JP6336557B2 - 医薬製剤 - Google Patents
医薬製剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6336557B2 JP6336557B2 JP2016238126A JP2016238126A JP6336557B2 JP 6336557 B2 JP6336557 B2 JP 6336557B2 JP 2016238126 A JP2016238126 A JP 2016238126A JP 2016238126 A JP2016238126 A JP 2016238126A JP 6336557 B2 JP6336557 B2 JP 6336557B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hcg
- ethylene glycol
- poly
- recombinant
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 15
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 89
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 55
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 53
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 41
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 claims description 41
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 37
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 37
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 17
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 13
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 9
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 claims description 8
- 230000036512 infertility Effects 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101100468640 Danio rerio rhcgl2 gene Proteins 0.000 description 63
- 101150053759 rhcg gene Proteins 0.000 description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 45
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 27
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 27
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 27
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 27
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 23
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 20
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 17
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 12
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 12
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 12
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 11
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 11
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 8
- 102100031974 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Human genes 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 7
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N hydrazine Substances NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 6
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 5
- 102100029945 Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Human genes 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000863864 Homo sapiens Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101000703754 Homo sapiens CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 4
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 4
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 4
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 101710083574 CMP-N-acetylneuraminate-beta-galactosamide-alpha-2,3-sialyltransferase 4 Proteins 0.000 description 3
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000023108 LH Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010011942 LH Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 108010001564 pegaspargase Proteins 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid group Chemical group S(O)(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 2
- MTDHILKWIRSIHB-UHFFFAOYSA-N (5-azaniumyl-3,4,6-trihydroxyoxan-2-yl)methyl sulfate Chemical compound NC1C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C(O)C1O MTDHILKWIRSIHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- HORYNJCIACQHGZ-BHVWUGLYSA-N 1-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-2,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]ethanone Chemical compound C(C)(=O)C1(O)[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)CO)[C@H](O1)CO HORYNJCIACQHGZ-BHVWUGLYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 101001089087 Cladrastis kentukea Agglutinin-2 Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Polymers OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 102100038551 Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase Human genes 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 241000208829 Sambucus Species 0.000 description 1
