JP6362311B2 - 積層構造体中の細胞の画像解析方法、及び角膜移植用積層構造体の評価方法 - Google Patents
積層構造体中の細胞の画像解析方法、及び角膜移植用積層構造体の評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6362311B2 JP6362311B2 JP2013184380A JP2013184380A JP6362311B2 JP 6362311 B2 JP6362311 B2 JP 6362311B2 JP 2013184380 A JP2013184380 A JP 2013184380A JP 2013184380 A JP2013184380 A JP 2013184380A JP 6362311 B2 JP6362311 B2 JP 6362311B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- image
- region
- laminated structure
- section
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 title claims description 129
- 238000003703 image analysis method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 615
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 258
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 76
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 42
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 claims description 42
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 40
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 29
- 101000623901 Homo sapiens Mucin-16 Proteins 0.000 claims description 26
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims description 26
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 14
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 6
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 121
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 26
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 22
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 17
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 14
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 11
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 11
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 11
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 9
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 8
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- 239000012625 DNA intercalator Substances 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000013441 quality evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N (+-)-Isoprenaline Chemical compound CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 JWZZKOKVBUJMES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWVRXSQPCQPQHM-UHFFFAOYSA-N 2-(4-aminophenyl)-1h-indol-6-amine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(N)C=C2N1 PWVRXSQPCQPQHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101000916532 Rattus norvegicus Zinc finger and BTB domain-containing protein 38 Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J YoYo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3O2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2O1 GRRMZXFOOGQMFA-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000005178 buccal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 210000005081 epithelial layer Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- VWQWXZAWFPZJDA-CGVGKPPMSA-N hydrocortisone succinate Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)COC(=O)CCC(O)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VWQWXZAWFPZJDA-CGVGKPPMSA-N 0.000 description 1
- 229950006240 hydrocortisone succinate Drugs 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 229940039009 isoproterenol Drugs 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002690 local anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003786 sclera Anatomy 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 229940072358 xylocaine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N2021/178—Methods for obtaining spatial resolution of the property being measured
- G01N2021/1785—Three dimensional
- G01N2021/1787—Tomographic, i.e. computerised reconstruction from projective measurements
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
(1) (a)少なくとも1層が細胞層である積層構造体中の細胞核及びその他の1種以上の生体分子を、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c)前記工程(b)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d)前記工程(c)により構築された立体断層画像から、1又は2以上の細胞領域を分割する工程と、
(e)前記工程(d)の後、分割された細胞領域ごとに、当該領域に含まれる全ての平面断層蛍光染色画像を合算することにより、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f)前記工程(e)により作製された前記1の平面スタック画像に対して画像解析を行い、当該積層構造体中の細胞を解析する工程と、
を有し、
