JP6354100B2 - Cas9 mRNAを哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、Cas9タンパク質をコードするmRNA(Cas9 mRNA)を哺乳動物の受精卵にエレクトロポレーションにより導入する方法に関する。本発明は、また、上記方法を利用して、Cas9を発現する哺乳動物の受精卵を製造すること、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行うこと、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵を作製すること、または、遺伝子改変動物を作製することに関する。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)下式(A)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(A) Rmin=882/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)下式(A)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(A) Rmin=882/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAおよびさらなる核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、さらなる核酸分子は、crRNA(CRISPR RNA)およびtracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)の組合せまたはgRNAである、
(b)下式(A)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(A) Rmin=882/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAおよびさらなる核酸分子を含む溶液並びに受精卵の混合物を置くこと、ここで、さらなる核酸分子は、crRNAおよびtracrRNAの組合せまたはgRNAである、
(b)下式(A)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(A) Rmin=882/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む方法を提供する。
本発明で使用するエレクトロポレーターは、電気パルスの発生装置を意味し、本発明の段階(a)および(b)を実施できるものであればどのようなものでもよい。エレクトロポレーターは、例えば、BioRad社、BTX社、BEX社、Intracel社、Eppendorf社などから購入できる。
式(A) Rmin=882/c
本発明において、電圧を複数のパルスに分けてかける場合、各パルスの大きさは同じであっても、異なっていてもよい。
(c)下式(B)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(B) Rmin=441/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下、好ましくは540Vmsec以下であり、電圧は2回以上のパルスに分けてかけてもよい、
(d)式(B)により算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に段階(c)とは逆方向の電圧をかけること、ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下、好ましくは540Vmsec以下であり、電圧は2回以上のパルスに分けてかけてもよい、
の各段階を含み、
段階(c)および(d)で電圧を2回以上のパルスに分けてかける場合、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい。
段階(c)および(d)では、段階(b)に準じて、電圧および通電時間等の条件を決定し得る。
本発明において、「ゲノム編集」は、人工制限酵素を使用して哺乳動物細胞の1つまたはそれ以上の遺伝子を改変することを意味する。ゲノム編集により、対立遺伝子の一方または両方が改変される。本発明では、細菌由来のCRISPR/Cas系を使用してゲノム編集を行う。CRISPR/Cas系の詳細は、例えば、Wang, H. et al., Cell, 153, 910-918 (2013) および米国特許第8697359号に記載されており、これらの文献を引用により本明細書の一部とする。
野生型Cas9タンパク質は、RuvCおよびHNHの2つの機能的ヌクレアーゼドメインを有し、これらは各々、DNAの二本鎖の異なる鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性である場合、Cas9タンパク質はゲノムDNAにDSB(二本鎖切断)を引き起こす。RuvCまたはHNHのいずれかの触媒活性のみを有するCas9タンパク質も開発されている。この場合、Cas9タンパク質は標的DNAのいずれかの鎖のみを切断する。例えば、スタフィロコッカス・ピオゲニス(Streptococcus pyogenes)由来のCas9タンパク質のRuvCドメインは、D10A変異により不活性化され、HNHドメインはH840A変異により不活性化される。
ゲノム編集には、標的特異的なgRNAが必要である。本発明において、「ガイドRNA」または「gRNA」は、crRNAとtracrRNAが融合した人工1本鎖RNAを意味する。crRNAとtracrRNAの間にリンカー配列が存在してもよい。Cas9タンパク質はgRNAの存在下で標的特異的にゲノムDNAに結合できる。