- 108010013180 Sambucus nigra lectins Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000001593 cAMP accumulation Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- -1 etc.) Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 235000008995 european elder Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 1
- 108010081934 follitropin beta Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002849 glucosamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 229940057854 gonal f Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 229940099216 oncaspar Drugs 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 108040002068 peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl)asparagine amidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008063 pharmaceutical solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- SOEVVANXSDKPIY-UHFFFAOYSA-M sodium glyoxylate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C=O SOEVVANXSDKPIY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
関する。
ゴナドトロピンは、雄および雌の生殖腺機能を制御する一群のヘテロ二量体糖タンパク質ホルモンである。それらには卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、お
よび絨毛性ゴナドトロピン(CG)が含まれる。
および***を支援する機能を果たす。hCGは、他の糖タンパク質ホルモン、LHおよびFSHにも共通する92個のアミノ酸から成るアルファ・サブユニットと、ホルモンの特異性を決定する145個のアミノ酸から成るベータ・サブユニットを含有する。各サブユニットは翻訳
後修飾により、複合糖質残基が付加される。アルファ・サブユニットは2つのN-結合型グリコシル化(glycosolation)部位(52位および78位アミノ酸)を有し、ベータ・サブユ
ニットは2つのN-結合型グリコシル化(glycosolation)部位(13位および30位のアミノ酸)および4つのO-結合型グリコシル化部位(121位、127位、132位、および138位のアミノ
酸)を有する。
する。組換え型hCG、Ovitrelle(Serono社)も利用可能である。これはチャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞で発現される。既知の組換えhCG製剤は、ヒト尿から生成されたhCGとは異なる薬物動態プロファイルを示す。
hCG製剤にはかなりの不均一性が認められ、これは、含有される種々のアイソフォーム
の量の相違に関係する。個々のhCGアイソフォームは同一のアミノ酸配列を示すが、翻訳
後修飾される度合いが異なっている;特定のアイソフォームは糖鎖分枝構造が不均一であること、およびシアル酸(末端糖)の導入量が異なっていることを特徴とし、そのいずれも、特定のアイソフォームの生体活性に影響を与えると考えられる。
み合わせて含有しうる、多様な構造を有する。グリカンは以下のような更なる修飾も有しうる:コアのフコシル化、バイセクティング(bisecting)グルコサミン、アセチルガラ
クトサミン伸長鎖、部分的または完全なシアリル化、α2,3およびα2,6結合型シアリル化、およびガラクトースを置換するグルコサミンサルフェート。更に、グリカン構造の個々のグリコシル化部位の分布は異なっている。
ランスフェラーゼの種類を反映する。既存のrhCG製剤であるOvitrelleは、組換えチャイ
ニーズ・ハムスターの卵巣細胞(CHO細胞)由来のものである。CHO由来rhCGにおけるグリカン修飾の種類は、尿由来の天然型製剤で見られるものに比較して限られたものである。CHO由来rhCG中に見られる還元型グリカンが異なっている例として、バイセクティンググ
ルコサミンの欠如、並びにコアのフコシル化およびアセチルラクトサミン伸長鎖の含量低下が挙げられる。更に、CHO細胞はα2,3結合によらなければシアル酸を付加することができない(Kagawaら, 1988, Takeuchiら, 1988, Svenssonら, 1990)。これは、天然由来の
hCGがα2,3およびα2,6結合型シアル酸を混合して保有するグリカンを含有するのとは異
なっている。
は、組換え製剤であるGonal-f(Serono社)およびPuregon(Oreganon社)に比較してかなり高い(Andersenら 2004)。FSHでは硫酸で修飾されて負に帯電したグリカンの含量が低いので、これはrFSH中に含有されるシアル酸のモル量が低いことを反映していると考えられる。天然型FSHに比較してシアル酸含量が低いことは両市販FSH製剤に共通する特徴であり、これは製造工程の限界を反映していると考えられる(BassettおよびDriebergen, 2005)。FSHの循環寿命は、種々の供与源からの物質について報告されている。これらの物質のいくつかは、分子全体の電荷(pIで表され、酸性度が高いほど負の電荷が高い)に基づいて分画が行われている。分子全体の電荷に寄与する主な要因は各FSH分子の総シアル酸
含量である。例えば、rFSH(Oreganon社)のシアル酸含量は約8mol/molであり、尿由来FSHのシアル酸含量はこれより高い(de Leeuwら 1996)。ラットにおけるそれぞれの血漿クリアランス速度は0.34ml/分および0.14ml/分である(Ulloa-Aguirreら 2003)。組換えFSHサンプルを高pI画分および低pI画分に分離した別の例では、高pI(シアル酸含量が低い
)画分はインビボにおける有効性が低下しており、血漿中半減期はより短かった(D’Antonioら 1999)。出願人が得た知見では、FSHと同様、既知のCHO由来組換えhCG製剤(例えばOvitrelle)でも、等電点(pI)が4未満である(酸性アイソフォームと見なされる)hCGの量は尿hCGより少なく、これも既知のrhCG製剤のシアル酸含量が尿hCGに比較して低い
ことを表している。
接比較することはできない。下垂体/血清/尿hCGはα2,3およびα2,6結合型シアル酸の
両方を含有し、前者が優位である。しかしながら、CHO細胞由来の組換え体はα2,3しか含有しない(Kagawara, 1988, Takeuchiら, 1988, Svenssonら, 1990)。すなわち、CHO株
を用いて発現させた組換えタンパク質は末端シアル酸結合のタイプがその天然型とは異なる。天然型製剤および現在使用されている組換え製剤では、後者の方が総シアル酸含量が低いことに加えて、この点が相違している。糖質部分は分子の薬理学的特性に寄与しうるため、これは医薬品用の生物学的製剤を製造する上で考慮すべき重要な点である。
酸の結合のタイプ(α2,3またはα2,6)は、hCGの生物学的クリアランスに劇的な影響を
与えうる。ヒト細胞株は、CHO細胞株とは異なり、α2,3およびα2,6結合型シアル酸の両
方を含有する組換えhCGを発現できる。
方を併せて含有する;後者は内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によって生成される
。これには、慣例的なCHO細胞で発現されるrhCGより優れた点が2つある:1つは、2つ
のシアリルトランスフェラーゼの複合活性によって物質がより高度にシアリル化されることである;また2つめは、物質が天然型hCGとより高い類似性を有することである。これ
は、CHO細胞由来の組換え産物(α2,3結合型シアル酸しか生成せず、シアル酸含量が低い)に比較して、生物学的により好適であると考えられる。これは国際特許出願PCT/GB2010/001854の対象である。出願人は、驚くべきことに、本発明のヒト由来rhCGが、他の組換
え製剤に比較して、天然型ヒト尿製剤の生理学的および薬物動態学的プロファイルをより高い類似性で再現または模倣しうることを発見した。すなわち、本発明のrhCGはより「天然の」hCGに類似している。これは投与等に関して、重要な利点となり得る。更に、より
「天然」であるか、またはより「ヒト」に近い製剤であること、ある意味では人工的であるが可能な限り「天然」であることは、治療を必要とする患者にとってより好ましい。