前記工程(d)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層以上の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であることを特徴とする、積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(2) 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなり、底面に平行な細胞領域を、細胞核が存在していない底面に平行な断面に対して細胞核標識画像内の前記特定の種類の細胞の総輝度値が所定量増大する断面に基づいて決定することを特徴とする前記(1)の積層構造中の細胞の画像解析方法。
(3) 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなる細胞領域を、
(i−1)前記特定の種類の細胞の細胞核が存在していない断面を特定する無細胞断面として特定する工程と、
(ii−1)細胞核標識画像の1画像あたりの前記特定の種類の細胞の総輝度値が、当該無細胞断面よりも所定量増大している断面を細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii−1)前記細胞底面基準断面に対して所定の高さ範囲を、前記特定の種類の細胞を含む細胞層からなる細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする前記(1)の積層構造中の細胞の画像解析方法。
(4) 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなる細胞領域を、
(i)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記特定の種類の細胞の細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、かつ前記細胞核標識画像の1画像当たりの前記特定の種類の細胞の総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii)前記細胞底面基準断面よりも前記積層構造体の高さ方向で5〜10μm下の断面から、前記積層構造体の高さ方向で15〜25μm上の断面までの領域を、前記特定の種類の細胞を含む細胞層からなる細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする前記(1)の積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(5) 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなる細胞領域を、
(i)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記特定の種類の細胞の細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、細胞核標識画像の1画像当たりの前記特定の種類の細胞の総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii−2)前記細胞底面基準断面に最も近い断面であって、当該細胞底面基準断面よりも上側の細胞核が存在しない断面から、当該細胞核底面基準断面よりも下側の細胞核が存在しない断面までの領域を、前記特定の種類の細胞を含む細胞層からなる細胞領域として決定する工程と
により決定することを特徴とする前記(1)の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
(6) 前記特定の種類の細胞が幹細胞であることを特徴とする前記(2)〜(5)のいずれかの積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(7) 前記細胞領域が、細胞核領域であることを特徴とする前記(1)〜(6)のいずれかの積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(8) (a)少なくとも1層が細胞層である積層構造体中の細胞核及びその他の1種以上の生体分子を、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c)前記工程(b)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d)前記工程(c)により構築された立体断層画像から、1又は2以上の細胞領域を分割する工程と、
(e)前記工程(d)の後、分割された細胞領域ごとに、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f)前記工程(e)により作製された各平面スタック画像に対して画像解析を行い、当該積層構造体中の細胞を解析する工程と、
を有し、
前記工程(d)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層以上の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であり、
前記積層構造体が、角膜上皮幹細胞又は口腔粘膜幹細胞を培養して形成されたことを特徴とする、積層構造体中の細胞の画像解析方法。
(9) 前記積層構造体は、角膜上皮幹細胞又は口腔粘膜幹細胞が分化した細胞を含むことを特徴とする、前記(8)の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
(10) 前記積層構造体が、第一の種類の細胞を含む第一の細胞層を有し、前記第一の細胞層の上方に、前記第一の種類とは異なる第二の種類の細胞を含む第二の細胞層を有することを特徴とする前記(1)〜(9)のいずれかの積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(11) 前記工程(a)において、細胞核に加えて、前記第一の種類の細胞において前記第二の種類の細胞よりも多く発現している生体分子及び前記第二の種類の細胞において前記第一の種類の細胞よりも多く発現している生体分子からなる群より選択される1種以上の生体分子を蛍光標識することを特徴とする前記(10)の積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(12) 前記第一の種類の細胞が幹細胞であり、前記第二の種類の細胞が、前記幹細胞が分化した細胞であることを特徴とする前記(10)又は(11)の積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(13) 前記工程(d)において、前記第一の細胞層からなる細胞領域と、前記第二の細胞層からなる細胞領域とを分割することを特徴とする前記(10)〜(12)のいずれかの積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(14) 前記工程(f)における画像解析が、各平面スタック画像の画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素からなる領域の形状からなる群より選択される1以上の解析であることを特徴とする前記(1)〜(13)のいずれかの積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(15) 前記工程(f)における画像解析が、各平面スタック画像中の細胞核の大きさに基づいて、当該平面スタック画像中の細胞が、幹細胞か、幹細胞が分化した細胞なのかの解析を行うことを特徴とする前記(1)〜(14)のいずれかの積層構造体中の細胞の画像解析方法、
(16) 上皮系幹細胞を培養して形成され、かつ角膜移植に用いられる積層構造体に対して、
(a’)前記積層構造体中の細胞核と、上皮系幹細胞に特異的な生体分子、分化後の上皮系細胞又はその周辺組織に特異的な生体分子、並びに上皮系幹細胞及び分化後の上皮系細胞の両方に存在する生体分子からなる群より選択される1種以上の生体分子とを、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b’)前記工程(a’)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c’)前記工程(b’)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d’)前記工程(c’)により構築された立体断層画像から、上皮系幹細胞を含む細胞層からなる下部細胞領域と、前記下部細胞領域の上方に隣接する上部細胞領域とを分割する工程と、
(e’)前記工程(d’)の後、分割された領域ごとに、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f’)前記工程(e’)により作製された各平面スタック画像に対して画像解析を行い、得られた解析結果に基づき、前記積層構造体を評価する工程と、
を有し、
前記工程(d’)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であることを特徴とする、角膜移植用積層構造体の評価方法、
(17) 前記工程(d’)において、前記下部細胞領域を、