CRISPR/Cas系では、また、HDRを利用して、標的配列の特定のヌクレオチドを改変することもできる。HDRによりゲノムDNA配列内のヌクレオチドを改変するためには、HDRの際に、所望の配列を含むDNA修復鋳型が存在しなければならない。本発明のある実施態様では、DNA修復鋳型として、ssODN(一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド)を用いることができる。ssODNは、DSBの上流および下流の配列に高い相同性を有する。各相同性領域の長さと位置は導入しようとする改変のサイズに依存する。適する鋳型の存在下で、HDRは、Cas9タンパク質によるDSBの部位で、特定のヌクレオチドを改変できる。ssODNを設計する際には、修復された遺伝子がCas9タンパク質により切断されないように、ssODNが、直後にPAM配列を有する標的配列を含まないように設計する。例えば、PAM配列に対応する配列をssODN中では別の配列にすることにより、ssODNがCas9タンパク質により切断されないようにできる。ssODNの設計方法の詳細は、例えば、引用により本明細書の一部とするYang, H. et al., Cell, 154(6), 1370-9 (2013) に記載されている。ssODNは、通常、gRNAおよびCas9 mRNAと共に細胞に導入される。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAおよびgRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNAおよびtracrRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、gRNAおよびssODNを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNA、tracrRNAおよびssODNを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAおよびgRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNAおよびtracrRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、gRNAおよびssODNを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNA、tracrRNAおよびssODNを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNAおよびgRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNAおよびtracrRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNA、gRNAおよびssODNを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNA、tracrRNAおよびssODNを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAおよびgRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNAおよびtracrRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、gRNAおよびssODNを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNA、tracrRNAおよびssODNを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約20V以上の電圧を約15msec以上、または、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約9msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNAおよびgRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNAおよびtracrRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、gRNAおよびssODNを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約200ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNA、tracrRNAおよびssODNを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNAおよびgRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNAおよびtracrRNAを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNA、gRNAおよびssODNを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、約50ng/μl以上のCas9 mRNA、crRNA、tracrRNAおよびssODNを含む溶液および1細胞期の受精卵の混合物を置くこと、
(b)電極間に、電極間距離1mm当たり約30V以上の電圧を約21msec以上かけること、
ただし、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、
の各段階を含む。
[1]哺乳動物の受精卵にCas9タンパク質をコードするmRNA(Cas9 mRNA)を導入する方法であって、
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)下式(A)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(A) Rmin=882/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約990Vmsec以下である、
の各段階を含む、方法。
[3]電圧が電極間距離1mm当たり約25Vないし約35Vである、項目[1]または項目[2]に記載の方法。
[4]電圧が電極間距離1mm当たり約30Vである、項目[1]ないし項目[3]のいずれかに記載の方法。
[5]mRNA濃度が約50ng/μlないし約1000ng/μlである、項目[1]ないし項目[4]のいずれかに記載の方法。
[6]mRNA濃度が約50ng/μlないし約200ng/μlである、項目[1]ないし項目[5]のいずれかに記載の方法。
[8]電圧が電極間距離1mm当たり約20V以上であり、通電時間が約36msec以上である、項目[7]に記載の方法。
[9]電圧が電極間距離1mm当たり約30V以上であり、通電時間が約21msec以上である、項目[7]に記載の方法。
[10]電圧が電極間距離1mm当たり約40V以上であり、通電時間が約14msec以上である、項目[7]に記載の方法。
[11]電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上であり、通電時間が約11msec以上である、項目[7]に記載の方法。
[13]電圧が電極間距離1mm当たり約20V以上であり、通電時間が約15msec以上である、項目[12]に記載の方法。
[14]電圧が電極間距離1mm当たり約30V以上であり、通電時間が約5msec以上である、項目[12]に記載の方法。
[15]電圧が電極間距離1mm当たり約30V以上であり、通電時間が約9msec以上である、項目[12]に記載の方法。
[16]電圧が電極間距離1mm当たり約40V以上であり、通電時間が約3.8msec以上である、項目[12]に記載の方法。
[17]電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上であり、通電時間が約1.6msec以上である、項目[12]に記載の方法。
[19]電圧と総通電時間の積が、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下である、項目[1]ないし項目[18]のいずれかに記載の方法。
[20]電圧を2回ないし15回のパルスに分けてかける、項目[1]ないし項目[19]のいずれかに記載の方法。
[21]電圧を5回ないし11回のパルスに分けてかける、項目[1]ないし項目[20]のいずれかに記載の方法。
[22]パルス間に約10ないし約150msecの間隔を空ける、項目[20]または項目[21]に記載の方法。
[23]各パルスの方向が同じである、項目[20]ないし項目[22]のいずれかに記載の方法。
[24]少なくとも1つのパルスの方向が他のパルスと逆である、項目[20]ないし項目[22]のいずれかに記載の方法。
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(c)下式(B)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(B) Rmin=441/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり約20Vないし約30Vのとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約30Vないし約40Vのとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約40Vないし約50Vのとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり約50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下であり、電圧は2回以上のパルスに分けてかけてもよい、
(d)式(B)により算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に段階(c)とは逆方向の電圧をかけること、ただし、電圧は電極間距離1mm当たり約20Vないし約55Vであり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり約630Vmsec以下であり、電圧は2回以上のパルスに分けてかけてもよい、
の各段階を含み、
段階(c)および(d)で電圧を2回以上のパルスに分けてかける場合、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい、
方法。
[27]受精卵が1細胞期のものである、項目[1]ないし項目[26]のいずれかに記載の方法。
[28]受精の約12時間後にエレクトロポレーションを実施する、項目[1]ないし項目[27]のいずれかに記載の方法。
[29]齧歯目の受精卵を使用する、項目[1]ないし項目[28]のいずれかに記載の方法。
[30]マウスの受精卵を使用する、項目[1]ないし項目[29]のいずれかに記載の方法。
[32]Cas9タンパク質が、RuvCヌクレアーゼ活性およびHNHヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有する、項目[1]ないし項目[31]のいずれかに記載の方法。
[33]Cas9タンパク質が配列番号1ないし配列番号4のいずれかのアミノ酸配列を含む、項目[1]ないし項目[32]のいずれかに記載の方法。
[34]Cas9タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含む、項目[1]ないし項目[33]のいずれかに記載の方法。
[36]さらなる核酸分子がgRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAの組合せである、項目[35]に記載の方法。
[37]さらなる核酸分子がgRNAである、項目[35]または項目[36]に記載の方法。
[38]溶液がssODNをさらに含む、項目[36]または項目[37]に記載の方法。
[39]エレクトロポレーションされた受精卵を培養し、受精卵の生存を確認する段階をさらに含む、項目[1]ないし項目[38]のいずれかに記載の方法。
[41]項目[35]ないし項目[38]のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にCas9 mRNAおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、哺乳動物の受精卵でゲノム編集を行う方法。
[42]ゲノム編集が起こったことを確認する段階をさらに含む、項目[41]に記載の方法。
[43]項目[35]ないし項目[38]のいずれかに記載の方法により、哺乳動物の受精卵にCas9 mRNAおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、ゲノム編集された哺乳動物の受精卵の作製方法。
[44]遺伝子改変動物の作製方法であって、項目[43]に記載の方法で得られる受精卵をレシピエント動物に移植することを含む、方法。
mRNAおよびgRNAの調製
pCS2−mCherryは、木下典行博士(基礎生物学研究所、日本)から譲り受けた。hCas9プラスミド(pX330)は、Addgene(ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)から購入した。pX330から切り出したhCas9を、pSP64ベクター(Promega)のSP6プロモーターの下流につなぎ(pSP64−hCas9)、mRNA合成に使用した。pCS2−mCherryおよびpSP64−hCas9を、各々NotIおよびSalIにより直鎖状にした。直鎖状プラスミドを鋳型として、インビトロRNA転写キット(mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit, Ambion, オースティン、テキサス州、米国)を使用して、mCherryおよびhCas9のmRNAを合成した。
ICR(日本クレア)またはB6D2F1(C57BL/6xDBA2F1)(日本SLC)のメスのマウスを使用した。ICR系統は主にエレクトロポレーション条件の決定に使用し、B6D2F1系統はゲノム編集に使用した。
同系統のオスと自然交配させたICRまたはB6D2F1のメスの卵管からE0.5(Eの後の数字は、受精後の日数を示す。E0.5は、腟栓を確認した日の暗期の中間点から12時間後である。)で受精卵を回収した。1%ヒアルロニダーゼ/M2培地(Sigma)でインキュベートすることにより、受精卵を覆っている卵丘細胞を除去した。H2b−mCherryを標的とするゲノム編集実験では、R26−H2b−mCherryのオス(RIKEN CDB、日本)と交配させたB6D2F1メスに由来する受精卵を使用した。回収した受精卵を、エレクトロポレーションに使用するまで、mWM培地(アーク・リソース、日本)またはKSOM培地(95mM NaCl、2.5mM KCl、0.35mM KH2PO4・7H2O、0.2mM MgSO4・7H2O、0.2mM グルコース、10mM 乳酸ナトリウム、25mM NaHCO3、0.2mM ピルビン酸ナトリウム、1.71mM CaCl2・2H2O、0.01mM Na2−EDTA・2H2O、1mM L−グルタミン、1mg/mlBSA)中で培養した。
白金ブロック電極(長さ:10mm、幅:3mm、高さ:0.5mm、ギャップ:1mm)(株式会社ベックス(以下、BEXと称する)、東京、日本)を外注して使用した(図2a)。CUY21EDIT II(BEX)またはCUY21 Vivo-SQ(BEX)に接続した電極を、実体顕微鏡上にセットした。mWM培地中で培養されている受精卵をOpti−MEM I(Life technologies)で3回洗浄し、血清含有培地を除去した。次いで、RNAを含有するOpti−MEM I溶液(5μl)で満たした電極のギャップに受精卵を並べ、エレクトロポレーションを行った。電気的条件は、特記しない限り、30V(3msecのパルス+97msecの間隔)×7回であった。エレクトロポレーションの後、すぐに受精卵を電極から回収し、M2培地で4回、mWM培地で2回洗浄した。次いで、受精卵を、mWM培地中、37℃で、5%CO2インキュベーター内で、2細胞期まで培養した。
mCherry蛍光のシグナル強度を、エレクトロポレーションの15時間後に測定した。ニプコー円板共焦点ユニットCSU−W1(横河電機、日本)を備えた Axio Observer.Z1 倒立顕微鏡(Zeiss、ドイツ)を使用した。蛍光シグナルは、EM-CCD カメラImageM(浜松ホトニクス、日本)により検出し、データはHCイメージソフトウェアならびにNIH ImageJ(http://imagej.nih.gov/ij/)で分析した。測定される蛍光強度は、蛍光シグナルの取得および解析の条件に依存する相対値であり、条件が全て一致する場合にのみ比較可能である。
Cas9 mRNAおよび、Fgf10またはH2b−mCherryを標的とするgRNAを、上記の通り、B6D2F1のメスから回収した受精卵に、E0.5でエレクトロポレーションにより導入した。HDRによるノックインの研究には、Cas9 mRNAおよびgRNAと共にssODNを導入した。H2b−mCherry用のssODNの配列は、以下の通りである;5’−AGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAATTCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCC−3’(配列番号7)、および、5’−CGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCC−3’(配列番号8)。生存している2細胞期の胚を、偽妊娠マウスの卵管に、膣栓が生じた日に移植した。あるいは、胚をインビトロで胚盤胞期(E4.5)まで培養した。
透明帯を酸で処理せずにマウス受精卵にmRNAを導入するためのエレクトロポレーションの条件を調べた。図2aに示すエレクトロポレーションシステムを用意した。ギャップ距離1mm、長さ10mm、幅3mm、高さ0.5mmであり、電極間に5μlの溶液を保持できる白金ブロック電極(図2c)を実体顕微鏡(図2a左)にセットし、エレクトロポレーター(CUY21EDIT II)(図2a右)に連結した。このシステムを使用して、約40個〜50個の受精卵を同時に処理できる。エレクトロポレーションに先立ち、マウスの受精卵を手技により一列に並べた。インビトロで転写した400ng/μlのmCherry mRNAをエレクトロポレーションにより受精卵に導入し、mCherryの蛍光強度および胚盤胞期までの胚の生存率をモニタリングすることにより、mRNA導入の効率を評価した。図2aは、この実験で使用したエレクトロポレーション装置の写真である。図2bは、図2aの四角で囲んだ部分の拡大図である。図2cは、白金ブロック電極の模式図である。受精卵は、電極間のギャップ中のmRNA溶液中に置かれている。図2dは、電極間のギャップに置かれた受精卵の顕微鏡像である。図2eは、マウスの受精卵にmRNAを導入するためのエレクトロポレーション条件の模式図であり、10Vないし50V、3msecのスクエアパルスを、97msecの間隔で、3回ないし11回反復することを示す。