つのPEG分子で修飾(付加)することを指して使用されてきた。ある種のポリ(エチレン
グリコール)部分を付加する方法は、例えばRoberts M. J.ら, Adv. Drug Del. Rev. 54:
459-476,2002;Harris J. M.ら, Drug Delivery Sytems 40: 538-551,2001に報告されている。PEG化された治療タンパク質、例えばADAGENX (重症複合型免疫不全症の治療のた
めのアデノシン・デアミナーゼのPEG化製剤)およびONCASPAR(高感受性のALL患者を治療するためのPEG化されたL-アスパラギナーゼ) が報告されている。しかしながら、PEG化
型のhCG、特に市販品とするのに好適な特性を有するものはこれまで得られていない。
リ(エチレングリコール)修飾されたhCGは式(Ia)を有する。
(R)n−X−Y (Ia)
式中、(R)はポリエチレングリコール(PEG)またはメトキシポリ(エチレングリコール
)(mPEG)であり;nは1、2、3、または4であり;Xは結合またはリンカーであり;そして、YはhCGまたはそのアゴニスト変異体である。好ましくは、nが1であってXが共有結合で
あるか、または、nが1、2、もしくは4であってXがリンカーである。好ましくは、リンカ
ーXの一末端がhCGのN-末端に結合している。
たは各R基)の末端酸素にも結合している)。リンカーXはPEG化の分野で知られる任意の
リンカー分子であってもよい。
れたhCGは式CH2R-CHR-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-hCGであり、式中、Rはそれぞれポリエチレングリコール(PEG)またはメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)である
。好ましい例では、Rはそれぞれメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)である(
実施例12A参照)。
そして、mは1から20、例えば1から10である。
あり、Z1およびZ2は共に(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)c-(CH2)f-O(CH2CH2O)mであり、式中、c
、d、およびfは1であり、eは0であり、そしてZ3およびZ4はそれぞれR基への結合を表す;すなわち、Xは[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-であり、ポリ(エチレングリコール)修飾されたhCGは以下の構造を有する:
はメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)である)。好ましい例では、Rはそれぞ
れメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)である。
合しており;R1は結合であるか、またはR(またはRが1つより多く存在する場合はRの少なくとも1つ)に結合した任意に置換されていてもよいC1からC10の分枝鎖もしくは直鎖アルキル基であり、そして、R2およびR3はそれぞれ独立して結合HまたはR基の1つもしくはそ
れ以上に結合した任意に置換されていてもよいC1からC10の分枝鎖もしくは直鎖アルキル
基から選択される。
た)組換えhCGであってもよい。組換えhCGの発現法および精製法は、当該分野で知られている。好ましくはhCGは組換えhCG(「rhCG」または「rechCG」)である。好ましくは、hCGはヒト細胞株由来の組換えhCGである。
記式Iaのポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG、好ましくはポリ(エチレングリコ
ール)修飾された組換えhCG、好ましくはヒト細胞株由来組換えhCGを含む医薬製剤を提供する。好ましくは、hCGはポリ(エチレングリコール)修飾されたヒト細胞株由来組換えhCGである。
好適なアルキル置換型PAO誘導体、例えばモノもしくはビス末端C1-C4基を含有するものが含まれる。非抗原性直鎖ポリマー、例えばモノメチルPEGホモポリマーは好ましい。他の
好適なポリアルキレンオキシドには、他のポリ(エチレングリコール)ホモポリマー、他のアルキルポリ(エチレンオキシド)ブロックコポリマー、およびポリ(アルキレンオキシド)のブロックコポリマーのコポリマーがある。
ール(PEG)またはメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)であり、分子量が約200から約40,000、例えば分子量が200から約20,000、例えば分子量が2,000から約10,000、例えば分子量が約5,000であってもよい。
していてもよい。ポリ(エチレングリコール)は、(例えば組換え)hCGのN-アミノ末端
および/または(例えば組換え)hCGのC-アミノ末端で(例えば組換え)hCGにコンジュゲートしていてもよい。好ましくは、ポリ(エチレングリコール)の90%またはそれ以上が(例えば組換え)hCGのN-アミノ末端にコンジュゲートしている。好ましくは、ポリ(エ
チレングリコール)の95%またはそれ以上が(例えば組換え)hCGのN-アミノ末端にコン
ジュゲートしている。この本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたhCGおよび/
または本発明の製剤のIVF法における制御された卵巣刺激および***誘発への使用は、既
存の組換え産物に比較してより天然に近い卵巣刺激と向上された薬物動態プロファイルとを兼ね備えると予想される。本発明は更に、主にhCGのN-末端に結合した1つまたは2つ
のPEGまたはmPEG分子(または1つ、2つ、またはそれ以上のPEGまたはmPEG分子を含有するリンカー分子)を有するPEG-hCGおよびmPEG-hCGコンジュゲートを提供する。これによ
り、異なるhCG分子上で異なる部位がPEG化されることに起因する産物の不均一性に伴う問題が回避または低減される。認識されるように、本発明のPEG-hCGおよびmPEG-hCGコンジ
ュゲートは、共有結合によってhCGのN-末端に結合した1つまたは2つのPEGまたはmPEG分子を有してもよい。リンカー分子がN-末端に結合している場合、リンカー分子は1つ、2つ、またはそれ以上のPEGまたはmPEG分子を有してもよい。
(R)n−X−Y (I)
式中、
Rは水溶性で実質的に非抗原性のポリマーであり;
nは1、2、3、または4であり;
Xは結合またはリンカーであり;そして、
YはhCGまたはそのアゴニスト変異体である。
てXがリンカーである。RまたはRの少なくとも1つは直鎖ポリマー、例えばポリ(アルキレンオキシド)、例えばポリエチレングリコール(PEG)またはメトキシポリ(エチレング
リコール)(mPEG)である。好ましくは、リンカーXの一末端がhCGのN-末端に結合している。
たは各R基)の末端酸素にも結合している)。リンカーXはPEG化の分野で知られる任意の
リンカー分子であってもよい。
はメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)であってもよい。好ましい例では、Rは
それぞれメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)である(実施例12A参照)。
そして、mは1から20、例えば1から10である。
あり、Z1およびZ2は共に(Z3CH2)d-(CH2)e-(CHZ4)c-(CH2)f-O(CH2CH2O)mであり、式中、c
、d、およびfは1であり、eは0であり、そしてZ3およびZ4はそれぞれR基への結合を表す;すなわち、Xは[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-CH[CH2R-CHR-CH2-O(CH2CH2O)m]-CH2-O-C(=O)-NH-(CH2)2-C(=O)-であり、修飾されたhCGは以下の構造を有する:
キシポリ(エチレングリコール)(mPEG)であってもよい。好ましい例では、Rはそれぞ
れメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)である。
合しており;R1は結合であるか、またはR(またはRが1つより多く存在する場合は少なく
とも1つのR)に結合した任意に置換されていてもよいC1からC10の分枝鎖もしくは直鎖ア
ルキル基であり、そして、R2およびR3はそれぞれ独立して結合HまたはR基の1つもしくは
それ以上に結合した任意に置換されていてもよいC1からC10の分枝鎖もしくは直鎖アルキ
ル基から選択される。
好適なアルキル置換型PAO誘導体、例えばモノもしくはビス末端C1-C4基を含有するものが含まれる。非抗原性直鎖ポリマー、例えばモノメチルPEGホモポリマーは好ましい。他の
好適なポリアルキレンオキシドには、他のポリ(エチレングリコール)ホモポリマー、他のアルキルポリ(エチレンオキシド)ブロックコポリマー、およびポリ(アルキレンオキシド)のブロックコポリマーのコポリマーがある。
ール(PEG)またはメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)であり、分子量が約200から約40,000、例えば分子量が200から約20,000、例えば分子量が2,000から約10,000、例えば分子量が約5,000であってもよい。
