C) Z02483 en PDGF-R1 humano inmovilizado. Las curvas rectas representan el modelo ajustado. Las Figuras 7A-D muestran imágenes del experimento de inmunofluorescencia descrito en el Ejemplo 5. Las imágenes muestran células AU565 que expresan PDGF-R1 teñidas con diferentes anticuerpos o variantes Z: A) anticuerpo de cabra anti-PDGF-R1, B) His6-(Z02465)2-Cys, C) His6-(Z02483)2-Cys y D) His6-(Z02516)2-Cys. La Figura 8 muestra el resultado del experimento de citometría de flujo descrito en el Ejemplo 5. La Figura muestra titulación de His6-(Z02465)2-Cys (+), His6-(Z02483)2-Cys (_) y His6-(Z02516)2-Cys (.) conjugados con Alexa Fluor® 647 en células AU565 que expresan PDGF-R1. La intensidad de fluorescencia media se representó frente a concentración logarítmica (ng/ml) de variantes Z.
Ejemplos
Se usaron los siguientes materiales a lo largo del presente trabajo excepto cuando se indique otra cosa.
•
Cepa de Escherichia coli RR1iM15 (Rüther, Nucleic Acids Res 10: 5765-5772, 1982)
•
El domino extracelular de PDGF-R1 humano recombinante con una fusión de Fc C terminal y marcador His6 (R&D Systems, Nº 385-PR/CF)
•
PDGF-R1-Fc murino (R&D Systems, Nº 1042-PR/CF)
•
PDGF-sRa humano (R&D Systems, Nº 322-PR/CF)
•
PDGF-BB (R&D Systems Nº 220-BB/CF)
Ejemplo 1: Selección y exploración de polipéptidos de unión a PDGF-R1
Materiales y procedimientos
Biotinilación de proteína diana: El domino extracelular de PDGF-R1 humano recombinante se biotiniló con un exceso molar 10x de Sulfo-NHS-LC-Biotina EZ-link (Pierce Nº 21327) en PBS (fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,68 mM, pH 7,4). Para retirar cualquier exceso de biotina, se realizó un intercambio de tampón en columnas PD-10 de desalación (GE Healthcare Nº 17-0851-01), preequilibradas con PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Preparación de perlas de estreptavidina acopladas con Z00000 y revestidas con Fc:
Se acopló Z00000 biotinilada (Affibody AB, Nº 10.0623.02.0005), es decir proteína Z (SEC ID Nº: 538) como se describe en Nilsson y col, Prot Eng 1: 107-113, 1987, con perlas magnéticas revestidas de estreptavidina (Estreptavidina Dynabeads® M-280, Dynal Nº 112.06). Se añadieron 15 !g de (Z00000)2-Cys-biotina por mg de perlas y las perlas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA). Las perlas se lavaron con PBS-T 0,1 (PBS complementado con Tween 20 0,1 %). Las perlas acopladas a Z00000 se revistieron a continuación con IgG1-Fc humano policlonal (Jackson Immuno Research Nº 009-000-008) por incubación de extremo sobre extremo durante 1 hora a TA usando 4 !g de Fc por mg de perlas acopladas a Z00000. Las perlas se lavaron con PBS-T 0,01 antes de su uso en la preselección descrita posteriormente.
Selección de presentación de fagos de polipéptidos de unión a PDGF-R1: Se usó una biblioteca de variantes aleatorias de proteína Z presentada en bacteriófagos, construida en fagémido pAffi1/pAY00065 como se describe en Grönwall y col, J Biotechnol 128: 162-183 (2007), para seleccionar polipéptidos de unión a PDGF-R1. La selección se realizó en cuatro ciclos divididos inicialmente en dos pistas (I y II). En el segundo ciclo de selección, estas se dividieron adicionalmente en dos pistas, dando como resultado un total de cuatro pistas (Ia=alta concentración de diana, Ib=baja concentración de diana, IIa=alta concentración de diana y IIb=baja concentración de diana). Las pistas Ia y Ib se realizaron frente a PDGF-R1 no biotinilado y las pistas IIa y IIb frente a PDGF-R1 biotinilado. Se muestra una visión de conjunto de la estrategia de selección en la Figura 4A.
Se preparó reserva de biblioteca de fagos de acuerdo con procedimientos anteriormente descritos (Nord y col, Nat Biotech 15: 772-777 (1997); Hansson y col, Immunotechnology 4: 237-252 (1999)). Antes de la selección, la reserva de fagos se precipitó dos veces en PEG/NaCl (polietilenglicol (PEG) 20 %, NaCl 2,5 M) y se disolvió en 1 ml de tampón de selección (gelatina 0,1 % en PBS-T 0,1). Para reducir la cantidad de aglutinantes de fondo, se realizó una preselección por incubación de la reserva de fagos con perlas de estreptavidina acopladas a Z00000 biotinilada revestidas con proteína Fc (pista I) o con perlas de estreptavidina (pista II) durante 1 h a TA. Todos los tubos y perlas usados en la selección se prebloquearon con tampón de selección.
En el ciclo 1 de la selección, el sobrenadante resultante de la preselección se mezcló con PDGF-R1 100 nM (pista I)
o PDGF-R1 biotinilado 100 nM (pista II), seguido de incubación en rotación continua durante 2 horas a TA. Los complejos de diana-fago se capturaron en perlas de estreptavidina mediante Z00000 biotinilada (0,5 mg de perlas, 20 minutos, pista I) o directamente en perlas de estreptavidina (0,77 mg de perlas, 15 minutos, pista II). Los fagos unidos a perla se lavaron 2 veces con 1000 !l de PBS-T 0,1. Después del lavado, los fagos unidos se eluyeron con 500 !l de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,2 seguido de neutralización inmediata con 50 !l de Tris-HCl, pH 8,0 y 450 !l de PBS. Las partículas de fago seleccionadas se amplificaron como se describe posteriormente y se prepararon nuevas reservas de fagos entre cada ciclo. La reserva de fagos, es decir fagos que entraban en el ciclo de selección y partículas de fago eluidas se titularon después de cada ciclo de selección.
En el ciclo 2, las pistas de selección I y II se dividieron respectivamente en pistas de selección Ia y Ib y pistas IIa y IIb. Por lo tanto, las nuevas reservas de fago preparadas se incubaron con PDGF-R1 50 nM (Ia) o 20 nM (Ib) en tampón de selección en rotación continua durante 2 horas a TA. Se capturaron complejos de diana-partícula de fago como en el ciclo 1 con 0,25 mg (Ia) o 0,1 mg (Ib) de perlas durante 20 (Ia) o 15 (Ib) minutos. De forma similar, se incubaron reservas de fagos con PDGF-R1 biotinilado 50 nM (IIa) o 20 nM (IIb) en tampón de selección, seguido de captura con 0,4 mg (IIa) o 0,15 mg (IIb) de perlas. El lavado se realizó como en el ciclo 1 pero con 4 lavados. Se realizó elución como en el ciclo 1.
En el ciclo 3, se incubaron reservas de fago con PDGF-R1 25 nM (Ia) o 4 nM (Ib) en rotación continua como se ha descrito anteriormente, seguido de captura con 0,15 mg (Ia) o 0,1 mg (Ib) de perlas. De forma similar, se incubaron reservas de fagos con PDGF-R1 biotinilado 25 nM (IIa) o 4 nM (IIb) y se capturaron con 0,2 mg (IIa) o 0,1 mg (IIb) de perlas. El lavado se realizó como en el ciclo 2 pero con 6 lavados. Se realizó elución como en el ciclo 1.
En el último ciclo de selección, se incubaron reservas de fago con PDGF-R1 12,5 nM (Ia) o 0,8 nM (Ib) en rotación continua y se capturaron con 0,15 mg (Ia) o 0,1 mg (Ib) de perlas. De forma similar, se incubaron reservas de fagos con PDGF-R1 biotinilado 12,5 nM (IIa) o 0,8 nM (IIb) en rotación continua y se capturaron con 0,2 mg (IIa) o 0,1 mg (IIb) de perlas. El lavado se realizó como en el ciclo 3 pero con 12 lavados. La elución se realizó como en el ciclo 1.
Amplificación de partículas de fago: Se infectaron células E. coli RR1iM15 de fase logarítmica con 950 !l de partículas de fago eluidas durante 20 minutos a 37 ºC después de cada ciclo de selección. Las fagos que aún estaban unidos a perlas después de la elución se amplificaron de forma similar. Después de 20 minutos de incubación a 37 ºC, las células infectadas con fago eluido y las células infectadas con fago unido a perla que se originaban del mismo ciclo y pista de selección, se agruparon y se sedimentaron por centrifugación. El sedimento se disolvió en un volumen pequeño de medio TSB-YE (TSB 30 g/l, extracto de levadura 5 g/l) y se extendieron en placas de extracción de levadura de triptona (TYE: agar 15 g/l, agua con triptona 10 g/l (Merck), extracto de levadura 5 g/l, NaCl 3 g/l. glucosa 2 % y ampicilina 0,1 g/l), seguido de incubación durante una noche a 37 ºC. En el ciclo de selección final, las bacterias se diluyeron antes de extenderlas sobre placas TYE para formar colonias sencillas a usar en exploración de ELISA.
Se resuspendieron bacterias infectadas con fagos crecidas en las placas TYE en medio TSB. Se preparó una cantidad de las células resuspendidas como reserva de glicerol y se almacenaron a -20 ºC. Las células suspendidas correspondientes a 100-1000 veces el número de fagos eluidos se inocularon en medio TSB-YE complementado con glucosa 2 % y ampicilina 100 !g/ml. Las células se cultivaron hasta fase log a 37 ºC. Se infectó una cantidad de células correspondiente a la misma cantidad de células usada para inoculación con un exceso 20x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs Nº NO315S) durante 30 minutos a 37 ºC. Las células se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio TSB-YE complementado con IPTG 100 !M (isopropil-1-D-1tiogalactopiranósido 1 M), kanamicina 25 !g/ml y ampicilina 100 !g/ml y se cultivó durante una noche a 30 ºC. Los cultivos de una noche se centrifugaron y las partículas de fago en el sobrenadante se precipitaron dos veces con tampón PEG/NaCl. Finalmente, los fagos se resuspendieron en tampón de selección antes de entrar en el siguiente ciclo de selección.
Exploración de ELISA de variantes Z: Para ensayar si las moléculas variantes Z podían de hecho interaccionar con el PDGF-R1, se realizó un ELISA. Las variantes Z se produjeron inoculando colonias sencillas, preparadas como se ha descrito anteriormente, en 1 ml de medio TSB-YE complementado con ampicilina 100 !g/ml e IPTG 0,1 mM en placas de pocillos profundos (Nunc Nº 278752). Las placas se incubaron durante 18-24 horas a 37 ºC. Después de la incubación, se realizaron repeticiones de placas transfiriendo una pequeña fracción de cada cultivo a placas de 96 pocillos con glicerol 15 % para almacenamiento a -20 ºC. Las células restantes se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 300 !l de PBS-T 0,05 (PBS complementado con Tween 20 0,05 %) y se congelaron a -80 ºC para liberar la fracción periplásmica de las células. Las muestras congeladas se descongelaron en un baño de agua y las células se sedimentaron por centrifugación. El sobrenadante periplásmico contenía las variantes Z como fusiones con un dominio de unión a albúmina (ABD, GA3 de proteína G de cepa de Streptococcus G148), expresado como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Grönwall y col, mencionado anteriormente). Z##### se refiere a variantes Z individuales.