20V R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×t
30V R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×t
40V R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×t
50V R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×t
実施例1と同様に、E0.5の受精卵にエレクトロポレーションによりmCherry mRNAを導入した。電圧およびパルス時間を30Vおよび3msecに固定し、パルスの反復回数および電圧の方向を図5cに示す通りに変化させた。図5において、×6は、一方向から6回のパルスを与えたことを示す。×+3−3は、一方向から3回のパルスを与え、続いて逆方向から3回のパルスを与えたことを示す。×alt±3は、両方向からのパルスを交互に3回ずつ与えたことを示す。×+6−6および×alt±6も同様である。mCherryの蛍光強度は、電圧の方向に拘わらず、パルスの回数に伴って増加した(図5a)。胚盤胞期までの生存率はいずれも高く(図5b)、特に、×+6−6および×alt±6で、一方向から12回のパルスを与えた場合に比べて高かった。
上記のエレクトロポレーション条件をCRISPR/Cas9によるゲノム編集に利用できるか否かを調べた。
表1:エレクトロポレーションされた胚の生存率
表2:エレクトロポレーションされた胚の形態異常
表3:Fgf10変異体の配列分析
Rosa26遺伝子座にHiston2b(H2b)−mCherry遺伝子を有する受精卵(引用により本明細書の一部とするAbe et al., Genesis 49, 579-590 (2011))をエレクトロポレーションに使用した。この受精卵から発生した胚では、Rosa26プロモーターの制御下でH2b−mCherryが遍在性に発現され、mCherry蛍光が4〜8細胞期の全ての核で観察される。H2b−mCherryを標的とするゲノム編集が起こり、遺伝子が破壊されると、mCherry蛍光は消失する。
実施例4と同様の実験により、2000ng/μlのCas9 mRNAおよび1000ng/μlのgRNAを使用し、ゲノム編集を達成する電気条件を調べた。Cas9 mRNAおよびgRNAをE0.5のマウス受精卵に導入し、インビトロで胚盤胞期(E4.5)まで培養し、核のmCherry蛍光を調べた。結果を図7に示す。エレクトロポレーションを行わなかった胚では全ての割球でmCherryの蛍光が見られた(図7a)。30V、0.05msec×2回では、一部の割球でmCherryの蛍光が消失し、30V、0.10msec×2回では、全ての割球でmCherryの蛍光が消失した(図7b)。20V、0.05msec×2回では、全ての割球でmCherryの蛍光が残り、20V、0.20msec×2回では、一部の割球でmCherryの蛍光が消失し(矢頭)、20V、1.00msec×2回では、全ての割球でmCherryの蛍光が消失した(図7c)。
実施例4と同様の実験により、200ng/μlのCas9 mRNAおよび100ng/μlのgRNAを使用して、ゲノム編集を達成するエレクトロポレーションの条件を検討した。様々な電圧(20〜50V)およびパルスの時間(6〜33msec)のエレクトロポレーションにより、E0.5の受精卵5〜12個に同時に、Cas9 mRNAおよびgRNAを導入した。表3に示すエレクトロポレーション条件により、E4.5の時点でmCherryの蛍光が消失している割球が観察され、ゲノム編集が起こったことが示された。
表4:ゲノム編集を達成するエレクトロポレーション条件
エレクトロポレーションによりssODNをマウスの受精卵に導入でき、HDRによるノックイン対立遺伝子を生成できるか否かを調べた。loxPおよびEcoRI認識配列(37塩基)の両側に隣接する40塩基長の相同領域を有する117塩基のssODN(配列番号7)を使用した。Cas9 mRNA、mCherry遺伝子を標的とするgRNAおよびssODNを、実施例4で使用したものと同様のH2b−mCherry遺伝子を有する受精卵にエレクトロポレーションした。胚を2細胞期まで発生させ、偽妊娠のメスに移植した。図8aは、標的配列および、37塩基のloxP配列およびEcoRI認識部位を挿入するためのssODNの模式図である。置き換えられた対立遺伝子は、loxP配列中の停止コドンにより機能を失い、核のmCherry蛍光は消失する。ssODNによる置換を、EcoRI切断およびRFLP(制限断片長多型)によりスクリーニングした。
表5:HDRによるloxPおよびEcoRI部位ノックイン胚の配列分析
表6:HDRによるEcoRV部位ノックイン胚の配列分析
Claims (20)
- マウスの受精卵にCas9タンパク質をコードするmRNA(Cas9 mRNA)を導入する方法であって、
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(b)下式(A)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(A) Rmin=882/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり25V以上、30V未満のとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり30V以上、40V未満のとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり40V以上、50V未満のとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり25Vより高く、55V以下であり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり990Vmsec以下である、
の各段階を含む、方法。 - Cas9 mRNA濃度が50ng/μl〜1000ng/μlである、請求項1に記載の方法。
- Cas9 mRNA濃度が50ng/μl以上であり、27.1以上のmRNA導入効率を達成する電圧と通電時間で電極間に電圧をかける、請求項1または2に記載の方法。
- Cas9 mRNA濃度が100ng/μl以上であり、14.7以上のmRNA導入効率を達成する電圧と通電時間で電極間に電圧をかける、請求項1または2に記載の方法。
- Cas9 mRNA濃度が200ng/μl以上であり、7.9以上のmRNA導入効率を達成する電圧と通電時間で電極間に電圧をかける、請求項1または2に記載の方法。
- Cas9 mRNA濃度が100ng/μl以上であり、27.1以上のmRNA導入効率を達成する電圧と通電時間で電極間に電圧をかける、請求項1ないし請求項4のいずれかに記載の方法。
- Cas9 mRNA濃度が200ng/μl以上であり、14.7以上のmRNA導入効率を達成する電圧と通電時間で電極間に電圧をかける、請求項1ないし請求項4のいずれかに記載の方法。
- 電圧を15までのパルスでかける、請求項1ないし請求項7のいずれかに記載の方法。
- マウスの受精卵にCas9 mRNAを導入する方法であって、
(a)エレクトロポレーション用電極の間に、Cas9 mRNAを含む溶液および受精卵の混合物を置くこと、
(c)下式(B)によりCas9 mRNA濃度c(ng/μl)から算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に電圧をかけること、
式(B) Rmin=441/c
ただし、mRNA導入効率(R)は、通電時間t(msec)から、
電圧が電極間距離1mm当たり25V以上、30V未満のとき、式(I)R=0.0005×t3−0.0057×t2+0.2847×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり30V以上、40V未満のとき、式(II)R=0.0015×t3−0.0191×t2+0.9489×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり40V以上、50V未満のとき、式(III)R=0.0005×t3+0.0508×t2+0.9922×tにより、
電圧が電極間距離1mm当たり50V以上のとき、式(IV)R=0.0078×t3−0.1414×t2+3.0103×tにより、算出される値である、
ただし、電圧は電極間距離1mm当たり25Vより高く、55V以下であり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり630Vmsec以下であり、電圧は2回以上のパルスに分けてかけてもよい、
(d)式(B)により算出される最低mRNA導入効率(Rmin)以上のmRNA導入効率(R)を達成する電圧と通電時間で、電極間に段階(c)とは逆方向の電圧をかけること、ただし、電圧は電極間距離1mm当たり25Vより高く、55V以下であり、電圧と通電時間の積は、電極間距離1mm当たり630Vmsec以下であり、電圧は2回以上のパルスに分けてかけてもよい、
の各段階を含み、
段階(c)および(d)で電圧を2回以上のパルスに分けてかける場合、一方向のパルスを連続してかけた後に逆方向のパルスをかけてもよく、各方向のパルスを交互にかけてもよく、各方向のパルスをランダムにかけてもよい、
方法。 - Cas9タンパク質が、配列番号1ないし配列番号4のいずれかのアミノ酸配列に90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、gRNA依存的にDNAに結合するタンパク質である、請求項1ないし請求項9のいずれかに記載の方法。
- Cas9タンパク質が、RuvCヌクレアーゼ活性およびHNHヌクレアーゼ活性のいずれかまたは両方を有する、請求項1ないし請求項10のいずれかに記載の方法。
- Cas9タンパク質が配列番号1ないし配列番号4のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項1ないし請求項11のいずれかに記載の方法。
- Cas9タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項1ないし請求項12のいずれかに記載の方法。
- 溶液が1種またはそれ以上のさらなる核酸分子を含み、該核酸分子がgRNAまたはcrRNAおよびtracrRNAの組合せであり、該核酸分子がCas9 mRNAと共に受精卵に導入される、請求項1ないし請求項13のいずれかに記載の方法。
- さらなる核酸分子がgRNAである、請求項14に記載の方法。
- 溶液が一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)をさらに含む、請求項14または請求項15に記載の方法。
- 請求項1ないし請求項16のいずれかに記載の方法により、マウスの受精卵にCas9 mRNAを導入することを含む、Cas9を発現するマウスの受精卵の製造方法。
- 請求項14ないし請求項16のいずれかに記載の方法により、マウスの受精卵にCas9 mRNAおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、マウスの受精卵でゲノム編集を行う方法。
- 請求項14ないし請求項16のいずれかに記載の方法により、マウスの受精卵にCas9 mRNAおよびさらなる核酸分子を導入することを含む、ゲノム編集されたマウスの受精卵の作製方法。
- 遺伝子改変マウスの作製方法であって、請求項19に記載の方法で得られるマウスの受精卵を、レシピエントマウスに移植することを含む、方法。
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