た)組換えhCGであってもよい。組換えhCGの発現法および精製法は、当該分野で知られている。好ましくはhCGは組換えhCG(「rhCG」または「rechCG」)である。好ましくは、hCGはヒト細胞株由来の組換えhCGである。
およびα2,6-シアリル化を含有する。rhCGは、必要によりα2,8-シアリル化を更に含有してもよい。
がα2,3-シアリル化であってもよい。rhCGは、総シアリル化の45%から80%、例えば総シアリル化の50%から70%、例えば総シアリル化の55%から65%の量のα2,3-シアリル化を
含有してもよい。rhCGは、総シアリル化の65%から85%、例えば総シアリル化の70%から80%、例えば総シアリル化の71%から79%の量のα2,3-シアリル化を含有してもよい。rhCGは、総シアリル化の50%またはそれ未満のα2,6-シアリル化を有してもよい。例えば総シアリル化の45、40、30、20、10、5%、またはそれ未満がα2,6-シアリル化であってもよい。rhCGは、総シアリル化の20%から55%、例えば総シアリル化の30-50%、例えば総シ
アリル化の35-45%の量のα2,6-シアリル化を含有してもよい。rhCGは、総シアリル化の15%から35%、例えば総シアリル化の20%から30%、例えば総シアリル化の21%から29%
の量のα2,6-シアリル化を含有してもよい。rhCGは、総シアリル化の5%またはそれ未満
のα2,8-シアリル化を含有してもよい。例えば、総シアリル化の2.5%またはそれ未満が
α2,8-シアリル化であってもよい。rhCGは、総シアリル化の0%から4%、例えば総シアリル化の0.1から4%、例えば総シアリル化の0.5から3%、例えば総シアリル化の0.5から3%の量のα2,8-シアリル化を含有してもよい。rhCGはα2,8-シアリル化を含有しなくてもよい。シアリル化は、hCGの糖鎖構造上に存在するシアル酸残基の量を表す。α2,3-シアリ
ル化は(当該分野で知られるように)2,3位がシアリル化されていることを意味し、α2,6-シアリル化は(当該分野で知られるように)2,6位がシアリル化されていることを意味する。従って、「総シアリル化のX%が2,3-シアリル化であってもよい」とは、hCG中に存在するシアル酸残基総数のX%が2,3位でシアリル化されていることを意味する。「総シアリル化のX%がα2,6-シアリル化である」とは、hCG中に存在するシアル酸残基総数のX%が2,6位でシアリル化されていることを意味する。
、タンパク質の質量ベースで)6重量%またはそれ以上(例えば6%から15%、例えば7%
から13%、例えば8%から12%、例えば11%から15%、例えば12%から14%)であっても
よい。
問題とならないためである。rhCGはPer.C6細胞株、Per.C6由来細胞株、または改変型Per.C6細胞株で生成または発現させてもよい。細胞株をα2,3-シアリルトランスフェラーゼを用いて改変してもよい。rhCGは、(細胞株の)内因性シアリルトランスフェラーゼ活性によって生成されたα2,6結合型シアル酸(α2,6-シアリル化)を含有してもよい。あるい
は、または、更に、細胞株をα2,6-シアリルトランスフェラーゼを用いて改変してもよい。
化)を含有してもよい。rhCGはα2,3-および/またはα2,6-シアリルトランスフェラーゼを用いて生成してもよい。
トラ-シリアル化グリカン構造を、例えば以下の相対量で含有してもよい:0.1-4%のモノ-シアリル化;35-45%のジ-シアリル化;0.5-8%のトリ-シアリル化;および0-1%のテトラ-
シアリル化(例えば実施例8Dに記載する帯電性グリカンのWAX分析に示すように)。好
ましくは、本発明の組換えhCGはモノ(1S)、ジ(2S)、トリ(3S)、およびテトラ(4S
)シアリル化構造を含有する。好ましくは、シアリル化構造の相対量は以下である(1S:2S:3S:4S):0.2-1%:35-40%:2.5-7%:0.5-1%(例えば実施例8Dに記載する帯電性グリカンのWAX分析に示すように)。
体)のアミノ酸残基を介して(例えば共有)結合している。好ましくは、ポリ(エチレングリコール)はhCGのN-末端に結合している。種々の官能基、リンカー、立体配置、およ
び分子量を有する多くの活性ポリ(エチレングリコール)が当業者に知られている。それらを使用して、当該分野で知られる方法によってPEG-hCGコンジュゲートまたはPEG-hCGアゴニスト変異体コンジュゲートを合成してもよい(例えばRoberts M. J.ら, Adv. Drug Del. Rev. 54: 459-476,2002;Harris J. M.ら, Drug Delivery Sytems 40: 538-551,2001参照)。
および/またはLHを更に含んでもよい。
せた)組換えFSHであってもよい。組換えFSHの発現および精製の方法は当該分野で知られている。
、または子宮腔内授精(IUI)に使用するためのものであってもよい。医薬組成物を、例
えば既知のhCG製剤を使用する医学的適応に使用してもよい。また、本発明は、不妊症治
療のための、または不妊症治療のための薬剤を製造するための、本明細書に記載する(本発明の観点の)ポリ(エチレングリコール)修飾された組換えrhCGおよび/またはポリ(エチレングリコール)修飾された組換えrhCG製剤の使用法を提供する。本発明の医薬組成物を調剤して、任意の薬剤投与経路(例えば経口、直腸、非経口、経皮(例えばパッチ法)、静脈内、筋肉内、皮下、胸骨内、膣内、腹腔内、局所(パウダー、軟膏、または滴下剤)のための既知の組成物、またはバッカルもしくは鼻腔内スプレーとしてもよい。一般的な組成物には医薬的に許容されるキャリアー、例えば水溶液、非毒性賦形剤(塩を含む)、保存剤、バッファーなど、特にRemington’s Pharmaceutical Sciences(第15版、Matt Publishing Company, 1975, 1405-1412ページおよび1461-87ページ)およびnational formulary XIV(第14版、American Pharmaceutical Association, 1975)に掲載されているものがある。
ングリコールなど)、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの好適な混合物、植物油(例えばオリーブ油)、そして注射用有機エステル(例えばオレイン酸エチル)がある。
含有される場合は)他の活性成分)の吸収を遅延させることが望まれる。これは、難水溶性の結晶または非結晶性物質の懸濁液を使用することによって行うことができる。この場合、hCGの吸収速度は溶解速度に依存し、溶解速度は結晶のサイズおよび形態に依存する
。あるいはまた、非経口投与されたhCG配合剤の吸収遅延を、hCG配合剤を油性賦形剤に溶解または懸濁することによって行う。
でポリ(エチレングリコール)修飾された組換えrhCG(および(含有される場合は)他の物質)のマイクロカプセル・マトリクスを形成することによって行うことができる。hCG
とポリマーの比率、および使用する特定ポリマーの性質に基づいて、hCGの放出速度を制
御できる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリビニルピロリドン、ポリ・オルトエステル、ポリ酸無水物などがある。また、デポー注射剤は、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションにhCGを封入させることによって調製する。
などと共に)含有する医薬組成物を含む製品として提供してもよい。活性成分が1つより多い場合(すなわち、ポリ(エチレングリコール)修飾された組換えrhCGと、例えばFSH
またはLH)、これらは個別投与または共投与に好適なものであってもよい。個別投与の場合、投与は連続的であってもよい。製品は任意の好適な包装で提供してもよい。例えば、製品はhCG、FSH、またはFSHおよびhCGの両者を併せて含有する薬剤充填済み注射器を複数含有し、注射器が滅菌を保つためにブリスター包装または他の方法で包装されていてもよい。製品には、任意にポリ(エチレングリコール)修飾された組換えrhCGおよびFSH製剤
を使用するための説明書が含まれてもよい。
ヒトhCG
FiddesおよびGoodman (1979)に従い、hCGαポリペプチド遺伝子のコード領域を使用し
た。配列はAH007338として登録されており、構築の時点で、このタンパク質配列には他の変異体は存在しなかった。本明細書ではこの配列をSEQ ID 1と称する。
た。配列はNP_000728として登録されており、CGベータ3、CGベータ5、およびCGベータ7のタンパク質配列と一致する。本明細書ではこの配列をSEQ ID 2と称する。
シアリルトランスフェラーゼ
ラクトシドα2,3-シアリルトランスフェラーゼ4(α2,3-シアリルトランスフェラーゼ
、ST3GAL4)遺伝子のコード領域を使用した。この配列はL23767として登録されており、
本明細書ではSEQ ID 3と称する。
。
hCGαポリペプチドのコード配列(AH007338, SEQ ID 1)およびhCGβポリペプチドのコード配列(NP_000728, SEQ ID 2)をPCRで増幅した(プライマーはそれぞれ、CGa-fwおよびCGa-rev、CGb-fwおよびCGb-revの組み合わせで使用)。
様に、hCGαDNAをBamHIおよびNheIで消化し、既にhCGβポリペプチドDNAを含有させた発
現ベクターのBamHI/NheI部位に挿入した。
αおよびβの両方を含有するベクターを含むもののうち20個を選択してシーケンシングを行った。シーケンシング用に選択したコロニーの全てがSEQ ID 1およびSEQ ID 2と一致する正しい配列を含有した。プラスミドphCG A+Bをトランスフェクションに使用した(図1)。
βガラクトシドα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ4のコード配列(ST3、L23767、SEQ
ID 3)のPCR増幅を、プライマー、2,3STfwおよび2,3STrevを使用して行った。
耐性マーカーを保有するCMV駆動性哺乳動物細胞発現ベクターのBamHI/AflII部位に挿入
した。ベクターを上記のように増幅し、シーケンシングを行った。クローンpST3#1(図2)はSEQ ID 3と一致する正しい配列を含有し、これをトランスフェクションに使用した。
βガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1のコード配列(ST6、NM_003032、SEQ ID 4)のPCR増幅を、プライマー、2,6STfwおよび2,6STrevを使用して行った。
カーを保有するCMV駆動性哺乳動物細胞発現ベクターのBamHI/AflII部位に挿入した。ベ
クターを上記のように増幅し、シーケンシングを行った。クローンpST6#11(図3)はSEQ
ID 4と一致する正しい配列を含有し、これをトランスフェクションに使用した。
クローンのトランスフェクション、単離、およびスクリーニング
hCGを生成するPer.C6クローンを作製するために、1つのプラスミドからhCGの両ポリペプチド鎖を発現させた(実施例1参照)。
した。合計389個のクローンを単離した。単離したクローンを選択培地中、70-80%の集密
度まで培養した。hCG選択的ELISAを用いて上清のhCGタンパク質含量を測定し、クローン
化した細胞株におけるhCG受容体の薬理活性をcAMP蓄積アッセイによって測定した。機能
性タンパク質を発現するクローン(118個)を24ウェル、6ウェル、およびT80フラスコに
順次、拡大培養した。
速度分析に供するクローンの選択を行った。十分な生産性およびクオリティーを有するクローンを選択し、シアリルトランスフェラーゼ操作に使用した。
クション、単離、およびスクリーニング
高度にシアリル化されたhCGを生成するPer.C6クローンを作製するために、既にhCGの両ポリペプチド鎖を発現することが確認されているPer.C6細胞(実施例4参照)において、別のプラスミド(実施例2参照)からα2,3-シアリルトランスフェラーゼを発現させた
。実施例4に記載するPER.C6(登録商標)細胞から作製したクローンについて、その特性(生産性、良好な増殖プロファイル、機能性タンパク質の生成、および生成されるシアリル化含有hCG)に基づく選択を行った。
する試験のためのクローン数は最終的に5個であった。α2,3-シアリルトランスフェラー
ゼ・クローンを懸濁条件で無血清培地に馴化させた。
換えhCG(Ovitrelle、Serono社)および親hCG Per.C6細胞株と比較した。代表的なサンプルを実施例および図に示す。
現により、hCGのみを発現する細胞に比較して、高レベルのシアリル化hCGが得られる。
上記のように作製したα、βヘテロダイマー(実施例4)はシアリル化のレベルが低く、非常に塩基性の高いIEFプロファイルを示した。上記(実施例5a)のように、Per.C6
細胞におけるhCGおよびα2,3-シアリルトランスフェラーゼの共発現により、hCGのみを発現する細胞に比較して、高レベルのシアリル化hCGが得られる。
ルトランスフェラーゼ酵素遺伝子の2重トランスフェクションを行った。hCGベクター(
2元(α/β)発現ベクター、実施例1)およびα2,3-シアリルトランスフェラーゼをコードするベクター(実施例2)の共トランスフェクションにより、無血清条件下において細胞株を作製した。PER.C6(登録商標)細胞から作製したクローンについて、その特性(生産性、良好な増殖プロファイル、機能性タンパク質の生成、および生成されるシアリル化含有hCG)に基づく選択を行った。クローンを単離、拡大培養、およびアッセイした。
組換えhCG(Ovitrelle、Serono社)および親hCG Per.C6細胞株と比較した。代表的なサンプルを実施例および図に示す(実施例6、9、10、図4、および5参照)。クローンによって生成された組換えhCG(すなわち、本発明にかかる組換えhCG)は、α2,3-シアリルトランスフェラーゼ無しで発現させたhCGおよびOvitrelleと比較して、著しく向上したシアリル化を示す(すなわち平均して、多数のシアル酸を有するhCGアイソフォームがより
多い)(実施例6および8、図4参照)。
電気泳動は、電場による溶媒中での荷電分子の移動と定義される。電場による生体分子の移動度は電場の強度、分子の正味荷電、分子のサイズおよび形状、分子が移動する溶媒のイオン強度および特性に依存する。
法である。pIは、タンパク質が正味の荷電を有さず、電場を移動しないpHである。hCGア
イソフォームのシアル酸含量により各アイソフォームのpIがわずかに変化するため、これを用いて各クローンからのPer.C6 hCGアイソフォームを可視化することができる。
て分析した。Per.C6 hCGクローンからの細胞培養液を実施例4、5a、および5bに記載するように調製した。
)上、ネイティブ条件下、pH 3.0-7.0のグラジエント、両性電解質溶液(pH 3.0-7.0)中で行った。当該分野で知られる方法により、クマシーブルー染色を用いてタンパク質を可視化した。
、より多くのシアル酸分子を保有するhCGアイソフォームを生成するクローンを同定した
。図4に示すように、α2,3-シアリルトランスフェラーゼ操作したヒト細胞株由来組換えhCGは、Ovitrelleに比較して、より酸性度の高いプロファイルを示す。
レクチンに基づくグリカン識別法を用いて、複合糖質の分析を行った。この方法によれば、ニトロセルロースに結合した糖タンパク質および複合糖質のキャラクタリゼーションを行うことができる。レクチンは特定の部分(例えばα2,3結合型シアル酸)を選択的に
認識する。適用したレクチンはステロイド・ハプテンであるジゴキシゲニンとコンジュゲートし、これによって結合したレクチンの免疫学的検出が可能となる。
の説明書に従って使用し、シアル酸の分析を行った。セイヨウニワトコ凝集素(Sambucus
nigra agglutinin、SNA)との陽性反応は末端結合(2,6)シアル酸の存在を示す。イヌ
エンジュ凝集素(Maackia amurensis agglutinin II、MAA)との陽性反応は末端結合(α2,3)シアル酸の存在を示す。
有レベルが高く、α2,6シアル酸結合の含有レベルが低かった。標準物質であるOvitrelleはα2,3シアル酸結合しか含有しない。これは、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞で生成された組換えタンパク質についての知見と一致している(Kagawaら, 1988, Takeuchiら, 1988, Svenssonら, 1990)。
。
シアル酸はタンパク質に結合した炭水化物であってモノサッカライドと見なされ、他のモノサッカライド(例えばガラクトース、マンノース、グルコサミン、ガラクトサミン、およびフコース)と化合して存在する。本発明の精製rhCG上の総シアル酸を、Stantonら
の方法に基づく方法を用いて測定した(J. Biochem. Biophys. Methods. 30 (1995), 37 - 48)。
α2,3-シアリルトランスフェラーゼで改変したPer.C6組換えhCG(例えば実施例5a、
実施例5b)の総シアル酸含量を測定したところ、(タンパク質のモル数に対するシアル酸のモル数の比で)15 mol/mol以上、例えば18 mol/mol以上、例えば19.1 mol/molであった。これはOvitrelle(総シアル酸含量 17.6 mol/mol)に匹敵する。
α2,3-シアリルトランスフェラーゼで改変したPer.C6組換えhCG(080019-19)(上記実施例5bの方法で調製したもの)の総シアル酸含量を測定したところ、(タンパク質のモル数に対するシアル酸のモル数の比で)20 mol/molであった。この場合も、これはOvitrelle(総シアル酸含量 17.6 mol/mol)を凌ぐものである。この事例(080019-19)について試験を行い、α2,3およびα2,6シアル酸の相対量を定量した(実施例8C)。
精製rhCG((080019-19)の例および実施例5で調製した他の2つの例)上のα2,3およびα2,6シアル酸の相対量(%)を、既知の方法、すなわち順相(NP-)HPLCを用いて測定した。
した。Orela Glycan Release Kitを用いてO-結合型グリカンをhCGサンプルから開裂し、NP-HPLCで分離した。抽出およびプールしたグリカン・サンプル(上記のように抽出)を異なるシアリダーゼで消化し、結合を確認した。このグリカンの酵素消化は、α2-3,6,8シ
アリダーゼおよびα2-3シアリダーゼを用いて行った。その後、酵素消化したグリカンをNPカラムで再分離し、調製した標準物質を用いてNP-HPLCでO-グリカンを同定した。算出した相対%を以下の表に示す(SA=シアル酸)。
は35-45%の範囲(例えば41%)であった。
精製rhCG(実施例8Cで使用した3つのサンプル)から抽出したグリカン上のモノ-、ジ-、トリ-、およびテトラ-シアリル化構造の相対量(%)を既知の方法で測定した。
Fで一晩消化した。その後、N-グリカンを抽出および処理した。NP-HPLCおよびWAX-HPLC
分析に用いるN-グリカンを、Royleらに詳述されているように、フルオロフォア2ABで標識した。
数に従ってグリカンを溶出した。全てのサンプルはモノ(1S)、ジ(2S)、トリ(3S)、およびテトラ(4S)シアリル化構造を含有した。シアリル化構造の相対量は以下の比率であった;1S:2S:3S:4S=0.1-4%:35-45%:0.5-8%:0-1%。
α2,3-シアリルトランスフェラーゼを用いて操作したPer.C6組換えhCGサンプル(例え
ば実施例5a、5b)の代謝クリアランス速度(MCR)を測定するために、意識のあるメ
ス・ラット(クローン毎に3検体)の尾静脈にrhCGをボーラス注射し(サンプルのELISA
定量(DRG社、EIA 1288)に基づき、1-10 μg/ラット)、時間=0とした。試験サンプル注射の1、2、4、8、12、24、および32時間後に、尾の先端部から血液サンプル(400μL)を採取した。遠心分離によって血清を回収し、ELISA(DRG社、EIA 1288)によってhCG含
量のアッセイを行った。α2,3-シアリルトランスフェラーゼで操作したPer.C6 hCGサンプ
ルのMCRは、半減期が標準物質と同程度であることを示した(図5)。図6は、α2,3-シ
アリルトランスフェラーゼで操作した他のhCGサンプルの半減期が標準物質と比較して向
上されることを示している(図6)。
hCGバイオアッセイを実施し、hCG特異的活性を測定した。活性の測定はUSP(USP Monographs:Chorionic Gonadotropin, USPC Official 8/1/09-11/30/09)に従い、Ovitrelleを標準物質として用いて行った。Ovitrelleの生体活性は26,000 IU/mgである(Curr Med Res Opin. 2005 Dec; 21(12): 1969 - 76)。許容限界(acceptance limit)は>21,000 IU hCG/mgである。α2,3-シアリルトランスフェラーゼで操作したヒト細胞株由来組換えhCG
サンプル(シアル酸含量 19.1 mol/mol、実施例8参照)の生体活性は27,477 IU hCG/mgであった。
無血清培地中で懸濁培養したPER.C6細胞において組換えhCGを生成させる方法を開発し
た。方法は以下に記載するが、いくつかのhCG生成PER.C6細胞株に適用される。
培養した。継代の際は、細胞を無血清培地(Excell 525+4mM L-グルタミン)中に再懸濁し、0.3x106細胞/mlの密度とした。25mlの細胞懸濁液を250mlの振とうフラスコに採取し
、100rpm、37℃、5% CO2で振とう培養した。細胞密度が>1x106細胞/mlに達した後、細胞を継代して0.2または0.3x106 細胞/mlの密度とし、更に37℃、5% CO2、100rpmで振とう
培養した。
に、細胞は>107細胞/mlの密度まで増殖した。細胞生存率が低下し始めた後、培地を回収
した。細胞を1000rpmで5分間遠心分離し、上清を用いてhCGの定量および精製を行った。hCGの濃度をELISA(DRG社、EIA 1288)で測定した。
着クロマトグラフィー、および調製用ポリアクリルアミド電気泳動によって行った。
全てのクロマトグラフィー操作で、免疫反応性組換えhCGの存在をRIA(DRG社、EIA 1288)およびIEF(実施例6)で確認した。
本発明のある例では、ポリ(エチレングリコール)はhCG(またはそのアゴニスト変異
体)のアミノ酸残基を介して(例えば共有)結合している。好ましくは、ポリ(エチレングリコール)はhCGのN-末端に結合している。種々の官能基、リンカー、立体配置、およ
び分子量を有する多くの活性ポリ(エチレングリコール)が当業者に知られている。それらを使用して、当該分野で知られる方法によってPEG-hCGコンジュゲートまたはPEG-hCGアゴニスト変異体コンジュゲートを合成してもよい(例えばRoberts M. J.ら, Adv. Drug Del. Rev. 54: 459-476,2002;Harris J. M.ら, Drug Delivery Sytems 40: 538-551,2001
参照)。
使用して合成した。メトキシ-PEG-ヒドラジン(20kD)は広く入手可能であり、当該分野
でもよく知られている。アミノ基転移反応を用いて、ヒト由来組換えhCGのN-末端アミン
基を除去し、この位置をアルデヒドとした。このアルデヒド基とメトキシ-PEG-ヒドラジ
ン(20kD)との化学反応により、hCGのN-末端のPEG化が起こる。当該分野で知られる方法により、一段階のイオン交換クロマトグラフィーを用いて、反応混液からPEG化されたhCG産物を>95%(SEC分析)まで精製した。
酸ナトリウム、および5mM CuSO4(pH5.5)を含有する溶液中、室温で4時間インキュベー
トした。その後、EDTAを最終濃度20mMまで添加して反応を停止させた。10KD-超遠心機を
用いて望ましくないアミノ基転移反応成分を除去し、バッファーを50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl(pH7.5)に交換した。
ンを10mMストック溶液から撹拌しながら添加した。その直後に、還元剤として75倍モルのシアノ水素化ホウ素ナトリウムをストック溶液から添加した。反応混液を室温で24時間撹拌し、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)(HPLCカラム;Superdex-75(GE healthcare社))によってhCGのPEG修飾(PEG化)の度合いをモニタリングした。24時間後、反応を停止させ、バッファー(400mMグリシン、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH 6.7)
で1:1から1mg/mLに希釈した。最終pHの調整は1M HClを用いて行った。反応混液を0.2μm
のフィルターで濾過し、分注して4℃で保存した。SEC HPLC分析を図7に示す。
子の約16%がPEG化された。ヒト化タンパク質の約80-90%はそのN-末端にアセチル基を有し、これはhCGのアミノ基転移段階での収量が相対的に低いことを意味するため、この反
応の収量は相対的に低いと信じられる。
m-PEG-アルデヒドの官能基は、pH5.5で主にN-末端と相互作用する。直鎖m-PEG-アルデ
ヒドを用いて行う実験では、期待される2分枝ではなく約6から7分枝のPEG鎖を有するPEG化hCGが生成される。これは、m-PEG-アルデヒドが他のアミノ酸、例えばヒスチジン(hCGは4個のヒスチジン残基を有する)と相互作用することを示唆している。
を調製するために、凍結乾燥粉末(Fluka社)を水に溶解した。
せ、バッファー(400mMグリシン、50mMリン酸ナトリウム、 150mM NaCl、pH 6.7)で1:1
から1mg/mLに希釈した。最終pHの調整は1M HClを用いて行った。反応混液を0.2μmのフィルターで濾過し、分注して4℃で保存した。
いる。使用したSEC条件下では、各集団におけるPEG鎖の数を測定することはできない。こ
れは、残存する遊離の2分枝m-PEG-アルデヒドがPEG化されたhCGと同じRT(保持時間)で溶出されるためである。分枝PEG化されたhCG産物の活性をバイオアッセイで試験した(実施例13)。
ークno.2)の単一集団が生成される確率がより高くなり、これは、4分枝m-PEG-アルデヒドがN-末端以外の部位へのアクセスを更に抑制するためである。
rhCG(研究室内で実施例5b記載の方法によって生成し、実施例11記載の方法によって精製したもの)を、実施例12Aの方法を用いて直鎖m-PEG-アルデヒド(10KD)で修飾した。実施した手順はスキーム3および以下の通りである:
組換えhCGを実施例5bの方法によって生成し、実施例11記載の方法によって精製し
た。21検体のラットを3群に分け(7検体/群)、各ラットに以下のいずれかの用量の組換えhCGを、3つの独立した日に3回注射した(各注射は異なる日に行った)(1群=
1用量):4.3ng(A群のラット)、8.6ng(B群のラット)、および17.1ng(C群のラット)。5日後、ラットを殺処分し、既知の慣例的なバイオアッセイ法に従って、効力測定のために子宮の重量を測定した。
(i)研究室内で実施例5bの方法によって生成し、実施例11の方法によって精製した組
換えhCGの単回注射。一日一回注射を3回行った際の最も高い濃度より10倍高い濃度(170ng)で投与;
(ii)実施例12Aの方法によって生成した本発明の分枝PEG化組換えhCGの単回注射。一日一回注射を3回行った際の最も高い濃度より10倍高い濃度(170ng)で投与;および、
(iii)実施例12の方法によって生成した本発明の直鎖PEG化組換えhCGの単回注射。一日
一回注射を3回行った際の最も高い濃度より10倍高い濃度(170ng)で投与。
結果を以下の表に示す。
化hCGの単回注射では、子宮の平均重量は134.11mgであり、一番高い用量(17.1ng)での
3回注射とほぼ同等であった。これは、本発明のPEG化hCGを用いた「1週間持続放出」製剤が実現可能であることを強く示唆している。組換えhCGの1週間製剤を提供できるとい
うことは、既知のhCG製剤に優る重要な利点である。
Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online.
