JP6359921B2 - 肺高血圧症治療薬およびそのスクリーニング方法 - Google Patents
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Landscapes
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Description
[1]IL−21(インターロイキン−21)からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする肺高血圧症の予防および/または治療用医薬。
[2]IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質が、IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質である前記[1]に記載の医薬。
[3]IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質が、抗IL−21抗体、抗IL−21受容体抗体、IL−21と結合するペプチドおよびIL−21受容体と結合するペプチドからなる群から選択される一種である前記[2]に記載の医薬。
[4]IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質が、抗IL−21抗体である前記[3]に記載の医薬。
[5]IL−21およびIL−21受容体を用いることを特徴とする肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法。
[6]IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする前記[5]に記載の方法。
[7]IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする前記[5]に記載の方法。
[8]被験物質とIL−21とIL−21受容体を発現する細胞を接触させる工程と、IL−21受容体の下流のシグナル量を測定する工程と、被験物質を接触させない場合の前記細胞におけるシグナル量と比較して、シグナル量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記[6]に記載の方法。
[9]被験物質とIL−21とIL−21受容体を接触させる工程と、IL−21とIL−21受容体との結合レベルを測定する工程と、被験物質を接触させない場合の結合レベルと比較して、結合レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記[7]に記載の方法。
本発明は、IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする肺高血圧症の予防および/または治療用医薬を提供する。本発明の医薬の有効成分は、IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質であればどのような物質でもよく、特に限定されないが、IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質であることが好ましい。IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質としては、例えば、抗IL−21抗体、抗IL−21受容体抗体、IL−21と結合するペプチド、IL−21受容体と結合するペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらの抗体またはペプチドは、IL−21またはIL−21受容体と結合することにより、IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害することができる抗体(中和抗体)またはペプチドであることが好ましい。IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害することができる抗体またはペプチドは、IL−21からのシグナル伝達を阻害することができ、肺高血圧症の病態形成を抑制することができる。
本発明の医薬の投与量は、目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約65〜70kgの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、1日当たり0.02mg〜4000mg程度が好ましく、0.1mg〜200mg程度がより好ましい。1日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