Se revistió media área de placas de ELISA de 96 pocillos (Costar Nº 3690) con 50 !l/pocillo de tampón de revestimiento (carbonato sódico 50 mM, pH 9,6) que contenía albúmina de suero humano 6 !g/ml (HSA, Sigma Nº A3782) y se incubó durante una noche. La solución de HSA se retiró por vertido y los pocillos se bloquearon con 100 !l de PBS-T 0,1 complementado con solución de leche en polvo sin grasa 2 % (Semper AB) durante 1 h a TA. La solución de bloqueo se descartó y se añadieron 50 !l de solución periplásmica a los pocillos y se incubó durante 1,5 horas a TA con agitación lenta. Los sobrenadantes se retiraron por vertido y los pocillos se lavaron 4 veces con PBS-T 0,05. Se añadieron 50 !l de una mezcla que contenía PDGF-R1 tanto biotinilado como no biotinilado a una concentración de 4,5 !g/ml en PBS-T 0,1 a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1,5 horas a TA seguido de lavado 4x en PBS-T 0,05. Las placas de control de IgG-Fc se prepararon por adición de Fc 3 !g/ml de IgG humana en 50 !l de PBS-T a los pocillos. Las placas de control se incubaron durante 1,5 horas a TA y se lavaron como se ha descrito anteriormente. Se añadió un anticuerpo contra Fc (DAKO, Nº P0214), marcado con peroxidasa de rábano rusticano y se diluyó 1:4000 en PBS-T 0,1, a los pocillos. Después de lavar como se ha descrito anteriormente, se añadieron 50 !l de sustrato de TMB ImmunoPure (Pierce Nº 34021) a los pocillos y las placas se trataron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Todas las etapas de bloqueo a lectura se realizaron en un robot Tecan Genesis Freedom 200 (Tecan Group LTD). La absorbancia de los pocillos se leyó a 450 nm en un lector de ELISA Tecan Ultra 384 (Tecan) y se evaluó con software Magellan v. 5.0 (Tecan).
Secuenciación: A partir de la exploración de ELISA, se seleccionaron los clones considerados positivos para secuenciación. Los fragmentos de PCR se amplificaron de colonias sencillas usando un programa de PCR convencional y los cebadores AFFI-21 (5’-tgcttccggctcg-tatgttgtgtg) y AFFI-22 (5’-cggaaccagagccaccaccgg). La
secuenciación de fragmentos amplificados se realizó usando el oligonucleótido biotinilado AFFI-72 (5’-biotinacggaaccagagccaccaccgg) y un kit de secuenciación en ciclo BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems), usado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las reacciones de secuenciación se purificaron uniendo a perlas revestidas con estreptavidina magnéticas usando un Magnatrix 8000 (Magnetic Biosolution) y se analizaron en Analizador Genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems). Los resultados de secuenciación se importaron y analizaron con un software ALD LIMS Nautilus™ 2003 R2 B3 (Thermo Electronics Corp.).
Subclonación de variantes Z: Se amplificaron variantes Z monoméricas y diméricas de vectores pAffi1/pAY00065. Se realizó una PCR usando diferentes pares de cebadores y los fragmentos génicos resultantes se purificaron e hibridaron en tampón de ligasa.
Los fragmentos génicos hibridados se subclonaron en el vector pAY01448, proporcionando un marcador His6 N terminal (His6-Z#####) y en el vector pAY01449, proporcionando un marcador His6 N terminal y una cisteína C terminal (His6-(Z#####)2-Cys). Las variantes Z de unión a PDGF-R1 se subclonaron como monómeros en pAY01448 y como dímeros en pAY01449 y las construcciones codificadas por los vectores de expresión fueron MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD para los monómeros y MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VDC para los dímeros Para los dímeros, se usó una ligación de tres partes para inserción de ambos fragmentos de inserto en el vector en la misma etapa. Se ligaron fragmentos génicos hibridados y vectores de expresión digeridos con Accl y desfosforilados en tampón de ligasa y se electroporaron en células E. coli TOP1 0 electrocompetentes. Las células transformadas se extendieron sobre placas TBAB (base de agar sangre de triptosa 30 g/l) complementadas con kanamicina 50 !g/ml, seguido de incubación a 37 ºC durante una noche. Las colonias se exploraron usando PCR y las longitudes de fragmentos de PCR se verificaron en geles de agarosa. Para verificar las secuencias, se realizó secuenciación con Kit de Secuenciación en Ciclo BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems), seguido de análisis en un Analizador Genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems) y evaluación usando software Sequencher™
4.0.5. (Gene Codes Corporation).
Se preparó reserva de AND plasmídico a partir de los clones secuenciados y se depositó en -80 ºC. Además, se transformaron células E. coli BL21 (DE3) con los plásmidos, a través de electroporación (construcciones monoméricas) o a través de transformación de células químicamente competentes (construcciones diméricas).
Resultados
Selección de presentación de fagos de polipéptidos de unión a PDGF-R1: Se realizaron cuatro ciclos de selecciones de presentación de fagos frente a PDGF-R1 humano no biotinilado (pista I) y biotinilado (pista II) fusionado con la parte Fc de IgG. Se capturaron complejos de diana-partícula de fago en perlas revestidas de estreptavidina con (I) o sin (II) Z00000-biotina acoplada a perla. Los cuatro ciclos de selección se realizaron con Ia) diana no biotinilada, alta concentración de diana, Ib) diana no biotinilada, baja concentración de diana, IIa) diana biotinilada, alta concentración de diana y IIb) diana biotinilada, baja concentración de diana. Para cada ciclo de selección, el número de lavados se aumentó. Las titulaciones de partículas de fago y los rendimientos se calcularon después de cada ciclo de selección. El rendimiento de partículas de fago (partículas de fago fuera/partículas de fago dentro) aumentó para cada ciclo (excepto el segundo), indicando un enriquecimiento de clones de unión a diana.
Exploración de ELISA de variantes Z: Los clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección se produjeron en placas de 96 pocillos y se exploraron con respecto a actividad de unión a PDGF-R1 en un ELISA. En paralelo, se ensayó la unión a Fc para cada clon. En total se exploraron 93 clones de cada pista de selección (Ia, Ib, IIa, IIb). Las mediciones de absorbancia mostraron muchos clones claramente positivos para PDGF-R1 y unos pocos clones positivos para Fc. Se usó una molécula variante Z de selecciones frente a CD33 como controles positivos y negativos. El control positivo se detectó con CD33-Fc humano y el control negativo no se detectó. Secuenciación: Se realizó secuenciación para los clones con los valores de mayor absorbancia frente a PDGF-R1 y con valores de baja absorbancia frente a Fc, es decir valores iguales a valores de absorbancia de fondo, en la exploración de ELISA. En total, se ejecutaron 147 clones positivos para PDGF-R1. La mayoría de los clones se hallaron en varias copias. Sin embargo, se identificaron once nuevas variantes Z. Se proporcionó a cada variante un número de identificación único ##### y las variantes individuales se denominan Z#####. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 restos aminoacídicos de largo se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 359
369. Los motivos de unión a PDGF-R1 deducidos de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 1-11. Las secuencias de aminoácidos de los péptidos de 49 restos aminoacídicos de largo que se ha predicho que constituyen el conjunto de tres hélices completo dentro de cada una de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 180-190.
Las secuencias únicas se agruparon juntas en un grupo de secuencias similares con una disimilitud interna menor de aproximadamente 25 % (resultados no mostrados). La similitud de secuencia sugiere que las variantes Z se unen a la misma superficie de unión en el receptor PDGF-R1.
Subclonación de variantes Z: Los clones únicos se seleccionaron para subclonación en los vectores de expresión pAY01448 y pAY01449 como monómeros y dímeros, respectivamente. La clonación dio como resultado ocho monómeros (Z01977, Z01978, Z01980, Z01981, Z01982, Z01983, Z01994 y Z01995) y siete dímeros (dímeros de Z01976, Z01977, Z01980, Z01982, Z01983, Z01994 y Z01995).
Ejemplo 2: Producción y caracterización de variantes Z
Materiales y procedimientos
Expresión y purificación de proteínas: Se dejaron crecer cultivos de E. coli BL21 (DE3) transformados como se subclonaron en el Ejemplo 1 hasta una densidad óptica de aproximadamente 1 (diluido 10x) y se indujo expresión proteica por adición de IPTG 1 M (0,5 ml/l de cultivo). Los cultivos se recogieron 5 horas después de la inducción, por 20 minutos de centrifugación a 15900 g. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se recogieron y almacenaron a -20 ºC antes de su uso adicional.
Las variantes Z de unión a PDGF-R1 se purificaron de sedimentos celulares en condiciones desnaturalizantes en columnas Ni-NTA Superflow (Qiagen) y se intercambió el tampón a PBS usando columnas PD-10 (GE Healthcare). Los niveles de expresión de proteínas solubles e insolubles se analizaron usando SDS-PAGE por determinación ocular de geles teñidos con Coomassie. Las variantes Z purificadas que no eran para usarse directamente se separaron en alícuotas y se almacenaron a -80 ºC.
Caracterización de proteínas: La concentración de las variantes Z purificadas (en forma His6-Z##### y en forma His6-(Z#####)2-Cys) se determinó por mediciones de absorbancia a 280 nm usando coeficientes de extinción teóricos. La pureza se estimó por análisis de SDS-PAGE en geles de NuPAGE™ 4-12 % de 10 pocillos (Invitrogen) usando tinción azul de Coomassie. Para verificar la identificad y para determinar los pesos moleculares de variantes Z purificadas, se realizó un análisis de EM/CL en un sistema Agilent 1100 LC/MSD (Agilent Technologies). Análisis de CD: Las variantes Z purificadas se descongelaron y se diluyeron en PBS a 0,5 mg/ml. Para cada variante Z diluida se obtuvo un espectro de CD a 250-195 nm a 37 ºC. Además, se realizó una medición de temperatura variable (VTM) para determinar la temperatura de fusión (Tm). En la VTM, la absorbancia se midió a 221 nm mientras que la temperatura se elevó de 20 a 90 ºC, con una pendiente de temperatura de 5 ºC/minuto. Las mediciones de CD se realizaron en un espectropolarímetro J-810 de Jasco (Jasco Scandinavia AB) usando una célula con una longitud de ruta óptica de 1 mm.
Análisis de unión de Biacore: Las interacciones de ocho variantes Z de unión a PDGF-R1 monoméricas marcadas con His6 con PDGF-R1 humano, PDGF-R1-Fc murino y PDGF-sRa humano se analizaron en un instrumento Biacore (GE Healthcare). Los tres receptores se inmovilizaron en diferentes celdas de flujo en la capa de dextrano carboxilado de una superficie de microplaca CM5 (GE Healthcare). La inmovilización se realizó usando química de acoplamiento de aminas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Una superficie de celda de flujo en la microplaca se activó y se desactivó para su uso como blanco durante inyecciones de analitos. Los analitos, es decir variantes Z diluidas en tampón de ejecución HBS-EP (GE Healthcare) a una concentración final de 5 !M se inyectaron en orden aleatorio por duplicado a un caudal de 10 !l/minuto durante 3 minutos. Después de 3 minutos de disociación, las superficies se regeneraron con una inyección de HCl 25 mM. Los resultados se analizaron en software BiaEvaluation (GE Healthcare). Las curvas de la superficie de blanco se restaron de las curvas de las superficies de ligando.
Ensayo de epítopos: La interacción del receptor PDGF-R1 con su ligando natural PDGF-BB en presencia de tres variantes Z diferentes (Z01977, Z01980 y Z01982 en forma His6-Z#####) se analizó en un instrumento Biacore (GE Healthcare). Se inmovilizó PDGF-BB humano en la capa de dextrano carboxilado de dos celdas de flujo en una superficie de microplaca CM5 de Biacore. La densidad de ligando fue diferente en las dos celdas de flujo. Se prepararon analitos que contenían PDGF-R1 100 nM mezclado con diversas concentraciones de variantes Z marcadas con His6 monoméricas por dilución en el tampón de ejecución HBS-EP. Se usó una variante Z específica para una proteína irrelevante (péptido 1 amiloide, A1) como un control negativo. Los analitos se inyectaron a un caudal de 10 !l/minuto durante 3 minutos. Después de 3 minutos de disociación, las superficies se regeneraron con dos inyecciones de HCl 10 mM. Los resultados se analizaron como se ha descrito anteriormente. Análisis de transferencia puntual: Se ensayaron siete variantes Z de unión a PDGF-R1 con respecto a especificidad por análisis de transferencia puntual. Las variantes Z se ensayaron frente a macroglobulina alfa 2 (MP biomedicals/Cappel, Nº 55833), glicoproteína ácida alfa-1 (RDI, Nº RD)-SCP-153-1), alfa-1 antiquimiotripsina (RDI, Nº RDI-SCP-159-0), alfa1-antitripsina (RDI, Nº RDI-SCP-165-5), complemento C3 (RDI, Nº RDI-SCP-150-0), complemento C4 (RDI, Nº RDISCP-151-0), fibrinógeno (Enzyme research, Nº 031015E), haptoglobulina (RDI, Nº RDI-SCP-119-1), hemopexina (Agilent), Fc de IgG1 humana, policlonal (Jackson Immuno Research, Nº 009-000-008), holotransferrina (Sigma, Nº T0665), IgA humana (Bethyl, Nº P80-102), IgE humana (Fitzgerald, Nº 30 A101), IgG humana (Sigma, Nº G4386), IgM humana (Sigma, Nº 18260), PDGF-sRa humano (R&D Systems, Nº 322-PR/CF), Albúmina de Suero humano (HSA, Sigma, Nº A3782), PDGF-R1-Fc murino (R&D Systems, Nº 1042-PR/CF), neutravidina (Pierce, Nº 31000), estreptavidina (Pierce, Nº 21122), transtiretina (Sigma, Nº P1742), y PDGF-R1-Fc humano. Se aplicaron puntualmente en membranas de nitrocelulosa (Invitrogen) 1 !l de cada proteína a una concentración de 0,1 mg/ml. Las membranas se bloquearon durante 1 hora en PBS complementado con caseína 0,5 % (solución de bloqueo) a TA. Después de la retirada de la solución, las membranas se incubaron durante 1 hora con 2 !g/ml de diferentes variantes Z diméricas, con marcadores His6 N terminales y cisteínas C terminales. Las membranas se lavaron 4 x 5 minutos en PBS-T 0,1. Las variantes Z se detectaron con una IgG de cabra policlonal contra un epítopo común para todas las variantes Z (Affibody AB, Nº 20.1000.01.0005). Esta IgG de cabra anti Z, se diluyó a 1 !g/ml en solución de bloqueo, se añadió a las membranas que se incubaron durante 1 hora a TA. Después de lavar, se añadió un anticuerpo contra IgG de cabra conjugado con HRP (DAKO Nº P0449), diluido 1:10000 en solución de bloqueo, a las
membranas, seguido de incubación de las membranas durante 1 hora a TA. Las membranas se lavaron, se aclararon en PBS y se empaparon con Supersignal (Pierce Nº 34075). Se fotografiaron emisiones de luz con un Chemilmager 5500 (Alpha Innotech Corp.).
Resultados
5 Producción de proteína: Las moléculas variantes Z tanto monoméricas (en forma His6-Z#####) como diméricas (en forma His6-(Z#####)2-CYS) produjeron niveles de expresión aceptables de producto génico soluble. La pureza de los lotes producidos se evaluó por análisis de SDS-PAGE. Se estimó que la pureza era mayor del 95 % para las moléculas monoméricas y que era aproximadamente 90 % para moléculas diméricas.
El análisis de EM/CL verificó el peso molecular correcto para todas las moléculas variantes Z.
10 Análisis de CD: En el análisis de CD, las mediciones de espectros se realizaron a 37 ºC. A esa temperatura, las estructuras de hélice alfa de las moléculas variantes Z habrían obtenido un estado parcialmente desplegado. Este resultado también se verificó en las mediciones de temperatura variable en las que se determinaron las temperaturas de fusión (Tm) (Tabla 1).
Tabla 1. Temperaturas de fusión para varias variantes Z
Variante Z
Tm (ºC)
His6-Z01977
30
His6-Z01978
43
His6-ZO1980
35
His6-Z01981
37
His6-Z01982
37
His6-Z01983
37
His6-Z01994
30
His6-Z01995
36
His6-(Z01976)2-Cys
34
His6-(ZO1977)2-Cys
35
His6-(Z01980)2-Cys
35
His6-(Z01982)2-Cys
41
His6-(Z01983)2-Cys
38
His6-(Z01994)2-Cys
31
His6-(Z01995)2-Cys
37
Análisis de unión de Biacore: La unión de ocho variantes Z monoméricas (Z01977, Z01978, Z01980, Z01981, Z01982, Z01983, Z01994 y Z01995) con PDGF-R1 humano y murino, así como con PDGF-sRa humano, se ensayó en un instrumento Biacore inyectando las variantes Z sobre superficies que contenían los tres receptores. Los niveles de inmunización de ligando en las superficies fueron: PDGF-R1 humano (celda de flujo 2): 2240 UR, PDGF
20 R1 murino (celda de flujo 3): 2010 UR y PDGF-sRa humano (celda de flujo 4): UR 1900. Todas las variantes Z ensayadas mostraron unión como PDGF-R1 tanto humano como murino, pero no mostraron unión con PDGF-Ra humano. El resultado se presenta en la Figura 2. Z01982 y Z01977 mostraron las curvas de disociación más lentas para PDGF-R1 humano. Z01982 también mostró la curva de disociación más lenta para PDGF-R1 murino.
Ensayo de epítopo: Se ensayó la unión de PDGF-R1 humano con su ligando natural PDGF-BB en presencia de
25 variantes Z monoméricas. Los niveles de inmunización de ligando en las superficies fueron: celda de flujo 2 (PDGF-BB): 1130 UR y celda de flujo 3 (PDGF-BB): 5090 UR. Las tres variantes Z ensayadas, Z01977, Z01980 y Z01982, bloquearon la unión de PDGF-R1-PDGF-BB parcialmente a una relación molar 1:1 (es decir variante Z 100 nM y PDGF-R1 100 nM). El resultado se presenta en la Figura 3. Cuando se usó un exceso de diez veces de variante Z
en comparación con PDGF-R1, el efecto de bloqueo fue casi completo. Para la variante Z de unión a A1 usada como el control negativo, no se vio efecto de bloqueo. Análisis de transferencia puntual: Se realizó un ensayo de especificidad añadiendo variantes Z diméricas purificadas a membranas de nitrocelulosa con puntos de 0,1 !g de diferentes proteínas. Se detectaron variantes Z unidas con anticuerpos conjugados con HRP que reaccionan a quimioluminiscencia. Se analizaron siete agentes de unión Z01976, Z01977, Z01980, Z01982, Z01983, Z01994 y Z01995. Las señales más fuertes se consiguieron para PDGF-R1 humano y murino para todas las variantes Z ensayadas (datos no mostrados). Se vieron algunas señales de fondo para todas las variantes Z, particularmente para las inmunoglobulinas.
En resumen, se mostró unión a PDGF-R1 tanto humano como murino, que son 79 % idénticos a un nivel de aminoácidos, por las variantes Z en los análisis de unión y en transferencia puntual. Cuando se ensayaron frente a proteínas de suero, Fc y PDGF-Ra en un instrumento Biacore y en transferencia puntual, se mostró que los agentes de unión eran negativos, es decir su unión era satisfactoria en lo que concierne a especificidad con respecto a PDGF-R1. Se mostró que tres de los agentes de unión (Z01977, Z01980 y Z01982) bloqueaban la unión del receptor PDGF-R1 con su ligando natural PDGF-BB en un ensayo de Biacore. El resultado sugiere que los tres agentes de unión comparten un epítopo en el receptor, puesto que mostraban el mismo resultado de bloqueo. Es probable que los agentes de unión no ensayados en el grupo de secuencias muestren el mismo tipo de patrón de unión.
Ejemplo 3: Diseño y construcción de una biblioteca madura de variantes Z de unión a PDGF-R1
En este Ejemplo, se construyó una biblioteca madura. La biblioteca se usó para selecciones de polipéptidos de unión a PDGF-R1. Habitualmente se espera que las selecciones de bibliotecas maduras den como resultado agentes de unión con afinidad aumentada (Orlova y col, Cancer Res 66(8): 4339-48 (2006)).
Materiales y procedimientos
Diseño de biblioteca: La biblioteca se basó en las secuencias de las variantes Z de unión a PDGF-R1 descritas en los Ejemplos 1 y 2. En la nueva biblioteca, 13 posiciones variables en el armazón de moléculas Z tenían preferencia hacia ciertos restos aminoacídicos, de acuerdo con una estrategia basada en las secuencias variantes Z definidas en SEC ID Nº: 1-11. Se obtuvo un oligonucleótido de 129 pb degenerado que codificaba las posibles variantes de Scandinavian Gene Synthesis AB y se indica AFFI-1011. Las frecuencias teóricas (en %) y distribuciones de restos aminoacídicos en la nueva biblioteca para las 13 posiciones Z variables se proporcionan en la Tabla 2:
Posibles aminoácidos
Posiciones de aminoácidos en la molécula variante Z
Ala (A)Arg (R)Asn (N)Asp (D)Cys(C) Gln (Q)Glu (E)Gly (G) His (H)Ile (I)Leu (L)Lys (K) Met (M)Phe (F)Pro (P)Ser (S)Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V)Parada ámbar (q)Parada (.)
Pos 2 Pos3 Pos 4 Pos 6 Pos7 Pos 10 Pos 11 Pos 17 Pos 18 Pos 20 Pos 21 Pos 25 Pos 28
0
0
6,25 100 6,25 25 17 0 6,25
0
0
0
0
50
17 9,375 0 9,375 0 8,25 100 9,375 45 0 37,5 17
0
0
3,125 0 3,125 12,5 8,25 0 3,125 0 100 12,5
0
0
0
3,125 0 3,125 12,5 8,25 0 3,125
0
0
0
0
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125
0
0
0
0
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125 0 0 12,5
0
0
0
3,125 0 3,125 12,5 8,25 0 3,125
0
0
0
0
0
16,5 6,25 0 6,25 0 16,5 0 6,25 0 0 0 16,5
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125 0 0 12,5
0
0
16,5 3,125 0 3,125 0 0 0 3,125 0 0 0 16,5
50
17 9,375 0 9,375 0 0 0 9,375 0 0 0 17
0
0
3,125 0 3,125 12,5 8,25 0 3,125 5 0 12,5
0
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125
0
0
0
0
0
0
3,125 0 3:125 0 0 0 3,125
0
0
0
0
0
0
6,25 0 6,25 0 0 0 6,25
0
0
0
0
0
16,5 9,375 0 9,375 0 8,25 0 9,375 0 0 12,5 16,5
0
0
6,25 0 6,25 25 17 0 6,25
0
0
0
0
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125 45
0
0
0
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125
0
0
0
0
0
16,5 6,25 0 6,25 0 0 0 6,25 0 0 0 16,5
0
0
3,125 0 3,125 0 0 0 3,125 5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Nº de aa
2 6 20 1 20 6 9 1 20 4 1 6 6
Construcción de bibliotecas: El oligonucleótido degenerado AFFI-1011 (5’-ctcgaggtagacaacaaattcaacaaagaackkvkynnkgcggctnnkgagatcrmmrvsttacctaacttaaaccgtnnkc aawrgaacgccttcatcmrwagtttavktgatgacccaagccaaagc) se amplificó por PCR usando 100 fmol de AFFI-1011, 50 pmol de cebador directo AFFI-47 (5’cccccccccctcgaggtagacaacaaattcaa) y 50 pmol de cebador inverso AFFI-50 (5’cccccctgctagcaagttagcgctttggcttgggtcatc). Puede encontrarse una explicación de la nomenclatura de nucleótidos degenerados en por ejemplo Biochemical Nomenclature and Related Documents, Portland Press, 1992. Se realizaron 95 reacciones de PCR usando polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems Nº N808-0244) en 10 ciclos, consistiendo cada ciclo en un periodo de desnaturalización de 15 segundos a 96 ºC, un periodo de hibridación de 15 segundos a 60 ºC y un periodo de extensión de 1 minuto a 72 º. Después de la amplificación, los productos de OCR se agruparon y purificaron usando kit de purificación de PCR QIAquick® (Qiagen). La concentración y calidad de los fragmentos se determinó por medición de la absorbancia y por análisis en un gel de agarosa. El fragmento amplificado se escindió por restricción a una concentración de 14 ng/ml usando 1000 U de las enzimas Xhol y Nhel (New England Biolabs, Nº R0146L, Nº 0131M). La mezcla de reacción de 1500 ml se incubó a 37 ºC durante 3,5 horas. Los fragmentos escindidos se purificaron usando un kit de purificación de PCR QIAquick®. Las concentraciones de los fragmentos se determinaron por mediciones de absorbancia y la calidad de los fragmentos por análisis en gel de agarosa.
El vector fagémido pAY00065 se restringió con las mismas enzimas, se purificó y se ligó con los fragmentos amplificados. Los fragmentos amplificados (1,93 !g) y el vector (12 !g), en una relación molar de 5:1, se ligaron durante 2 horas a TA. Se usó 50 U de ADN ligasa T4 (Fermentas Nº EL0012) por !g de ADN en una mezcla de ligación de 6000 !l y se separó en alícuotas en tubos eppendorf con 500 !l en cada uno. La ligasa se inactivó a 65 ºC durante 10 minutos y se recuperó ADN por extracción con fenol/cloroformo (Invitrogen) y precipitación con etanol seguido de disolución en agua desionizada estéril.
Las reacciones de ligación (2 !l de aproximadamente 150 ng/!l) se transformaron en células E. coli RRIiM15 electrocompetentes (100 !l). Inmediatamente después de la electroporación, se añadió aproximadamente 1 ml de medio SOC (medio TSB-YE, glucosa 1 %, MgCl2 50 !M, MgSO4 50 !M, NaCl 50 !M y KCl 12,5 !M). Las células transformadas se incubaron a 37 ºC durante 40-50 minutos. Se tomaron muestras para titulación y para determinación del número de transformantes. Las células se dividieron a continuación en 6 fracciones que se inocularon en 1000 ml de medio TSB-YE, complementado con glucosa 2 % y ampicilina 100 !g/ml y se cultivaron durante una noche a 37 ºC. Las células se sedimentaron durante 8 minutos a 6000 g, se resuspendieron en una solución de PBS/glicerol (glicerol aproximadamente 20 %). Las diferentes fracciones celulares se separaron en alícuotas y se almacenaron a -80 ºC.
Preparación de reserva de fago: Se inocularon células de la reserva de glicerol que contenían el vector de fagémido en 2 x 1000 ml de medio TSB-YE, complementado con glucosa 2 % y ampicilina 100 !g/ml y se dejaron crecer a 37 ºC. Cuando las células alcanzaron una densidad óptica (DO) de 0,65, se infectó la misma cantidad de células que se habían inoculado inicialmente usando un exceso molar 10x de fago auxiliar M13K07 (New England Biolabs). Las células se incubaron durante 30 minutos, se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos y se resuspendieron. Posteriormente, las células se cultivaron en 2x 1000 ml de medio TSB-YE, complementado con IPTG 100 !M para inducción de la expresión, kanamicina 25 !g/ml y ampicilina 100 !g/ml y se dejaron crecer durante una noche a 30 ºC. El cultivo inducido se recogió por centrifugación a 2500 g durante 10 minutos. Para separar las partículas de fago de las células, el sobrenadante se precipitó en PEG/NaCl. El tampón de precipitación se añadió al sobrenadante en una relación de volumen 1:4 y la mezcla resultante se incubó en hielo durante 1 hora. Los fagos precipitados se sedimentaron por centrifugación a 10500 g a 4 ºC durante 30 minutos y se resuspendieron en H2O estéril. El procedimiento de precipitación se repitió una vez y los fagos se resuspendieron en 1 ml de PBS. La solución de fago resultante se clarificó de las células y los residuos celulares por centrifugación, seguido de filtración a través de un filtro de 0,45 !m. Se añadió glicerol a una concentración final de aproximadamente 40 %. Las reservas de fago se almacenaron a -80 ºC.
Secuenciación: Se secuenciaron clones de la biblioteca de reserva de fago de variantes Z para verificar el contenido y evaluar el resultado de la biblioteca construida en relación con el diseño de la biblioteca. Se realizó secuenciación como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se calculó la distribución de aminoácidos.
Resultados
Construcción de biblioteca: La nueva biblioteca se diseñó basándose en un conjunto de variantes Z de unión a PDGF-R1 con propiedades de unión verificadas (Ejemplos 1 y 2). El tamaño teórico de la biblioteca diseñada fue de 7,5 x 108 variantes Z. El tamaño real de la biblioteca, determinado por valoración y después de transformación en células E. coli. RRIiM15, fue de 5,3 x 109 transformantes.
La calidad de la biblioteca se ensayó por secuenciación de 95 transformantes y comparando sus secuencias reales con el diseño teórico. Se mostró que los contenidos de la biblioteca real en comparación con la biblioteca diseñada eran satisfactorios. Las posiciones bloqueadas en la secuencia de aminoácidos diseñada se reflejaron en la secuencia real por que sólo los aminoácidos esperados aparecían en estas posiciones. De forma similar, las posiciones polarizadas o dopadas en el diseño también se reflejaron en la secuencia real por que la mayoría de los aminoácidos esperados aparecían en estas posiciones.
Se construyó por lo tanto exitosamente una biblioteca madura de polipéptidos de unión a PDGF-R1.
Ejemplo 4: Selección, exploración y caracterización de variantes Z de una biblioteca madura
Materiales y procedimientos
La proteína diana, PDGF-R1 recombinante humana, se biotiniló como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se acopló Z00000 dimérico biotinilado a perlas de estreptavidina como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Selección de presentación de fagos de polipéptidos de unión a PDGF-R1: Se realizaron selecciones de presentación de fagos contra PDGF-R1 esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 1 usando la nueva biblioteca de moléculas variantes Z descrita en el Ejemplo 3. La selección se realizó inicialmente en cuatro pistas. Estas se dividieron adicionalmente en dos ciclos dando como resultado un total de seis pistas. La selección se realizó en cuatro ciclos (véase Figura 4B para una visión de conjunto de las concentraciones diana y el número de lavados. Para reducir el número de agentes de unión de fondo, los fagos se preincubaron con perlas de estreptavidina acopladas a Z00000 revestidas con proteínas de Fc durante 1 hora a TA antes de los ciclos de selección 1-3.
A continuación, se añadió PDGF-R1 humano no biotinilado (1a, 1b y 2) y biotinilado (3a, 3b y 4) a la solución de fago. La selección tuvo lugar en tubos bloqueados (prebloqueados en tampón de selección) incubados en agitación durante dos horas. Para capturar los complejos de fago-proteína, la solución de selección se incubó con perlas de estreptavidina acopladas a Z00000 prebloqueadas (1a, 1 b y 2) o perlas de estreptavidina (3a, 3b y 4) durante 20 minutos y durante 15 minutos, respectivamente. A continuación, se retiraron las partículas de fago no unidas lavando con PBS-T 0,1. El número de lavados se aumentó para cada ciclo de selección, comenzando con cuatro lavados en el primer ciclo y terminando con hasta 20 lavados en el último ciclo. Se realizó lavado a TA (2 y 4), 37 ºC (1b y 3b) y 45 ºC (1a y 3a). La longitud del lavado fue menor de 1 minuto en todas las etapas, excepto para la última etapa de lavado en el último ciclo que duró 30 minutos. Los fagos unidos se eluyeron usando una estrategia de pH bajo en la que se añadieron 500 !l de glicina-HCl 50 mM, pH 2,2, a las perlas de estreptavidina. Después de 10 minutos de incubación a TA, la solución se neutralizó mediante adición de 450 !l de PBS y 50 !l de Tris-HCl 1 M, pH 8.
Amplificación de partículas de fago: Después de cada ciclo de selección, se usaron aproximadamente 950 !l de los fagos eluidos de las diferentes pistas de selección para infectar células E. coli RR1iM15 en fase logarítmica. Se infectaron de forma similar fagos unidos a perlas. Después de 20 minutos de incubación a 37 ºC, las células infectadas con fago eluido y fago unido a perlas de la misma selección se agruparon (ciclos 1-3) o se mantuvieron separados (ciclo 4). Las células infectadas se recogieron por centrifugación. El sedimento se disolvió en un volumen pequeño de TSB-YE y se extendió posteriormente en placas de TYE. Las placas se incubaron a continuación durante una noche a 37 ºC. En el ciclo de selección final se diluyeron bacterias antes de extenderlas sobre placas de TYE para formar colonias sencillas a usar en la exploración de ELISA.
Las células de las placas de TYE se resuspendieron en medio TSB. Una parte de las células resuspendidas se almacenó en glicerol a -20 ºC. Una cantidad de células suspendidas correspondientes a 100-1000 veces el número de fagos eluidos se inoculó en medio TSB-YE, complementado con glucosa 2 % y ampicilina 100 !g/ml. Las células se cultivaron hasta fase logarítmica a 37 ºC. La misma cantidad de células que se inoculó antes se infectó con exceso 10x de fagos auxiliares M13K07 (New England Biolabs) durante 30 minutos a 37 ºC. Las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron en medio TSB-YE complementado con kanamicina 25 !g/ml, ampicilina 100 !g/ml e IPTG 100 !M para inducir la producción de moléculas variantes Z. Los cultivos se incubaron durante una noche a 30 ºC. Las partículas de fago se recogieron por centrifugación y precipitación como se ha descrito anteriormente.
Exploración de ELISA de variantes Z: Se produjeron moléculas variantes Z por inoculación de colonias sencillas, preparadas como se ha descrito anteriormente, en el medio TSB-YE como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se prepararon placas de ELISA de 96 pocillos de media área como se ha descrito en el mismo ejemplo. Después de retirar la solución de bloqueo de los pocillos, se añadieron 50 !l de la solución periplásmica que contenía moléculas variantes Z a cada pocillo. Las placas se incubaron a TA durante 1,5 horas. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS-T 0,05. Se añadió PDGF-R1 humano, a una concentración de 4,5 !g/ml en 50 !l de PBS-T 0,1 a los pocillos y las placas se incubaron durante 1,5 horas a TA. Después de lavar como se ha descrito anteriormente, se detectó diana unida a las variantes Z por detección del anticuerpo contra Fc conjugado con HRP, diluido 1:4000 en PBS-T 0,1. Esto se siguió de incubación durante 1 hora a TA. A continuación, se realizó desarrollo como se ha descrito anteriormente. Se midió la absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro de ELISA. Todas las etapas de bloqueo a lectura se realizaron manualmente.
Secuenciación de agentes de unión potenciales: De la exploración de ELISA, se seleccionaron clones individuales de las diferentes pistas de selección para secuenciación. Los clones con valores de absorbancia de al menos dos veces la absorbancia de fondo a diez veces la absorbancia de fondo se secuenciaron. Se realizó amplificación de fragmentos génicos y análisis de frecuencia de fragmentos génicos como se ha descrito en el Ejemplo 1.
Análisis de unión de Biacore: Para clasificar los clones secuenciados, se analizaron fracciones periplásmicas que contenían variantes Z de unión a PDGF-R1 marcadas con ABD, previamente preparadas para ELISA, en un instrumento de Biacore (GE Healthcare). Se inmovilizaron PDGF-R1 humana y HSA en una microplaca CM5 de Biacore; PDGF-R1 en la celda de flujo 2 y HSA en la celda de flujo 3 y 4. Se activó y desactivó una superficie de celda de flujo en la microplaca (celda de flujo 1) para su uso como un blanco durante las inyecciones de analito. La inmovilización se analizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las fracciones periplásmicas se clarificaron a 16000 g durante 5 minutos y se inyectaron a TA. Además, se analizaron algunos agentes de unión a 37 ºC. El tampón de ejecución fue HBS-EP y los analitos se inyectaron a un caudal de 10 !l/minuto durante 5 minutos. Después de 5 minutos de disociación, las superficies se regeneraron con una inyección de SDS 0,05 % y una inyección de HCl 15 mM. Los resultados se analizaron usando software de BiaEvaluation. Se restaron los sensogramas de la superficie de blanco (celda de flujo 1) de los sensogramas de las superficies de ligando.
Subclonación de moléculas variantes Z en vectores de expresión: Basándose en análisis de secuencia y análisis de unión en Biacore, se seleccionaron varios clones para subclonación en el vector de expresión pAY01449 como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se amplificaron fragmentos variantes Z monoméricos y diméricos a partir de los vectores pAffi1/pAY00065 como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1.
Se ligaron vector pAY01449 digerido con Accl y fragmentos variantes Z amplificados usando ADN ligasa T4. La mezcla de ligación se electroporó en células E. coli TOP-10 electrocompetentes. Los transformantes resultantes se sembraron en placas TBAB, complementadas con kanamicina 50 !g/ml, seguido de incubación a 37 ºC durante una noche. A continuación, las colonias con las diferentes moléculas variantes Z se exploraron usando PCR y las longitudes de los fragmentos de PCR se verificaron en geles de agarosa.
Para verificar las secuencias, se realizó secuenciación con Kit de Secuenciación en Ciclo BigDye® Terminator v3.1 usando cebadores biotiniliados en reacciones separadas. Los productos de secuenciación se purificaron usando un Magnatrix 8000 con perlas magnéticas revestidas con estreptavidina y se analizaron en un Analizador Genético ABI PRISM® 3100. Las secuencias se evaluaron con software Sequencher™.
Se preparó ADN plasmídico de clones con secuencia confirmada. Las bacterias se cultivaron durante una noche en medio TSB, complementado con kanamicina 50 !g/ml. Las células se sedimentaron por centrifugación. Se prepararon plásmidos usando Kit de Miniprep QlAprep Spin y se electroporaron en células E. coli BL21 (DE3) electrocompetentes. Los nuevos plásmidos se depositaron a -80 ºC. Se almacenaron de forma similar alícuotas de los cultivos de TOP-10 y BL21 DE3 en glicerol a -80 ºC.
Resultados
Selección de presentación de fagos de polipéptidos de unión a PDGF-R1: Se realizó selección en un total de seis pistas paralelas con cuatro ciclos cada una. Las diferentes pistas de selección diferían en concentración de diana y condiciones de lavado como sigue: 1a) diana no biotinilada, concentración alta, lavado a 37/45 ºC, 1b) diana no biotinilada, concentración baja, lavado a 37 ºC, 2) diana no biotinilada, concentración baja, lavado a TA, 3a) diana biotinilada, concentración alta, lavado a 37/45 ºC, 3b) diana biotinilada, concentración baja, lavado a 7 ºC y 4) diana biotinilada, concentración baja, lavado a TA. Para cada ciclo de selección, la concentración de diana se redujo y las condiciones de lavado fueron más rigurosas. Se introdujo una presión para estabilidad estructural en las selecciones por el lavado a alta temperatura (37 ºC y 45 ºC) de complejos de fago-diana. Se determinaron las titulaciones de partículas de fago y rendimiento de partículas de fago (% de fago fuera/fago dentro) después de cada ciclo. Para cada ciclo de selección, el rendimiento de partículas de fago fue mayor (no mostrado), lo que indicó un enriquecimiento de los clones de unión a diana.
Exploración de ELISA de variantes Z: Se produjeron clones obtenidos después de cuatro ciclos de selección en placas de 96 pocillos y se exploraron con respecto a actividad de unión a PDGF-R1 usando ELISA. En total, se analizaron 2 x 93 clones del grupo de fago eluido y 2 x 93 clones del grupo de fago unido a perlas. Se describieron muchos clones claramente positivos con señales de hasta 2,2 unidades de absorbancia (UA). Los clones de todas las pistas de selección (y de fago tanto eluido como unido a perla) mostraron señales positivas. Los controles negativos (lisados de un clon negativo, básicamente pAffil/pAY00065, sin inserto de variante Z) fueron claramente negativos (absorbancia < 0,2 UA). El control positivo (Z01977 del Ejemplo 1) dio una señal de absorbancia (0,5-1,4 UA) que era menor que la mayoría de los clones positivos.
Secuenciación: Se secuenciaron 192 clones con señales de ELISA positivas (96 clones del grupo “fago eluido” y 96 clones del grupo “fago unido a perla”). Se proporcionó a cada variante Z individual un número de identificación, Z#####, como se ha descrito anteriormente. En total, se identificaron 163 nuevas moléculas variantes Z. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 restos aminoacídicos de longitud se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 370-532. Los motivos de unión a PDGF-R1 de estas variantes Z deducidos se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 12-174. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 restos aminoacídicos de longitud que se ha predicho que constituyen el conjunto de tres hélices completo dentro de cada una de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 y en la lista de secuencias como SEC ID Nº: 191-353. Entre los clones secuenciados, quince secuencias aparecieron dos veces y una secuencia apareció tres veces.
El agrupamiento de las variantes Z de unión a PDGF-R1 secuenciadas mostró que las variantes tenían secuencias similares con una disimilitud interna de hasta 2 %, que corresponde a una diferencia en un aminoácido sencillo.
Análisis de unión de Biacore: Debido al gran número de diferentes variantes Z con fuertes señales en ELISA, se realizó una segunda exploración usando análisis de unión de Biacore. Se seleccionaron clones con altas señales de ELISA, aparición frecuente (>1), origen en selecciones con lavados a 37/45 ºC y secuencias similares a Z01982 (una variante de secuencia con alta afinidad por PDGF-R1 y Z01978 (una variante de secuencia con Tm alta), para análisis de unión. En total se seleccionaron 45 clones. Se incluyeron Z01977 y Z01982 para comparación. Se usó una molécula variante Z de unión a CD22 como control negativo. Los niveles de respuesta adquiridos del experimento a TA frente a HSA se usaron para aproximación de las concentraciones relativas. Aparte de las diferencias de respuesta debido a los diversos niveles de expresión de molécula variante Z, las formas de los sensogramas en el experimento a TA para los clones explorados frente a PDGF-R1 fueron similares. Sin embargo, se vieron pequeñas disimilitudes y relacionando los niveles de expresión de molécula variante Z con los sensogramas de la superficie de PDGF-R1, pudieron clasificarse las variantes Z. En el experimento realizado a 37 ºC, pudieron verse pequeñas diferencias entre las variantes Z relacionando las respuestas frente a PDGF-R1 con las respuestas frente a HSA. Por lo tanto, se seleccionaron cinco variantes Z (Z02465, Z02477, Z02483, Z02516 y Z02558) para subclonación y análisis adicional, basándose en su baja respuesta a HSA y alta respuesta a PDGF-R1, su curva de disociación lenta, su aparición por duplicado en la selección y/o su fuerte unión a 37 ºC.
Subclonación de moléculas variantes Z en vectores de expresión: Se subclonaron con éxito cinco clones, Z02465, Z02477, Z02483, Z05.16 y Z02558, en el vector de expresión pAY01449 como monómeros y dímeros como se ha descrito previamente en este ejemplo.
Ejemplo 5: Producción y caracterización de un subconjunto de variantes Z de unión a PDGF-R1
Materiales y procedimientos
Expresión y purificación de proteínas: Se dejaron crecer cultivos de E. coli BL21 (DE3) transformados de la subclonación descrita en el Ejemplo 4 a 37 ºC hasta una densidad óptica de aproximadamente 1 (diluidos 10x) y se indujo expresión proteica por adición de IPTG 1 M (cultivo de 0,5 ml/l). Se recogieron cultivos por centrifugación (20 minutos, 15900 g) 5 horas después de la inducción. Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos celulares se recogieron y almacenaron a -20 ºC. Se analizaron los niveles de expresión de proteínas solubles e insolubles usando SDS-PAGE por determinación ocular de geles teñidos con Coomassie.
Se purificaron los monómeros y dímeros constituyentes de las variantes Z de unión a PDGF-R1 de Z02465, Z02477, Z02483, Z0516 y Z02558 (en forma de His6-Z#####-Cys y en forma de His6-(Z#####)2-Cys; es decir expresados como las construcciones MGSSHHHHHH-LQ-[Z#####]-VDC y MGSSHHHHHHLQ-[Z#####][Z#####]-VDC, respectivamente) de sedimentos celulares en condiciones desnaturalizantes en columnas de Ni-NTA Superflow (Qiagen), se intercambió el tampón a PBS usando columnas PD-10 (GE Healthcare), se separaron alícuotas y se almacenaron a -80 ºC.
Se realizó caracterización de proteínas esencialmente como en el Ejemplo 2. Análisis de CD: Las variantes Z monoméricas purificadas se descongelaron y se diluyeron a 0,5 mg/ml en PBS. Para cada variante Z diluida se obtuvo un espectro de CD a 250-195 nm a 20 ºC, seguido de una medición de temperatura variable (VTM) para determinar la temperatura de fusión (Tm). Después de incubación a 20 ºC, se obtuvo un segundo espectro de CD 250-195 nm a 20 ºC para verificar que la molécula variante Z conservaba su estructura alfa helicoidal después de la VTM. En la VTM, la absorbancia se midió a 221 nm mientras que la temperatura se elevó de 20 a 90 ºC, con una pendiente de temperatura de 5 ºC/minuto. Las mediciones de CD se realizaron en un espectropolarímetro J-810 Jasco usando una celda con una longitud del camino óptico de 1 mm.
Análisis cinético y de unión de Biacore: Se sometió a cinco moléculas variantes Z monoméricas, con cisteínas bloqueadas por NEM (N-etilmaleimida, Pierce Nº 23030) y con marcadores His6 (His6-Z#####-Cys-NEM), a estudios de interacción en un instrumento Biacore (GE Healthcare) con PDGF-R1 humano, PDGF-R1 murino y PDGF-Ra humano. Los tres receptores de PDGF se habían inmovilizado previamente (Ejemplo 2) en diferentes celdas de flujo de una microplaca CM5. Los analitos se diluyeron en el tampón de ejecución HBS-EP a una concentración final de 100 nM, se inyectaron por duplicado o triplicado a un caudal de 20 !l/minuto durante 3 minutos. Después de 3 minutos de disociación, las superficies se regeneraron con una inyección de HCl 10 mM.
Las afinidades de unión de variantes Z Z02465 y Z02483 (en forma His6-Z#####-Cys-NEM) y el agente de unión de primera generación Z01982 (en forma His6-Z#####) para PDGF-R1 humano y murino se determinaron en Biacore. Se inmovilizó PDGF-R1 humano y murino en diferentes celdas de flujo de una microplaca CM5 de Biacore como se ha descrito anteriormente. Se inyectaron diferentes concentraciones de las variantes Z (100 nM, 40 nM, 16 nM, 6,4 nM y 2,56 nM) en tampón HBS-EP a un caudal de 50 !l/minuto durante 1 minuto. Después de 1 minuto de disociación, se regeneraron las superficies con una inyección de SDS 0,05 % y una inyección de HCl 10 mM.
Una superficie de celda de flujo de la microplaca se activó y desactivó para su uso como blanco durante inyecciones de analito. Se restaron los sensogramas de la superficie de blanco de los sensogramas de las superficies de ligando.
Se usó software BiaEvaluation (GE Healthcare) para analizar los resultados y calcular las constantes de disociación (KD).
Análisis de transferencia puntual: Se ensayaron tres variantes Z de unión a PDGF-R1 con respecto a especificidad por análisis de transferencia puntual realizado como se describe en el Ejemplo 2 usando moléculas variantes Z 5 diméricas con marcadores His6 N terminales y cisteínas C terminales.
Citometría de flujo: Se añadieron cinco moléculas variantes Z diméricas diferentes (20 ó 5 !g/ml en PBS) a 0,5 x 106 células AU565 que expresan PDGF-R1 (células de carcinoma de glándula mamaria humana, ATCC) en un tubo Falcón de 5 ml. Las mezclas se incubaron durante 1 hora en hielo. Posteriormente, las células se lavaron en PBS y se sedimentaron en una centrífuga a 200 g durante 3 minutos. Las moléculas variantes Z unidas se detectaron por 10 adición de anticuerpo de cabra contra variantes Z, seguido de Ig anti cabra conjugado con Alexa Fluor® 647 (Invitrogen Nº A20347, 5 !g/ml). Después de cada adición las células se incubaron durante 45-60 minutos y se lavaron a continuación dos veces en PBS. Como un control, las células AU565 se tiñeron con un anticuerpo de cabra anti-PDGF-R1 disponible en el mercado (R&amp;D systems) seguido de un anticuerpo anti-Ig de cabra conjugado con Alexa Fluor® 647 (Invitrogen). Después de la tinción, las células se lavaron, se resuspendieron y se analizaron 15 usando un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences). En un segundo conjunto de análisis de citometría de flujo, se usaron His6-(Z02465)2-Cys, His6-(Z02483)2-Cys y His6-(Z02516)2-Cys conjugados con Alexa Fluor® 647 para tinción. Las variantes Z se conjugaron usando reactivo de maleimida C2 de Alexa Fluor® 647 (Invitrogen). Las células AU565, 0,5 x 106 por tubo (tubo Falcon de 5 ml), se mezclaron con una serie de diluciones 3 veces de los tres agentes de unión conjugados. Después de una hora de incubación en hielo, las células se lavaron como se ha
20 descrito anteriormente y se resuspendieron en PBS para análisis de Citometría de Flujo usando FACSCanto II.
Inmunofluorescencia: Se dejaron crecer durante una noche células AU565 en portaobjetos multipocillo (Histolab) para producir una monocapa de células. Al día siguiente, las células se aclararon con PBS y se sometieron a tinción. Las células se tiñeron con una cualquiera de tres moléculas variantes Z (10 !g/ml) o un anticuerpo de cabra anti-PDGF-R1 (5 !g/ml), diluido en PBS en células no fijadas. Después de una hora de incubación, las células se 25 lavaron. Las moléculas variantes Z se detectaron con una Ig de cabra anti-Z purificada (5 !g/ml), seguido de Alexa488 anti-IgG de cabra (5 !g/ml, Invitrogen Nº A21467). El anticuerpo anti-PDGF-R1 de cabra se detectó por Alexa488 anti-IgG de cabra. Después de cada adición de anticuerpo, los pocillos se incubaron durante 1 hora y se lavaron con PBS. Las células se fijaron durante 10 minutos con formaldehído 3 % en PBS, seguido de lavado con PBS. Los pocillos se secaron y los portaobjetos de vidrio se montaron con solución antidecoloración (medio de
30 montaje Vectashield para fluorescencia con DAPI, Vector Laboratories Nº H-1200) y se analizaron usando un microscopio Leica DM-LA (Leica Microsystems) equipado con una cámara de video de toma de imágenes en vivo.
Resultados
Expresión y purificación de proteínas: Todas las variantes expresadas, Z02465, Z02477, Z02483, Z02516 y Z02558 (en forma His6-Z#####-Cys y en forma His6-(Z#####)2-Cys) proporcionaron buenos rendimientos de producto génico
35 soluble. La cantidad de moléculas variantes Z purificadas por IMAC varió de 5,5 mg a 12,1 mg por lote purificado y la solubilidad in vitro para todas las variantes fue buena. Se estimó en SDS-PAGE que la pureza excedía 90 % para todas las variantes. Los pesos moleculares correctos se verificaron con EM-CL.
Análisis de CD: Se realizaron mediciones de espectro de CD a 20 ºC. A esa temperatura, las estructuras alfa helicoidales de las variantes Z se desarrollaron casi completamente. Una capa de los espectros obtenidos después
40 de las mediciones de temperatura variable (calentamiento a 90 ºC seguido de enfriamiento a 20 ºC) sobre los espectros obtenidos antes de la medición de temperatura variable mostró que todas las variantes Z se plegaban de nuevo en sus estructuras alfa helicoidales después de calentar a 90 ºC (resultado no mostrado). Las temperaturas de fusión se determinaron a partir de las mediciones de temperatura variable y se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Temperaturas de fusión de variantes Z.
Molécula variante Z
Tm (ºC)
His6-Z02465-Cys
46
His6-ZO2477-Cys
46
His6-ZO2483-Cys
44
His6-Z02516-Cys
42
His6-Z02558-Cys
39
His6-(Z02477)2-Cys
46
Análisis cinético y de unión de Biacore: La unión de cinco moléculas variantes Z (en forma His6-Z##### Cys-NEM) con PDGF-R1 humano y murino así como con PDGF-Ra humano se ensayó en Biacore inyectando cada una de las moléculas variantes Z monoméricas Z02465, Z02477, Z02483, Z02516 y Z02558 sobre superficies que contenían los tres receptores. Se realizaron comprobaciones con dos variantes de la primera selección (Ejemplo 1). Z01977 y
5 Z01982 (en forma His6-Z#####). Todas las variantes Z ensayadas mostraron unión a PDGF-R1 tanto humano como murino pero no mostraron unión a PDGF-Ra humano. Z02465 y Z02483 mostraron las curvas de mayor respuesta frente al receptor tanto humano como murino. Los resultados se presentan en la Figura 5.
Las afinidades de unión de dos variantes Z maduras (Z02465 y Z02483) y una variante Z de la primera selección (Z01982; Ejemplo 1), se determinaron por cálculo de la constante de disociación KD. El cálculo se basó en los
10 resultados de un experimento de Biacore en el que las moléculas variantes Z, en cinco concentraciones diferentes, se aplicaron sobre una microplaca de Biacore que contenía PDGF-R1 humano y murino. Las clasificaciones de inmovilización de ligando en las superficies fueron: celda de flujo 2 (h PDGF-R1): 1110 UR, celda de flujo 3 (h PDGF-R1): UR 3010 y celda de flujo 4 (mPDGF-R1): 3080 UR.
Los cálculos de KD se realizaron usando un modelo de unión de Langmuir 1:1 en sensogramas de la serie de
15 concentración frente al receptor humano (celda de flujo 2) y el murino (celda de flujo 4). Se consiguió buen ajuste de curva para Z01982 (las cinco concentraciones) así como para Z02465 y Z02483 (todas excepto una concentración) frente a PDGF-R1 humano (Figura 6). Para receptor murino, se usaron todas las concentraciones de variante Z en los cálculos (sensogramas no mostrados). Las constantes de disociación calculadas se muestran en la Tabla 4 a continuación.
20 Tabla 4. Constantes de disociación (KD) para variantes Z de unión a PDGF-R1
Variante Z PDGF-R humano PDGF-R murino
His6-Z01982 4 nM 27 nM
His6-Z02465-Cys-NEM 500 pM 7 nM
His6-Z02483-Cys-NEM 400 pM 6 nM
Análisis de transferencia puntual: Las especificidades de Z02516, Z02483 y Z02465 (en forma His6-(Z#####)2-Cys) para PDGF-R1 se ensayaron usando análisis de transferencia puntual. Se transfirieron 22 proteínas diferentes a membranas de nitrocelulosa. Las 22 proteínas incluyeron 16 proteínas de suero humanas altamente abundantes, PDGF-R1 y PDGF-R1 humano y de ratón recombinante. Las tres moléculas variantes Z se unieron a PDGF-R1
25 humano y de ratón pero no a PDGF-Ra o a ninguna de las otras 19 moléculas. Por lo tanto, la especificidad de las variantes Z ensayadas fue satisfactoria (datos no mostrados).
Citometría de flujo: La capacidad de unión a células de las moléculas variantes Z de unión a PDGF-R1 se analizó usando citometría de flujo. Se tiñeron células AU565 que expresaban PDGF-R1 con 20 !g/ml de Z02465, Z02483, Z02477, Z02516 o Z02558 (en forma de His6-(Z#####)2-Cys). Las moléculas variantes Z se detectaron con un
30 anticuerpo de cabra anti-Z e IgG anti cabra conjugado con Alexa Fluor® 647. Se usó un anticuerpo de cabra anti-PDGF-R1 como un control. Las cinco moléculas variantes Z proporcionaron desplazamientos de la intensidad de fluorescencia (datos no mostrados).
Además, las tres moléculas variantes Z Z02465, Z02483 y Z02516 (en forma de His6-(Z#####)2-Cys) se conjugaron con Alexa Fluor® 647 en la cisteína C terminal y se compararon sus capacidades para unirse a células AU565. Las
35 células se incubaron con las moléculas en una serie de titulaciones de tres veces, variando entre 20000 y 1 ng/ml. Las tres moléculas variantes Z mostraron una unión equivalente a células AU565. El resultado se presenta en la Figura 8.
Inmunofluorescencia: Se detectó PDGF-R1, expresada en las membranas de células AU565, por tinción de inmunofluorescencia usando una cualquiera de las variantes Z diméricas Z02465, Z02483 y Z02516 (en forma de
40 His6-(Z#####)2-Cys) o un anticuerpo de cabra anti-PDGF-R1. Se observó tinción de membrana con el anticuerpo de control así como con las tres variantes Z (Figura 7). La tinción con Z02483 dio como resultado un patrón de tinción punteado además de tinción membranosa que podía deberse a PDGF-R1 internalizada.
En conclusión, se mostró unión a PDGF-R1 tanto humano como murino por las seis variantes Z investigadas en un instrumento Biacore y en análisis de transferencia puntual. Cuando se ensayaron frente a PDGF-Ra, Fc y proteínas 45 del suero (Biacore y transferencia puntual), se mostró que las variantes Z eran negativas, es decir las variantes Z mostraron especificidad por PDGF-R1. En experimentos de citometría de flujo, cinco variantes Z diméricas mostraron unión a células que expresaban PDGF-R1. El análisis microscópico mostró que las tres variantes Z más fuertes se unían a la membrana de células, de forma similar al anticuerpo de control específico de PDGF-R1. La variante Z02483 también se unió a otras estructuras, que probablemente eran vesículas internas. Esto sugiere que 50 PDGF-R1 reside dentro de la célula. Las temperaturas de fusión para las variantes Z maduras se mejoraron en
comparación con las variantes Z de la primera selección de biblioteca. Las variantes Z02465 y Z02477 alcanzaron una Tm de 46 ºC.
Ejemplo 6: Análisis de caracterización y unión de variantes Z mutadas
Se sometieron dos variantes Z de la selección descrita en el Ejemplo 4 a mutagénesis dirigida para crear nuevos polipéptidos de unión a PDGF-R1.
Materiales y procedimientos
Los motivos de unión a PDGF-R1 de variantes Z Z02465 (SEC ID Nº: 60) y Z02483 (SEC ID Nº: 78) se mutaron para crear las nuevas variantes Z Z03358 (de Z02465, PBM enumerada como SEC ID Nº: 179 y las secuencias de polipéptidos de 49 y 58 restos aminoacídicos de longitud enumeradas como SEC ID Nº: 358 y SEC ID Nº: 537, respectivamente), Z02831, Z02832, Z02833 y Z02834 (los cuatro PBM de Z02483; enumerados como SEC ID Nº: 175-178 y las secuencias de los polipéptidos de 49 y 58 restos aminoacídicos de longitud enumerados como SEC ID Nº: 354-357 y SEC ID Nº: 533-536, respectivamente).
Se introdujeron nuevos aminoácidos en posiciones relevantes del armazón parental en diferentes vectores de expresión. Las construcciones codificadas por los vectores de expresión fueron MGSSLQ-[Z#####]-VDC (Z02465), M-[Z#####]-C (Z03358) y MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD (Z02831, Z02832, Z02833 y Z02834), retirándose cada M por la célula huésped durante la producción. Las variantes Z se generaron usando oligonucleótidos con diversos codones y una técnica de mutagénesis basada en PCR. Los fragmentos de PCR obtenidos se ligaron a un vector de expresión escindido por enzima de restricción, como se describe en el Ejemplo 1 o usando tecnología In-Fusion (Clontech, Nº 639607) y se transformaron en células E. coli TOP 10. Se exploraron colonias por PCR y las secuencias se verificaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1. Se prepararon plásmidos y se transformaron en E. coli BL21 (DE3).
Se expresaron proteínas marcadas con His6, se liberaron por sonicación y se purificaron esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se expresaron proteínas y marcador His6 y después se purificaron como sigue: se suspendieron células E. coli que portaban Z02465-Cys o Z03358-Cys soluble en Tris-HCl 20 mM, pH 7,1. Para romper las células y liberar el contenido intracelular, las suspensiones celulares se calentaron a 85 ºC durante 3 minutos. Los lisados se clarificaron por centrifugación seguida de filtración y se cargaron en 25 ml de Q Sepharose FF (GE Healthcare) empaquetado en una columna XK26 (GE Healthcare), equilibrado previamente con Tris-HCl 20 mM, pH 7,1. Después de lavar la columna con 5 volúmenes de columna (CV) de Tris-HCl 20 mM, pH 7,1, las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl 0-0,5 M en Tris-HCl 20 mM, pH 7,1, durante 10 CV. El caudal fue de 5 ml/min y se controló la señal de 280 nm. Las fracciones que contenían Z02465-Cys o Z03358-Cys se identificaron por análisis de SDS-PAGE. Las fracciones relevantes se agruparon y se ajustó el pH a 8,0 por adición de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, a una concentración final de 50 mM.
La cisteína C terminal de las construcciones se redujo por adición de DTT a 20 mM, seguido de incubación a 40 ºC durante 3 minutos. Después de la reducción, se añadió acetonitrilo (ACN) a una concentración final de 5 % y se cargó Z02465-Cys o Z03358-Cys reducida en 1 ml de columnas Resource 15 RPC (GE Healthcare), previamente equilibradas con tampón A de RPC (TFA 0,1 %, ACN 5 %, agua 95 %). Después de lavar la columna con 10 CV de tampón A de RPC, las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de 0-40 % de tampón B de RPC (TFA 0,1 %, ACN 80 %, agua 20 %). El caudal fue de 1 ml/min y se controló la señal de 280 nm. Se identificaron las fracciones que contenían Z02465-Cys o Z03358-Cys pura por análisis de SDS-PAGE. Se agruparon fracciones relevantes y el tampón se cambió a NH4HC03 10 mM, pH 8,0, usando columnas PD10 (GE Healthcare). Las nuevas variantes Z se analizaron por EM-CL para verificación de los pesos moleculares.
Las variantes Z purificadas se diluyeron a 0,2 ó 0,5 mg/ml en PBS y se realizaron análisis de CD entre 250 y 195 nm a 20 ºC. Posteriormente, se realizaron VTM a 220 nm entre 20 y 90 ºC. Se obtuvo otro espectro de CD para las variantes Z después de la VTM.
Se ensayó la unión de variantes Z Z02831, Z02832, Z02833, Z02834 y Z02483 (molécula parental; proteína producida en el Ejemplo 4 y NEM tratada como se ha descrito en el Ejemplo 5) con receptores de PDGF (humanos y murinos) en un instrumento de Biacore. Los receptores se inmovilizaron en diferentes celdas de flujo en microplacas de Biacore como se ha descrito en el Ejemplo 2 y las variantes Z, diluidas en tampón HBS-EP, se inyectaron sobre la superficie de microplaca en diferentes concentraciones. Los resultados se analizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se realizó análisis cinético de las variantes Z Z02465 y Z03358 (tratadas con NEM como se ha descrito en el Ejemplo 5) esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 5, usando las concentraciones de variante Z 4 nM, 20 nM y 100 nM y el caudal 30 !l/min.
Resultados
Todas las variantes se expresaron de forma exitosa y mostraron pureza satisfactoria. Se verificaron sus pesos moleculares teóricos por EM-CL. Las temperaturas de fusión (Tm), una estimación de la estabilidad molecular, se determinaron con análisis de CD: Z02831 Tm = 44 ºC, Z02832 Tm = 42 ºC, Z02833 Tm = 49 ºC, Z02834 Tm = 49 ºC y Z003358 Tm = 42 ºC. Las variantes Z recuperaron su estructura helicoidal después de la VTM, es decir la fusión era reversible.
Una de las variantes Z mutadas, Z02834, mostró una tasa de disociación más rápida de PDGF-R1 humano que su molécula parental Z02483. Los otros mutantes de Z02483 (Z02831, Z02832 y Z02833) mostraron unión similar con PDGF-R1 humano que Z02483. Todas las variantes Z mutadas mostraron mejor unión con PDGF-R1 humano que con PDGF-R1 murino. Las constantes de disociación (KD) se calcularon como se ha descrito en el Ejemplo 5 usando sensogramas de las inyecciones de 4 nM y 20 nM. Los valores de KD calculados se muestran en la Tabla 5 a continuación.
Tabla 5. Contantes de disociación (KD) para variantes Z de unión a PDGF-R1
Variante Z PDGF-R humano PDGF-R murino
Z02465-Cys-NEM 640 pM 7 nM Z03358-Cys-NEM 440 pM 7 nM

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Polipéptido de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta (PDGF-R1), que comprende un motivo de unión a receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas beta, PBM, consistiendo dicho motivo en la secuencia de aminoácidos seleccionada de
    i) EX2X3X4AAX7EID X11LPNLX16X17X18QW NAFIX25X26LX28X29, en la que, de forma independiente entre sí, X2 se selecciona de L, R y I; X3 se selecciona de R, I, L, V, K, Q, S, H, y A; X4 se selecciona de A, R, N, D, Q, E, H, K, M, S, T, W, F y V; X7 se selecciona de A, R, D, Q, E, G, K y S; X11 se selecciona de A, R, N, D, E, G, K, S, T y Q; X16 se selecciona de N y T; X17 se selecciona de R y K; X18 se selecciona de A, R, N, D, C, Q, E, G, L, K, M, S, T, W y V; X25 se selecciona de K, R, Q, H, S, G y A; X26 se selecciona de S y K; X28 se selecciona de V, R, I, L y A; X29 se selecciona de D y K; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90 % de identidad con la secuencia definida en i), y en la que el polipéptido de unión a PDGF-R1 se une a PDGF-R1 de modo que el valor de KD de la interacción es como máximo 1 x 10-6 M.
  2. 2.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que i) es una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 1-179.
  3. 3.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 2, en el que i) se selecciona de SEC ID Nº: 2-3, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 11-12, SEC ID Nº: 18-19, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 47, SEC ID Nº: 60-62, SEC ID Nº: 64, SEC ID Nº: 67-68, SEC ID Nº: 71-72, SEC ID Nº: 78, SEC ID Nº: 80-81, SEC ID Nº: 83, SEC ID Nº: 86, SEC ID Nº: 91-92, SEC ID Nº: 94-97, SEC ID Nº: 101-103, SEC ID Nº: 105, SEC ID Nº: 109, SEC ID Nº: 111, SEC ID Nº: 116, SEC ID Nº: 119, SEC ID Nº: 133, SEC ID Nº: 137, SEC ID Nº: 139-140, SEC ID Nº: 149, SEC ID Nº: 153, SEC ID Nº: 160, SEC ID Nº: 164, SEC ID Nº: 170, SEC ID Nº: 174 y SEC ID Nº: 179.
  4. 4.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicho motivo de unión a PDGF-R1 forma parte de un dominio proteico de conjunto de tres hélices.
  5. 5.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:
    i) K-[PBM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLNDXdQ; en la que [PBM] es un motivo de unión a PDGF-R1 como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; Xa se selecciona de A y S; Xb se selecciona de N y E; Xc se selecciona de A y S; Xd se selecciona de A y S; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80 % de identidad con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente.
  6. 6.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 5, en el que i) se selecciona de SEC ID Nº: 180
  7. 358.
  8. 7.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 6, en el que i) se selecciona de SEC ID Nº: 181182, SEC ID Nº: 184, SEC ID Nº: 186, SEC ID Nº: 190, SEC ID Nº: 239, SEC ID Nº: 251, SEC ID Nº: 257, SEC ID Nº: 290, SEC ID Nº: 332 y SEC ID Nº: 358.
  9. 8.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 359-537.
  10. 9.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia seleccionada de SEC ID Nº: 360-361, SEC ID Nº: 363, SEC ID Nº: 365, SEC ID Nº: 369, SEC ID Nº: 418, SEC ID Nº: 430, SEC ID Nº: 436, SEC ID Nº: 469, SEC ID Nº: 511 y SEC ID Nº: 537.
  11. 10.
    Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
  12. 11.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como un medicamento.
  13. 12. Combinación de un polipéptido de unión a PDGF-R1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 5 un agente terapéutico.
  14. 13.
    Combinación de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso como un medicamento.
  15. 14.
    Polipéptido de unión a PDGF-R1 o combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 12, para tratamiento de una afección relacionada con PDGF-R1 seleccionada de enfermedad cancerosa, tal como gliomas, sarcomas y leucemias; trastornos vasculares, tales como aterosclerosis, reestenosis, hipertensión pulmonar
    10 y enfermedades retinales; enfermedades fibróticas, tales como fibrosis pulmonar, cirrosis hepática, esclerodermia, glomeruloesclerosis y fibrosis cardiaca.
    45 46 47 48 49 50 51
ES08862011T 2007-12-19 2008-12-17 Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf. Active ES2373832T3 (es)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2972 1995-08-30
US9171P 1995-12-22
US12/002,972 US8937047B2 (en) 2007-12-19 2007-12-19 Biokinetics of fast-clearing polypeptides
EP07150394 2007-12-21
EP07150394A EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2007-12-21 Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US917107P 2007-12-26 2007-12-26
PCT/EP2008/010776 WO2009077175A1 (en) 2007-12-19 2008-12-17 Polypeptide derived from protein a and able to bind pdgf

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2373832T3 true ES2373832T3 (es) 2012-02-09

Family

ID=40547476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES08862011T Active ES2373832T3 (es) 2007-12-19 2008-12-17 Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf.

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP2231860B1 (es)
AT (1) ATE527353T1 (es)
DK (1) DK2231860T3 (es)
ES (1) ES2373832T3 (es)
WO (1) WO2009077175A1 (es)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4976412B2 (ja) 2005-12-01 2012-07-18 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ゲーエムベーハー エンドセリン、エンドセリンアゴニスト及びアドレノメジュリンアンタゴニストによる危篤患者の診断及び治療のための方法
EP2077272A1 (en) 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US8124725B2 (en) * 2007-12-19 2012-02-28 General Electric Company PDGF-Rβ binders
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
US9402900B2 (en) 2011-11-16 2016-08-02 Adrenomed Ag Methods of modulating adrenomedullin by administering an anti-adrenomedullin (ADM) antibody
MY174877A (en) 2011-11-16 2020-05-20 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (adm) antibpdy or anti-adm antibody fragment of anti-adm non-ig scaffold for prevention or reduction of organ dysfunction or organ failure in a patient having a chronic of acute disease or acute condition
ES2494191T3 (es) 2011-11-16 2014-09-15 Adrenomed Ag Anticuerpo anti-adrenomedulina (ADM) o fragmento de anticuerpo anti-ADM o andamiaje proteico sin Ig anti-ADM para su utilización en tratamientos
EP2780371B1 (en) 2011-11-16 2018-10-24 AdrenoMed AG Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for regulating the fluid balance in a patient having a chronic or acute disease
AU2012338731B2 (en) 2011-11-16 2017-07-06 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold for prevention or reduction of organ dysfunction or organ failure in a patient having a chronic or acute disease or acute condition
AU2012338730B2 (en) 2011-11-16 2017-07-06 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (ADM) antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold for reducing the risk of mortality in a patient having a chronic or acute disease or acute condition
AU2013222836B2 (en) 2012-02-20 2017-07-20 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement C5
CN103308673B (zh) 2012-03-08 2017-05-31 思芬构技术有限公司 用于预测雌性对象中发生心血管事件的风险的方法
CN103308670B (zh) 2012-03-08 2017-06-09 思芬构技术有限公司 用于预测对象患糖尿病和/或代谢综合征的风险的方法
CN103308689B (zh) 2012-03-08 2017-04-12 思芬构技术有限公司 用于预测雌性对象中患上癌症的风险或诊断癌症的方法
ES2674822T3 (es) 2012-10-02 2018-07-04 Sphingotec Gmbh Método para diagnosticar o monitorizar la función renal o diagnosticar la disfunción renal
EP2904013B1 (en) 2012-10-05 2018-11-07 Affibody AB Her3 binding polypeptides
JP6396303B2 (ja) 2012-10-25 2018-09-26 アフィボディ・アーベー アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法
ES2639099T3 (es) 2012-10-25 2017-10-25 Affibody Ab Polipéptido de unión a albúmina
US9957330B2 (en) * 2012-12-19 2018-05-01 Affibody Ab Polypeptides
CA2897327A1 (en) 2013-01-08 2014-07-17 Sphingotec Gmbh Fasting levels of growth hormone as a predictive marker of cardiovascular risk
LT2970406T (lt) 2013-03-15 2018-03-12 Affibody Ab Naujieji polipeptidai
US10598674B2 (en) 2013-03-20 2020-03-24 Sphingotec Gmbh Adrenomedullin to guide therapy of blood pressure decline
ES2842105T3 (es) * 2013-08-28 2021-07-12 Ipc Res Llc Polipéptidos estables que se unen a C5 de complemento humano
PL3039033T3 (pl) 2013-08-28 2020-01-31 Affibody Ab Polipeptydy wiążące o zmutowanym rusztowaniu
CN106488930B (zh) * 2014-06-13 2021-11-02 阿菲博迪公司 新型多肽
WO2015189431A1 (en) * 2014-06-13 2015-12-17 Affibody Ab New polypeptide
BR112017004189A2 (pt) 2014-09-17 2017-12-12 Affibody Ab dímero de ligação ao fcrn, proteína de fusão ou conjugado, e, composição
EP3002589A1 (en) 2014-10-01 2016-04-06 sphingotec GmbH A method for stratifying a female subject for hormone replacement therapy
CN108064235A (zh) * 2015-01-12 2018-05-22 阿菲博迪公司 Il-17a结合多肽
SG11201708655UA (en) 2015-04-24 2017-11-29 Sphingotec Gmbh A method for predicting the risk of incidence of chronic kidney disease
AU2016347495B2 (en) 2015-10-30 2020-07-02 Affibody Ab New polypeptide having affinity to PD-L1
JP6990652B2 (ja) 2015-10-30 2022-02-03 アフィボディ・アーベー 新規ポリペプチド
JP2019520550A (ja) 2016-04-21 2019-07-18 スフィンゴテック セラピューティクス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｄｐｐ３の定量方法および治療方法
MA45493A (fr) 2016-06-27 2019-05-01 Aicuris Anti Infective Cures Gmbh Inhibiteurs d'entrée de hcmv.
CN109716136B (zh) 2016-07-08 2023-09-22 斯弗因高泰克有限公司 肾上腺髓质素用于评估急性心力衰竭患者的充血
EP3309550A1 (en) 2016-10-12 2018-04-18 sphingotec GmbH Method for the detection of apolipoprotein e4
EP3339324A1 (en) 2016-12-22 2018-06-27 sphingotec GmbH Anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment or anti-adm non-ig scaffold for use in intervention and therapy of congestion in a patient in need thereof
AU2017375049A1 (en) 2016-12-16 2019-06-13 Adrenomed Ag Anti-Adrenomedullin (ADM) antibody or anti-ADM antibody fragment or anti-ADM non-Ig scaffold for use in intervention and therapy of congestion in a patient in need thereof
UY37651A (es) 2017-03-31 2018-10-31 Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ Polipéptido de unión al il-1r-i
RU2019144031A (ru) 2017-05-30 2021-06-30 Сфинготек Гмбх Способ диагностики или мониторинга функции почек или диагностики дисфункции почек
WO2018219301A1 (zh) * 2017-05-31 2018-12-06 四川大学华西医院 一种PDGFRβ靶向性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体变异体及其制备方法和用途
CA3076691A1 (en) 2017-09-25 2019-03-28 Adrenomed Ag Anti-adrenomedullin (adm) binder for use in therapy or prevention of symptoms of illness
JP2021500548A (ja) 2017-10-18 2021-01-07 アドレノメト アクチェンゲゼルシャフト 抗アドレノメデュリン（ａｄｍ）結合剤での処置下での治療モニタリング
US11844812B2 (en) 2017-10-24 2023-12-19 Sphingotec Gmbh Selenoprotein P for prediction of a first cardiovascular event
EP3700937A2 (en) 2017-10-25 2020-09-02 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Dpp3 binder directed to and binding to specific dpp3-epitopes and its use in the prevention or treatment of diseases / acute conditions that are associated with oxidative stress
US20210302440A1 (en) 2018-02-08 2021-09-30 Sphingotec Gmbh Adrenomedullin (adm) for diagnosis and/or prediction of dementia and anti-adrenomedullin binder for use in therapy or prevention of dementia
EP3569614A1 (en) 2018-05-18 2019-11-20 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Compounds and methods for the immobilization of myostatin-inhibitors on the extracellular matrix by transglutaminase
EP3586865A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Charité - Universitätsmedizin Berlin Complement anaphylatoxin binders and their use in treatment of a subject having an ocular wound and/or fibrosis
EP3899547A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 sphingotec GmbH Selenoprotein p in heart failure
CN113557031A (zh) 2018-12-21 2021-10-26 4Teen4制药有限公司 使用血管紧张肽受体激动剂和/或其前体的治疗的疗法指导和/或疗法监测
US20220291234A1 (en) 2019-08-15 2022-09-15 Sphingotec Gmbh A method for diagnosing or monitoring kidney function or diagnosing kidney dysfunction in pediatric patients
BR112022002856A2 (pt) 2019-08-30 2022-08-09 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Orientação de terapia e/ou monitoramento de terapia para o tratamento de choque
WO2021089695A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Affibody Ab Polypeptides
EP3871689A1 (en) 2020-02-26 2021-09-01 sphingotec GmbH Anti-adm-antibodies binding to the free n-terminus for accelerated transition of adm-gly to bio-adm in patients with adm-gly/ bio-adm ratio above a threshold and combination with vitamin c
IL295951A (en) 2020-02-27 2022-10-01 Adrenomed Ag Antiadrenomedullin (adm) binders for use in the treatment of shock patients
MX2022010207A (es) 2020-02-27 2022-11-16 Adrenomed Ag Anticuerpo anti-adrenomedulina (adm) o fragmento de anticuerpo anti-adm o andamiaje no ig anti-adm para usarse en terapia o prevencion de choque.
WO2021170838A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Dpp3 for therapy guidance, monitoring and stratification of nt-adm antibodies in patients with shock
EP3922993A1 (en) 2020-06-12 2021-12-15 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Dpp3 in patients infected with coronavirus
CA3171332A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Andreas Bergmann Dpp3 in patients infected with coronavirus
WO2021185784A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Sphingotec Gmbh Pro-adrenomedullin or fragment thereof in patients infected with corona virus and treatments with binder against adrenomedullin
EP4023218A1 (en) 2020-12-02 2022-07-06 S-Form Pharma Combination therapy for patients having acute and/or persistent dyspnea
WO2022263648A1 (en) 2021-06-18 2022-12-22 Sphingotec Gmbh A method for predicting sepsis and septic shock
KR20240041912A (ko) 2021-06-29 2024-04-01 베리솔 게엠베하 체액내 셀레늄 결핍을 식별하기 위한 복합 바이오마커
WO2023152144A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 Affibody Ab Protein z variants binding thymic stromal lymphopoietin and their medical use
WO2023175035A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Adrenomed Ag Stable aqueous formulation of an anti-adrenomedullin (adm) antibody or anti-adm antibody fragment
WO2024023368A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 4TEEN4 Pharmaceuticals GmbH Prediction of an increase of dpp3 in a patient with septic shock

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5443072A (en) * 1994-01-21 1995-08-22 Kagan; Andrew Miniature disposable blood flow monitor

Also Published As

Publication number Publication date
EP2231860A1 (en) 2010-09-29
WO2009077175A1 (en) 2009-06-25
EP2231860B1 (en) 2011-10-05
DK2231860T3 (da) 2011-12-05
ATE527353T1 (de) 2011-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2373832T3 (es) Polipéptido derivado de proteína a y capaz de unirse a pdgf.
JP7221259B2 (ja) 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
US7655412B2 (en) Self-assembly molecules
ES2660912T3 (es) Nuevos polipéptidos
CN103459415B (zh) 设计的与血清白蛋白结合的重复蛋白
KR102406610B1 (ko) 혈액-뇌 장벽을 통과이동하는 인간화 항체 및 그의 용도
KR102355310B1 (ko) 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도
US9187535B2 (en) Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
KR102355309B1 (ko) 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체-특이적 항체 및 그의 용도
EP4326749A1 (en) Novel human programmed death ligand 1 (pd-l1) specific binding molecules
Borras et al. Generation of an anti-idiotypic affibody-based masking domain for conditional activation of EGFR-targeting
CN114685667B (zh) 间皮素结合分子及其应用
TW201102086A (en) Antibodies against human CCN1 and uses thereof
WO2016059057A1 (en) Vegfr-2 binding polypeptides
CN107073093A (zh) 亲和蛋白及其用途
WO2024074762A1 (en) Ultrastable antibody fragments with a novel disuldide bridge
KR101559479B1 (ko) 고감도 바이오센서용 다가항체
CN116554317A (zh) Muc1结合分子及其应用
WO2023205333A2 (en) Tumor necrosis factor receptor 1 antagonist polypeptides and methods of use thereof
CN117327191A (zh) 靶向cd20的笼状蛋白及其应用