JP6371219B2 - 神経性および神経変性の疾患、障害、および関連過程の診断および治療のための方法 - Google Patents

神経性および神経変性の疾患、障害、および関連過程の診断および治療のための方法 Download PDF

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Description

発明の分野
本発明は、概して、神経性および神経変性の疾患、障害、および関連過程の診断および治療のための方法に関し、より具体的には、αシヌクレインのレベルおよび疾患との相関関係に関する。
背景情報
タンパク質、αシヌクレインは、様々なヒトおよび動物試験によってパーキンソン病（ＰＤ）と関連付けられてきた。最近の研究により、ＰＤに罹患した患者において、αシヌクレインのＣＳＦ中濃度が対照対象よりも有意に低いことが示され、これはＰＤに罹患した患者においてαシヌクレインの代謝が変化することを示唆している。タンパク質の誤った折り畳みによる他の疾患と同様に、タンパク質の誤った折り畳は濃度依存的である。したがって、シヌクレインの合成を低下させることまたはクリアランスを増加させることは、ＰＤの治療薬を開発するための見込みのある方法であり、製薬会社は、薬物標的としてこのタンパク質の代謝に注目してきた。
安定同位体標識化動態（ＳＩＬＫ）アッセイは、安定同位体で標識されたアミノ酸のタンパク質およびペプチドへの代謝取り込みを検出する能力に依存する。安定同位体は、該安定同位体を含有するペプチドにわずかな重量（２〜１００ダルトン）を付加し、この付加的重量は、質量分析計によって測定することができる。安定同位体の投与後の種々の時点で、ＣＳＦ中のタンパク質への安定同位体の代謝取り込みを測定することにより、ＳＩＬＫアッセイを使用してヒト中枢神経系におけるタンパク質の産生およびクリアランスを測定することができる。
以下に、ヒト対象における脳由来αシヌクレインの代謝を測定するためのプロトコルを記載する。試験参加者を特定し、試験に登録する。試験の第１日目に、参加者にＩＶおよび腰椎カテーテルを設置し、所定期間の間、安定同位体を投与する。所定の時点で、カテーテルを通して血漿およびＣＳＦの試料を採取する。次いで、生体試料からαシヌクレインを単離し、質量分析計によってタンパク質への安定同位体の取り込みを測定する。標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの経時的な変化により、タンパク質の産生速度およびクリアランス速度の算出が可能となる。
αシヌクレイン代謝を測定することにより、正常および疾患状態におけるαシヌクレインの合成およびクリアランス速度に関する情報を得るための結果を提供することができ、またαシヌクレインの合成およびクリアランスを標的とする治療のヒトにおける影響を直接決定するための方法も提供することができる。
本発明の一実施形態において、本発明者らは、αシヌクレインを認識する抗体を用いた免疫沈降により、生体試料からαシヌクレインを単離する方法を記載する。この実施形態では、例えば、ギ酸を使用することにより、抗体から単離タンパク質を溶出し、次いで、トリプシンまたは別のプロテアーゼで消化する。次いで、αシヌクレインペプチドへの安定同位体の取り込みを質量分析計で分析し、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を算出する。
一実施形態において、本発明は、対象由来の生体試料中のαシヌクレインのレベルを検出するために該試料と検出可能な同位体とを接触させる段階を含む、対象における予後を判定するための、診断を決定するための、または治療レジメンの有効性を判定するための方法である。
ある実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害を診断するための方法であって、該方法は、（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分の投与；（ｂ）対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；（ｃ）対象および対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；（ｄ）対象および対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに（ｆ）対象のαシヌクレイン代謝と、対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較を含み、ここで、対応する正常試料と比較した対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害の陽性の診断を示し、それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を診断する。
別の実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害の予後を判定するための方法であって、該方法は、（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分の投与；（ｂ）対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；（ｃ）対象および対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；（ｄ）対象および対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに（ｆ）対象のαシヌクレイン代謝と、対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較を含み、ここで、対応する正常試料と比較した対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害の良好な予後を示し、それによってαシヌクレイン関連疾患または障害の予後を予測する。
さらなる実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するために治療レジメンの有効性を判定するための方法であって、該方法は、（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分および治療剤の投与；（ｂ）対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；（ｃ）対象および対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；（ｄ）対象および対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに（ｆ）対象のαシヌクレイン代謝と、対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較を含み、ここで、対応する正常試料と比較した対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の治療レジメンの有効性を示し、それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療レジメンの有効性を判定する。
ある実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定するためのインビボでの方法であって、該方法は、（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分および治療剤の投与；（ｂ）対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；（ｃ）対象および対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；（ｄ）対象および対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに（ｆ）対象のαシヌクレイン代謝と、対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較を含み、ここで、対応する正常試料と比較した対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の特定を示し、それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定する。
一実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定するためのインビトロでの方法であって、該方法は、（ａ）細胞への、標識された成分および治療剤の投与；（ｂ）細胞および対応する正常試料からのαシヌクレインの採取；（ｃ）細胞および対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；（ｄ）細胞および対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに（ｆ）細胞のαシヌクレイン代謝と、対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較を含み、ここで、対応する正常試料と比較した細胞のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の特定を示し、それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定する。
一実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤に対する対象の反応を予測するための方法であって、該方法は、（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分および治療剤の投与；（ｂ）対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；（ｃ）対象および対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；（ｄ）対象および対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに（ｆ）対象のαシヌクレイン代謝と、対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較を含み、ここで、対応する正常試料と比較した対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の特定を示し、それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を診断する。
一態様において、標識された成分は、標識されたアミノ酸である。さらなる態様において、アミノ酸は、放射性同位体または非放射性標識同位体で標識されている。一態様において、アミノ酸は、非放射性標識同位体で標識されている。さらなる態様において、非放射性標識同位体は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏまたは１８Ｏ、および３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓであってもよい。さらなる態様において、アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンであってもよい。さらに、標識されたアミノ酸は、ｘ＝１〜６である１５Ｎｘで標識されたロイシン、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニン、およびｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンのうちの１つ以上であってもよい。一態様において、標識された成分は、標識された水である。さらなる態様において、標識された水は、重水素化水（２Ｈ２Ｏ）、酸素１８水（Ｈ２ １８Ｏ）、または他の同様の分子である。一態様において、生体試料は、体液または組織試料である。さらなる態様において、体液は、血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、唾液、汗、および涙であってもよい。一態様において、体液はＣＳＦである。さらなる態様において、組織試料はＣＮＳ試料である。さらなる態様において、ＣＮＳ試料は、ＣＮＳ系由来の組織、脳組織、前脳組織、間脳組織、中脳組織、後脳組織、および脊髄組織であってもよい。
一態様において、治療剤は、αシヌクレインの低分子阻害剤、αシヌクレインに対する抗体、αシヌクレインクリアランス活性化剤、サーチュイン２阻害剤、プロテアソーム阻害剤、αシヌクレイン重合の低分子阻害剤、Ｌ−ＤＯＰＡ、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＰＴ）阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、ホルモン、神経保護薬、および細胞死阻害剤であってもよい。一態様において、治療剤は、Ｌ−ＤＯＰＡである。
一実施形態において、本発明は、αシヌクレイン関連疾患または障害を有するかまたは有することが疑われる対象における予後を判定するための、診断を決定するための、または治療レジメンの有効性を判定するためのキットである。一態様において、キットは、１つ以上の標識された成分と、対象に該１つ以上の成分を投与するための手段とを含む。さらなる態様において、キットは、生体試料を得るための手段と、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を決定するための指示とをさらに含む。
[本発明1001]
対象由来の生体試料中のαシヌクレインのレベルを検出するために、該試料と検出可能な同位体とを接触させる段階
を含む、対象における予後を判定するための、診断を決定するための、または治療レジメンの有効性を判定するための方法であって、
前記レベルが、予後を判定するために、診断を決定するために、または治療レジメンの有効性を判定するために参照基準レベルと比較される、
前記方法。
[本発明1002]
（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分の投与；
（ｂ）前記対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；
（ｃ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
（ｄ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
（ｆ）前記対象のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
を含む、αシヌクレイン関連疾患または障害を診断するための方法であって、
前記対応する正常試料と比較した前記対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害の陽性の診断を示し、
それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を診断する、
前記方法。
[本発明1003]
（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分の投与；
（ｂ）前記対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；
（ｃ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
（ｄ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
（ｆ）前記対象のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
を含む、αシヌクレイン関連疾患または障害の予後を判定するための方法であって、
前記対応する正常試料と比較した前記対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害の良好な予後を示し、
それによってαシヌクレイン関連疾患または障害の予後を予測する、
前記方法。
[本発明1004]
（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有する対象への、標識された成分および治療剤の投与；
（ｂ）前記対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；
（ｃ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
（ｄ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
（ｆ）前記対象のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
を含む、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するために治療レジメンの有効性を判定するための方法であって、
前記対応する正常試料と比較した前記対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の治療レジメンの有効性を示し、
それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療レジメンの有効性を判定する、
前記方法。
[本発明1005]
（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分および治療剤の投与；
（ｂ）前記対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；
（ｃ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
（ｄ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
（ｆ）前記対象のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
を含む、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定するためのインビボでの方法であって、
前記対応する正常試料と比較した前記対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の特定を示し、
それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定する、
前記方法。
[本発明1006]
（ａ）細胞への、標識された成分および治療剤の投与；
（ｂ）前記細胞および対応する正常試料からのαシヌクレインの採取；
（ｃ）前記細胞および前記対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
（ｄ）前記細胞および前記対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
（ｆ）前記細胞のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
を含む、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定するためのインビトロでの方法であって、
前記対応する正常試料と比較した前記細胞のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の特定を示し、
それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤を特定する、
前記方法。
[本発明1007]
（ａ）αシヌクレイン関連疾患または障害を有することが疑われる対象への、標識された成分および治療剤の投与；
（ｂ）前記対象からの生体試料の採取および対応する正常試料の採取；
（ｃ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
（ｄ）前記対象および前記対応する正常試料に由来する標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
（ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
（ｆ）前記対象のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
を含む、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤に対する対象の反応を予測するための方法であって、
前記対応する正常試料と比較した前記対象のαシヌクレイン代謝における変化が、αシヌクレイン関連疾患または障害を治療するための治療剤の特定を示し、
それによってαシヌクレイン関連疾患または障害を診断する、
前記方法。
[本発明1008]
前記標識された成分が、標識されたアミノ酸または標識された水である、本発明1002〜1007の方法。
[本発明1009]
前記アミノ酸が、放射性同位体または非放射性標識同位体で標識されている、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記アミノ酸が、非放射性標識同位体で標識されている、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記非放射性標識同位体が、 2 Ｈ、 13 Ｃ、 15 Ｎ、 17 Ｏまたは 18 Ｏ、および 33 Ｓ、 34 Ｓ、または 36 Ｓからなる群から選択される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される、本発明1008の方法。
[本発明1013]
前記標識されたアミノ酸が、ｘ＝1〜6である 15 Ｎ ｘ で標識されたロイシン、ｘ＝1〜9である 13 Ｃ ｘ で標識されたフェニルアラニン、およびｘ＝1〜6である 13 Ｃ ｘ で標識されたイソロイシンのうちの1つ以上からなる群から選択される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記標識された成分が、標識された水である、本発明1002〜1007の方法。
[本発明1015]
前記標識された水が、重水素化水または酸素18水からなる群から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記生体試料が、体液または組織試料からなる群から選択される、本発明1002〜1007の方法。
[本発明1017]
前記体液が、血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、唾液、汗、および涙からなる群から選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記体液がＣＳＦである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記組織試料がＣＮＳ試料である、本発明1016の方法。
[本発明1020]
前記ＣＮＳ試料が、ＣＮＳ系由来の組織、脳組織、前脳組織、間脳組織、中脳組織、後脳組織、および脊髄組織からなる群から選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記治療剤が、αシヌクレインの低分子阻害剤、αシヌクレインに対する抗体、αシヌクレインクリアランス活性化剤、サーチュイン2阻害剤、プロテアソーム阻害剤、αシヌクレイン重合の低分子阻害剤、Ｌ−ＤＯＰＡ、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＰＴ）阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、ホルモン、神経保護薬、および細胞死阻害剤からなる群から選択される、本発明1004〜1007の方法。
[本発明1022]
前記治療剤がＬ−ＤＯＰＡである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
αシヌクレイン関連疾患または障害を有するかまたは有することが疑われる対象における予後を判定するための、診断を決定するための、または治療レジメンの有効性を判定するためのキット。
[本発明1024]
1つ以上の標識された成分と、対象に該1つ以上の成分を投与するための手段とを含む、本発明1023のキット。
[本発明1025]
生体試料を得るための手段と、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を決定するための指示とをさらに含む、本発明1023のキット。
トリプシン切断部位を示している、αシヌクレイン（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。 α、β、およびγシヌクレインのアミノ酸配列における違いを示している、多重配列（配列番号１〜３）の比較を示す。 質量分析計で観察された、αシヌクレインを起源とするトリプシン消化ペプチド（配列番号４〜１３）を示す。本発明者らは、脳脊髄液、馴化細胞培養培地、および細胞ライセート等の生物学的供給源から単離したαシヌクレイン、ならびに組換えαシヌクレインを分析した。 αシヌクレイン８１−９６ペプチド（配列番号１３）の質量スペクトルを示す。必須アミノ酸フェニルアラニン（Ｆ）を含有する。８１−９６トリプシン消化ペプチド中のフェニルアラニンの存在は、安定同位体で標識されたフェニルアラニンの投与によって、このペプチドを、αシヌクレインの代謝をモニタリングするために使用することができるペプチドにする。 αシヌクレイン３３−４３ペプチド（配列番号６）の質量スペクトルを示す。必須アミノ酸ロイシン（Ｌ）を含有する。３３−４３トリプシン消化ペプチド中のロイシンの存在は、安定同位体で標識されたロイシンの投与によって、このペプチドを、αシヌクレインの代謝をモニタリングするために使用することができるペプチドにする。 αシヌクレイン３５−４３ペプチド（配列番号７）の質量スペクトルを示す。必須アミノ酸ロイシン（Ｌ）を含有する。３５−４３トリプシン消化ペプチド中のロイシンの存在は、安定同位体で標識されたロイシンの投与によって、このペプチドを、αシヌクレインの代謝をモニタリングするために使用することができるペプチドにする。 標識された成分の投与から３、５、および７日後に採取された試料から得られたαシヌクレインの標準曲線を示す。 標識された成分の投与から３、５、および７日後に採取された試料から得られたαシヌクレインのイオンの相対強度を示す。 標識された試料および非標識の試料において測定されたαシヌクレインの相対イオン強度を示す。 標識された成分の投与後３６時間にわたってＳＩＬＫアッセイにより検出されたアミロイドβタンパク質およびαシヌクレインのレベルを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、生体分子の安定同位体標識化は、生体分子の分子量にわずかな差をもたらすが、生体分子の物理特性または化学特性は変化させないという発見に一部基づいている。本明細書に提供される技術を使用して、生体分子の分析を、神経障害または神経変性障害を有するかまたは発症するリスクのある対象を診断および／または治療するために使用することができる。したがって、本発明は、対象におけるαシヌクレインの代謝を測定するために有用な方法およびキットを提供する。
本発明はまた、治療剤が、対象におけるαシヌクレインの産生速度またはクリアランス速度に影響を及ぼすかどうかを評価するための方法も提供する。したがって、方法は、治療剤の最適な用量および／または最適な投与レジメンを決定するために使用されてもよい。さらに、方法は、どの対象が特定の治療剤により良好に反応するかを判定するために使用されてもよい。例えば、αシヌクレインの産生が高い対象は、ある治療剤により良好に反応する可能性があるのに対し、αシヌクレインのクリアランスが低い対象は、別の治療剤により良好に反応する可能性がある。あるいは、ある特定の遺伝子型を有する対象は、異なる遺伝子型を有する対象よりも特定の治療剤により良好に反応する可能性がある。最後に、アイソフォーム特異的な定量化を可能にすることにより、治療剤が、あるアイソフォームの産生を別のアイソフォーム産生に切り替えることによってαシヌクレインの産生を調節することができるかどうかを判定するために、この方法が使用されてもよい。
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈上、明らかにそうではないという指示のない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本開示等を読めば当業者に明白となるであろう、本明細書に記載されるタイプのうち１つ以上の方法および／または段階を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等であるいずれの方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を次に記載する。
本明細書で使用される「対象」という用語は、本方法が実施される任意の個体または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者には理解されるように、対象は動物であってもよい。したがって、哺乳動物、例えば、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む）、ならびに霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）を含む他の動物が、対象の定義の範囲内に含まれる。さらに、「対象」という用語は、細胞の培養物を指してもよく、その場合、本発明の方法は、例えば、治療剤の有効性を評価するためにインビトロで行われる。
本明細書で使用される場合、「試料」および「生体試料」という用語は、本発明によって提供される方法に好適な任意の試料を指す。本発明の方法において使用される細胞の試料は、組織試料もしくは対象由来の体液、または生検手技（例えば、針生検）もしくは外科手技によって得られた組織から得ることができる。特定の実施形態において、本発明の生体試料は、体液、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、尿、唾液、および涙の試料である。
本発明において使用される「抗体」という用語は、エピトープ決定基に結合することができる、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、およびそれらの断片（ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２、ＦｖおよびＳＣＡ断片等）のインタクトな分子を含むことが意図される。抗体に関連して使用される場合、「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」という用語は、抗体と特定のエピトープとの相互作用が、少なくとも約１×１０−６、一般的には少なくとも約１×１０−７、通常少なくとも約１×１０−８、および具体的には少なくとも約１×１０−９または１×１０−１０またはそれ以下の解離定数を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「αシヌクレイン関連疾患または障害」という用語は、αシヌクレインの循環レベルもしくは産生、またはαシヌクレイン代謝が正常から変化する、任意の疾患または障害を指す。この変化は、正常と比較した場合のαシヌクレインのレベルまたは代謝における増加または減少であり得る。
本明細書に開示される場合、αシヌクレインの安定同位体標識化は、αシヌクレインの分子量にわずかな差をもたらすが、αシヌクレインの全体的な物理特性または化学特性は変化させない。よって、αシヌクレインは、同一の様式で抗体に結合し、液体クロマトグラフィーカラムから溶出する。質量分析計等の感度の高い機器のみが、標識されたαシヌクレインと標識されていないαシヌクレインとの間の重量のわずかな差を測定する能力を提供する。
いくつかの異なる成分が、αシヌクレインを標識するために使用されてもよい。一般的に言えば、本発明の方法において用いられる２種類の標識化成分は、放射性同位体および非放射性（安定）同位体である。一実施形態において、非放射性同位体が使用されてもよく、質量分析法によって測定されてもよい。好ましい安定同位体は、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏまたは１８Ｏ、および３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓを含むが、一般的な天然型に見られるよりも多いまたは少ない中性子によって原子の質量を変化させる他の多くの安定同位体もまた効果的であることが認識される。好適な標識は、一般に、αシヌクレインの質量を、質量分析計において検出できるように変化させる。代替として、放射性同位体が使用されてもよく、標識されたαシヌクレインは、質量分析計によるだけでなく、シンチレーションカウンターを用いて（または核シンチグラフィーによって）測定されてもよい。１つ以上の標識された成分が、同時にまたは順番に使用されてもよい。
したがって、一実施形態において、本方法がαシヌクレインの代謝を測定するために用いられる場合、標識された成分は、典型的にはアミノ酸である。当業者は、αシヌクレインの標識を提供するためにいくつかのアミノ酸が使用されてもよいことを理解するであろう。一般に、アミノ酸の選択は、以下のような様々な要因に基づいている：（１）そのアミノ酸が、通常、αシヌクレインの少なくとも１つの残基に存在する。（２）そのアミノ酸は、通常、タンパク質産生部位に迅速に到達し、血液脳関門または他の組織もしくは細胞の障壁を越えて迅速に平衡に達することができる。（３）そのアミノ酸標識は、通常、関心対象のタンパク質の代謝に影響を与えない（例えば、非常に大量のロイシンは、筋肉代謝に影響を及ぼし得る）。および（４）所望のアミノ酸の入手しやすさ（すなわち、一部のアミノ酸は、他のアミノ酸よりもはるかに高価であるかまたは製造が困難である）。
一実施形態において、アミノ酸は、必須アミノ酸（体内で産生されない）であるため、より高い割合の標識化が達成され得る。別の実施形態において、アミノ酸は、非必須アミノ酸である。例示的なアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。そのため、一実施形態において、標識されたアミノ酸は、１５Ｎで標識されたアミノ酸、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニン、ｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンのうちの１つ以上である。例えば、６つの１３Ｃ原子を含有する１３Ｃ６−フェニルアラニンが、αシヌクレインを標識するために使用されてもよい。別の実施形態において、１３Ｃ６−ロイシンが、αシヌクレインを標識するために使用されてもよい。
非放射性同位体および放射性同位体の両方の、標識されたアミノ酸の商業的供給源が多数存在する。一般に、標識されたアミノ酸は、生物学的にまたは合成的に生成することができる。生物学的に生成されたアミノ酸は、生物がタンパク質を産生する際にアミノ酸に組み込まれる１３Ｃ、１５Ｎ、または別の同位体の濃縮混合物中で成長させた生物（例えば、ケルプ／海藻）から得られてもよい。アミノ酸は、次いで分離され、精製される。代替として、アミノ酸は、既知の合成化学プロセスを用いて作製されてもよい。
一実施形態において、本方法がαシヌクレインの代謝を測定するために用いられる場合、標識された成分は、典型的には、標識された水である。一態様において、標識された水は、重水素化水（２Ｈ２Ｏ）である。別の態様において、標識された水は、酸素１８水（Ｈ２ １８Ｏ）である。さらなる態様において、標識された水は、重水素化水または酸素１８水と同様の分子である。
標識された成分（例えば、標識されたアミノ酸）は、いくつかの方法によって対象に投与されてもよい。好適な投与経路は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または経口を含む。一実施形態において、標識された成分は、静脈内注入によって投与されてもよい。別の実施形態において、標識された成分は、経口的に摂取されてもよい。
標識された成分は、選択される分析の種類（例えば、定常状態またはボーラス／チェイス）に依存して、単回大量用量として一定期間にわたって緩徐に投与されてもよいか、最初のボーラス投与後に一定期間にわたって緩徐に投与されてもよい。標識されたαシヌクレインの定常状態レベルを達成するために、標識化時間は、一般に、標識されたαシヌクレインが確実に定量化され得るように十分な期間であるべきである。一実施形態において、標識された成分は、単回経口用量として投与される。別の実施形態において、標識された成分は、約１時間〜約３６時間に及ぶ期間にわたって投与される。別の実施形態において、標識された成分は、約６時間〜約１２時間に及ぶ期間にわたって投与される。さらに別の実施形態において、標識された成分は、約９時間〜約１２時間に及ぶ期間にわたって投与される。さらに別の実施形態において、標識された成分は、約９時間〜約２４時間に及ぶ期間にわたって投与される。標識された成分の投与速度は、約０．５ｍｇ／ｋｇ／時間〜約５ｍｇ／ｋｇ／時間の範囲であり得る。一実施形態において、標識されたロイシンの投与速度は、約１ｍｇ／ｋｇ／時間〜約３ｍｇ／ｋｇ／時間である。別の実施形態において、標識されたロイシンの投与速度は、１．８ｍｇ／ｋｇ／時間〜約２．５ｍｇ／ｋｇ／時間である。別の実施形態において、標識されたロイシンは、約５０〜約５００ｍｇ／ｋｇ対象の体重、約５０〜約３００ｍｇ／ｋｇ対象の体重、または約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ対象の体重の、ボーラスとして投与されてもよい。さらに別の実施形態において、標識されたロイシンは、約２００ｍｇ／ｋｇ対象の体重の、ボーラスとして投与されてもよい。代替の実施形態において、標識されたロイシンは、約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ対象の体重、約１〜約４ｍｇ／ｋｇ対象の体重、または約２ｍｇ／ｋｇ対象の体重の、最初のボーラスの後に、上に詳述したように静脈内投与されてもよい。別の実施形態において、１〜７日間にわたって水が投与される。
当業者は、標識された成分の量（または用量）は異なり得ることおよび異なることを認識するであろう。一般に、量は以下の要因に依存する（また、これらによって推定される）：（１）所望される分析の種類。例えば、血漿中で約１５％の標識されたロイシンの定常状態を達成するためには、１０分にわたる３ｍｇ／ｋｇの最初のボーラスの後に、約９時間にわたる約２ｍｇ／ｋｇ／時間が必要である。対照的に、定常状態が必要ではない場合、標識された成分の大量ボーラス（例えば、１または５グラムの標識されたロイシン）が最初に与えられてもよい。（２）αシヌクレインの代謝速度。例えば、αシヌクレインが急速に産生されている場合、必要とされる標識化時間はより短くなり得、より必要とされる標識はより少なくなり得る（おそらくは、１時間にわたってわずか０．５ｍｇ／ｋｇ）。しかしながら、ほとんどのタンパク質が数時間から数日間の半減期を有するため、むしろ、９、１２、または２４時間の持続注入が０．５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇで用いられてもよい。（３）標識の検出感度。例えば、標識検出の感度が高まるにつれて、必要な標識の量が減少し得る。
単一の対象に１つより多くの標識された成分が使用されてもよいことを理解されたい。これにより、αシヌクレインの多重標識化が可能となり、異なる時点でのαシヌクレインの産生またはクリアランスに関する情報を提供することができる。例えば、第１の標識が、第１の期間にわたって対象に与えられ、その後、薬理作用のある物質（薬物）が与えられてもよく、次いで、第２の標識が投与されてもよい。一般に、対象から得られた試料の分析は、薬物投与の前および後にαシヌクレインの代謝の測定を提供し、同じ対象における薬物の薬力学的効果を直接的に測定する。代替として、αシヌクレインの標識化を増加させるために、複数の標識が同時に用いられてもよい。
本発明の方法は、αシヌクレインの代謝を測定することができるように対象から試料を得ることを提供する。一実施形態において、試料は体液である。好適な体液は、限定されないが、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液血漿、血清、尿、唾液、汗、および涙を含む。別の実施形態において、試料は組織試料、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）由来の組織の試料等である。試料は、通常、当業者に周知の標準的な手順を使用して採取される。
一実施形態において、試料はＣＮＳ試料であり、これは、脳組織および脊髄組織を含む中枢神経系由来の組織を含むが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、ＣＮＳ試料は、限定されないが、前脳（例えば、大脳皮質、基底核、海馬）、間脳（例えば、視床、視床下部、視床腹部）、中脳（例えば、蓋、被蓋）、または後脳（例えば、脳橋、小脳、延髄）に由来する組織を含む脳組織から採取されてもよい。別の実施形態において、ＣＮＳ試料は、脊髄組織から採取されてもよい。さらに他の実施形態において、１つより多くのＣＮＳ領域に由来するＣＮＳ試料が採取されてもよい。したがって、αシヌクレインの代謝は、異なるＣＮＳ試料において、例えば、皮質および海馬において、同時に測定されてもよい。
ＣＮＳ試料は、既知の技術によって得られてもよい。例えば、脳組織または脊髄組織は、切開または切除を介して得られてもよい。代替として、ＣＮＳ試料は、レーザー顕微解剖を用いて得られてもよい。所望のＣＮＳ試料および用いられる対象に依存して、試料を得るために対象を殺処分しなければならない場合またはそうではない場合がある。
一実施形態において、試料は、所定の単一時点で、例えば、標識化の１時間以内に、対象から得られる。一般に、代謝が迅速なタンパク質の場合、標識された成分の投与開始後、最初の１２〜１８時間の間に得られる試料が、αシヌクレインの産生速度を決定するために使用されてもよく、標識された成分の投与開始後２４〜３６時間の間に採取された試料が、αシヌクレインのクリアランス速度を決定するために使用されてもよい。一般に、代謝が緩徐なタンパク質の場合、標識された成分の投与開始後、最初の１〜４日の間に得られる試料が、αシヌクレインの産生速度を決定するために使用されてもよく、標識された成分の投与開始後４〜１４日の間に採取された試料が、αシヌクレインのクリアランス速度を決定するために使用されてもよい。別の実施形態において、０〜１２時間、０〜２４時間、または０〜３６時間の間、対象から毎時間試料が得られる。さらに別の実施形態において、αシヌクレインの産生速度およびクリアランス速度に依存して、１時間から数日、またはさらには数週間の間を空けて、試料が採取されてもよい。
当業者は、標識された成分のαシヌクレインへの取り込みの観察を可能にするタイミングで、標識された成分が投与されるべきであることを認識するであろう。αシヌクレインの標識化は、タンパク質が細胞内で合成されるときに行われる。しかしながら、αシヌクレインへの標識の取り込みは、一旦タンパク質が細胞を出て、脳脊髄液または血流に入ってからのみ測定される。タンパク質が細胞を出るために複雑なプロセシングを受ける場合、合成から体液中に出現するまでに多くの時間がかかる可能性がある。したがって、αシヌクレインがＣＳＦ中に現れるのに２４〜４８時間かかる場合、標識の投与は、ＣＳＦ試料採取開始の２４〜４８時間前に行われなければならない。あるいは、αシヌクレインがＣＳＦ中に現れるのに４８〜７２時間かかる場合、標識の投与は、ＣＳＦ試料採取開始の４８〜７２時間前に行われなければならない。さらに、αシヌクレインがＣＳＦ中に現れるのに３日から１週間かかる場合、標識の投与は、ＣＳＦ試料採取開始の３日から１週間前に行われなければならない。
異なる時点の試料が所望される場合、１つより多くの対象が用いられてもよいことを理解されたい。例えば、１対象がベースラインの試料に用いられてもよく、別の対象が、標識された成分の投与後１時間の時点に用いられてもよく、別の対象が、標識された成分の投与後６時間の時点に用いられてもよい。
したがって、本発明は、試料中の標識されたαシヌクレインの量および標識されていないαシヌクレインの量の検出を、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を決定するために使用できること、次いで、対象におけるαシヌクレインの産生速度およびクリアランス速度を推定するために使用できることを提供する。標識されたαシヌクレインと標識されていないαシヌクレインとの間の質量の差を検出するための例示的な手段として、限定されないが、液体クロマトグラフィー質量分析法、ガスクロマトグラフィー質量分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法、およびタンデム質量分析法が挙げられる。
しかしながら、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を検出する前に、試料中の他の生体分子からαシヌクレインを単離および／または分離することが望ましい場合がある。よって、一実施形態においては、αシヌクレインを分析する前に、免疫沈降を用いてαシヌクレインを単離および精製してもよい。別の実施形態においては、αシヌクレインは、親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィーによって単離または精製されてもよい。代替として、クロマトグラフィー設定を有する質量分析計を用いて、免疫沈降を行わずに生体分子を分離してもよく、次いで、αシヌクレインを直接測定してもよい。例示的な一実施形態においては、αシヌクレインを免疫沈降させ、次いで、エレクトロスプレーイオン化源（ＬＣ−ＥＳＩタンデムＭＳ）を備えたタンデムＭＳユニットと適合する液体クロマトグラフィーシステムによって分析してもよい。
別の態様において、本発明は、同じ試料中の複数の生体分子の代謝を同時に測定できることを提供する。すなわち、非標識の生体分子および標識された生体分子の両方の量が、複数の生体分子について別々にまたは同時に検出および測定され得る。そのため、本発明は、１つ以上の生体分子の産生およびクリアランスにおける変化を大規模にスクリーニングするための有用な方法（すなわち、プロテオミクス／メタボロミクス）を提供し、また、根底にある病態生理に関与する生体分子を検出および測定するための感度の高い手段を提供する。一態様において、本発明はまた、複数の種類の生体分子を測定するための手段も提供する。これに関連して、例えば、タンパク質および脂質は、同時にまたは連続的に測定されてもよい。例えば、ＣＳＦ試料からαシヌクレインおよびＡβの両方を単離することができ、２つの個々のタンパク質の産生およびクリアランスを同じ対象において決定することができる。
一旦、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの量が試料中で検出されると、標識されたαシヌクレインの量を、標識されていないαシヌクレインの量で除すことにより、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率または割合を決定することができる。αシヌクレインの検出に質量分析計が使用される場合、この比率は、標識されたαシヌクレインのイオン強度を、標識されていないαシヌクレインのイオン強度で除すことにより算出される。
本発明は、標識されていないタンパク質に対する標識されたタンパク質の比率、および他の計算を行うことができるように、標識されたタンパク質および標識されていないタンパク質の同時測定を可能にする。標識化比率の測定値は、安定同位体の注入後の異なる試料採取時間にわたって組み合わされるが、代謝プロファイルを形成するようにデータを組み合わせることができる。当業者は、本発明の方法とともに使用できる標識化の一次速度則モデルに精通しているであろう。例えば、分画合成速度（ＦＳＲ）を算出することができる。ＦＳＲは、標識されていないタンパク質に対する標識されたタンパク質の初期増加率を前駆体の濃縮度で除したものと等しい。同様に、分画クリアランス速度（ＦＣＲ）を算出することができる。さらに、分画代謝回転速度（ＦＴＲ）、遅延時間、同位体トレーサーの定常状態等の他のパラメータを決定し、タンパク質の代謝および生理機能の尺度として用いてもよい。また、コンパートメント間の移動を推定するために、多重コンパートメントモデルに適合するようにデータのモデル化が行われてもよい。当然、選択される数学モデル化の種類は、個々の合成およびクリアランスパラメータ（例えば、ワンプール、マルチプール、定常状態、非定常状態、コンパートメントモデル化等）に依存する。本明細書で使用される場合、「定常状態」は、指定された期間にわたって測定されたパラメータに有意な変化が存在しない状態を指す。
安定同位体標識化動態（ＳＩＬＫ）法は、生存している対象の脳脊髄液において新たに合成されたタンパク質への安定（非放射性）同位体の代謝取り込みを検出することが示されている。ＳＩＬＫに関する詳細な情報は、米国特許出願公開第２００８／０１４５９４１号および同第２００９／０１４２７６６号、ならびに国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１０７８１４号（これらの各々の内容全体が、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。ＳＩＬＫは、中枢神経系においてタンパク質の産生速度およびクリアランス速度を測定することを可能にする。これまで、この方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連するアミロイドβタンパク質（Ａβ）の産生およびクリアランスの測定に適用されてきた。
しかしながら、これまでのところ、現行版のＳＩＬＫアッセイ法は、Ａβの代謝しか測定していない。本明細書に実証するデータにおいて、本発明者らは、ＳＩＬＫもαシヌクレインに適用できることを示す。このアッセイは、生体液からαシヌクレインを単離するために、αシヌクレインに特異的に結合する抗体を使用する点において、およびαシヌクレインへの安定同位体の取り込みをモニタリングするために、αシヌクレイン特異的ペプチドを選択する点において、独特なものである。
したがって、タンパク質の産生は、典型的には、標識されたタンパク質／標識されていないタンパク質の比率の経時的な増加率に基づいている（すなわち、傾き、指数関数近似曲線、またはコンパートメントモデルの適合がタンパク質産生速度を規定する）。これらの算出には、典型的には、最低１つの試料が必要である（ベースラインの標識を推定することができる）が、２つが好ましく、タンパク質への標識の取り込みについての正確な曲線（すなわち、産生速度）を算出するためには、複数の試料がより好ましい。複数の試料が使用されるかまたは好まれる場合、試料は同じ対象から採取される必要はない。例えば、ゼロ時点で、異なる５つの対象においてタンパク質が標識されてもよく、次いで、標識化後の異なる時点で、各対象から単一の試料が採取されてもよい。
反対に、標識されたアミノ酸の投与が終了した後、標識されていないタンパク質に対する標識されたタンパク質の比率の減少率は、典型的には、そのタンパク質のクリアランス速度を反映している。これらの算出には、典型的には、最低１つの試料が必要とされる（ベースラインの標識を推定することができる）が、２つが好ましく、タンパク質由来の標識の経時的な減少についての正確な曲線（すなわち、クリアランス速度）を算出するためには、複数の試料がより好ましい。複数の試料が使用されるかまたは好まれる場合、試料は同じ対象から採取される必要はない。例えば、ゼロ時点で、異なる５つの対象においてタンパク質が標識されてもよく、次いで、標識化後の異なる時点で、各対象から単一の試料が採取されてもよい。所与の時点でのＣＮＳ試料中の標識されたタンパク質の量は、産生速度またはクリアランス速度（すなわち、除去または破壊）を反映し、通常、対象におけるタンパク質の、１時間当たりの割合または質量／時間（例えば、ｍｇ／時間）として表される。
本発明の方法は、対象におけるαシヌクレインのインビボでの代謝を測定することにより、神経疾患または神経変性疾患の進行を診断またはモニタリングするために使用されてもよい。さらに、本発明の方法は、対象におけるαシヌクレインのインビボでの代謝を測定することにより、神経疾患または神経変性疾患の治療をモニタリングするために使用されてもよい。αシヌクレインの代謝は、任意の増加または減少が疾患の存在または進行を示し得るように、神経疾患または神経変性疾患と関連付けることができる。したがって、αシヌクレインの代謝は、対応する正常試料中のαシヌクレインの代謝、神経疾患状態または神経変性疾患状態であることが分かっている対象におけるαシヌクレインの代謝、より早期の時点で決定された同じ対象のαシヌクレインの代謝、またはそれらの任意の組み合わせと比較することができる。
さらに、そのような方法は、疾患を発症する素因を有するとして個体を特定するのに役立ち得るか、または実際の臨床症状の出現の前に疾患を検出するための手段を提供し得る。この種のより決定的な診断は、医療従事者が、より早期に予防措置または積極的な治療を用いることを可能にし、それによって疾患の発症またはさらなる進行を予防する。
本明細書で使用される場合、「対応する正常試料」は、検査する試料と同じ臓器に由来するおよび／または同じ種類の試料を指す。一態様において、対応する正常試料は、健常な個体から得られた細胞の試料を含む。そのような対応する正常試料は、検査する試料を提供する個体と年齢を適合させた、および／または同じ性別の個体に由来してもよいが、そうである必要はない。別の態様において、対応する正常試料は、検査する試料を提供する対象の組織の他の健康な部分から得られた細胞の試料を含む。
神経疾患状態または神経変性疾患状態であることが分かっている対象におけるαシヌクレインの代謝への言及は、神経疾患または神経変性疾患と関連するαシヌクレインの所定の代謝を含む。したがって、代謝は、単一の個体の試料から得られたαシヌクレインの既知の代謝と比較されてもよく、または対象のものと同じ種類の樹立細胞株に由来してもよい。一態様において、樹立細胞株は、そのような細胞株のパネルのうちの１つであってもよく、ここでパネルは、同じ種類の疾患の異なる細胞株、および／またはαシヌクレインに関連する異なる疾患の異なる細胞株を含むことができる。そのような細胞株のパネルは、例えば、治療される対象から少数の細胞しか得ることができない場合に本発明の方法を実施するために有用であり得（つまり、対象の細胞の代わりとなる試料を提供する）、また、本発明の方法を実施する際に対照試料として含めるためにも有用であり得る。
αシヌクレインの代謝に関連し得る例示的な神経疾患または神経変性疾患としては、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、加齢関連性の障害および認知症、レビー小体病、脳外傷（ＴＢＩ）、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはルー・ゲーリック病）が挙げられる。また、ＣＮＳの正常な生理機能、代謝、および機能を研究するために本発明の方法が使用されることも想定される。
別の態様において、本発明は、神経疾患または神経変性疾患を治療するために使用される治療剤が対象におけるαシヌクレインの代謝に影響を及ぼすかどうかを評価するための方法を提供する。例えば、αシヌクレインの代謝を測定して、所与の治療剤が、αシヌクレインの産生またはクリアランスにおける増加または減少をもたらすかどうかを判定することができる。一実施形態において、本明細書に記載されるように、方法はインビボで行われる。別の実施形態において、方法は、細胞の培養物を使用してインビトロで行われ、その場合、細胞の培養物は、本明細書に記載される方法における「対象」である。したがって、本明細書に記載される方法の使用により、当業者は、αシヌクレインの代謝における変化の程度を正確に決定することができ、これらの測定値を疾患修飾治療の治療成績と相関させることができる。したがって、本発明のこの態様の結果は、治療剤の最適な用量および投薬頻度を決定するのに役立ち得、臨床試験の設計に関する意思決定における補助となり得、最終的には、神経疾患または神経変性疾患の治療に有効な治療剤の検証を促進し得る。
したがって、本発明の方法は、どの対象が特定の治療剤に反応するかを予測するために使用されてもよい。例えば、αシヌクレインの代謝が高い対象は、αシヌクレインの代謝が低い対象とは異なって特定の治療剤に反応する可能性がある。具体的には、本方法の結果を用いて、特定の対象に適切な治療（例えば、αシヌクレインの産生を遮断する薬剤、またはαシヌクレインのクリアランスを増加させる薬剤）を選択することができる。同様に、本方法の結果を用いて、特定の遺伝子型を有する対象に適切な治療を選択することもできる。
どの対象が特定の治療剤に反応するかを予測するための方法は、治療剤および標識された成分を対象に投与することを含み、対象においてαシヌクレインが産生されるときに、標識された成分がαシヌクレインに取り込まれる。一実施形態において、標識された成分の投与前に、治療剤が対象に投与されてもよい。別の実施形態において、治療剤の投与前に、標識された成分が対象に投与されてもよい。各々の投与の間の期間は、数分間、１時間、数時間、または長時間であってもよい。さらに別の実施形態において、治療剤および標識された成分は、同時に投与されてもよい。方法は、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインを含む少なくとも１つの生体試料を採取することと、試料中の標識されたαシヌクレインと標識されていないαシヌクレインとの比率を決定することと、対象におけるαシヌクレインの代謝を算出することとをさらに含む。その後、算出された代謝を対照値に対して比較することにより、治療剤が、対象におけるαシヌクレインの代謝を（例えば、産生の速度またはクリアランスの速度を変化させることによって）変化させるかどうかを判定する。
当業者は、治療される神経疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害に依存して、治療剤が異なり得ることおよび異なることを認識するであろう。好適な治療剤の非限定的な例として、αシヌクレイン産生の低分子阻害剤、αシヌクレインに対するヒト化抗体、αシヌクレインＣＮＳクリアランス活性化剤、サーチュイン２阻害剤、プロテアソーム阻害剤、αシヌクレイン重合の低分子阻害剤が挙げられる。
他の好適なＡＤ治療剤は、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、ホルモン、神経保護薬、Ａβ産生阻害剤（γおよびβセクレターゼ等の阻害剤および調節因子）、抗Ａβ抗体、抗Ｔａｕ抗体、ならびに細胞死阻害剤を含む。上記治療剤の多くは、神経変性障害に関係する他のタンパク質のインビボでの代謝にも影響を及ぼし得る。
治療剤は、既知の方法に従って対象に投与されてもよい。典型的には、治療剤は経口投与されるが、非経口または局所等の他の投与経路も用いられ得る。対象に投与される治療剤の量は、薬剤の種類、対象、および特定の投与様式に依存して、変化してもよく、また変化する。当業者は、Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｏｌｄｍａｎ'ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｔｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＩ，ｐｐ．４７５−４９３および医師用卓上参考書（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ' Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）からの指針を用いて投与量が決定されてもよいことを認識するであろう。
別の態様において、本発明は、本発明の方法を行うためのキットを提供する。一実施形態において、対象における神経疾患または神経変性疾患の進行または治療を診断および／またはモニタリングするためのキットが提供される。キットは、１つ以上の標識された成分（例えば、標識されたアミノ酸）と、１つ以上のアミノ酸を対象に投与するための手段とを含む。キットは、対象から一定の時間間隔で生体試料を得るための手段をさらに含んでもよい。特定の実施形態において、キットはまた、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を経時的に検出および決定し、αシヌクレインの代謝を算出するための指示も含む。一実施形態において、指示は、算出された濃度を、本明細書に開示される特定の標準物質および／または対照と比較するための方法を開示する。
別の実施形態において、本発明のキットは、標識された成分を収容する１つ以上の容器を含む仕切りのある担体と、本発明の方法を行うための種々の手段とを提供する。
本発明のこの実施形態において、本発明者らは、安定同位体標識化動態（ＳＩＬＫ）αシヌクレインアッセイの実行可能性を実証する。図１は、αシヌクレイン配列におけるトリプシン切断部位、ひいては、αシヌクレイン起源の生じ得るトリプシン消化ペプチドのリストを示す。トリプシンの代わりに他のプロテアーゼが使用されてもよく、これは、異なる切断パターンおよび異なるペプチドを生じる。組換えαシヌクレインまたは生物学的供給源から単離されたαシヌクレインを消化したとき、本発明者らは、αシヌクレイン起源のいくつかのトリプシン消化ペプチドを観察した。図３は、組換えαシヌクレイン、またはＣＳＦもしくは他の生物学的供給源から単離されたαシヌクレインのいずれかから観察されたペプチドのリストを示す。
以下の実施例は、本発明の利点および特徴をさらに例示するために提供されるのであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。これらは使用され得るものの典型であるが、当業者に既知の他の手順、方法、または技術が代替として使用されてもよい。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。当業者は、以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において良好に機能するように本発明者によって発見された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい様式を構成するものと見なされてもよいことを理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされてもよく、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、尚も同様のまたは類似した結果が得られることを認識するはずである。
実施例１：細胞によって産生されるαシヌクレインへの１３Ｃ６ロイシンの取り込みの測定
αシヌクレインの過剰発現をもたらす構築物を、組織培養細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）に安定にトランスフェクトした。１２Ｃ６に対する１３Ｃ６についての既知の比率で標識したロイシン（トレーサー：トレイシー比、ＴＴＲ）（ＴＴＲ＝０．００、０．０１２７、０．０２５６、０．０５２６、０．１１１、０．２５）を含有する培地で細胞を増殖させた。標識された培地における増殖の３、５、および７日後に培地を回収した。Ｃ２Ｎ−ＡＳＭＡＢ３を用いた免疫沈降によりαシヌクレインを培地試料から単離した。単離したタンパク質をトリプシンで消化し、ＴＳＱ−Ｖａｎｔａｇｅトリプル四重極質量分析計設定にて分析し、標識されたおよび標識されていないαシヌクレイン３５−４３ペプチドをモニタリングした。各試料ごとに、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率を算出した。最初の回収からその後の回収まで、細胞がよりコンフルエントに増殖するにつれて、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの強度によって測定されるαシヌクレインのおよその濃度が増加した。さらに、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率は、細胞が元々標識されていないαシヌクレインを代謝回転させて、標識されたアミノ酸と標識されていないアミノ酸の混合物を用いて新しいαシヌクレインを生成した場合に、予想濃度とより厳密に適合した。
実施例２：ヒトによって産生されるαシヌクレインへの１３Ｃ６ロイシンの取り込みの測定
ヒトボランティアに１３Ｃ６ロイシンを９時間投与し、ロイシン注入時から開始して３６時間の間、毎時間ＣＳＦ試料を採取した。ＣＳＦ試料、および１つの１３Ｃ６ロイシンαシヌクレイン標準曲線の試料から、免疫沈降によりαシヌクレインを単離し、トリプシンで消化した。質量分析計により、各試料ごとに３５−４３ペプチドへの１３Ｃ６ロイシンの取り込みを分析した。
上記実施例を参照して本発明について説明してきたが、修正および変更が本発明の主旨および範囲内に包含されることを理解されたい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (30)

  1. 標識されたαシヌクレインのレベルをインビトロで測定するための方法であって、以下：
    標識されたαシヌクレインを含む、対象由来の生体試料中の標識されたαシヌクレインのレベルを測定する段階；および
    前記試料中の標識されたαシヌクレインのレベルを、対応する正常試料と比較する段階
    を含み、
    標識されたαシヌクレインの循環レベルまたは産生における、対応する正常試料との差が、神経性疾患または神経変性疾患の存在を示し、
    対応する正常試料と比較した、前記試料のαシヌクレイン代謝における変化が、神経性疾患もしくは神経変性疾患の予後を予測するために、治療レジメンの有効性を判定するために、および／または神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するための治療剤に対する対象の反応を判定するために、決定され、ならびに
    前記神経性疾患または神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症、レビー小体病、脳外傷、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、
    方法。
  2. 標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインのレベルをインビトロで測定するための方法であって、以下：
    (a) 標識された成分および治療剤を事前に投与された対象由来の生体試料に由来する、および神経性疾患または神経変性疾患を有さない対象由来の対応する正常試料に由来する、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
    (b) 前記試料および前記対応する正常試料に由来する、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
    (c) 段階(b)の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
    (d) 前記試料のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
    を含み、
    標識されたαシヌクレインの循環レベルまたは産生における、対応する正常試料との差が、神経性疾患または神経変性疾患の存在を示し、
    対応する正常試料と比較した、該試料のαシヌクレイン代謝における変化が、神経性疾患もしくは神経変性疾患の予後を予測するために、および／または前記治療剤に対する対象の反応を予測するために、決定され、ならびに
    前記神経性疾患または神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症、レビー小体病、脳外傷、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、
    方法。
  3. 標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインのレベルをインビトロで測定するための方法であって、以下：
    (a) 神経性疾患または神経変性疾患を有し、かつ標識された成分および治療剤を投与された対象由来の生体試料、および対応する正常試料に由来する、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
    (b) 前記試料および前記対応する正常試料に由来する、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
    (c) 段階(b)の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
    (d) 前記試料のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
    を含み、
    標識されたαシヌクレインの循環レベルまたは産生における、対応する正常試料との差が、神経性疾患または神経変性疾患の存在を示し、
    対応する正常試料と比較した、前記試料のαシヌクレイン代謝における変化が、治療レジメンの有効性を判定するために、および／または神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するための前記治療剤に対する対象の反応を判定するために、決定され、ならびに
    前記神経性疾患または神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症、レビー小体病、脳外傷、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、
    方法。
  4. 神経性疾患または神経変性疾患を治療するための治療剤を特定するための方法において用いるための、標識された成分および治療剤を含むキットであって、前記方法が以下：
    (a) 標識された成分および治療剤を投与された対象由来の生体試料、および対応する正常試料の用意；
    (b) 前記対象由来の生体試料、および前記対応する正常試料における、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
    (c) 前記試料および前記対応する正常試料に由来する、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
    (d) 段階(c)の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
    (e) 前記試料のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
    を含み、
    標識されたαシヌクレインの循環レベルまたは産生における、対応する正常試料との差が、神経性疾患または神経変性疾患の存在を示し、
    前記神経性疾患または神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症、レビー小体病、脳外傷、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択され、ならびに
    対応する正常試料と比較した、前記試料のαシヌクレイン代謝における変化が、前記治療剤が神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するために有効かどうかを示し、
    それによって神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するための治療剤が特定される方法
    である、キット。
  5. 神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するための治療剤の特定を補助するためのインビトロでの方法であって、
    （ａ）インビトロでの、細胞への標識された成分および治療剤の添加；
    （ｂ）インビトロでの、前記細胞および対応する正常試料からのαシヌクレインの採取；
    （ｃ）前記細胞および前記対応する正常試料に由来する、標識されたαシヌクレインおよび標識されていないαシヌクレインの測定；
    （ｄ）前記細胞および前記対応する正常試料に由来する、標識されていないαシヌクレインに対する標識されたαシヌクレインの比率の決定；
    （ｅ）段階（ｄ）の比率からのαシヌクレイン代謝の決定；ならびに
    （ｆ）前記細胞のαシヌクレイン代謝と、前記対応する正常試料のαシヌクレイン代謝との比較
    を含み、
    標識されたαシヌクレインの循環レベルまたは産生における、対応する正常試料との差が、神経性疾患または神経変性疾患の存在を示し、
    前記神経性疾患または神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症、レビー小体病、脳外傷、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択され、ならびに
    対応する正常試料と比較した、前記試料のαシヌクレイン代謝における変化が、前記治療剤が神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するために有効かどうかを示し、
    それによって神経性疾患もしくは神経変性疾患を治療するための治療剤が特定される、方法。
  6. 前記標識された成分が、標識されたアミノ酸または標識された水である、請求項２、３、または５に記載の方法。
  7. 前記アミノ酸が、放射性同位体または非放射性標識同位体で標識されている、請求項６に記載の方法。
  8. 前記アミノ酸が、非放射性標識同位体で標識されている、請求項７に記載の方法。
  9. 前記非放射性標識同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏまたは１８Ｏ、および３３Ｓ、３４Ｓ、または３６Ｓからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  11. 前記標識されたアミノ酸が、ｘ＝１〜６である１５Ｎｘで標識されたロイシン、ｘ＝１〜９である１３Ｃｘで標識されたフェニルアラニン、およびｘ＝１〜６である１３Ｃｘで標識されたイソロイシンのうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記標識された成分が、標識された水である、請求項２、３、または５に記載の方法。
  13. 前記標識された水が、重水素化水または酸素１８水からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記生体試料が、体液または組織試料からなる群から選択される、請求項１、２、３、または５に記載の方法。
  15. 前記体液が、血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、唾液、汗、および涙からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記体液がＣＳＦである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記組織試料がＣＮＳ試料である、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記ＣＮＳ試料が、ＣＮＳ系由来の組織、脳組織、前脳組織、間脳組織、中脳組織、後脳組織、および脊髄組織からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記治療剤が、αシヌクレインの低分子阻害剤、αシヌクレインに対する抗体、αシヌクレインクリアランス活性化剤、サーチュイン２阻害剤、プロテアソーム阻害剤、αシヌクレイン重合の低分子阻害剤、Ｌ−ＤＯＰＡ、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＰＴ）阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、ホルモン、神経保護薬、および細胞死阻害剤からなる群から選択される、請求項１、２、３、または５に記載の方法。
  20. 前記治療剤がＬ−ＤＯＰＡである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記標識された成分が、標識されたアミノ酸または標識された水である、請求項４に記載のキット。
  22. 前記アミノ酸が、放射性同位体または非放射性標識同位体で標識されている、請求項２１に記載のキット。
  23. 前記アミノ酸が、非放射性標識同位体で標識されている、請求項２２に記載のキット。
  24. 前記非放射性標識同位体が、 ２ Ｈ、 １３ Ｃ、 １５ Ｎ、 １７ Ｏまたは １８ Ｏ、および ３３ Ｓ、 ３４ Ｓ、または ３６ Ｓからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
  25. 前記アミノ酸が、ロイシン、イソロイシン、およびフェニルアラニンからなる群から選択される、請求項２１に記載のキット。
  26. 前記標識されたアミノ酸が、ｘ＝１〜６である １５ Ｎ ｘ で標識されたロイシン、ｘ＝１〜９である １３ Ｃ ｘ で標識されたフェニルアラニン、およびｘ＝１〜６である １３ Ｃ ｘ で標識されたイソロイシンのうちの１つ以上からなる群から選択される、請求項２５に記載のキット。
  27. 前記標識された成分が、標識された水である、請求項４に記載のキット。
  28. 前記標識された水が、重水素化水または酸素１８水からなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
  29. 前記治療剤が、αシヌクレインの低分子阻害剤、αシヌクレインに対する抗体、αシヌクレインクリアランス活性化剤、サーチュイン２阻害剤、プロテアソーム阻害剤、αシヌクレイン重合の低分子阻害剤、Ｌ−ＤＯＰＡ、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＰＴ）阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬、ホルモン、神経保護薬、および細胞死阻害剤からなる群から選択される、請求項４に記載のキット。
  30. 前記治療剤がＬ−ＤＯＰＡである、請求項２９に記載のキット。
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