本発明は、肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、IL−21およびIL−21受容体を用いることを特徴とする。本発明のスクリーニング方法で用いるIL−21およびIL−21受容体は、全長タンパク質でもよく、機能断片でもよい。本発明のスクリーニング方法に用いるIL−21およびIL−21受容体は、どのような動物由来のIL−21でもよいが、哺乳動物のIL−21であることが好ましく、ヒトのIL−21であることがより好ましい。IL−21およびIL−21受容体またはこれらのフラグメントは、上述の方法で作製することができる。
(1)実験動物
全ての実験は8週齢の雄マウスを使用して行った。IL−21受容体欠損(IL−21RKO)マウスを用いた実験以外の実験には、C57BL/6マウス(日本SLCから購入)を用いた。IL−21RKO)マウスは米国NIHのWarren J. Leonard博士から供与を受けた。IL−21RKOマウスの遺伝子バックグラウンドはC57BL/6である。
全てのマウスは明暗12時間/12時間サイクルで24±1℃に調節した飼育室に収容し、標準的マウス飼料と水を自由に摂取させた。低酸素負荷をする際には、マウスを10%酸素の低酸素チェンバー内に4週間収容した。ただし、低酸素チェンバー内の掃除のために週2回各5分間、マウスをチェンバー外(正常酸素環境)に置いた。低酸素チェンバーへ低酸素ガスを流量1L/分で持続的に供給した。実験では、低酸素コントロール抗体投与群および低酸素中和抗体投与群、ならびに正常酸素コントロール抗体投与群を設けた。1群の匹数は8〜12匹とした。低酸素曝露後、マウスの血行動態測定を行った後にマウスを安楽死させ、心臓と肺を摘出して臓器重量を測定し、病理学的解析に供した。
(2−1)抗IL−6受容体中和抗体
抗IL−6受容体中和抗体(MR16−1)は、中外製薬株式会社から供与された。MR16−1は、マウスIL−6受容体に対するラットモノクローナルIgG1抗体である。MR16−1によるIL−6シグナル阻害効果を検討するために、最初にMR16−1またはコントロール抗体(purified rat non-immune isotype IgG; MP Biomedicals)2mgを、それぞれ低酸素または正常酸素負荷の直前に静脈内投与し、その後は1週間に1回0.5mgのMR16−1またはコントロール抗体を腹腔内投与した(図4参照)。
IL−17中和抗体は、ラット抗マウスIL−17モノクローナル抗体(MAB421;R&D systems)を購入して使用した。抗IL−17中和抗体またはコントロールIgG0.2mgを、それぞれ低酸素または正常酸素の負荷1日前から負荷後4日目まで毎日、その後は負荷後7,10,13,16,19,22,25,28日目に腹腔内投与した(図16参照)。
IL−21中和抗体は、市販のラット抗マウスIL−21モノクローナル抗体(FFA21, eBioscience)を購入して使用した。抗IL−21中和抗体またはアイソタイプコントロール抗体100μgを、それぞれ低酸素または正常酸素の負荷1日前、負荷当日、負荷後1,2,3,4日目に腹腔内投与した。
ペントバルビタールナトリウム(60 mg/kg 腹腔内投与)と鎮痛薬の酒石酸ブトルファノール(0.1-0.4 mg/kg腹腔内投与)でマウスを麻酔した。さらに、ペントバルビタールナトリウム(15-20 mg/kg/h 腹腔内投与)と酒石酸ブトルファノール(0.03-0.05 mg/kg/h 腹腔内投与)を手術レベルの麻酔深度を維持するために定期的に追加投与した。直腸温モニターと連動したサーモスタット制御のヒートパッドを用いて、血行動態測定中のマウスの体温を37〜38℃に維持した。気管にカニュレーションを挿入し、マウス用の人工呼吸器(Minivent type 845; Harvard apparatus)を用いて肺を換気した。吸気ガスは高濃度酸素に調整され、人工呼吸器を1回換気量6μL/g、頻度170〜190/分に設定した。
凍結したマウス肺を溶解用緩衝液(50 mM HEPES, 100 mM sodium fluoride, 2 mM sodium orthovanadate, 4 mM EDTA, 1% Tween-20, 0.1% SDS, プロテアーゼ阻害薬カクテルComplete (Roche Applied Science))中で、ポリトロンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。遠心分離により固形物を除去し、肺の溶解液を定法に従いSDS−PAGEに供した。ブロットはECLシステム(GEヘルスケア)を用いて発色させた。ウエスタンブロット解析では以下の抗体を使用した。抗P−STAT3−Tyr705抗体(CloneD3A7, Cell Signaling Technology)、抗STAT3抗体(Clone 79D7, Cell Signaling Technology)、抗F4/80抗体(MCA497GA, AbD Serotec)、抗RELM alpha (Fizz1)抗体(ab39626, Abcam)、抗IL−17抗体(sc-52567, Santa Cruz)および抗IL−21抗体(MAB594, R&D Systems)。また、抗β−tubulin抗体(T5201, Sigma-Aldrich)によるウエスタンブロットを内部コントロールとして用いた。
気管支肺胞洗浄液(BALF)は、0.9mLのPBSを3回気管支内に滴下して取得し、塊状の上皮細胞を除去するために40μmのセルストレーナーでろ過した。細胞培養実験のために、BALFから初代マウス肺胞マクロファージを得た。2%ウシ胎仔血清(FBS)含有DMEMを用いて、マクロファージを含む回収細胞を培養した。細胞を24ウェル細胞培養プレートに1.5×105個/ウェルで播種し、10%FBS、2mM L−グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むDMEMで培養した。37℃で4時間培養した後、血清を含有しないDMEMに培地交換し、種々のサイトカインによる刺激試験に供した。血清を含まない培地で一夜培養した後、組換えマウスIL−21(20ng/mL)、IL−6(20ng/mL)、可溶性IL−16受容体(sIL6R、20ng/mL)(R&D systems)で18時間刺激した。
血行動態測定後、マウスを過麻酔により安楽死させ、心臓を摘出した。心房を取り除き、右心室(RV)壁を左心室(LV)と中隔(septum)から分離した。水分を吸い取ったうえで組織重量を測定し、100gの体重換算で標準化した。RVと(LV+septum)との重量比(フルトン係数)を、右室肥大の指標として用いた。
肺は、組織学的および免疫組織化学的な解析のために回収した。肺動脈と気管は、それぞれ4%パラフォルムアルデヒド(PFA)を定圧で(肺動脈は100cmH2O、気管は25cmH2O)潅流して、肺血管と気道を完全に拡張した状態で固定した。切除した肺は4%PFAにて4℃で一夜固定し、パラフィン包埋して4μmで切片化した。肺血管の形態解析のために、切片にエラスチカ・ワンギーソン染色を施した。動脈の画像はBZ−9000顕微鏡(Keyence)で撮像した。各処置群でランダムに選んだ5〜6匹の動物の肺切片を用いて形態解析を行った。肺血管リモデリングは肺実質にある肺動脈、終末細気管支レベルにある小動脈(small artery)、肺細葉レベルにある細小動脈(arteriole)で中膜肥厚係数(% wall thickness)を測定して検討した。中膜肥厚係数は、内弾性板と外弾性板の間の距離を2倍して、外弾性板間の距離(血管の直径)で除したものに100を乗じたものと定義される。一層の弾性板しかない血管では、弾性板と内皮下の基底膜との間の距離を計測した。中膜肥厚は、切り口がほぼ円形の血管のみを対象に解析した。肺動脈の直径はNIH Image Jソフトウェアを用いて測定した。中膜肥厚係数は1匹のマウスあたり少なくとも10の肺小動脈と肺細小動脈で計算した。
免疫組織化学解析に用いるサンプルは4%PFA/PBSで1時間固定した後、5〜20%のスクロース入りPBSで置換してから、OCTコンパウンド(Sakura)で包埋して凍結し、10μm厚で切片化した。凍結切片はPBS処理してから、1%過酸化水素水/メタノールで30分処理し、PBST(PBS/0.1%Triton-X100)中に1%ウシ血清アルブミン(BSA)または5%スキムミルクを含むブロッキング溶液で1時間インキュベートし、PBST中の1次抗体で4℃一晩インキュベートした。1次抗体には、抗CD68抗体(1:200希釈; MCA1957GA, AbD Serotec)、抗RELM alpha(Fizz1)抗体(1:100希釈; ab39626, Abcam)、抗IL−6抗体(1:200希釈; ab6672, Abcam)、抗phospho−Histone−H3抗体(Ser10)(1:100希釈; 06-570, Upstate)、抗Actin, alpha−Smooth Muscle−Cy3抗体(1:200希釈; C6198, Sigma-Aldrich)を用いた。次に、PBSTで切片を洗浄し、蛍光標識2次抗体(1:200希釈; Alexa Fluor 488- or 546-結合; Invitrogen)またはHRP標識2次抗体(1:200希釈; 7074, Cell Signaling Technology)で室温1時間インキュベートした。必要に応じてPBSTで洗浄後、DAB(Sigma)を用いて発色させた。染色像はBZ−9000蛍光顕微鏡(Keyence)で撮像した。
マウスの肺組織をコラゲナーゼおよびDNaseI(1U/mL;Takara)含有DMEM中に直接浸漬し、で37℃40分〜1時間インキュベートした。組織懸濁液を40μmのメッシュに通し、ペレットをPBS−F(2%FBS入りPBS)で再懸濁して、PBS−Fで2回洗浄した。Fcγレセプターをブロックするために、CD16/32で細胞をプレインキュベートし、洗浄後、全量100μLのPBS−Fで蛍光標識した抗CD4抗体と30分間インキュベートした。
肺組織または肺胞マクロファージからTRIzol(Invitrogen)を用いてトータルRNAを抽出した。定量リアルタイムRT−PCRはQuantiFast SYBRGreen RT−PCRキット(Qiagen)を用いて行った。RT−PCR反応は、80ngのトータルRNAを10分間50℃で逆転写させ、95℃で5分間変性した後、95℃10秒間と60℃30秒間を40サイクル行った。蛍光データはABI PRISM 7900HTを用いて収集し、解析した。用いた遺伝子とそのプライマーは以下の通りである。
Gapdh: 5’- TCTCCACACCTATGGTGCAA -3’ (配列番号1)
5’- CAAGAAACAGGGGAGCTGAG -3’ (配列番号2)
Fizz1: 5’- CCCTTCTCATCTGCATCTCC -3’ (配列番号3)
5’- AGGAGGCCCATCTGTTCATA -3’ (配列番号4)
Arg1: 5’- GTGAAGAACCCACGGTCTGT -3’ (配列番号5)
5’- CTGGTTGTCAGGGGAGTGTT -3’ (配列番号6)
Chi3I3: 5’- CCCACCAGGAAAGTACACAG -3’ (配列番号7)
5’- GAGGGAAATGTCTCTGGTGA -3’ (配列番号8)
Mrc1: 5’- CGCGAGGCAATTTTTAATCT -3’ (配列番号9)
5’- ATTTGCATTGCCCAGTAAGG -3’ (配列番号10)
Cxcl12: 5’- GGTTCTTCGAGAGCCACATC -3’ (配列番号11)
5’- TAATTTCGGGTCAATGCACA -3’ (配列番号12)
Il17a: 5’- TCCAGAAGGCCCTCAGACTA -3’ (配列番号13)
5’- CTCGACCCTGAAAGTGAAGG -3’ (配列番号14)
Rorc: 5’- AACCAGGCATCCTGAACTTG -3’ (配列番号15)
5’- CGTAGAAGGTCCTCCAGTCG -3’ (配列番号16)
Il17ra: 5’- TGTACCTCGAGGGTGCAGA -3’ (配列番号17)
5’- GGCCAGGATCTACCACAAAG -3’ (配列番号18)
Cxcl1: 5’- GCCTATCGCCAATGAGCTG -3’ (配列番号19)
5’- TCTGAACCAAGGGAGCTTCA -3’ (配列番号20)
Cxcl5: 5’- CTGCCCCTTCCTCAGTCATA -3’ (配列番号21)
5’- TGGATCCAGACAGACCTCCT -3’ (配列番号22)
Il21: 5’- GGACAGTGGCCCATAAATCA -3’ (配列番号23)
5’- CAGGGTTTGATGGCTTGAGT -3’ (配列番号24)
Il21r: 5’- ATGCGCTTGTCTCAATTCCT -3’ (配列番号25)
5’- CACGTAGTTGGAGGGTTCGT -3’ (配列番号26)
Il6: 5’- TGTGCAATGGCAATTCTGAT -3’ (配列番号27)
5’- GGTACTCCAGAAGACCAGAGGA -3’(配列番号28)
Nos2: 5’- GCTCATGACATCGACCAGAA -3’ (配列番号29)
5’- TGTTGCATTGGAAGTGAAGC -3’ (配列番号30)
Il12b: 5’- AGGTCACACTGGACCAAAGG -3’ (配列番号31)
5’- AGGGTACTCCCAGCTGACCT -3’ (配列番号32)
Tnf-α: 5’- TGCCTATGTCTCAGCCTCTTC -3’,(配列番号33)
5’- GGTCTGGGCCATAGAACTGA -3’ (配列番号34)
ヒト肺動脈平滑筋細胞はLonza社から購入した。ヒト肺動脈平滑筋細胞は最初から6世代までのものを使用した。ヒト肺動脈平滑筋細胞を96ウェル細胞培養プレートに2×103個/100μL/ウェルで播種した。培地には、5%FBSおよびSingleQuotサプリメント(Lonza)を含むSmBM(Lonza)を用いた。アッセイの2日前に、0.1%FBS、10mM L−グルタミン、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを含むSmBMに培地交換した。
全てのデータは平均値±標準誤差で表した。多群間の差は一元配置分散分析法それに続くSheffe法を用いた事後比較により比較した。2群間の差の検定には、スチューデントt検定を用いた。P<0.05の場合に統計的有意差ありと判断した。
実験1:低酸素負荷によるC57BL6マウス肺でのIL−6発現動態の検討
C57BL/6マウスを低酸素チェンバー(10%酸素)内で飼育し、低酸素負荷後2、4、7、14および28日目のマウス肺からRNAを回収し、IL−6 mRNAの発現量を定量RT−PCRで解析した。IL−6 mRNAの発現量は低酸素負荷後2日目に負荷前の約8倍に増加したが、負荷後4日目には約5倍に下がり、負荷後7日目にはベースラインレベルに復帰した(図1)。
抗IL−6抗体による免疫組織化学染色によりIL−6の発現部位を検討すると、低酸素負荷後2日目のマウス肺の細動脈(arteriole)、小動脈(small artery)の内皮細胞(内膜)と平滑筋細胞(中膜)に発現が強く見られた(図2)。
IL−6シグナルは主に転写因子STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)により媒介されるため、低酸素負荷後2日目の肺におけるSTAT3活性化、すなわちSTAT3の705チロシン残基のリン酸化状態をウエスタンブロットにより検討した。低酸素コントロール抗体投与群では、正常酸素コントロール抗体投与群よりSTAT3チロシンリン酸化が亢進していたが、低酸素MR16−1投与群では、そのリン酸化が正常酸素コントロール抗体投与群と同レベルに抑制されていた(図3)。この結果から、抗IL−6受容体抗体投与により、マウス肺でのIL−6によるSTAT3活性化が効率的に抑制されることが示された。
低酸素負荷後の肺における炎症細胞の浸潤を検討する目的で、マクロファージに焦点を当てて、その動態を検討した。低酸素負荷後7日目の肺における、F4/80(マクロファージに限局して発現する糖たんぱく質)の発現を、ウエスタンブロットにより検討した結果を図6A、Bに示した。低酸素コントロール抗体投与群では正常酸素コントロール抗体投与群に比して有意に増加していたが、低酸素MR16−1投与群ではその増加が有意に抑制されていた。F4/80に対する免疫組織化学染色でもウエスタンブロットと同様の結果が得られた(図6C、D)。以上の結果より、抗IL−6受容体抗体投与によるIL−6シグナル阻害は、低酸素により誘導される肺へのマクロファージ浸潤を抑制することが示された。
マクロファージの極性形成にヘルパーT細胞が決定的な働きをすることが近年報告されている。そこで、低酸素負荷後3日目の肺組織でのTh1細胞、Th2細胞の動態に対して抗IL−6受容体抗体投与が影響を与えるかどうかを検討した。正常酸素コントロール投与群、低酸素コントロール投与群および低酸素MR16−1投与群のマウスから試験開始3日目に肺を摘出し、上記実験材料と方法(8)に記載の方法で実験を行った。
CD4陽性ヘルパーT細胞をTh1マーカーのインターフェロン−γ、Th2マーカーのIL−4でFACS展開して、コントロール抗体投与群とMR16−1投与群とで比較したが、有意な差を認めなかった(図11A〜C)。
IL−17シグナルの阻害が低酸素誘発性肺高血圧症の病態形成に与える影響を検討する目的で、C57BL/6マウスを低酸素チェンバーで飼育して、図16に示した実験プロトコールでコントロール抗体または抗IL−17A中和抗体を投与した。低酸素負荷後28日目に右心カテーテルによりマウスの右室収縮期圧(RVSP)を測定して、マウスの心臓を摘出してフルトン係数を測定した。RVSPおよびフルトン係数のどちらもコントロール抗体投与群と抗IL−17A中和抗体投与群との間に有意な差は観察されなかった(図17A、B)。なお、示してないが、コントロール抗体投与群と抗IL−17A中和抗体投与群とも、正常酸素コントロール抗体投与群と比較して有意な増加が観察され、低酸素誘発性PAHの病態が形成されていた。この結果より、IL−17シグナル阻害は低酸素誘発性PAHの病態形成を抑制し得ないことが明らかになった。
次に、Th17細胞が産生するTh17サイトカインの1つであるIL−21に焦点を当てて検討した。低酸素負荷後2、4、7、14、28日目の肺から回収したトータルRNAを用いて定量RT−PCRを行い、IL−21 mRNAの発現量を検討したところ、低酸素負荷後2日目に負荷前の約2倍に増加してピークを認め、負荷後7日目まで継続してその増加が観察されたが、14日目以降はベースラインに復帰した(図18)。
C57BL/6マウスから気管支肺胞洗浄で採取したマクロファージをin vitroで培養して、一晩血清除去した後にIL−21存在下で18時間培養してマクロファージマーカーの遺伝子発現を検討した。IL−21刺激によりM2マクロファージマーカー遺伝子であるFizz1、Arg1およびCxcl12のmRNA発現量が約2倍に増加した(図22A〜C)のに対して、M1マクロファージマーカー遺伝子であるNos2、IL−12βおよびTNF−αの発現量には、有意な変化が見認められなかった(図23A〜C)。
低酸素誘発性肺高血圧症モデルでは、低酸素によりマウス肺動脈の内皮細胞や平滑筋細胞でIL−6の発現が誘導され、その下流でTh17細胞からIL−21が分泌されることが肺高血圧症病態形成に決定的な役割をしていることが示唆された。そこで、我々は低酸素誘発性肺高血圧症モデルに対してコントロール抗体または抗IL−21中和抗体を投与して、マクロファージのM2極性形成と肺動脈平滑筋細胞の増殖に対する効果を検討した。
IL−21受容体遺伝子欠損(IL−21RKO)マウス(Ozaki et al., Science 298, 1630-1634, 2002)と野生型マウスを用いて、それぞれ低酸素誘発性肺高血圧症モデルを作製し、肺高血圧症病態形成に対するIL−21R遺伝子欠損の影響を検討した。低酸素負荷後28日目に右心カテーテルによりマウスのRVSPを測定し、その後マウスの心臓を摘出してフルトン係数を測定し、さらに肺組織をEVG染色して肺動脈の中膜肥厚係数を計測した。低酸素負荷した野生型マウスではRVSP、フルトン係数および中膜肥厚係数のいずれにおいても、正常酸素環の野生型マウスに比べて有意な増加が認められたが、低酸素負荷したIL−21RKOマウスでは、これらの増加が有意に抑制された(図29A〜C)。この結果から、IL−21シグナル阻害は低酸素誘発性高血圧症の病態形成過程を抑制し得ることが明らかになった。
Claims (9)
- IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質を有効成分とする肺高血圧症の予防および/または治療用医薬。
- IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質が、IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質である請求項1に記載の医薬。
- IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質が、抗IL−21抗体、抗IL−21受容体抗体、IL−21と結合するペプチドおよびIL−21受容体と結合するペプチドからなる群から選択される一種である請求項2に記載の医薬。
- IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質が、抗IL−21抗体である請求項3に記載の医薬。
- IL−21およびIL−21受容体を用いることを特徴とする肺高血圧症治療薬のスクリーニング方法。
- IL−21からのシグナル伝達を阻害する物質を選択することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- IL−21とIL−21受容体との相互作用を阻害する物質を選択することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 被験物質とIL−21とIL−21受容体を発現する細胞を接触させる工程と、IL−21受容体の下流のシグナル量を測定する工程と、被験物質を接触させない場合の前記細胞におけるシグナル量と比較して、シグナル量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする請求項6に記載の方法。
- 被験物質とIL−21とIL−21受容体を接触させる工程と、IL−21とIL−21受容体との結合レベルを測定する工程と、被験物質を接触させない場合の結合レベルと比較して、結合レベルを低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする請求項7に記載の方法。
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