(i’)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii’)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、かつ前記細胞核標識画像の1画像当たりの総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、幹細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii’)前記幹細胞底面基準断面よりも前記積層構造体の高さ方向で5〜10μm下の断面から、前記積層構造体の高さ方向で15〜25μm上の断面までの領域を、前記下部細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする前記(16)の角膜移植用積層構造体の評価方法
(18) 前記工程(d’)において、前記上部細胞領域と前記下部細胞領域とを、
(i”−1)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、下側の無細胞断面として特定する工程と、
(i”−2)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も高い断面を、上側の無細胞断面として特定する工程と、
(iii”)前記下側の無細胞断面と前記上側の無細胞断面の両方から等距離にある断面を境界面とし、前記下側の無細胞断面から前記境界面までの領域を下部細胞領域として決定し、前記境界面から前記上側の無細胞断面までの領域を上部細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする前記(16)の角膜移植用積層構造体の評価方法、
(19) 前記工程(a’)において、細胞核と、サイトケラチン、ムチン、上皮細胞のタイトジャンクションを構成する生体分子、及びp63からなる群より選択される1種以上の生体分子とを蛍光標識することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(20) 前記工程(a’)において、細胞核と、AE5、MUC16、ZO−1、panCK、及びp63からなる群より選択される1種以上の生体分子とを蛍光標識することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(21) 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びAE5を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、上部細胞領域から作製された平面スタック画像のAE5の蛍光標識画像における画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のAE5の蛍光標識画像よりも大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(22) 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びMUC16を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、上部細胞領域から作製された平面スタック画像のMUC16の蛍光標識画像における画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のMUC16の蛍光標識画像よりも大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(23) 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びZO−1を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、上部細胞領域から作製された平面スタック画像のZO−1の蛍光標識画像における画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のZO−1の蛍光標識画像よりも大きく、かつ上部細胞領域から作製された平面スタック画像のZO−1の蛍光標識画像における1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素からなる領域が網目構造の形状である場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(24) 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びp63を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像のp63の標識画像中の各細胞核領域における画素当たりの平均輝度値が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のp63の蛍光標識画像よりも大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(25) 前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像中に存在する全細胞核領域に対する、面積が閾値以上の大きさである細胞核領域の割合が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像よりも多い場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(26) 前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像中に存在する細胞核領域の面積の平均値が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像中に存在する細胞核領域の面積の平均値よりも3倍以上大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(16)〜(18)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
(27) 前記工程(a’)において、さらにpanCKを蛍光標識し、
前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
さらに各細胞核領域の外周部分を内周とするドーナツ型の領域であって、ドーナツ型の幅が等間隔である領域を、細胞質領域として決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像のpanCKの標識画像中の各細胞質領域における画素当たりの平均輝度値が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のpanCKの蛍光標識画像と同程度である場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする前記(19)〜(26)のいずれかの角膜移植用積層構造体の評価方法、
を提供する。
このため、当該画像解析方法を利用した本発明の角膜移植用積層構造体の評価方法により、角膜移植用積層構造体を、当該構造体中の上皮系幹細胞と分化した細胞との位置関係を含めて効率よく評価することができる。
さらに、本発明の積層構造体中の細胞の画像解析方法は、同時多染色を行い、積層構造体の広域(広範囲)を一度に観察し解析することができるため、解析時間をより短縮することもできる。
本発明の積層構造体中の細胞の画像解析方法(以下、本発明の画像解析方法、ということがある。)は、下記(a)〜(f)の工程を有し、下記工程(d)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層以上の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であることを特徴とする。
(a)少なくとも1層が細胞層である積層構造体中の細胞核及びその他の1種以上の生体分子を、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c)前記工程(b)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d)前記工程(c)により構築された立体断層画像から、1又は2以上の細胞領域を分割する工程と、
(e)前記工程(d)の後、分割された細胞領域ごとに、当該領域に含まれる全ての平面断層蛍光染色画像を重ね合わせて、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f)前記工程(e)により作製された各平面スタック画像に対して画像解析を行い、当該積層構造体中の細胞を解析する工程。
まず、工程(a)として、少なくとも1層が細胞層である積層構造体中の細胞核及びその他の1種以上の生体分子を、それぞれ蛍光標識する。当該生体分子としては、タンパク質、核酸、糖類、脂質等が挙げられる。蛍光標識される生体分子は、1種類であってもよく、2種類以上であってもよい。マルチ蛍光染色を行うことによって、積層構造体の解析時間を短縮することができる。
積層構造体は、細胞観察用容器に接着していればよく、必ずしも固定化処理がなされている必要はない。なお、細胞観察用容器への積層構造体の固定方法は、特に限定されるものではなく、常法により行うことができる。例えば、自然乾燥させてもよく、ホルムアルデヒドやパラホルムアルデヒド、メタノール等の細胞固定架橋剤を呈することにより、細胞観察用容器へ積層構造体を固定することができる。