9(2), 231-236.
Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.
D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human
follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167
Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis
of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281,
351-356.
Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1980) The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region. Nature, 286, 684-387.
Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human in
terferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.
Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.
Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.
Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.
Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.
Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.
Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.
Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.
ヒト絨毛性ゴナドトロピンアルファポリペプチド
寄託番号AH007338
hCGアルファのヌクレオチド配列
1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT
61 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA
121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA
181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG
241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG
301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A
1 MDYYRKYAAI FLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRA
61 YPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS
ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータポリペプチド
寄託番号NP_000728
hCGベータのヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列
1 ATGGAGATGT TCCAGGGGCT GCTGCTGTTG CTGCTGCTGA GCATGGGCGG GACATGGGCA
61 TCCAAGGAGC CGCTTCGGCC ACGGTGCCGC CCCATCAATG CCACCCTGGC TGTGGAGAAG
121 GAGGGCTGCC CCGTGTGCAT CACCGTCAAC ACCACCATCT GTGCCGGCTA CTGCCCCACC
181 ATGACCCGCG TGCTGCAGGG GGTCCTGCCG GCCCTGCCTC AGGTGGTGTG CAACTACCGC
241 GATGTGCGCT TCGAGTCCAT CCGGCTCCCT GGCTGCCCGC GCGGCGTGAA CCCCGTGGTC
301 TCCTACGCCG TGGCTCTCAG CTGTCAATGT GCACTCTGCC GCCGCAGCAC CACTGACTGC
361 GGGGGTCCCA AGGACCACCC CTTGACCTGT GATGACCCCC GCTTCCAGGA CTCCTCTTCC
421 TCAAAGGCCC CTCCCCCCAG CCTTCCAAGT CCATCCCGAC TCCCGGGGCC CTCGGACACC
481 CCGATCCTCC CACAATAA
1 MEMFQGLLLL LLLSMGGTWA SKEPLRPRCR PINATLAVEK EGCPVCITVN TTICAGYCPT
61 MTRVLQGVLP ALPQVVCNYR DVRFESIRLP GCPRGVNPVV SYAVALSCQC ALCRRSTTDC
121 GGPKDHPLTC DDPRFQDSSS SKAPPPSLPS PSRLPGPSDT PILPQ
β-ガラクトシドα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ4
寄託番号L23767
ST3GAL4のヌクレオチド配列
1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG
61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG
121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC
181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA
241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA
301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG
361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC
421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC
481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC
541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG
601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC
661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT
721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG
781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT
841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC
901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG
961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA
1 MCPAGWKLLA MLALVLVVMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN
61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV
121 VVGNGHRLRN SSLGDAINKY DVVIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN
181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA
241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL
301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF
β-ガラクトサミドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ1
寄託番号NM_003032
ST6GAL1のヌクレオチド配列
1 ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCTGCG TCCTGGTCTT TCTTCTGTTT
61 GCAGTCATCT GTGTGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG
121 CAAACCAAGG AATTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC
181 CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT
241 CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAACCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC
301 TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAATTACCT AAGCATGAAC
361 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG
421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCTTC
481 AATACCTCTG AATGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGACCAA GGCTGGGCCT
541 TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGATCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA
601 GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA
661 CAAGATGTGG GCACAAAAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TACCACAGAG
721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAT GAAGGAATCC TAATTGTATG GGACCCATCT
781 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC
841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCTTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG
901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC
961 CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT
1021 TATGAGTTCC TCCCATCCAA GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTACTACCA GAAGTTCTTC
1081 GATAGTGCCT GCACGATGGG TGCCTACCAC CCGCTGCTCT ATGAGAAGAA TTTGGTGAAG
1141 CATCTCAACC AGGGCACAGA TGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCACACTGCCTGGC
1201 TTCCGGACCA TTCACTGCTA A
1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS
61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN
121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP
181 WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE
241 KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM
301 PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF
361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
Claims (14)
- 式(Ia)を有するポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG:
(R) n −X−Y (Ia)
式中: Xがリンカーであり、(Z 1 CH 2 ) b −(CH 2 ) z −(CHZ 2 ) a −(CH 2 ) u −O−C(=O)−NH−(CH 2 ) t −CH 2 −で示される部分を含み、ここで、aおよびbは、それぞれ独立して、0および1から選択されるが、aおよびbが両方とも0であることは無く;
t、uおよびzは、それぞれ独立して、0または1〜10の整数から選択され、Z 1 およびZ 2 は、それぞれ、R基への結合を表すか、または、Z 1 およびZ 2 は、それぞれ独立して、(Z 3 CH 2 ) d −(CH 2 ) e −(CHZ 4 ) c −(CH 2 ) f −O(CH 2 CH 2 O) m −から選択され、ここで、Z 3 およびZ 4 は、それぞれ、R基への結合を表し;cおよびdは、それぞれ独立して0および1から選択され;eおよびfは、それぞれ独立して、0または1〜10の範囲の整数であり、かつ、mは、1〜20の範囲の整数であり;
それぞれのRは、ポリエチレングリコール(PEG)またはメトキシポリエチレングリコール(mPEG)基であり;
nは、2、3または4であり、かつ
Yは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)である、ポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。 - hCGが組換えhCGである、請求項1に記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- hCGがヒト細胞株由来の組換えhCGである、請求項1または2に記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- hCGがα2,3−およびα2,6−シアリル化を含有する組換えhCG(rhCG)である、請求項1〜3のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- hCGが、15mol/molまたはそれ以上のシアル酸含量(タンパク質のモル数に対するシアル酸のモル数の比で表される)を有する組換えhCGである、例えば15mol/molから25mol/molのシアル酸含量を有する組換えhCGである、請求項1〜4のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- hCGが、総シアリル化の10%もしくはそれ以上がα2,3−シアリル化であり、および/または総シアリル化の50%もしくはそれ未満がα2,6−シアリル化である組換えhCGである、請求項1〜5のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- hCGが、総シアリル化の45%から80%がα2,3−シアリル化である組換えhCGである、請求項1〜6のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- hCGが、総シアリル化の20%から55%がα2,6−シアリル化である組換えhCGである、請求項1〜7のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG。
- 請求項1〜8のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCGを含む医薬製剤。
- hCGのアミノ酸残基にポリ(エチレングリコール)またはメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)または水溶性で実質的に非抗原性であるポリマーがコンジュゲートしている、請求項1〜8のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG、または請求項9記載の医薬製剤。
- hCGのN−アミノ末端またはC−アミノ末端にポリ(エチレングリコール)、メトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)または水溶性で実質的に非抗原性であるポリマーがコンジュゲートしている、請求項1〜8のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG、または請求項9記載の医薬製剤。
- ポリ(エチレングリコール)またはメトキシポリ(エチレングリコール)(mPEG)または水溶性で実質的に非抗原性であるポリマーの90%またはそれ以上がhCGのN−アミノ末端にコンジュゲートしている、請求項1〜8のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG、または請求項9記載の医薬製剤。
- 請求項1〜8のいずれかに記載されるポリ(エチレングリコール)修飾されたhCG、または請求項9〜12いずれかに記載される医薬製剤を含み、FSHおよび/またはLHを更に含んでいてもよい、(任意に不妊症治療用であってもよい)医薬組成物。
- 不妊症を治療することに用いるための、請求項9〜13のいずれかに記載される医薬組成物。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP11160736 | 2011-03-31 | ||
EP11160736.2 | 2011-03-31 | ||
EP12151389 | 2012-01-17 | ||
EP12151389.9 | 2012-01-17 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014501706A Division JP6087338B2 (ja) | 2011-03-31 | 2012-03-29 | 医薬製剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017101030A JP2017101030A (ja) | 2017-06-08 |
JP6336557B2 true JP6336557B2 (ja) | 2018-06-06 |
Family
ID=46051700
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014501706A Active JP6087338B2 (ja) | 2011-03-31 | 2012-03-29 | 医薬製剤 |
JP2016238126A Active JP6336557B2 (ja) | 2011-03-31 | 2016-12-08 | 医薬製剤 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014501706A Active JP6087338B2 (ja) | 2011-03-31 | 2012-03-29 | 医薬製剤 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9757469B2 (ja) |
EP (1) | EP2691119B1 (ja) |
JP (2) | JP6087338B2 (ja) |
CN (1) | CN103619358B (ja) |
CA (2) | CA3163525A1 (ja) |
ES (1) | ES2693273T3 (ja) |
PL (1) | PL2691119T3 (ja) |
WO (1) | WO2012131306A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI488640B (zh) | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
TWI604850B (zh) * | 2009-10-05 | 2017-11-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
JP6087338B2 (ja) * | 2011-03-31 | 2017-03-01 | フェリング ベスローテン フェンノートシャップ | 医薬製剤 |
BR102016006222A2 (pt) * | 2016-03-22 | 2017-09-26 | Universidade De São Paulo - Usp | Process of production and purification of recombinant hydrogen hydrogen hybrid or non-hybrid, recombinant hydrogen hydrogen hybrids or non-hybrid, vectors of expression, and uses of recombinant glicoprotetic hormones |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US4421896A (en) * | 1979-11-13 | 1983-12-20 | The Dow Chemical Company | Method of coupling a protein to a polymer particle containing hydrazide groups in a polymer latex and the products formed therefrom |
DK49987A (da) | 1987-01-30 | 1988-07-31 | Nordisk Gentofte | Fremgangsmaade til behandling af infertilitet og middel til anvendelse ved fremgangsmaaden |
IT1206302B (it) | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
IL122732A0 (en) | 1997-01-15 | 1998-08-16 | Akzo Nobel Nv | Liquid gonadotropin-containing formulation its preparation and a device containing same |
SI0996629T1 (sl) | 1997-06-25 | 2006-12-31 | Applied Research Systems | Analogi glikoproteinskega hormona povezanega z disulfidi, priprava in uporaba |
US6500627B1 (en) | 1998-02-03 | 2002-12-31 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for predicting pregnancy outcome in a subject by HCG assay |
SK287146B6 (sk) | 2000-02-22 | 2010-01-07 | Laboratoires Serono Sa | Spôsob prípravy rekombinantného choriogonadotropínu - hCG zo vzorky |
IL160780A0 (en) | 2001-09-12 | 2004-08-31 | Applied Research Systems | USE OF hCG IN THE MANUFACTURE OF A MEDICAMENT |
CA2464368A1 (en) | 2001-10-22 | 2003-05-01 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Compositions of fsh with high sialylation degree and their use for the preparation of medicaments |
AU2002335585B2 (en) | 2001-10-29 | 2007-08-16 | Crucell Holland B.V. | Methods and means for producing proteins with predetermined post-translational modifications |
US20040248784A1 (en) | 2003-06-03 | 2004-12-09 | Marco Filicori | Unitary combinations of FSH and hCG |
EP1711834B1 (en) | 2004-02-04 | 2010-08-04 | Centre National De La Recherche Scientifique | Process for screening glycoform-specific antibodies |
CA2557725C (en) | 2004-02-13 | 2015-06-30 | Glycotope Gmbh | Highly active glycoproteins-process conditions and an efficient method for their production |
CN101516388B (zh) * | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
CN101600448B (zh) | 2006-10-04 | 2015-11-25 | 诺和诺德公司 | 甘油连接的peg化的糖和糖肽 |
JP5647899B2 (ja) * | 2008-01-08 | 2015-01-07 | ラツィオファルム ゲーエムベーハーratiopharm GmbH | オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化 |
TWI488640B (zh) | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
TWI604850B (zh) | 2009-10-05 | 2017-11-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
JP6087338B2 (ja) * | 2011-03-31 | 2017-03-01 | フェリング ベスローテン フェンノートシャップ | 医薬製剤 |
-
2012
- 2012-03-29 JP JP2014501706A patent/JP6087338B2/ja active Active
- 2012-03-29 CA CA3163525A patent/CA3163525A1/en active Pending
- 2012-03-29 ES ES12719996.6T patent/ES2693273T3/es active Active
- 2012-03-29 PL PL12719996T patent/PL2691119T3/pl unknown
- 2012-03-29 WO PCT/GB2012/000291 patent/WO2012131306A1/en active Application Filing
- 2012-03-29 CN CN201280026567.5A patent/CN103619358B/zh active Active
- 2012-03-29 US US14/008,067 patent/US9757469B2/en active Active
- 2012-03-29 EP EP12719996.6A patent/EP2691119B1/en active Active
- 2012-03-29 CA CA2831486A patent/CA2831486A1/en not_active Abandoned
-
2016
- 2016-12-08 JP JP2016238126A patent/JP6336557B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2012131306A8 (en) | 2013-10-24 |
JP6087338B2 (ja) | 2017-03-01 |
CA2831486A1 (en) | 2012-10-04 |
ES2693273T3 (es) | 2018-12-10 |
JP2014510745A (ja) | 2014-05-01 |
PL2691119T3 (pl) | 2019-01-31 |
EP2691119A1 (en) | 2014-02-05 |
JP2017101030A (ja) | 2017-06-08 |
WO2012131306A1 (en) | 2012-10-04 |
US9757469B2 (en) | 2017-09-12 |
EP2691119B1 (en) | 2018-08-01 |
CN103619358A (zh) | 2014-03-05 |
CA3163525A1 (en) | 2012-10-04 |
US20140088010A1 (en) | 2014-03-27 |
CN103619358B (zh) | 2017-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6580104B2 (ja) | 医薬製剤 | |
JP6336557B2 (ja) | 医薬製剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170919 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171213 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180319 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180403 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180502 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6336557 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |