JP6370853B2 - 免疫グロブリンの調製方法 - Google Patents

Description

本願発明は、免疫グロブリンの新規調製方法に関する。得られた免疫グロブリン組成物は、例えば、非経口投与のために適している。

免疫グロブリンは、脊椎動物の血液、及び他の体液中で、可溶型で見られる糖タンパク質であり、細菌、ウイルス、又は寄生虫などの異物を認識し、そして無効にするために、免疫系によって使用される。免疫グロブリンは、疾患の診断、治療的処置、及び出生前治療などの様々な医学的応用を有する。免疫グロブリンの最も一般的な医療適用は、病理の３つの一般的な群：原発性免疫不全（体液性免疫不全）、続発性免疫不全、又は後天性免疫不全（例えば、ウイルス感染の予防、及び治療において）、及び自己免疫の免疫不全（抗体の発生）に分類することができる。

免疫グロブリンは、例えば、筋肉内、静脈内、及び皮下経路などのような様々な経路によって投与することができる。静脈内経路は、多くの利点、特に、優れた治療効果を提供するので、静脈内経路を使用することが、当然、好ましい。

免疫グロブリンは、ヒト血漿から、Ｃｏｈｎ分画法（Ｃｏｈｎ ＥＪ．ら．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９４６，６２，４５９‐４７５）、Ｃｏｈｎ‐Ｏｎｃｌｅｙ法（Ｏｎｃｌｅｙ ＪＬ．ら．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，１９４９，７１，５４１‐５５０）、又は低温エタノール分画法、例えば、Ｋｉｓｔｌｅｒ‐Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法（Ｋｉｓｔｌｅｒ Ｐ，Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ Ｈ，１９６２，７，４１４‐４２４）に基づいた他の同等の方法に基づいた手順を使用することにより、通常、精製される。従って、任意の上記の方法によって得られた、免疫グロブリンに富む分画（例えば、分画ＩＩ＋ＩＩＩ、又は分画ＩＩ、又は沈殿Ａ、又はγグロブリンＧＧ沈殿など）を使用する。免疫グロブリンを徹底的に精製し（ＩｇＧ）、そしてそれらを投与、好ましくは、静脈内投与に許容されるようにするために、修飾が導入される。当該修飾は、例えば、凝集物、及び他の不純物を除去するためや、製品の安全性を保証するために、導入される。しかしながら、免疫グロブリンの調製のための方法への複数のステップの追加は、方法における収率を低下させ、そして製造コストを増加させる。主に静脈内投与のための免疫グロブリン製品の需要の増加は、工業規模でのそれらの製造過程において、収率を重大な側面にする。

先行技術に記載された方法の、静脈内経路を介して許容される免疫グロブリン組成物を得るための方法は、以下のステップ：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ウイルス不活性化能を伴う物理的／化学的方法、又は酵素での処理、及び免疫グロブリン分子の部分的な化学的修飾を使用するものが含まれる。

従って、病原性生物学的因子を除去する能力を有する安定なステップを行うことにより、製品の安全性を保証する必要がある。タンパク質の生物学的活性を著しく低下させないので、一般的に使用される方法は、脂質エンベロープを有するウイルスを不活性化するために、溶媒／洗浄剤の使用を含む。しかしながら、溶媒／洗浄剤混合物の毒性を考慮すると、この試薬は、最終製品を得る前に、十分に除去されなければならず、そしてこれは、製造過程に要する時間を増加させ、そして収率を低下させる。当該溶媒／洗浄剤の除去のために記載された方法は、単純ではなく、そして直接的な疎水性相互作用による、又はイオン交換樹脂における免疫グロブリンの間接的な捕捉、そして捕捉されなかった溶媒／洗浄剤の分離による、クロマトグラフィー吸着技術の使用を、通常、必要とする。すべての場合において、当該方法は、費用がかかり、そして面倒であり、タンパク質の著しい損失を伴う。

しかしながら、より単純で、そしてより効率的な、ウイルスを不活性化する能力を有する代替的な処理が、当該技術分野において知られている。例えば、カプリル脂肪酸（また、オクタン酸としても知られる）、又はその塩などが使用される。

米国特許第４４４６１３４号では、カプリル酸ナトリウムが、アミノ酸及び第ＶＩＩＩ因子の調製のための方法におけるウイルス不活性化手順としての熱処理と組み合わされて使用される。脂質膜を分解することができる殺ウイルス剤は、解離していないカプリル酸であると思うが、当該剤を使用する方法は、カプリレートによる不活性化として一般的に知られており、生化学の慣例に従って、酸溶液、及びそのイオン化形態は、後者の名前、すなわち、カプリレートの名称を有する。

カプリル酸は、また、免疫グロブリンを精製するための沈殿剤として使用されてきた（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ，Ｍ．ら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９６９，１３４（２），２７９‐２８４）。免疫グロブリンの純度、及び収率は、主に、添加されたカプリル酸の濃度、及びｐＨに依存する。Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ，Ｍ．らは、また、２つのステップの間で、沈殿物の除去を伴う、２つの異なるステップにおいて、カプリレートの効果的な量を添加することが好都合であることを記載する。これは、沈殿物における非免疫グロブリンタンパク質の分布の結果、エンベロープを有する及び有しないウイルスの両方を除去するための能力を方法に与えるであろう。

説明では、沈殿とカプリレートの組み合わせ、その後に、免疫グロブリンの精製のためのイオン交換クロマトグラフィーが続く最先端の技術を見出したことが記載されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈ，Ｍ．ら．，ｖ．ｓｕｐｒａ）。

欧州特許第０８９３４５０号では、２重の沈殿ステップにおいて、１５〜２５ｍＭの濃度で、カプリレートを添加するステップ後の、連続した２つの陰イオン交換カラム、及びカプリレートの両方の効果を組み合わせること：沈殿によって非免疫グロブリンタンパク質の低減、及びインキュベーションを用いたウイルス不活性化能力を含む、分画ＩＩ＋ＩＩＩ（上述したＣｏｈｎ方法に基づいた方法を用いることで得られた）を使用する、ＩｇＧの精製のための方法を開示する。後の陰イオン交換ステップは、他の不純物（ＩｇＭ、ＩｇＡ、アルブミンなど）を除去することに加えて、カプリレートを除去するために使用され、そして従って、二重の吸着は、相対的に大量の陰イオン樹脂を使用する必要がある。

国際公開第２００５／０８２９３７号では、また、カプリレート及び／又はヘプタノエートを、溶液又は免疫グロブリンを含む組成物に添加し、そして続いて、当該溶媒を、陰イオン交換樹脂を有するカラムに適用するステップを含む、免疫グロブリンを含む組成物の調製方法を開示する。

しかしながら、本発明者らは、先行技術文献に記載されたように、ウイルス不活性化能力を有する処理を提供するための、適切な濃度、及びｐＨ（例えば、ｐＨ５．０〜５．２）でのカプリレートの使用は、高分子量のタンパク質凝集体の形成を引き起こし、そしてそれは、希釈及び／又はｐＨの変化により、部分的に不可逆である。さらに、これらの凝集物は、濾過によってのみ、部分的に濾過でき、従って、例えば、クロマトグラフィー又は沈殿を用いた、特定の後続の分離ステップが必要である。これらの凝集物の分離は、タンパク質の著しい損失、及び免疫グロブリンの工業プロセスにおける収率の低下を引き起こす。

また、本発明者らは、カプリレートでの処理の間に形成された凝集物の存在は、たとえ非常に低いレベルであっても、最適なプロセス条件下、限外濾過膜を使用する分離ステップの直接適用により、カプリレートの正確な除去を妨げる。これらの凝集体は、コロイド（濁度）の存在、又は液体形態での不安定性のため、治療濃度（例えば、５％〜２０％）での免疫グロブリンの溶液の調製を妨げ、又は阻み、従って、ナノ濾過、及び滅菌濾過などの、免疫グロブリンの調製のための方法の後続のステップを妨げ、又は阻む。

上記の結果として、本発明者らは、驚くべきことに、先行技術文献に記載されたものよりも低い濃度のカプリレートで、ウイルス不活性化能力を有するカプリレート処理を含み、そして最初の溶液が、適切に精製及び希釈され、そして少なくとも１つの、グリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在下、凝集物の出現を阻害し、防止し、回避し、又は促進しない、免疫グロブリンの調製のための方法を開発した。

また、本発明者らは、本発明の方法における、少なくとも１つの、グリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在が、カプリレートの活性、及び有効性を、エンベロープを有するウイルスのためのその能力の点で、妨げないことを見出した。

さらなる態様では、本発明者らは、同様に最適な条件下での不活性化能力を有する処理を含む、限外濾過技術のみを使用することによる、カプリレート、及びグリコールのポリエーテル、又はポリマー試薬（前記処理の間に既に存在）の除去、又は低減の可能性を企図する、免疫グロブリンを得るための方法を、初めて記載する。この限外濾過ステップは、生成物を、最終生成物において、免疫グロブリンタンパク質凝集物を生成することなしに、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下経路を介した、その投与のために許容されるレベルに精製し、そして濃縮することを可能にする。これは、例えば、クロマトグラフィーなどの、カプリレートでの処理後の追加の分離ステップを導入する必要性を除去する。さらに、限外濾過後のグリコールのポリエーテル、又はポリマー、及びカプリレートの残存レベルは、最大２０±２％までの免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧの濃度を達成し、正しく製剤化された場合、液体形態でのそれらの保存の間、安定性を損なわない。

本発明の方法の単純化を考えると、これは、実質的に収率を改善し、そして先行技術文献に記載された従前の方法と比較して製造コストを顕著に低減することを可能にし、それによる製品の安全性、又は純度のレベルを損なうことはない。

従って、第一態様では、本発明は、カプリル酸、又はその塩の、少なくとも１つのグリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在下での、免疫グロブリンの精製された溶液への添加、及び後続の前記試薬の、限外濾過／透析濾過を用いた、除去、又は低減を含む、免疫グロブリン溶液の調製のための方法に関する。

さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つのグリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在下での、タンパク質製造方法におけるウイルス不活性化のための、カプリル酸、又はその塩の使用、及び後続の前記試薬の、限外濾過／透析濾過を用いた、除去、又は低減に関する。

さらなる態様では、本発明は、タンパク質製造方法においてウイルス不活性化のために使用される、カプリル酸、又はその塩及び／又はグリコールのポリエーテル、又はポリマーのレベルの除去、又は低減のための限外濾過／透析濾過の単一ステップの実現に関する。

従って、本発明は、グリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在下、９６％以上の純度を有する、免疫グロブリンの最初の溶液に基づく、免疫グロブリンの溶液の調製方法であって、前記方法が、以下のステップ：
ａ）カプリル酸、又はその塩を、最初の溶液に添加し；
ｂ）ステップａ）で得られた溶液のｐＨを調整し；
ｃ）エンベロープを有するウイルスの不活性化のために必要な時間、及び温度で、ステップｂ）で得られた溶液をインキュベートし；そして
ｄ）ステップｃ）で得られた溶液について、限外濾過／透析濾過のステップを行う
ことを含むことを特徴とする、方法を開示する。

本発明の方法は、また、ステップｄ）で得られた溶液の、最終製剤化のステップを含んでもよい。

本発明の方法では、免疫グロブリンの最初の溶液は、Ｃｏｈｎ法、又はＣｏｈｎ‐Ｏｎｃｌｅｙ法に従って得られた分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、分画ＩＩ＋ＩＩＩ、又は分画ＩＩに由来するか、又はＫｉｓｔｌｅｒ‐Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法に従って得られた、又はさらに精製して、９６％以上のＩｇＧ純度を得る、同様の方法のバリエーションに従って得られた、沈殿物Ａ、又はＩ＋Ａ、又はＧＧに由来する。好ましくは、免疫グロブリンの最初の溶液は、Ｃｏｈｎ法、又は同様の方法のバリエーションに従って得られた分画ＩＩ＋ＩＩＩに由来し、そしてそれは、欧州特許第１２２５１８０Ｂ１において記載されたように、続いて、ＰＥＧ、及び陰イオンクロマトグラフィーを用いて精製される。本特許に従って、任意の上記分画は、ＰＥＧを使用する沈殿方法、続いて、沈殿物を除去し、そしてイオン交換カラム（例えば、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを有するカラム）を使用する追加の精製ステップを除去するための濾過に供されることができる。すべてのこれらの場合において、免疫グロブリンの最初の溶液は、ヒト血漿に由来する。

最も好ましい実施態様では、免疫グロブリンの最初の溶液は、Ｃｏｈｎ法に基づく方法によって得られた分画ＩＩ＋ＩＩＩに由来し、そしてそれは、先行技術文献において記載された方法の任意の１つによってさらに精製され、本発明の非沈殿条件（すなわち、全タンパク質に対して、アルブミン含量が、好ましくは１％以下（ｗ／ｖ）である、酢酸セルロースでの電気泳動によって決定されたＩｇＧの９６％（ｗ／ｖ）以上の純度）の下、カプリレートでの処理に供されるのに十分な精製レベルを達成する。従って、免疫グロブリンの最初の溶液は、追加の精製が、本発明のウイルス不活性化能力を有するステップ後、必要とされないように、企図される治療投与の経路のために、カプリレートでの処理前後で、十分に精製される。

本発明の方法の最初の溶液の免疫グロブリンは、また、遺伝子組み換え技術、例えば、細胞培養中での発現；化学合成技術；又はトランスジェニックタンパク質生成技術によって、得ることができる。

最も好ましい実施態様では、本発明の方法で言及される免疫グロブリンは、ＩｇＧである。ＩｇＧは、モノクローナル、又はポリクローナルであってもよいことが企図される。最も好ましい実施態様では、ＩｇＧは、ポリクローナルである。

本発明のグリコールのポリエーテル、又はポリマーは、アルカンのポリエーテル、又はポリアルカンの酸化物、また、ポリグリコールとしても知られており、であってもよく、そして例えば、エチル、又はエチレン、及びプロピル、又はプロピレンの誘導体を意味し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、又はそれらの同等物として良く知られていることが企図される。また、試薬は、それらが、それらの安定性、又は溶解性を損なわせず、それらの大きさによって、それらが、限外濾過技術によって除去され、又はそれらの低い毒性によって、それらが、免疫グロブリンの治療的使用に適合するという意味で、免疫グロブリンに適合しなければならない。

好ましい実施態様では、グリコールのポリエーテル、又はポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、又はそれらの組み合わせから選択される。好ましくは、グリコールのポリエーテル、又はポリマーは、ＰＥＧであり、より好ましくは、３３５０Ｄａ〜４０００Ｄａの間の公称分子量を有するＰＥＧであり、そして最も好ましくは、４０００Ｄａの公称分子量を有するＰＥＧである。

上記免疫グロブリンの最初の溶液中のグリコールのポリエーテル、又はポリマーの量は、好ましくは、２％〜６％（ｗ／ｖ）であり、そしてより好ましくは、３％〜５％（ｗ／ｖ）である。

免疫グロブリンの最初の溶液中のグリコールのポリエーテル、又はポリマーの濃度を調整する必要があるかもしれないことが企図される。グリコールのポリエーテル、又はポリマー調整は、免疫グロブリンの最初の精製された溶液を希釈することにより、及び／又はこれを添加することにより、達成することができる。

免疫グロブリンの最初の溶液の組成によれば、本発明の方法のステップａ）の前に、精製、又は濃度の調整の一連のステップが行われることが企図され、例えば、免疫グロブリンの濃度の、１〜１０ｍｇ／ｍｌの間、より好ましくは、３〜７ｍｇ／ｍｌの間への調整などである。この調整は、その時の都合で、当該技術分野において知られた任意の方法、例えば、確立された範囲（Ｂｉｕｒｅｔ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、又は特に免疫比濁法によって、例えば、２８０ｎｍでの光学濃度 Ｅ（１％）＝１３．８−１４．０ ＵＡによる全タンパク質に従って決定される）へのタンパク質の希釈、又は濃縮により、達成することができる。従って、好ましい実施態様では、免疫グロブリンの最初の溶液は、好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｍｌ、そしてより好ましくは３〜７ｍｇ／ｍｌの免疫グロブリンの濃度；及び／又は免疫グロブリンの溶液の純度の調整、そしてそれは、好ましくは、全タンパク質に関して、少なくとも９６％のＩｇＧに到達するべきであり、を有する。この精製は、当業者に十分に知られた技術、例えば、ＰＥＧでの沈殿、濾過、及び後続の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）によって、達成することができる。

本発明の方法のステップａ）では、好ましくは、同じ濃縮された溶液、例えば、１．５Ｍ〜２．５Ｍの間、を使用して、カプリル酸、又はその塩が添加され、好ましくは、９ｍＭ〜１５ｍＭの間の最終濃度を達成する。

好ましい実施態様では、ステップｂ）では、得られた溶液は、５．０〜５．２、より好ましくは、５．１のｐＨに調整される。

好ましい実施態様では、ステップｃ）では、得られた溶液は、少なくとも１０分間、より好ましくは、１〜２時間、そしてさらにより好ましくは、２時間、インキュベートされる。また、インキュベーションが行われる温度は、２℃〜３７℃、より好ましくは、２０℃〜３０℃である。

好ましい実施態様では、本発明の方法のステップｄ）の前に、ステップｃ）において得られた溶液中の高分子量を有する、ポリマー、又は凝集物の量は、０．２％以下、より好ましくは０．１未満である。全タンパク質に対する、ポリマー、又は免疫グロブリンの分子凝集物のこの割合は、２８０ｎｍでの光学濃度値に従った、排除ＨＰＬＣゲルカラムによって決定される。ポリマー、又は免疫グロブリンの分子凝集物の割合は、例えば、欧州薬局方の静脈内γグロブリンのモノグラフに記載される分析方法を使用して、評価することができる。

好ましくは、免疫グロブリンの溶液は、ステップｄ）の限外濾過／透析濾過を行う前に、デプスフィルターを使用して清澄化される。

ステップｄ）に関して、本発明の方法における限外濾過／透析濾過は、透析及び容積の低減による濃縮、後続の一定の容積での透析濾過の適用の最初のステップを有することが好ましくは企図される。

限外濾過／透析濾過は、タンパク質の濃度が最適であり、そして好ましくは３０ｍｇ／ｍｌであるという事実を考慮すると、試薬の消費が、多少低く、そしてプロセスがより効率的であるように、生成物の容積を減らし、そして次に透析濾過する、好ましくは、同時透析及び濃縮の方法により、工業スケールで、実施することができる。いずれにしても、当業者は、当該技術分野において知られた様々な操作方（例えば、希釈／濃縮、又は透析濾過／濃縮、一定容積での透析濾過、又は上記の改良及び組み合わせ）から選択される、限外濾過／透析濾過のこのステップを行う最適な、そして実際的な方法を容易に決定することができる。

本発明の方法のステップｄ）において使用される限外濾過／透析濾過膜は、好ましくはポリスルホン、再生セルロース、又は同等物からなり、例えば、Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）、Ｏｍｅｇａ（登録商標）（Ｐａｌｌ，ＵＳＡ）、Ｋｖｉｋ‐ｆｌｏｗ（登録商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，ＵＳＡ）の商品名の下で販売される膜である。しかしながら、膜のために選択される分子量カットオフは、様々な要因、例えば、選択する製造業者などに依存して異なってもよい。当業者は、選択する膜を容易に決定することができ、そしてそれは、例えば、処理される溶液中のカプリレート、及びグリコールのポリエーテル、又はポリマーの濃度に依存するそれぞれの場合の必要に適応されるであろう。

好ましくは、ステップｄ）の限外濾過／透析濾過は、１００ｋＤａ以下、より好ましくは、１００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いて、達成される。

最も好ましい実施態様では、ステップｄ）の限外濾過／透析濾過は、以下の２つの段階：大部分のカプリレートを低減、又は除去するために、ｐＨが、５．０〜６．０の間に調整される第一段階、及び大部分のグリコールのポリエーテル、又はポリマーを低減、又は除去するために、ｐＨが、５．０以下、好ましくは、４．０〜５．０の間のｐＨに調整される第二段階、で行われる。

好ましい実施態様では、限外濾過／透析濾過のステップの第一段階において、透析濾過は、約５ｍＭ以上の濃度で、カルボン酸のアルカリ塩、例えば、酢酸を含む、透析濾過媒質を使用して行われる。最も好ましい実施態様では、当該透析濾過は、上述したようにｐＨが調整された（すなわち、５．０〜６．０の間）、５ｍＭ以上の濃度での、酢酸ナトリウムの溶液を用いて、行われる。

ステップｄ）の限外濾過／透析濾過の第一段階において行われる透析濾過容積の量は、最初に使用されるカプリレートの量、及び許容される最終量に従って、当業者によって、容易に決定されることができる。好ましくは、少なくとも３容積の透析濾過媒質が使用され、当該透析濾過媒質は、好ましくは、上述したように、ｐＨ５．０〜６．０の、５ｍＭの酢酸ナトリウム溶液である。好ましくは、限外濾過／透析濾過の第一段階において、この第一段階において、カプリレートの濃度が、約１ｍＭ以下に低減されるように、約９０％以上の最初のカプリレートが除去される。

ステップｄ）の限外濾過／透析濾過の第二段階において、免疫グロブリンの溶液は、好ましくは、一定の容積で、透析濾過される。

好ましくは、限外濾過／透析濾過の第二段階における透析濾過は、アセテート、ホスフェート、又は同等物によって形成されたアルカリ金属塩、又はアミノ酸及び／又はポリオール、例えば、グリシン及び／又はソルビトールを含む、上述したｐＨ値である、緩衝液を使用して行われる。

透析濾過の第一段階の場合と同様に、第二段階において、本発明の方法において使用されるグリコールのポリエーテル、又はポリマーを適切に低減するために使用される透析容積の量は、グリコールのポリエーテル、又はポリマーの必要とされる低減又は除去を考慮して、当業者によって容易に決定されることができる。好ましい実施態様では、ステップｄ）の限外濾過／透析濾過の第二段階の透析において交換される緩衝液の量は、６容積以上である。最も好ましい実施態様では、当該第二段階において、交換は、ステップｄ）の限外濾過／透析濾過を始める前の、グリコールのポリエーテル、又はポリマーの最初の量の１００倍以上のグリコールのポリエーテル、又はポリマーの低減を得るために必要な緩衝液の容積量に従って、行われる。

カプリレート、及びグリコールのポリエーテル、又はポリマーが、ステップｄ）の限外濾過／透析濾過において低減されると、上述した最終製剤化ステップにおいて、最終製剤化を達成するために、生成物を濃縮するために、必要な賦形剤及び／又は安定剤を添加することにより、所望する最終組成に調整することができる。最終製剤化後に行われる賦形剤及び／又は安定剤の添加は、固形、又は濃縮された溶液において、賦形剤及び／又は安定剤を添加することにより、又はよりさらに好ましくは、最終生成物の適切な組成を保証するために、製剤化溶液の交換容積の必要な量を用いる透析濾過を用いて、直接的に達成することができる。

他の実施態様では、賦形剤及び／又は安定剤の添加は、最終濃縮後、免疫グロブリンが既に製剤化されるように、ステップｄ）の第二段階において使用される酢酸ナトリウムの透析緩衝液を、賦形剤及び／又は安定剤を含む、好ましくは、同じ４．０〜５．０の間のｐＨ値に調整された、溶液で全体的に、又は部分的に置換されることにより、行われる。

当業者は、所望する安定性を達成するために、如何なる種類の賦形剤及び／又は安定剤を添加すべきかを知っている。例えば、当該賦形剤及び／又は安定剤は、１つ以上のアミノ酸、例えば、好ましくは、０．２〜０．３Ｍの間の濃度での、グリシン；１つ以上の炭水化物、又はポリオール、例えば、ソルビトール；又はそれらの組み合わせであってもよいことが企図される。

最後に、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの最終濃度は、その静脈内、筋肉内、又は皮下使用のために適した濃度に調整され、そしてそれは、当業者に知られ、そして例えば、５％〜２２％（ｗ／ｖ）の間であってもよい。当該濃縮は、当該技術分野において知られた任意の方法、例えば、限外濾過による濃縮により、達成される。免疫グロブリンの濃縮が、限外濾過によって達成される場合、当該濃縮は、従前の透析濾過において使用されたものと同様の膜を使用して行われてもよいことが企図される。当然、３つの透析濾過方法、及び濃縮は、また、異なる膜を使用して行われてもよい。

本発明の方法は、また、生成物の安全マージンを増加させるために、ナノ濾過のステップの導入の可能性を企図する。方法において複数の段階が存在し、ここで生成物は、２０ｎｍ以下〜５０ｎｍまでの細孔径、好ましくは、２０ｎｍ以下の細孔径を有する、市販のフィルター（例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）及びＢｉｏｅｘ（登録商標）（旭化成）、ＤＶ（登録商標）及びＳＶ４（登録商標）（Ｐａｌｌ）、Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｖｐｒｏ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又は同等物）でナノ濾過することができ、又は１５ｎｍのナノフィルターさえも、使用することができる。ナノ濾過ステップを行うことができる中間ステップは、例えば、免疫グロブリンの最初の溶液において；又は限外濾過／透析濾過のステップ後、カプリレートで処理された材料において（カプリレート及びグリコールのポリエーテル、又はポリマーが低減された時点で）；又は免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの溶液を濃縮し、そして製剤化した後の材料において（最終生成物）である。当業者は、とりわけ、膜の細孔径、方法の時間に従って必要とされる濾過面積、ナノ濾過される生成物の容積、及びタンパク質の収率に依存する最適な選択肢を選択するであろう。

本発明の方法によって得られる最終生成物は、同種赤血球凝集素の内容に関連する欧州薬局方の基準に完全に準拠する。しかしながら、本発明の方法は、また、抗Ａ及び／又は抗Ｂ抗体の選択的、及び特定の捕捉のステップを含む選択肢を、それらの低減を最大にするために、企図する。このステップは、先行技術文献に記載されたように、好ましくは、生体特異性の親和性樹脂を使用して行われる。例えば、三糖によって形成されたリガンドを有する生体特異性の親和性樹脂を使用することにより、同種赤血球凝集素のレベルにおける顕著な低減が、達成されることができる（Ｓｐａｌｔｅｒら．，Ｂｌｏｏｄ，１９９９，９３，４４１８‐４４２４）。この追加の捕捉は、本発明の方法の任意のステップにおいて、任意により、当業者の裁量で、組み込まれてもよく、又は本発明の方法を実施する前又は後で、行ってもよい。

従って、本発明の免疫グロブリンの溶液の調製のための方法に関して、最も好ましい実施態様では、９６％以上のＩｇＧの純度を有する免疫グロブリンの最初の溶液が、使用される。この溶液は、好ましくは、１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの間、そして好ましくは、３ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの間のＩｇＧの濃度に調整され、そしてそれは、ＰＥＧを、４±１％（ｗ／ｖ）の濃度で含むか（前のステップでの添加により）、又は添加される。溶液のｐＨは、その後、酢酸で、５．０〜５．２の間に調整され、そしてカプリル酸ナトリウムが添加される（例えば、カプリル酸ナトリウムの濃縮溶液を使用して）。好ましい実施態様では、カプリレートの濃縮溶液は、ＩｇＧの精製された溶液にゆっくりと添加され、そして撹拌される。９〜１５ｍＭの間のカプリレートの最終濃度を生成物にもたらすために計算されたすべてのカプリレートを添加後、最終ｐＨが、その後、必要に応じて、５．０〜５．２の間に調整され、そして溶液は、好ましくは、２〜３７℃の間の温度で、そしてより好ましくは、２５±５℃の温度で、少なくとも１０分間、そして好ましくは、１〜２時間の間、インキュベートされる。

清澄化は、その後、デプスフィルター（例えば、Ｃｕｎｏ ９０ＬＡ、５０ ＬＡ、Ｓｅｉｔｚ ＥＫ、ＥＫ‐１、ＥＫＳ、又は同等物）を使用して、行われる。

従って、得られた溶液は、その後、ポリスルホンを含む膜、例えば、Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、又はＯｍｅｇａ（登録商標）（Ｐａｌｌ）によって形成された限外濾過／透析濾過装置、好ましくは、積み重ね可能なカセットの形態で、を用いて、処理される。溶液は、それぞれの限外濾過／透析濾過ユニットを介して、好ましくは、約１００〜５００Ｌ／ｈの間の容積で、そして５±３℃の温度で、循環される。注入口、及び排出口の間の圧力の圧力低下（気圧）は、好ましくは、１〜３バールの間である。次に、限外濾過／透析濾過のステップの第一透析濾過段階は、カプリレートを除去するために、好ましくは、５ｍＭ以上の濃度で、そして５．０〜６．０の間のｐＨで、好ましくは、酢酸ナトリウムの溶液によって形成された緩衝液の少なくとも３容積の交換を適用して、開始される。好ましくは、添加される、又は消費される緩衝液のそれぞれの容積で、生成物の溶液の容積は、最後の添加を除いて、最初の容積の半分に減らされる。

透析濾過の第一段階（希釈、及び濃縮、又は同等物による）後、得られた溶液のｐＨは、例えば、酢酸を使用して、４．０〜５．０の間に調整される。一定の容積での透析濾過が、その後、５ｍＭ以上の濃度で、４．０〜５．０の間のｐＨで、好ましくは、酢酸ナトリウムによって形成された緩衝溶液の６以上の容積を使用して、開始される。

上記酢酸ナトリウムによって形成された透析緩衝溶液は、最終濃縮後、免疫グロブリンが既に製剤化されるように、０．２〜０．３Ｍの濃度での、アミノ酸、例えば、グリシンの、任意により、炭水化物、及びポリオール、例えば、ソルビトールと組み合わされ、好ましくは、同じ４．０〜５．０の間のｐＨ値に調整された溶液によって、任意により、全体的に、又は部分的に、置換されてもよい。

好ましくは、少なくとも６容積（より好ましくは、６〜１０容積の間）の上記透析溶液の、４．０〜５．０の間のｐＨでの適用後、生成物が製剤化されていない場合、賦形剤及び／又は安定剤、例えば、グリシン、又は他のアミノ酸、及び炭水化物、例えば、ソルビトール、又はそれらの組み合わせを、固形、又は当該賦形剤及び／又は安定剤の濃縮溶液の形態で、得られた溶液に直接的に添加することにより、生成物が製剤化される。次に、容積低減によって得られたＩｇＧの溶液は、濃縮され、静脈内、筋肉内、又は皮下使用のための適切なＩｇＧ濃度を達成する。

賦形剤及び／又は安定剤の濃度、及びｐＨに関して適切に調整された、当該濃縮溶液は、０．２μｍの細孔径のフィルターを使用する完全な濾過によって適用され、そして任意により、ナノ濾過である。最後に、ＩｇＧの溶液は、注射剤、アンプル、バイアル、ボトル、又は他のガラス容器中に、無菌的に入れられ、そしてそれは、その後、密閉される。他の選択肢は、適合する固い、又は柔軟なプラスチック容器、例えば、バッグ、又はボトルへの注入である。

上記のように調製された生成物は、２〜３０℃の間の温度での、少なくとも２年までの保存のための貯蔵に移される前に、検疫、及び目視検査を受ける。

さらに、上述したように、本発明は、また、タンパク質製造方法におけるウイルス不活性化のための、少なくとも１つのグリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在下での、カプリル酸、又はその塩の使用を、初めて開示し、ここでグリコールのポリエーテル、又はポリマー、及びカプリル酸、又はその塩は、限外濾過を用いて、続いて除去される。

好ましくは、当該タンパク質は、免疫グロブリン；アルブミン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、及び第ＩＸ因子；及びヴォン・ヴィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子を含むタンパク質の群から選択される。さらにより好ましくは、当該タンパク質は、免疫グロブリンである。最も好ましい実施態様では、当該タンパク質は、ＩｇＧである。

本発明は、様々な実施態様の例に関して、より詳細に記載する。しかしながら、これらの例は、本発明の範囲を限定することを目的とせず、その説明を例示することを目的とする。

実施例１
血漿から、ウイルス的に安全であり、凝集体がなく、そして工業適用のために適切な収率を有する、免疫グロブリンの溶液を得るための本発明の方法
出発材料は、１６Ｌの免疫グロブリン溶液であり、そしてそれは、主なタンパク質成分としてＩｇＧを含み、欧州特許第１２２５１８０Ｂ１に記載の方法によって得られた。要約すれば、当該溶液を、Ｃｏｈｎ法を使用して、分画ＩＩ＋ＩＩＩから、γグロブリンを抽出することにより得た。分画ＩＩ＋ＩＩＩからγグロブリンのこの抽出を行うために、当該分画を、エタノールを使用して、ヒト血漿の分画により、前もって単離した。その後、炭水化物の存在下で懸濁し、そして付随する多数のタンパク質の含量を、ＰＥＧ‐４０００での沈殿により、低減させた。最後に、分画の最終精製を、イオン交換樹脂カラム（ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）における吸着により行った。従って、得られたカラム溶出物（樹脂、すなわちＤＥＡＥに吸着されなかった分画）は、９８±２％の免疫グロブリンの酢酸セルロースにおける電気泳動純度、６．０のｐＨ、２．６の比濁計濁度単位（ＮＴＵ）の濁度、及び約５ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度を有する。

得られた溶液を、酢酸を添加することにより、５．１のｐＨに調整し、そして２〜８°の間の温度に調整した。免疫グロブリンのこの溶液を、その後、カプリル酸ナトリウムの濃縮溶液を添加することにより、１３ｍＭの最終濃度にした。

カプリレートを有する免疫グロブリンの溶液を、２５℃に加熱し、そしてこの温度で２時間、ゆっくりとした撹拌下で、インキュベートした。インキュベーションの間、ｐＨを、５．１０±０．０５に維持した。得られた溶液の濁度は、１７．３ＮＴＵであった。

カプリレートで処理された溶液を、デプスフィルター（ＣＵＮＯ（登録商標），Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用する後続の清澄化のために、約８℃の温度に冷却した。約４ｍｇ／ｍｌのＩｇＧ濃度、及び３ＮＴＵ以下の濁度を有する、約２０Ｌの濾過された液体を、当該清澄化（すすぎを含む）から得た。

上記清澄化溶液を、１００ｋＤａの公称分子量カットオフを有する膜（Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）を使用して、限外濾過により透析した。限外濾過を、２つの異なる段階において行った。第一段階では、５．１のｐＨを有する材料を、ｐＨ５．１に調整された、５ｍＭの酢酸溶液を使用し、そして約３０ＵＡへの濃縮を使用することにより、３つのステップの一連の透析、及び濃縮に供した。第二段階では、タンパク質、カプリレート、及びＰＥＧの適切な濃度を有する、溶液を、ｐＨ４．５±０．１にし、そして透析を、その後、ｐＨ４．５で、５ｍＭの酢酸溶液の８容積を使用して、開始した。次に、生成物を、ｐＨ４．２で、約２０Ｌの２００ｍＭのグリシン溶液を使用して、透析を使用して、製剤化し、そして１０％（ｗ／ｖ）の濃度を有するＩｇＧの溶液を得る目的で、同じ限外濾過ユニットで、１４０．５ＵＡの値に濃縮した。

最後に、当該溶液を、デプスフィルター（ＣＵＮＯ（登録商標），Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、及びアブソリュートフィルター、又は０．２２の細孔径を有する膜（ＣＶＧＬ（登録商標），Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ；又はＤＦＬ（登録商標），ＰＡＬＬ，ＵＳＡ）を使用して、濾過した。

表１は、上記方法に従った、出発材料、複数の中間生成物、及び最終生成物の特性評価を示す。当該表に示される結果に関して、濁度を、比濁法によって測定したこと；ポリマー、又は免疫グロブリンの分子凝集物の割合を、検出された全タンパク質に対して、２８０ｎｍでの、光学濃度値に従って、排除ＨＰＬＣゲルカラムによって決定したこと；カプリレートの濃度を、比色分析基質の定量化によって、酵素法を使用して、決定したこと；ＰＥＧの濃度を、示差屈折率検出器を使用して、ＨＰＬＣ濾過ゲルカラムを用いて決定したこと：及び方法の収率（％）を、比濁法により、定量化されたＩｇＧの濃度に従って、計算したことに留意すべきである。

本実施例の結果は、上記精製された溶液のカプリレートでの処理が、免疫グロブリン、又は他の沈殿物の任意の形成を誘導せず、生成物の分子分布を未変化に維持することを示す。従って、カプリレートでの処理後、凝集物及び／又は沈殿物を除去するために、精製ステップを必要としなかった。この事実は、製品製造方法を、著しく容易にし、そして材料の限外濾過膜への直接適用を可能にする。

従って、後続の限外濾過プロセスは、製造過程の化学試薬（すなわち、ＰＥＧ、及びカプリレート）を効果的に低減する目的を達成し、そして精製された免疫グロブリンの溶液の形成、及び濃縮を可能にし、その治療上の使用のための適切な組成物を得る。

表１から分かるように、出発溶出物から１０％濃縮生成物への、この場合における得られたタンパク質の収率は、８９．４％であり、本方法の工業スケールでの実行可能性を示す。この回収率は、国際公開第２００５／０７３２５２（７０％の収率、最初の６．８ｇ／Ｌと比較して４．８ｇ／Ｌの収率に基づく）に記載されたような、先行技術文献に従った従来の方法により得られる値よりも大きい。

実施例２
カプリレートでの処理における免疫グロブリンの最初の溶液の純度の影響
本実施例において、評価を、免疫グロブリンの最初の溶液の純度の影響、及び本発明の方法に供する出発材料中の付随するタンパク質の存在で行った。

２つの独立した試験群を作製した：
Ａ群において、出発材料は、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム溶出物であり、９８±２％の電気泳動純度（ＡＣＥ）、すなわち、実施例１に記載の出発材料であった。
Ｂ群において、出発材料、指定された４％ＰＥＧの濾液を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー前のステップまでの実施例１に記載の方法によって得た。従って、材料Ｂを、分画ＩＩ＋ＩＩＩの抽出懸濁物のＰＥＧでの沈殿後、得て、そして約９０％ＩｇＧの電気泳動純度（ＡＣＥ）を有する。

約４％相当のＰＥＧ含量を有する、両出発材料（Ａ群、及びＢ群）を、１３ｍＭの濃度、及び５．０〜５．２の間のカプリレートで処理し、そして実施例１に示されるように精製した。

表２は、両試験群（それぞれＡ、及びＢ）において使用される出発材料、及びカプリレートでの処理後のステップにおいて生成されるそれらの材料の特性を示す。

表２における得られた、そして収集された結果は、不活性化のために有効な濃度（１３ｍＭ）でのカプリレートの、低い純度（約９０％ＩｇＧ、Ｂ群を参照）の材料への添加は、溶液の成分の沈殿を引き起こし、濁度の劇的な増加（５００ＮＹＵ超）を生じる。従って、溶液に関する分子分布の結果は、高分子量を有する付随するタンパク質の部分の沈殿を示した。

カプリレートの、前に記載した量、及び条件下（１３ｍＭのカプリレート、５．０〜５．２の間のｐＨ）での、低い純度の材料への添加は、沈殿した懸濁物を生じ、高分子量を有するタンパク質、及び沈殿した凝集物を分離するために、分離、及び精製の追加のステップを含む必要を生じさせる。従って、カプリレートで処理したＡ群の生成物の分子組成、すなわち、１％を上回る凝集物含量を有する、は、精製、又は分離の追加のステップ、例えば、ＰＥＧでの沈殿、クロマトグラフィー、又は同等の方法を含まない限り、この生成物を処理して精製された最終生成物にすることが、実行可能でないことを示す。最後に、この事実は、カプリレートが、十分な純度の材料に添加された場合のみ、非沈殿条件での、ウイルス不活性化能力を有する試薬としてのカプリレートの使用の実行可能性を示す。

実施例３
出発材料の組成物の凝集物の生成に与える影響
本実施例の目的は、カプリレートでの処理を受ける免疫グロブリンの最初の溶液の組成の影響を評価することであった。

２つの独立した試験群、同等の純度（９７．９±１．５％）の材料から開始するが、異なる組成を有するＡ及びＢ群を作製した。

Ａ群において、出発材料は、カラム溶出物（実施例１に記載の最初の方法に従って得られた）であり、５±２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、及び４±１％のＰＥＧ‐４０００濃度を有する。

Ｂ群において、指定され、濃縮され、そして透析された溶出物である、出発材料は、Ａ群で述べられたものと同じカラム溶出物であるが、濃縮され、そして透析された後のものである。従って、ＤＥＡＥカラム溶出物（上記実施例１で述べられ、そして本実施例の群Ａに相当する）を、ＰＥＧ含量を、約６倍まで減らし、そしてタンパク質を、約４％の値、すなわち４０ｍｇ／ｍｌに濃縮するように、限外濾過による透析、及び濃縮の追加のステップに供した。

両実験群Ａ、及びＢにおいて得られた材料を、１０％のＩｇＧ濃度を有する生成物を得るために、１３ｍＭの濃度、及び５．０〜５．２の間のｐＨでの、カプリレートでの処理に供し、実施例１に記載の条件下で、限外濾過した。

表３は、上記試験群Ａ、及びＢにおいて処理された材料の主な特性、及びそれぞれの実験群に関する、後続のカプリレートでの処理ステップにおいて、及び透析され、そして濃縮された最終生成物において、生成された材料の特性を示す。

表３から分かるように、結果は、４０±１０ｍｇ／ｍｌ（４±１％）のＰＥＧ濃度の存在下での、５±２ｍｇ／ｍｌの濃度での、免疫グロブリンの精製された溶液（Ａ群、カラム溶出物）の特定の条件下での、カプリレートでの処理が、免疫グロブリンの溶液の何らかの変化、又は凝集を引き起こさず、検出不可能な０．１％以下の凝集物の割合を有する、カプリレートの添加の間、及び後の分子分布を未変化に維持するという証拠を示す。

しかしながら、カプリレートでの処理のためのこれらの同じ条件を、低いＰＥＧ含量（＜１％）を有する材料（Ｂ群）を適用した場合、免疫グロブリン凝集物の実質的な増加を、カプリレートの添加後、観察した。さらに、使用した条件下で、限外濾過により、この凝集物含量を除去することができず、そして同程度のポリマーを、最終生成物において測定した。

実験群Ａ、及びＢにおいて使用された出発材料の間の主な異なった特性が、タンパク質濃度、及びＰＥＧ濃度であることを考えると、追加の試験を、これらのパラメーターのそれぞれの、後続のカプリレートでの処理に与える影響を突き止めるために、行った。

本実験において、出発点は、濃縮され、そして透析された溶出物の単一バッチ（上記群Ｂの最初の材料）であり、そしてそれを、４つの区別できる実験群：Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ４に分離した。

Ｂ１群の材料を、約４％のタンパク質濃度、及び約０．６％のＰＥＧ濃度で処理した。

Ｂ２群の材料を、約４％の同じタンパク質濃度で処理したが、ＰＥＧ濃度を、４±１％（ｗ／ｗ）の値に、再調整した。

Ｂ３群、及びＢ４群において、材料を、０．５±０．２％のタンパク質に希釈した。ＰＥＧ濃度に関して、群Ｂ３では、約０．６％（ｗ／ｗ）の濃度にしたが、Ｂ４群では、ＰＥＧ濃度を、４±１％（ｗ／ｗ）に再調整した。

４つの実験群において得られた生じた材料を、５．１０±０．０５のｐＨ、及び１５ｍＭのカプリレート濃度にし、そしてその後、２５℃で２時間、インキュベートした。

表４に示された結果は、定められた条件下での、カプリレートでの処理の間の、ＰＥＧ保護効果を、十分なタンパク質希釈と組み合わせて観察したことを示す。出発材料が、およそ、５±２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、及び４％のＰＥＧ濃度である場合、検出できない値の凝集物を、カプリレートでの処理後に得た（＜０．１％）ことは注目に値する。

実施例４
カプリレートで処理した免疫グロブリンの溶液の溶解度に与えるｐＨの影響
免疫グロブリンの溶液中のＰＥＧの除去、及び当該免疫グロブリンの、それらの静脈内使用のために適した濃度への濃縮は、好ましくは、約４．５のｐＨ値で、行うべきである。

さらに、本実験における、カプリル酸の、そのｐＫａ（４．８９）未満のｐＨ値での不溶性を考慮して、カプリレートで処理した免疫グロブリンの溶液の溶解度に与えるｐＨの影響を、限外濾過を開始するための適切なｐＨ値を定めるために、評価した。

このような目的を達成するために、実施例１に詳細に記載された最初の方法に従って得られたカラム溶出物のバッチを処理して、１３ｍＭのカプリレートで処理し、そして清澄化した免疫グロブリンの溶液を得た。

この中間体は、そしてそれは、限外濾過ステップ前の材料を構成し、酢酸の添加によって酸性化されて、カプリレートでの処理のｐＨ（５．１）から約４．５のｐＨ値になる。続いて、溶液の外観、及び溶解度を、それぞれの評価したｐＨごとに評価し、そしてコロイド粒子の生成を、濁度の比濁分析によって、定量した。

表５は、評価したｐＨ値それぞれについて得られた外観、及び濁度を示す。

得られた結果は、表５において示されたように、１３ｍＭのカプリレートで処理された免疫グロブリンの溶液を、５．０未満のｐＨに、酸性化した場合、白色沈殿物の出現を、濁度の明らかな増加と共に、観察した。この効果は、コロイド形態での不溶性のカプリル酸の形成に起因し、そしてそれは、５．０未満のｐＨで、限外濾過の処理を開始するのを、実行不能にした。

得られた結果は、精製した溶液を、ウイルス不活性化のための有効な濃度範囲（９〜１５ｍＭのカプリレート）において、そして前に記載した条件下で、カプリレートでの処理に供した場合、ウイルス不活性化処理のｐＨ以上のｐＨ（すなわち、５．１）で、イオン化、及び可溶型の濃度を増加させて、そして従って、限外濾過膜を介したその透過性を容易にすることを目的として、開始することが好ましいという証拠となる。

実施例５
限外濾過／透析濾過によるカプリレートの低減に与える透析溶液中の酢酸含量の影響
一連の独立した限外濾過／透析濾過プロセスを、生成物の透析のために使用する緩衝液中の酢酸の異なる濃度の存在下、行った。

使用した出発材料、指定し、濃縮し、そして透析した溶出物は、実施例３のＢ群のものと同じであった。９８±２％のＩｇＧ純度、約４０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、及び約０．６％のＰＥＧ含量を有する、当該出発材料を、カプリレートでの処理に供し、そして続いて、約１００ｋＤａの公称分子量カットオフを有する膜を使用する限外濾過／透析濾過に供した。

適用した限外濾過／透析濾過ステップは、約４％（ｗ／ｖ）のＩｇＧへの濃縮の第一段階、８容積の透析溶液を使用する透析の第二段階、及び最終的な、約９〜１０％（ｗ／ｖ）のＩｇＧ値への濃縮を含む。

最初の限外濾過／透析濾過試験を、注射用蒸留水を使用して行ったが、後続の試験を、増加した濃度の酢酸、より具体的には、それぞれ、２、５、２０、又は５０ｍＭの酢酸を有し、そしてすべての場合において、５．０〜５．５の間のｐＨに調整した、緩衝液を使用して行った。

（１）透析後、８透析容積で測定した値
（２）以下の式：
透析容積の数＝ｌｎ（Ｃｆ／Ｃｏ）／（Ｒ−１）
（式中、Ｃｆは、問題になっている透析容積の数での透析後の濃度であり、Ｃｏは、透析前の濃度であり、そしてＲは、保持係数である）
を用いて計算した透過性

表６の結果は、約１００ｋＤａの分子量カットオフの膜を使用し、５．０〜５．５の間のｐＨで、そして約５ｍＭの最小濃度の酢酸、そして少なくも５０ｍＭを有する、酢酸を有する緩衝液の８透析量を適用する、限外濾過／透析濾過の方法が、最終濃縮生成物において、適切なレベルへのカプリレートの効率的な低減を、十分に達成することを示す。

対照的に、透析に使用した溶液が、注射用蒸留水、又は２ｍＭの酢酸レベルを有する緩衝液であった場合、カプリレートを、濾液において、効率的に除去されない。

これは、前に記載した条件下での、約１００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を使用する、限外濾過／透析濾過の方法が、正しいレベルの当該試薬を、最終濃縮生成物において検出したことを考慮すると、前の処理に由来するカプリレートの低減に効果的であるという証拠となる。

実施例６．単一ステップの限外濾過を用いた化学試薬（ＰＥＧ、及びカプリレート）の同時除去
ＩｇＧのバッチを、実施例１に記載の方法に従って処理し、カプリレートで不活性化され、そして清澄化された溶液を得た。約０．５％のタンパク質濃度、及び５．１のｐＨを有する、当該溶液を、１００ｋＤａの分子量カットオフを有する、ポリスルホン膜のＢｉｏｍａｘ（登録商標）ｔｙｐｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）で形成された限外濾過／透析濾過装置を使用して処理した。限外濾過／透析濾過を、実施例５で記載したような、２つの異なる段階において、行った。

ｐＨ５．１、５．６、又は５．８で行われる、第一段階において、材料を、ｐＨ５．１、５．６、又は５．８に調整した、５ｍＭの酢酸緩衝液の少なくとも３容積での透析濾過、及び約２％の値へのタンパク質の濃縮を用いた、一連の透析及び濃縮のステップに供した。

第二段階において、カプリレートの量を、約１／１０に低減した後、溶液を、４．５±０．１、又は５．１のｐＨにした。生成物を、その後、タンパク質、及びＰＥＧを適切な濃度にし、透析を開始し、そして透析を、４．５、又は５．１のｐＨの、５ｍＭの酢酸緩衝液の８容積で、開始した。

最後に、生成物を、４．２のｐＨ、及び２００ｍＭの濃度での、６容積のグリシン溶液での透析を用いて製剤化し、そしてＩｇＧの１０％溶液を得るために、濃縮した。

表７は、それぞれの段階の限外濾過／透析濾過の開始で、そして様々なｐＨ値で、得られたＰＥＧ、及びカプリレートの通過の割合を示す。

表７の結果は、限外濾過／透析濾過の開始時点では、段階Ｉにおいて、カプリレートが、ｐＨ５．１〜ｐＨ５．８の間で、非常に高い通過値を示したことを示す。これらの値は、限外濾過／透析濾過ステップの段階Ｉの間の、カプリレートの非常に高い低減をもたらした（最初の含量に対して、１０倍以上のカプリレートの低減を観察した）。対照的に、ＰＥＧの通過は、段階Ｉにおいて、非常に低く（＜２０％）、そしてその全除去は、カプリレートの存在下において、ｐＨ＞５で、実質的に実行不能であった。

一方、段階ＩＩにおいて、表７において分かるように、ＰＥＧの通過は、ｐＨ４．５で、非常に高く、８２％の値であった。また、この段階ＩＩの間、この段階の開始時点において、カプリレートが、＜１ｍＭの残存レベルで存在し、そして実質的に１００％の通過を可能にしたことを考慮すれば、カプリレートもまた、低減したことが理解できた。

表８は、限外濾過／透析濾過ステップ、及び最終製剤化ステップのそれぞれの段階における、タンパク質、ＰＥＧ、及びカプリレートの濃度の進展を詳述する。

それぞれのステップ、及び段階で記録したＰＥＧ、及びカプリレートの値に従って、そしてそれぞれのステップでのタンパク質濃度を考慮すると、約３５０倍の全低減係数（段階Ｉ、及び段階ＩＩ）（限外濾過／透析濾過ステップの最後で得られた０．０２の吸光度と比較して６．９の最初の吸光度）を前提として、ＰＥＧ低減係数は、限外濾過／透析濾過ステップの段階Ｉ（ｐＨ５．１における）において、４であり、そして限外濾過／透析濾過ステップの段階ＩＩ（ｐＨ４．５における）において、９０であった。

カプリレートの場合、約７００倍の全低減係数（段階Ｉ、及び段階ＩＩ）（限外濾過／透析濾過ステップの最後で得られた０．００３の吸光度と比較して２．２の最初の吸光度）を前提として、低減係数は、限外濾過／透析濾過ステップの段階Ｉ（ｐＨ５．１における）において、５５であり、そして限外濾過／透析濾過ステップの段階ＩＩ（ｐＨ４．５における）において、１３であった。

結果は、ウイルス不活性化能を有する試薬（カプリル酸、又はカプリレート）、及び沈殿試薬（ＰＥＧ）を、限外濾過／透析濾過ステップのそれぞれの段階で適用される物理的、及び化学的条件（特に、ｐＨ、タンパク質濃度、透析容積の数、透析緩衝液）を選択して、約１００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を使用する限外濾過の単一ステップによって効率的に低減し、そして静脈内使用に適した両試薬のいくらかの残存濃度を有する、１０％の濃度のＩｇＧの最終生成物を生じることを示した。

実施例７．ＰＥＧの存在下でのカプリレートでのウイルス不活性化能の評価
出発材料として、カラム溶出物、又は透析され、そして濃縮された溶出物（それぞれ、実施例１、及び３に従って得られた）を用いて、様々な独立した実験を行って、脂質エンベロープを有するウイルスを除去し、又は不活性化するための、ＰＥＧの存在下での、カプリル酸、又はカプリレートの能力を評価した。

両材料は、９８＋２％の免疫グロブリン純度、及び５〜１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有する一方で、それらのＰＥＧ含量は、それぞれ、４０ｍｇ／ｍｌ、及び１．５ｍｇ／ｍｌと異なった。

ウイルス不活性化試験を、脂質エンベロープを有し、物理的、及び化学的剤に対して平均的な耐性を有する、４０〜６０ｎｍの、フラビウイルス科の牛ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）を使用して、行った。

それぞれの試験において、対応する出発材料を、０．５％以下に、ウイルスで接種し、そして９ｍＭ、又は１３ｍＭのカプリレート濃度を適用して、１５℃〜２５℃の温度で、２時間、ウイルス不活性化処理に供した。

生成した異なるサンプルにおけるＢＶＤＶのウイルス負荷の定量化を、ＭＢＤＫ細胞株を用いた、ＴＣＩＤ５０試験（５０％組織培養感染量）を使用して、行った。ウイルス不活性化ステップのウイルス低減係数（ＲＦ）を、ｌｏｇ₁₀で表された、処理終了時に得られたサンプルにおいて検出したウイルスの量で割った、接種された出発材料において検出したウイルス負荷量の商として、決定した。

表９は、それぞれの試験の出発材料の特性、及び得られたＲＦを詳述する。

すべての試験で得られた、ウイルス低減の結果（表９を参照）は、異なる温度（１５、及び２５℃）での試験後、カプリレートの最少の９ｍＭの濃度に関してさえ、両出発材料において、ＢＶＤＶの不活性化のための高い能力を示す。さらに、これらの試験は、分析したそれぞれのＰＥＧ濃度で、同等の結果を、両評価した材料で得たことを考えれば、カプリレートのウイルス不活性化能において、ＰＥＧによる、観察される干渉はないことを示した。

実施例８．本発明の製造方法に従って得た静脈内免疫グロブリン溶液の特性評価
本実施例は、本発明の方法によって得た１０％（ｗ／ｖ）のタンパク質を有する免疫グロブリンの溶液の生物学的、及び機能的特性を定めることを目的とする。

ＤＥＡＥカラム溶出物の２つのバッチを、約２００Ｌの血漿規模での、カプリレートで不活性化されたウイルス溶液を得るために、実施例１で詳述した方法に従って、処理した。

一旦清澄化した、カプリレートを有する当該溶液を、主なプロセス残余物（ＰＥＧ、及びカプリレート）の除去を達成する目的で、実施例６に記載されたように、区別された段階において、透析、及び限外濾過により、濃縮した。続いて、当該精製した溶液を、約２．５％のタンパク質濃度で、ｐＨ４．５±０．１に調整した、１％のソルビトール、及び２４０ｍＭのグリシンからなる緩衝液の約６容積の定容で、透析することにより、製剤化した。最後に、当該溶液を、限外濾過で濃縮し、そして１０％（ｗ／ｖ）のタンパク質に相当する、１４０±５ＵＡ（２８０ｎｍ）の光学濃度に調整し、そして５．２５±０．２５の最終ｐＨに調整した。

ソルビトール、及びグリシンで安定化させ、そして一旦清澄化し、そして滅菌グレード膜（０．２２μｍ）を使用して濾過した、得られた生成物（ＩＧＩＶ １０％（ｗ／ｖ））を、静脈内投与のための免疫グロブリンの溶液の品質、不変性、及び安定性の最も関連性のある分析パラメーターを決定するために、クロロブチルストッパーを有するガラス容器に入れた。２つのバッチのために得られた平均分析値、及び欧州薬局方の値指定を、表１０に示す。

Ｅｕｒ．Ｐｈ．：欧州薬局方；ｎ．ｅ．：規定されていない；ＴＧＴ ＦＸＩ：トロンビン生成試験（第ＩＸ因子欠乏血漿を使用）；ＮＡＰＴＴ ＰＫＡ：プレカリクレイン活性化因子；ＡＣＡ：抗‐補体活性

上記結果は、得られた生成物が、ポリマーの不在、ＰＫＡ、又はＡＣＡ活性などの所望しない生物活性、特に、血漿に関する、いくつかの損傷のない機能的特性、例えば、ＩｇＧサブクラスの割合、及びＦｃフラグメントの完全性の保存などのパラメーターに関して、本発明の精製プロセスの結果として、実質的に不変であり、そして同時に優れた純度プロフィールを示す（抗‐Ａ／抗‐Ｂ同種赤血球凝集素の低い滴定量、ＩｇＭの濃度、凝固促進活性等）ことを高める。

ＰＥＧの存在下での、カプリレートでのウイルス不活性化、及び続くその分離、及び最終製剤化ステップを含む、１０％（ｗ／ｖ）のＩＧＩＶを得るための本発明の全体的な方法は、全体的に実行可能であり、１０％（ｗ／ｖ）のＩＧＩＶタンパク質溶液として製剤化され、そして濃縮された最終生成物に拡張可能であり、欧州薬局方において規定された値に完全に適合する最終生成物を与えるという結論に達する。

安定性試験を実施し、そしてそれは、生成物の商業化のために不可欠であり、室温（２５℃〜３０℃）で、２年間、１０％（ｗ／ｖ）の静脈内免疫グロブリン溶液を安定化するために、ソルビトール（５％）、グリシン（等量）、又はそれらの組み合わせを有し、４．２〜６．０のｐＨ範囲である製剤の適合性を示した。

実施例９．代替的な方法によって得られたＩｇＧに富む画分に対するカプリレートでの処理の適用可能性
評価を、代替的な精製方法を使用して得られた他のプロセス中間体を使用して、本明細書に記載の条件下で、カプリレートでの適用の有効性で、行った。

２つの独立した実験を、出発材料として、ＩｇＧに富む血漿中間体、Ｃｏｈｎ‐Ｏｎｃｌｅｙエタノール分画由来の、分画ＩＩの所定の懸濁液を使用して、行った。

この中間体を、分画ＩＩ＋ＩＩＩまで、本明細書に記載の血漿分画方法と同じ方法により得た。その後、手順を、分画ＩＩ＋ＩＩＩ抽出物懸濁物のアルコール再沈殿で続け、その後、分画ＩＩＩの分離、最後に、９６％超の純度を有する分画ＩＩを得た。当該分画ＩＩの懸濁物を、一旦、ベントナイトで精製し、そして水で透析して、アルコールを除去し、これらの実験のための出発材料とした。

行った２つの実験において、２つの血漿バッチ由来の材料を、それらのＰＥＧ含量に従って、２つの異なる群、Ａ、及びＢに分離した。Ｂ群では、出発材料を、ＰＥＧ‐４０００の濃縮された溶液を添加することにより、４０ｍｇ／ｍｌの公称ＰＥＧ濃度にした。

その後、両群（Ａ、及びＢ）由来の両材料を、本明細書に記載のように、約５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈し、５．１のｐＨ値に調整し、そして１３ｍＭの公称濃度、及び５．０〜５．２の間のｐＨに達するまで、カプリレートでの処理に供した。

表１１は、両試験群（Ａ、及びＢのそれぞれ）において使用した出発材料の主な特性、及びカプリレートでの処理後に生じた材料の特性を詳細する。

（１）ＰＥＧ、及びカプリレート値は、分析定量を用いて得られた値に相当する。

結果は、異なる方法によって十分に精製された免疫グロブリン溶液を使用して、所定の条件下、カプリレートでの不活性化処理の実行可能性を示し、免疫グロブリン凝集物、又は他の不可逆の沈殿物の形成を誘導せず、そしてそれは、続く精製プロセスを非常に容易にすることを示す。

結果は、タンパク質の十分な希釈と、十分な程度の純度との組み合わせにおいて、免疫グロブリンポリマーの生成に与えるＰＥＧの保護効果が、明らかであることを示す。

本実験例は、十分な純度を有する材料を添加し、そしてタンパク質、及びＰＥＧ濃度に関する特定の条件に適合する場合、非沈殿条件、及び／又は凝集促進条件下、ウイルス不活性化能力を有する試薬としてのみの、カプリレートの使用の実行可能性を示す。

本発明は、同じ実施態様を参照して提示し、そして記載してきたが、本明細書、及び特許請求の範囲において開示された主題を解釈した後、当業者に明らかである、製造、又は他の詳細に関して、複数の変形が存在するので、これらの実施態様が、本発明を限定するものでないことが理解される。従って、すべての変形、又は同等物が、以下の特許請求の範囲に記載の発明の最も広い範囲内に含まれると考えられる場合、それらは、本発明の範囲に含まれる。

Claims (20)

1. グリコールのポリエーテル、又はポリマーの存在下での、９６％以上の純度を有する免疫グロブリン溶液を出発溶液とする、免疫グロブリンの溶液の調製方法であって、前記方法が、以下のステップ：
   ａ）カプリル酸、又はその塩を、前記出発溶液に添加し；
   ｂ）ステップａ）で得られた溶液のｐＨを５．０〜５．２の間に調整し；
   ｃ）エンベロープを有するウイルスの不活性化のために必要な時間、及び温度で、ステップｂ）で得られた溶液をインキュベートし；そして
   ｄ）ステップｃ）で得られた溶液について、限外濾過／透析濾過を行う
   ことを含み、
   ここで、前記出発溶液が、１〜１０ｍｇ／ｍｌの間の免疫グロブリン濃度を有するものであり、
   ここで、前記出発溶液中のグリコールのポリエーテル又はポリマーの濃度が、２％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）の間である、調製方法。
2. 前記方法が、ステップｄ）で得られた免疫グロブリンの溶液の最終製剤化のステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記出発溶液が、Ｃｏｈｎ法、又はＣｏｈｎ‐Ｏｎｃｌｅｙ法に従って得られた、分画Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ、分画ＩＩ＋ＩＩＩ、又は分画ＩＩに由来するか、又はＫｉｓｔｌｅｒ‐Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ法に従って得られた、又はさらに精製して、９６％以上のＩｇＧ純度が得られた、沈殿物Ａ、又はＩ＋Ａ、又はＧＧに由来することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記出発溶液が、Ｃｏｈｎ法に従って得られた、分画ＩＩ＋ＩＩＩに由来し、続いて前記分画が、ＰＥＧでの沈殿、及び陰イオンクロマトグラフィーを用いて精製されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記出発溶液が、３〜７ｍｇ／ｍｌの間の免疫グロブリン濃度を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
6. 前記グリコールのポリエーテル、又はポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、又はそれらの組み合わせから選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記出発溶液中のＰＥＧの濃度が、３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の間であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記ＰＥＧが、４０００Ｄａの公称分子量を有するＰＥＧであることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
9. ステップａ）において、カプリル酸、又はその塩が、添加され、９ｍＭ〜１５ｍＭの間の濃度を達成することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. ステップｂ）において、前記得られた溶液が、５．１のｐＨに調整されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. ステップｃ）において、前記溶液が、２℃〜３７℃の間の温度で、少なくとも１０分間、インキュベートされることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ステップｃ）において、前記溶液が、２０℃〜３０℃の間の温度で、少なくとも２時間、インキュベートされることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
13. 前記出発溶液が、全タンパク質に対して、１％（ｗ／ｖ）以下のアルブミン含量を有することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記出発溶液が、ヒト血漿に由来することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記出発溶液が、遺伝子組み換え技術、化学合成技術、又は細胞培養技術において得られることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ステップｄ）の限外濾過／透析濾過が、１００ｋＤａの膜を使用して行われることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. ステップｄ）の限外濾過／透析濾過が、以下の２段階：
    大部分のカプリル酸を低減し、又は除去するために、ｐＨが、５．０〜６．０の間に調整される、第一段階；及び
    大部分のグリコールのポリエーテル、又はポリマーを低減し、又は除去するために、ｐＨが、５．０以下の値に調整される、第二段階
    で行われることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. ステップｄ）の前記第二段階の限外濾過／透析濾過において、前記ｐＨが、４．０〜５．０の間に調整されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
19. 最終製剤化のステップにおいて、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の炭水化物、若しくはポリオール、又はそれらの組み合わせから選択される、賦形剤及び／又は安定化剤が添加されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
20. 免疫グロブリンの最終濃度が、前記免疫グロブリンの静脈内、筋肉内、又は皮下使用に適した濃度に調整されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。