本発明の角膜移植用積層構造体の評価方法(以下、本発明の評価方法)では、上皮系幹細胞を培養して形成され、かつ角膜移植に用いられる積層構造体の評価を、本発明の画像解析方法を利用して行う。本発明の評価方法の評価対象となる角膜移植用積層構造体は、培養された上皮系幹細胞を含み、かつ角膜に移植される積層構造体であれば特に限定されるものではなく、従来公知のいずれの手法で作製されたものであってもよい。
(a’)前記積層構造体中の細胞核と、上皮系幹細胞に特異的な生体分子、分化後の上皮系細胞又はその周辺組織に特異的な生体分子、並びに上皮系幹細胞及び分化後の上皮系細胞の両方に存在する生体分子からなる群より選択される1種以上の生体分子とを、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b’)前記工程(a’)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c’)前記工程(b’)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d’)前記工程(c’)により構築された立体断層画像を、上皮系幹細胞を含む細胞層からなる下部細胞領域と、前記下部細胞領域の上方に隣接する上部細胞領域とに分割する工程と、
(e’)前記工程(d’)の後、分割された領域ごとに、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f’)前記工程(e’)により作製された各平面スタック画像に対して画像解析を行い、得られた解析結果に基づき、前記積層構造体を評価する工程。
(i’)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii’)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、かつ前記細胞核標識画像の1画像当たりの総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、幹細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii’)前記幹細胞底面基準断面よりも前記積層構造体の高さ方向で5〜10μm下の断面から、前記積層構造体の高さ方向で15〜25μm上の断面までの領域を、前記下部細胞領域として決定する工程。
(i”−1)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、下側の無細胞断面として特定する工程と、
(i”−2)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も高い断面を、上側の無細胞断面として特定する工程と、
(iii”)前記下側の無細胞断面と前記上側の無細胞断面の両方から等距離にある断面を境界面とし、前記下側の無細胞断面から前記境界面までの領域を下部細胞領域として決定し、前記境界面から前記上側の無細胞断面までの領域を上部細胞領域として決定する工程。
この決定方法によれば、常に、前記積層構造体中の細胞を含む領域のほぼ中央面が、下部細胞領域と上部細胞領域の分割面となる。
なお、特に記載がない場合、以降の実施例において解析した角膜移植用積層構造体は、以下のようにして作製した。まず、ヒト角膜上皮組織を、死体ドナーの角膜(Northwest Lions Eye Bank(Seattle,WA)より提供。)から単離された角膜強膜縁から、はさみを使って単離した(n=4)。ヒト口腔粘膜組織(3×3mmのサンプル)を健常者ボランティアの口腔内の頬粘膜から、キシロカインによる局所麻酔下で外科的に切除された(n=3)。各組織を、抗生物質及び抗真菌剤を含有するダルベッコPBS(リン酸緩衝生理食塩水)で洗浄した後、37℃で1時間、ディスパーゼIIでインキュベートした。分離された上皮層をトリプシン−EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液(Invitrogen社製)で処理した後、懸濁した細胞を温度感受性培養インサート(セルシード社製)に、初期細胞密度が1.5×105細胞(角膜上皮細胞)又は2.0×105細胞(口腔粘膜上皮細胞)/23−mmインサートになるように、細胞培養インサートによって分離されたマイトマイシンC処理済NIH/3T3細胞と共に播き、ケラチノサイト培養培地(KCM)中で培養した。KCMは、10%の牛胎児血清(ジャパン・バイオシーラム社製)、0.5%のインシュリン−トランスフェリン−セレニウム(ITS、Invitrogen社製)、10μMのイソプロテレノール(興和社製)、2.0×10−9Mのトリヨードサイロニン(MP Biomedicals社製)、0.4μg/mLのコハク酸ヒドロコルチゾン(和光純薬社製)、及び10ng/mLのEGF(R&D Systems社製)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)/F12(混合比=3:1)である。以下の実施例において、得られた角膜移植用積層構造体を蛍光標識する工程は、細胞培養が終了したその日中に完了した。
角膜移植用積層構造体の細胞核とAE5を蛍光標識し、本発明の評価方法により、評価した。
まず、角膜移植用積層構造体の細胞核とAE5を蛍光標識した。AE5の蛍光標識には、未標識の抗AE5抗体(PROGEN社製、製品番号:61807)、若しくはAlexa488で予め直接標識された抗AE5抗体(Alexa488標識抗AE5抗体)を使用した。なお、抗AE5抗体へのAlexa488の標識は、Monoclonal antibody labeling kit(Invitrogen社製、製品番号:A20181)を用いて行った。
具体的には、作成した細胞シート(メンブレンから剥がしたもの、若しくはメンブレンがそのままついたまま)をPBS(−)もしくはトリス緩衝液(TBS)にて洗浄し、100%冷メタノールで10分間固定した後、PBS(−)若しくはトリス緩衝液(TBS)にて洗浄した。次いで、未標識の抗AE5抗体若しくはAlexa488標識抗AE5抗体を添加し、40〜60分間室温で反応させた(染色バッファー:0.3% tritonX−100、5% donkey血清(シグマ社製、製品番号:D9663)を含有させたTBS)。未標識の抗AE5抗体を使用した場合には、反応後に洗浄した後、2次抗体としてAleaxa488ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体を加え、20〜30分間室温で反応させた(染色バッファーは前記と同様。)。洗浄後、DAPI(5μg/mL)溶液を加え、5分室温で反応させた。Aleaxa488標識抗AE5抗体を使用した場合には、反応後に洗浄した後、DAPI(5μg/mL)溶液を加え、5分室温で反応させた。反応終了後、洗浄することにより、細胞核とAE5を蛍光標識した角膜移植用積層構造体を得た。
角膜移植用積層構造体の細胞核とMUC16を蛍光標識し、本発明の評価方法により、評価した。
まず、角膜移植用積層構造体の細胞核とMUC16を蛍光標識した。MUC16の蛍光標識には、未標識の抗MUC16抗体(Abcam社製、製品番号:ab693)、若しくはAlexa555で予め直接標識された抗MUC16抗体(Alexa555標識抗MUC16抗体)を使用した。なお、抗MUC16抗体へのAlexa555の標識は、ZenonIgG1ラベリングキット(Invitrogen社製、製品番号:Z25060)を用いて行った。
具体的には、未標識の抗AE抗体、Aleaxa488標識抗AE5抗体、及びAleaxa488ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体に代えて、未標識の抗MUC16抗体、Alexa555標識抗MUC16抗体、及びAleaxa555ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体を用いた以外は、実施例1と同様にして、角膜移植用積層構造体の細胞核とMUC16を蛍光標識した。
角膜移植用積層構造体の細胞核とZO−1を蛍光標識し、本発明の評価方法により、評価した。
まず、角膜移植用積層構造体の細胞核とZO−1を蛍光標識した。ZO−1の蛍光標識には、未標識の抗ZO−1抗体(Invitrogen社製、製品番号:339100)、若しくはビオチンで予め直接標識された抗ZO−1抗体(ビオチン標識抗ZO−1抗体)を使用した。なお、抗ZO−1抗体へのビオチンの標識は、Biotin Labeling kit−SH(Dojindo社製)を用いて行った。
具体的には、作成した細胞シート(メンブレンから剥がしたもの、若しくはメンブレンがそのままついたまま)をPBS(−)もしくはトリス緩衝液(TBS)にて洗浄し、100%冷メタノールで10分間固定した後、PBS(−)若しくはトリス緩衝液(TBS)にて洗浄した。次いで、未標識の抗ZO−1抗体若しくはビオチン標識抗ZO−1抗体を添加し、40〜60分間室温で反応させた(染色バッファー:0.3% tritonX−100、5% donkey血清(シグマ社製、製品番号:D9663)を含有させたTBS)。未標識の抗ZO−1抗体を使用した場合には、反応後に洗浄した後、2次抗体として、Aleaxa555ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体を加え、20〜30分間室温で反応させた(染色バッファーは前記と同様。)。一方で、ビオチン標識抗ZO−1抗体を使用した場合には、反応後に洗浄した後、Aleaxa555標識ストレプトアビジンを加え、20〜30分間室温で反応させた(染色バッファーは前記と同様。)。反応終了後、洗浄することにより、細胞核とZO−1を蛍光標識した角膜移植用積層構造体を得た。
角膜移植用積層構造体の細胞核とpanCKを蛍光標識し、本発明の評価方法により、評価した。
まず、角膜移植用積層構造体の細胞核とpanCKを蛍光標識した。panCKの蛍光標識には、未標識の抗panCK抗体(Progen社製、製品番号:61006)、若しくはビオチンで予め直接標識された抗panCK抗体(ビオチン標識抗panCK抗体)を使用した。なお、抗panCK抗体へのビオチンの標識は、Biotin Labeling kit−SH(Dojindo社製)を用いて行った。
具体的には、未標識の抗ZO−1抗体及びビオチン標識抗ZO−1抗体に代えて、未標識の抗MpanCK抗体及びAlexa555標識抗panCK抗体を用いた以外は、実施例3と同様にして、角膜移植用積層構造体の細胞核とpanCKを蛍光標識した。
上皮系幹細胞の培養を10%FBS含有D’MEM培地を用いて行った以外は実施例4で用いた角膜移植用積層構造体と同様の手法で作製した角膜移植用積層構造体について、実施例4と同様にして、細胞核とpanCKを蛍光標識し、蛍光標識された角膜移植用積層構造体の細胞核標識画像とpanCK標識画像を撮像し、得られた平面画像データを重ね合わせて立体断層画像を構築した。図16に、構築された立体断層画像、及びその底面に垂直な断面図を示す。図16(A)は細胞核標識画像とpanCK標識画像の重ね合わせ画像であり、図16(B)は細胞核標識画像であり、図16(C)はpanCK標識画像である。また、図16(D)は、細胞核標識画像とpanCK標識画像の重ね合わせ画像の底面に垂直な断面図である。この結果、panCKは、立体断層画像の上方にしか発現していなかった。
角膜移植用積層構造体の細胞核とp63を蛍光標識し、本発明の評価方法により、評価した。
まず、角膜移植用積層構造体の細胞核とp63を蛍光標識した。p63の蛍光標識には、未標識の抗p63抗体(LIFESPAN社製、製品番号:LS−C118547)若しくは同じく未標識の抗p63抗体(Santacruz社製、製品番号:sc−8431)を使用した。
具体的には、未標識の抗AE抗体及びAleaxa488ヤギ抗マウスIgG(H+L)抗体に代えて、未標識の抗p63抗体及びAlexa555ヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体を用いた以外は、実施例1と同様にして、角膜移植用積層構造体の細胞核とp63を蛍光標識した。
実施例6において構築された立体断層画像を目視により、比較的小さな細胞群が存在する下方の細胞領域と、下方の細胞領域よりは比較的大きな細胞群が存在する中間の細胞領域と、扁平で大きな細胞群が存在する上方の細胞領域との3つに分割し、細胞領域ごとに1の平面スタック画像を実施例1と同様にして作製した。図22に、得られた平面スタック画像の細胞核標識画像を示す。図22中、「Lower」は下方の細胞領域から作製された平面スタック画像であり、「Mid」は中間の細胞領域から作製された平面スタック画像であり、「Upper」は上方の細胞領域から作製された平面スタック画像である。
Claims (27)
- (a)少なくとも1層が細胞層である積層構造体中の細胞核及びその他の1種以上の生体分子を、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c)前記工程(b)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d)前記工程(c)により構築された立体断層画像から、1又は2以上の細胞領域を分割する工程と、
(e)前記工程(d)の後、分割された細胞領域ごとに、当該領域に含まれる全ての平面断層蛍光染色画像を合算することにより、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f)前記工程(e)により作製された前記1の平面スタック画像に対して画像解析を行い、当該積層構造体中の細胞を解析する工程と、
を有し、
前記工程(d)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層以上の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であることを特徴とする、積層構造体中の細胞の画像解析方法。 - 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなり、底面に平行な細胞領域を、細胞核が存在していない底面に平行な断面に対して細胞核標識画像内の前記特定の種類の細胞の総輝度値が所定量増大する断面に基づいて決定することを特徴とする請求項1に記載の積層構造中の細胞の画像解析方法。
- 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなる細胞領域を、
(i−1)前記特定の種類の細胞の細胞核が存在していない断面を特定する無細胞断面として特定する工程と、
(ii−1)細胞核標識画像の1画像あたりの前記特定の種類の細胞の総輝度値が、当該無細胞断面よりも所定量増大している断面を細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii−1)前記細胞底面基準断面に対して所定の高さ範囲を、前記特定の種類の細胞を含む細胞層からなる細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする請求項1に記載の積層構造中の細胞の画像解析方法。 - 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなる細胞領域を、
(i)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記特定の種類の細胞の細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、細胞核標識画像の1画像当たりの前記特定の種類の細胞の総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii)前記細胞底面基準断面よりも前記積層構造体の高さ方向で5〜10μm下の断面から、前記積層構造体の高さ方向で15〜25μm上の断面までの領域を、前記特定の種類の細胞を含む細胞層からなる細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする請求項1に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。 - 前記工程(d)において、決定される細胞領域のうち、特定の種類の細胞を含む1の細胞層からなる細胞領域を、
(i)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記特定の種類の細胞の細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、細胞核標識画像の1画像当たりの前記特定の種類の細胞の総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii−2)前記細胞底面基準断面に最も近い断面であって、当該細胞底面基準断面よりも上側の細胞核が存在しない断面から、当該細胞核底面基準断面よりも下側の細胞核が存在しない断面までの領域を、前記特定の種類の細胞を含む細胞層からなる細胞領域として決定する工程と
により決定することを特徴とする請求項1に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。 - 前記特定の種類の細胞が幹細胞であることを特徴とする請求項2〜5のいずれか一項に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記細胞領域が、細胞核領域であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- (a)少なくとも1層が細胞層である積層構造体中の細胞核及びその他の1種以上の生体分子を、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b)前記工程(a)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c)前記工程(b)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d)前記工程(c)により構築された立体断層画像から、1又は2以上の細胞領域を分割する工程と、
(e)前記工程(d)の後、分割された細胞領域ごとに、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f)前記工程(e)により作製された各平面スタック画像に対して画像解析を行い、当該積層構造体中の細胞を解析する工程と、
を有し、
前記工程(d)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層以上の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であり、
前記積層構造体が、角膜上皮幹細胞又は口腔粘膜幹細胞を培養して形成されたことを特徴とする、積層構造体中の細胞の画像解析方法。 - 前記積層構造体は、角膜上皮幹細胞又は口腔粘膜幹細胞が分化した細胞を含むことを特徴とする請求項8に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記積層構造体が、第一の種類の細胞を含む第一の細胞層を有し、前記第一の細胞層の上方に、前記第一の種類とは異なる第二の種類の細胞を含む第二の細胞層を有することを特徴とする請求項1〜9のいずれか一項に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記工程(a)において、細胞核に加えて、前記第一の種類の細胞において前記第二の種類の細胞よりも多く発現している生体分子及び前記第二の種類の細胞において前記第一の種類の細胞よりも多く発現している生体分子からなる群より選択される1種以上の生体分子を蛍光標識することを特徴とする請求項10に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記第一の種類の細胞が幹細胞であり、前記第二の種類の細胞が、前記幹細胞が分化した細胞であることを特徴とする請求項10又は11に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記工程(d)において、前記第一の細胞層からなる細胞領域と、前記第二の細胞層からなる細胞領域とを分割することを特徴とする請求項10〜12のいずれか一項に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記工程(f)における画像解析が、各平面スタック画像の画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素からなる領域の形状からなる群より選択される1以上の解析であることを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 前記工程(f)における画像解析が、各平面スタック画像中の細胞核の大きさに基づいて、当該平面スタック画像中の細胞が、幹細胞か、幹細胞が分化した細胞なのかの解析を行うことを特徴とする請求項1〜14に記載の積層構造体中の細胞の画像解析方法。
- 上皮系幹細胞を培養して形成され、かつ角膜移植に用いられる積層構造体に対して、
(a’)前記積層構造体中の細胞核と、上皮系幹細胞に特異的な生体分子、分化後の上皮系細胞又はその周辺組織に特異的な生体分子、並びに上皮系幹細胞及び分化後の上皮系細胞の両方に存在する生体分子からなる群より選択される1種以上の生体分子とを、それぞれ蛍光標識する工程と、
(b’)前記工程(a’)の後、前記積層構造体に対して、高さ方向の異なる複数枚の平面断層蛍光標識画像を、蛍光標識された生体分子の種類ごとにそれぞれ取得する工程と、
(c’)前記工程(b’)により取得された平面断層蛍光染色画像群を重ね合わせることにより、立体断層画像を構築する工程と、
(d’)前記工程(c’)により構築された立体断層画像から、上皮系幹細胞を含む細胞層からなる下部細胞領域と、前記下部細胞領域の上方に隣接する上部細胞領域とを分割する工程と、
(e’)前記工程(d’)の後、分割された領域ごとに、1の平面スタック画像を作製する工程と、
(f’)前記工程(e’)により作製された各平面スタック画像に対して画像解析を行い、得られた解析結果に基づき、前記積層構造体を評価する工程と、
を有し、
前記工程(d’)において分割される細胞領域は、立体断層画像中の、1層又は2層の細胞層を含み、かつ底面に平行な領域であることを特徴とする、角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(d’)において、前記下部細胞領域を、
(i’)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、無細胞断面として特定する工程と、
(ii’)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、前記無細胞断面よりも上側に存在し、かつ前記細胞核標識画像の1画像当たりの総輝度値が、当該無細胞断面よりも10〜50%増大している断面であって、当該無細胞断面に最も近い断面を、幹細胞底面基準断面として特定する工程と、
(iii’)前記幹細胞底面基準断面よりも前記積層構造体の高さ方向で5〜10μm下の断面から、前記積層構造体の高さ方向で15〜25μm上の断面までの領域を、前記下部細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする請求項16に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(d’)において、前記上部細胞領域と前記下部細胞領域とを、
(i”−1)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も低い断面を、下側の無細胞断面として特定する工程と、
(i”−2)前記立体断層画像の底面に平行な断面のうち、細胞核が存在していない断面であって、前記積層構造体の底面からの高さが最も高い断面を、上側の無細胞断面として特定する工程と、
(iii”)前記下側の無細胞断面と前記上側の無細胞断面の両方から等距離にある断面を境界面とし、前記下側の無細胞断面から前記境界面までの領域を下部細胞領域として決定し、前記境界面から前記上側の無細胞断面までの領域を上部細胞領域として決定する工程と、
により決定することを特徴とする請求項16に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(a’)において、細胞核と、サイトケラチン、ムチン、上皮細胞のタイトジャンクションを構成する生体分子、及びp63からなる群より選択される1種以上の生体分子とを蛍光標識することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。
- 前記工程(a’)において、細胞核と、AE5、MUC16、ZO−1、panCK、及びp63からなる群より選択される1種以上の生体分子とを蛍光標識することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。
- 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びAE5を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、上部細胞領域から作製された平面スタック画像のAE5の蛍光標識画像における画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のAE5の蛍光標識画像よりも大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びMUC16を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、上部細胞領域から作製された平面スタック画像のMUC16の蛍光標識画像における画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のMUC16の蛍光標識画像よりも大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びZO−1を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、上部細胞領域から作製された平面スタック画像のZO−1の蛍光標識画像における画素当たりの平均輝度値、全画素の輝度値の総和、及び1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素の総面積が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のZO−1の蛍光標識画像よりも大きく、かつ上部細胞領域から作製された平面スタック画像のZO−1の蛍光標識画像における1画素当たりの輝度値が閾値以上である画素からなる領域が網目構造の形状である場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(a’)において、少なくとも細胞核及びp63を蛍光標識し、
前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像のp63の標識画像中の各細胞核領域における画素当たりの平均輝度値が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のp63の蛍光標識画像よりも大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像中に存在する全細胞核領域に対する、面積が閾値以上の大きさである細胞核領域の割合が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像よりも多い場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像中に存在する細胞核領域の面積の平均値が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像中に存在する細胞核領域の面積の平均値よりも3倍以上大きい場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項16〜18のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。 - 前記工程(a’)において、さらにpanCKを蛍光標識し、
前記工程(f’)において、
工程(e’)により作製された各平面スタック画像について、細胞核の標識画像に基づき、細胞核領域を決定し、
さらに各細胞核領域の外周部分を内周とするドーナツ型の領域であって、ドーナツ型の幅が等間隔である領域を、細胞質領域として決定し、
上部細胞領域から作製された平面スタック画像のpanCKの標識画像中の各細胞質領域における画素当たりの平均輝度値が、下部細胞領域から作製された平面スタック画像のpanCKの蛍光標識画像と同程度である場合に、前記積層構造体が角膜移植用として適していると評価することを特徴とする請求項19〜26のいずれか一項に記載の角膜移植用積層構造体の評価方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013184380A JP6362311B2 (ja) | 2012-09-06 | 2013-09-05 | 積層構造体中の細胞の画像解析方法、及び角膜移植用積層構造体の評価方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012195938 | 2012-09-06 | ||
JP2012195938 | 2012-09-06 | ||
JP2013184380A JP6362311B2 (ja) | 2012-09-06 | 2013-09-05 | 積層構造体中の細胞の画像解析方法、及び角膜移植用積層構造体の評価方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014066702A JP2014066702A (ja) | 2014-04-17 |
JP6362311B2 true JP6362311B2 (ja) | 2018-07-25 |
Family
ID=50188087
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013184380A Active JP6362311B2 (ja) | 2012-09-06 | 2013-09-05 | 積層構造体中の細胞の画像解析方法、及び角膜移植用積層構造体の評価方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9086378B2 (ja) |
JP (1) | JP6362311B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9086378B2 (en) * | 2012-09-06 | 2015-07-21 | Olympus Corporation | Method of analyzing image of cell in laminated structure and method of evaluating laminated structure for corneal transplantation |
CN104732230A (zh) * | 2015-03-27 | 2015-06-24 | 麦克奥迪(厦门)医疗诊断***有限公司 | 一种基于细胞核统计信息的病理图像局部特征提取方法 |
CN109196112B (zh) | 2016-06-16 | 2022-10-04 | 株式会社日立高新技术 | 球状体内部细胞状态的分析方法 |
JP7109730B2 (ja) * | 2018-05-17 | 2022-08-01 | 株式会社エビデント | 細胞集塊の細胞増殖能評価方法 |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09281405A (ja) | 1996-04-17 | 1997-10-31 | Olympus Optical Co Ltd | 顕微鏡システム |
US6986993B1 (en) * | 1999-08-05 | 2006-01-17 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
US6716588B2 (en) * | 1999-12-09 | 2004-04-06 | Cellomics, Inc. | System for cell-based screening |
US7383076B2 (en) * | 2000-11-27 | 2008-06-03 | The General Hospital Corporation | Fluorescence-mediated molecular tomography |
US7515953B2 (en) * | 2002-08-01 | 2009-04-07 | The Johns Hopkins University | Techniques for identifying molecular structures and treating cell types lining a body lumen using fluorescence |
US7186554B2 (en) * | 2003-01-28 | 2007-03-06 | Stanford University | Methods and compositions for human bladder epithelial cell culture |
US7711174B2 (en) * | 2004-05-13 | 2010-05-04 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Methods and systems for imaging cells |
JP4709604B2 (ja) * | 2004-08-03 | 2011-06-22 | 株式会社東芝 | 画像表示装置、画像表示方法、記憶媒体及びプログラム |
US7729750B2 (en) * | 2005-01-20 | 2010-06-01 | The Regents Of The University Of California | Method and apparatus for high resolution spatially modulated fluorescence imaging and tomography |
US20070031819A1 (en) * | 2005-04-26 | 2007-02-08 | University Of Washington | Microfluidic systems for biological and molecular analysis and methods thereof |
JP2006343573A (ja) | 2005-06-09 | 2006-12-21 | Olympus Corp | 顕微鏡システム、観察方法および観察プログラム |
US8314406B2 (en) * | 2007-04-06 | 2012-11-20 | The General Hospital Corporation | Systems and methods for optical imaging using early arriving photons |
US20100285577A1 (en) * | 2007-08-07 | 2010-11-11 | Fariborz Izadyar | Isolation, Characterization and Propagation of Germline Stem Cells |
US8509879B2 (en) * | 2007-11-06 | 2013-08-13 | The Regents Of The University Of California | Apparatus and method for widefield functional imaging (WiFI) using integrated structured illumination and laser speckle imaging |
JP4558047B2 (ja) | 2008-01-23 | 2010-10-06 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡システム、画像生成方法、及びプログラム |
JP5523791B2 (ja) * | 2008-10-27 | 2014-06-18 | 株式会社東芝 | X線診断装置および画像処理装置 |
JP4997255B2 (ja) * | 2009-01-05 | 2012-08-08 | オリンパス株式会社 | 細胞画像解析装置 |
WO2010101225A1 (ja) * | 2009-03-04 | 2010-09-10 | 学校法人 東京女子医科大学 | 細胞シートを利用した細胞評価システム及びその利用方法 |
TWI406181B (zh) * | 2009-05-11 | 2013-08-21 | Nat Univ Tsing Hua | 一種建構和搜尋三維影像資料庫之方法 |
JP5513038B2 (ja) * | 2009-08-21 | 2014-06-04 | オリンパス株式会社 | 三次元細胞画像解析装置 |
JP5482057B2 (ja) | 2009-09-29 | 2014-04-23 | オリンパス株式会社 | 細胞核を構成する構造体の解析方法 |
WO2011118655A1 (ja) * | 2010-03-23 | 2011-09-29 | オリンパス株式会社 | 幹細胞の分化状態をモニタリングする方法 |
JP5566751B2 (ja) * | 2010-03-31 | 2014-08-06 | 富士フイルム株式会社 | 光断層情報生成装置、光強度分布算出方法および光強度分布算出プログラム |
JP2011214942A (ja) * | 2010-03-31 | 2011-10-27 | Fujifilm Corp | 光断層計測装置 |
JPWO2012008368A1 (ja) * | 2010-07-16 | 2013-09-09 | 株式会社日立製作所 | 細胞培養容器、および細胞培養装置 |
US9086378B2 (en) * | 2012-09-06 | 2015-07-21 | Olympus Corporation | Method of analyzing image of cell in laminated structure and method of evaluating laminated structure for corneal transplantation |
-
2013
- 2013-09-05 US US14/019,363 patent/US9086378B2/en active Active
- 2013-09-05 JP JP2013184380A patent/JP6362311B2/ja active Active
-
2015
- 2015-06-12 US US14/738,379 patent/US9423352B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20150276603A1 (en) | 2015-10-01 |
US9086378B2 (en) | 2015-07-21 |
US9423352B2 (en) | 2016-08-23 |
JP2014066702A (ja) | 2014-04-17 |
US20140065639A1 (en) | 2014-03-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Franco‐Barraza et al. | Preparation of extracellular matrices produced by cultured and primary fibroblasts | |
JP6362311B2 (ja) | 積層構造体中の細胞の画像解析方法、及び角膜移植用積層構造体の評価方法 | |
Oliver et al. | A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche | |
Di Iorio et al. | Q‐FIHC: Quantification of fluorescence immunohistochemistry to analyse p63 isoforms and cell cycle phases in human limbal stem cells | |
US20130078667A1 (en) | Methods for detecting and collecting circulating tumor cells | |
Elia et al. | Culturing MDCK cells in three dimensions for analyzing intracellular dynamics | |
CA2818699C (en) | Method for identifcation and culture of multipotent mesenchymal stem cells with high proliferation potential | |
Altay et al. | Imaging the cell morphological response to 3D topography and curvature in engineered intestinal tissues | |
Harris et al. | Imaging of neutral lipids and neutral lipid associated proteins | |
Shibata et al. | Large-area fluorescence and electron microscopic correlative imaging with multibeam scanning electron microscopy | |
Bayerl et al. | Guidelines for visualization and analysis of DC in tissues using multiparameter fluorescence microscopy imaging methods | |
Schoumacher et al. | Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay | |
Choi et al. | Three‐dimensional image cytometer based on widefield structured light microscopy and high‐speed remote depth scanning | |
D’Imprima et al. | Light and electron microscopy continuum-resolution imaging of 3D cell cultures | |
JP2012223104A (ja) | 誘導多能性幹細胞の識別方法 | |
Araújo et al. | Time-lapse imaging and morphometric analysis of tracheal development in drosophila | |
Al-Rekabi et al. | Uncovering the cytotoxic effects of air pollution with multi-modal imaging of in vitro respiratory models | |
Allocca et al. | Confocal/two-photon microscopy in studying colonisation of cancer cells in bone using xenograft mouse models | |
Debeir et al. | Models of cancer cell migration and cellular imaging and analysis | |
Nowotarski et al. | Automated platform for cell selection and separation based on four-dimensional motility and matrix degradation | |
Morris | Computational and image analysis techniques for quantitative evaluation of striated muscle tissue architecture | |
Poobalasingam et al. | Imaging the lung: the old ways and the new | |
Ferkowicz et al. | Whole embryo imaging of hematopoietic cell emergence and migration | |
Rehfeld et al. | Histological methods | |
EP2607898A1 (en) | Method for evaluating graft |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160822 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170719 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170829 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171019 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171226 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180605 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180626 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6362311 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |