JP6333231B2 - 組織の作成のための、デバイス、システム、および方法 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
本出願は、2010年10月21日に出願の、米国仮特許出願第61/405,582号の利益を主張し、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で言及される、すべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それら全体が引用によって組み込まれる。
現在、新たな(de novo)臓器合成のための信頼できる方法はない。臓器は、(例えば、腎臓と肝臓の提供のための)生体ドナー、(例えば、肺と心臓の提供のための)死亡したドナー、および少数例では、動物(例えば、ブタの心臓弁)に由来するだけである。したがって、臓器移植を必要とする患者は、ドナー臓器が入手可能になるのを待たなければならない。これは結果的に入手可能な臓器の不足につながる。さらに、有機体から採取された臓器に頼ることによって、移植拒絶反応の確率が増加する。
特定の例において、臓器移植を受ける患者は、超急性拒否反応を経験する。本明細書で使用されるように、「超急性拒否反応」は、ドナー臓器に対するレシピエントが有する先在する抗体から結果として生じる、補体媒介性の免疫反応を意味する。超急性拒否反応は、数分内に生じ、血液凝集によって特徴付けられる。移植器官がすぐに取り除かれないと、患者は敗血症になり得る。レシピエントが最初に免疫抑制剤を投与されなければ、異種移植片は超急性拒否反応をもたらす。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、抗原を含まず、それ故、レシピエントの抗体によって認識することができない。
特定の例において、ドナー臓器は、感染因子によって感染され得る。感染した臓器の移植後、感染因子は、(一つには免疫抑制剤の使用が原因で)ドナーの全体にわたって広がりかねない。限定しない例として、レシピエントは、移植器官から、HIV、西ナイルウイルス、狂犬病、C型肝炎、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)、結核、シャガス病、およびクロイツフェルト−ヤコブ病に感染した。このような感染はまれではあるが、それにもかかわらず生じる場合があり、すなわち、死亡したドナーのための社会生活歴は必然的に最近親者に由来するため、多くの場合不正確であり、血清学的検査は、セロコンバージョンが起こらないと、偽陰性結果をもたらし得るか、または輸血後の血液希釈が原因で偽陰性をもたらし得る。さらに、採取された臓器が生存可能である時間が限定されているため、多くの一般的ではない感染因子はスクリーニングされていない。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、感染因子を含まない。
生体ドナーは、臓器の提供の結果として合併症も経験し得る。これらの合併症は、院内感染、麻酔に対するアレルギー反応、および手術ミスを含む。さらに、臓器は、提供した臓器をいつか必要となるかもしれない。例えば、腎臓ドナーの残りの腎臓または肝臓ドナーの残りの葉は、損傷しかねない。幾つかの実施形態において、新たに作成された組織または臓器は、ドナー臓器の必要性を除去し、故にドナーに対する負の副作用を回避する。
組織工学は、臓器または組織の増強、修復、または置換を介して組織機能を回復、維持、改善する生物学的代替物の開発に向けて、工学とライフサイエンスの原理を適用し、組み合わせる学際的分野である。典型的な組織工学に対する基本的なアプローチは、生体適合性であり、最終的に生物分解性である環境(例えば、スキャフォールド)に生細胞を播種し、その後、始原細胞の個体群がさらに拡大する且つ成熟するように、この構成物をバイオリアクター内で培養し、移植後に標的組織をもたらすことである。生物学的な細胞外マトリックス(ECM)を模倣する適切なスキャフォールドによって、発展中の組織は、インビトロ(in vitro)およびインビボ(in vivo)の成熟後の所望の臓器の形態および機能の両方を取り入れ得る。しかしながら、天然の組織のようなアーキテクチャーを有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたる細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、結果的に、機械的性質が乏しい及び/又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされ得る。さらなる困難は、スキャフォールドの生物分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試みられた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、いくつかの制限を受ける:
* 各層が異なる細胞型を含む、多層構造などの複雑な幾何学的構造は、天然の組織のような結果を再生可能に達成するために、具体的なアーキテクチャー内で細胞型の明確で高分解能の配置を必要とし得る。
* 尺度および幾何学的構造は、拡散及び/又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
* 組織の生存能力は、拡散を限定し、栄養に対する細胞のアクセスを制限する制限物質によって損なわれ得る。
* それらは、細胞を含む組織及び/又は臓器をもたらすことができる。
* それらは、発生生物学の原則を活用することによって、天然の組織形成プロセスの環境条件を模倣する。
* それらは、広範囲の複雑なトポロジー(例えば、多層構造、繰り返しの幾何学模様、セグメント、シート、チューブ、嚢など)を達成することができる。
* それらは、製造の自動化した手段と適合性があり、スケーラブルである。
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するための、デバイス、システム、および方法が開示される。幾つかの実施形態において、デバイスは、バイオプリンターである。幾つかの実施形態において、方法は、バイオ印刷技術の使用を含む。さらなる実施形態において、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法の使用によって作成された組織および臓器は、バイオ印刷される。
本明細書には、特定の実施形態において、組織を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、バイオ印刷プロセスを自動化する任意の器機である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、1つ以上のプリンターヘッドを含み、ここで、プリンターヘッドは、少なくとも1つのカートリッジを受け保持するための手段を含み、前記カートリッジは、バイオインクおよび支持物質の1つ以上から選択されるコンテンツを含み、該バイオプリンターはさらに、少なくとも1つのカートリッジの位置を較正するための手段、および少なくとも1つのカートリッジのコンテンツを分注するための手段を含む。
幾つかの実施形態において、温度は、約40℃から約90℃の間に調節される。他の実施形態において、温度は、約0℃から約10℃の間に調節される。
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するための方法が開示される。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、1つ以上のプリンターヘッドを含む。さらなる実施形態において、プリンターヘッドは、少なくとも1つのカートリッジを受ける且つ保持するための手段を含む。またさらなる実施形態において、プリンターヘッドは、少なくとも1つのカートリッジをバイオプリンターに取り付ける。
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターに取り付けられたカートリッジは、バイオインクまたは支持物質を含む。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、具体的な細胞の構成物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持物質を分注する。複合組織の構成物を作成するために、バイオプリンターは、正確な速度および均一の量で、バイオインクまたは支持物質を沈着させる。したがって、(a)滑らか又は略滑らかな分注のオリフィスおよび(b)滑らか又は略滑らかな内面を有するカートリッジが必要とされている。
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターに取り付けられたカートリッジは、バイオインク及び/又は支持物質を含む。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、具体的な細胞の構成物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持物質を分注する。幾つかの実施形態において、バイオインクを含むカートリッジは、使い捨てである。幾つかの実施形態において、カートリッジは、コンテンツの押出後にバイオプリンターから取り出される。幾つかの実施形態において、続いて、新しいカートリッジがバイオプリンターに取り付けられる。
様々な実施形態において、適切な反復可能な正確性は、任意の軸上の、約±5、10、20、30、40、50μmの正確性を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されるバイオプリンターは、約±20μmの反復可能な正確性を有するカートリッジからバイオインク及び/又は支持物質を分注する。しかしながら、カートリッジの制御されない除去および挿入は、結果的に、組織構成物に関してプリンターヘッド(および故にカートリッジ)の位置の変更をもたらし、そのため、新しいカートリッジから沈着した第1バイオインク粒子の配置の精度は、以前のカートリッジから沈着した最近のバイオインク粒子と比べて変わり得る。したがって、カートリッジをプリンターヘッドに取り付け、固定する方法が必要とされ、ここで、前記取り付けおよび固定は、プリンターヘッドの位置の最小の変化をもたらすだけである。
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するためのバイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、バイオインク及び/又は支持物質の、複数の要素、セクション、及び/又は領域を受け面上へと分注する。さらなる実施形態において、分注は、具体的なパターンおよび具体的な位置で生じる。またさらなる実施形態において、バイオプリンターが、バイオインク及び/又は支持物質を受け面上へと沈着する位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに変換される。
本明細書には、特定の実施形態において、組織および臓器を作成するための、バイオプリンターが開示される。幾つかの実施形態において、バイオプリンターに取り付けられた1つ以上のカートリッジは、バイオインク及び/又は支持物質を含む。幾つかの実施形態において、バイオプリンターは、具体的な細胞の構成物、組織、または臓器を形成するために、具体的なパターンおよび具体的な位置でバイオインクまたは支持物質を分注する。
幾つかの実施形態において、バイオプリンターがバイオインク及び/又は支持物質を沈着させる位置は、ユーザー入力によって定義され、コンピューターコードに変換される。
幾つかの実施形態において、本明細書に開示される、デバイス、システム、および方法は、コンピューター読取り可能な媒体またはコンピューター読取り可能なプログラムコードによってコード化された媒体をさらに含む。さらなる実施形態において、コンピューター読取り可能な媒体は、バイオプリンター(あるいはその構成要素)またはバイオプリンター(あるいはその構成要素)に接続されたコンピューターなどのデジタル加工デバイスの有形要素である。またさらなる実施形態において、コンピューター読取り可能な媒体は、デジタル加工デバイスから随意に除去可能である。幾つかの実施形態において、コンピューター読取り可能な媒体は、限定しない例として、CD−ROM、DVD、フラッシュメモリ装置、ソリッドステートメモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスク駆動装置、クラウドコンピューティングのシステムおよびサービスなどを含む。
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される、デバイス、システム、および方法は、ソフトウェア、サーバー、およびデータベースモジュールを含む。幾つかの実施形態において、「コンピューターモジュール」は、より大きなコンピューターシステムと相互に作用する(コードのセクションを含む)ソフトウェアコンポーネントである。さらなる実施形態において、ソフトウェアモジュール(またはプログラムモジュール)は、1つ以上のファイルの形態で生じ、典型的に、より大きなソフトウェアシステム内の具体的なタスクを処理する。
幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、グラフィカルユーザーインタフェース(GUI)を含む。本明細書で使用されるように、「グラフィックユーザーインタフェース」は、アプリケーションの入出力の画像表示に加え、テキスト表示、および情報が保存される階層的構造または他のデータ構造を使用するユーザー環境を意味する。幾つかの実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを含む。さらなる実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを介して、二次元のGUIを提示する。他の実施形態において、コンピューターモジュールは、ディスプレイスクリーンを介して、バーチャルリアリティー環境などの三次元のGUIを提示する。幾つかの実施形態において、ディスプレイスクリーンは、タッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンであり、対話型のGUIを提示する。
ある実施形態において、本明細書に記載されているのは、組織と器官を作成するためのデバイス、システム及び方法である。幾つかの実施形態では、デバイスは、随意にバイオインクを含んでいる少なくとも1個のカートリッジを受け、保持するために、1つ以上のプリンターヘッドを含む。幾つかの実施形態では、その方法は、バイオインクの使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載されているデバイス、システム及び方法の使用により作成された組織と器官は、作成時に、又はその後にバイオインクを含む。
様々な実施形態では、本明細書に開示されているのは、複数の細胞から成る液体、半固形又は固形組成物を含むバイオインクである。幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体又は半固形細胞溶液、細胞懸濁液、又は細胞濃度を含む。幾つかの実施形態では、いかなる哺乳動物細胞も、バイオインク、及び本明細書に記載されているデバイス、システム及び方法を使用する組織と器官の生成で使用するのに適している。様々な実施形態では、細胞は任意の適切な細胞である。さらに様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞又はそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された方法の中で使用される細胞のタイプは、生成される細胞構成物、組織又は器官のタイプに依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは1つのタイプの細胞を含む(「相同性のインク(homologous ink)」とも呼ぶ)。幾つかの実施形態では、バイオインクは1つを超えるタイプの細胞を含む(「異種のインク(heterologous ink)」とも呼ぶ)。
幾つかの実施形態では、バイオインクは細胞培養培地を含む。細胞培養培地は任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、これらの例に限定されないが、Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline、Earle’s Balanced Salts、Hanks’ Balanced Salts、Tyrode’s Salts、Alsever’s Solution、Gey’s Balanced Salt Solution、Kreb’s−Henseleit Buffer Modified、Kreb’s−Ringer Bicarbonate Buffer、Puck’s Saline、Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient F−12 Ham、Nutrient Mixture F−10 Ham (Ham’s F−10)、Medium 199、Minimum Essential Medium Eagle、RPMI−1640 Medium、Ames’ Media、BGJb Medium (Fitton−Jackson Modification)、Click’s Medium、CMRL−1066 Medium、Fischer’s Medium、Glascow Minimum Essential Medium (GMEM)、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)、L−15 Medium(Leibovitz)、McCoy’s 5A Modified Medium、NCTC Medium、Swim’s S−77 Medium、Waymouth Medium、William’s Medium E、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は変更されるか補充される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地はさらに、アルブミン、セレニウム、トランスフェリン、フェチュイン、砂糖、アミノ酸、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン又はそれらの組み合わせを含む。
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、1つ以上の細胞外マトリクスの成分又はその誘導体を含む。幾つかの実施形態では「細胞外マトリクス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外マトリクス空間に輸送されるタンパク質を含んでおり、そこでそれらは、組織を一緒に保持し、引張力を提供し、及び/又は細胞シグナル伝達を促進するための補助として役立っている。細胞外マトリクス成分の例は、これらに限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸塩、エラスチン及びプロテオグリカン類を含む。例えば、多細胞の集合体は、様々なECMタンパク質(例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び/又はプロテオグリカン)を含み得る。ECM成分又はECM成分の誘導体は、多細胞の集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられ得る。細胞ペーストに加えられたECM成分又はECM成分の誘導体は、ヒト又は動物源から精製され得、又は当該技術分野に既知の組換え方法によって生成され得る。あるいは、ECM成分又はECM成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌され得るか、又は細長い細胞体を作るために使用される細胞は、当該技術分野に既知の任意の適切な方法によって遺伝子操作され得、1以上のECM成分又はECM成分の誘導体、及び/又は1以上の細胞接着分子又は細胞マトリクス接着分子(例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン及びアドヘリン)の発現レベルを変化させることができる。ECM成分又はECM成分の誘導体は、多細胞の集合体中で、細胞の凝集を促進し得る。例えば、ゼラチン及び/又はフィブリノゲンは、多細胞の集合体を形成するために使用される細胞ペーストに、適切に加えられ得る。その後、フィブリノゲンは、トロンビンの追加によってフィブリンに転換され得る。
幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、押し出しコンパウンド(すなわちバイオインクの押し出し特性を変更する化合物)を含む。押し出しコンパウンドの例は、これらに限定されないが、ゲル剤、ヒドロゲル剤、界面活性剤ポリオール(例えば、プルロニックF−127又はPF−127)、熱応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、細胞外マトリクス成分(及びその誘導体)、コラーゲン、その他の生物学的適合性のある天然又合成ポリマー、ナノファイバー、及び自己組織化ナノファイバーを含む。
一定の実施形態では、本明細書に開示されているのは、組織と器官を作成するためのデバイス、システム及び方法である。幾つかの実施形態では、デバイスは、随意に支持物質を含んでいる少なくとも1個のカートリッジを受け、保持するために、1つ以上のプリンターヘッドを含む。幾つかの実施形態では、その方法は、支持物質の使用を含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載されているデバイス、システム及び方法の使用により作成された組織と器官は、作成時に、又はその後に支持物質を含む。
幾つかの実施形態では、支持物質は、生物学的な構成物(例えば細胞の構成物、組織、器官など)を構成するための成形ユニット(building units)として使用される。さらなる実施形態では、支持物質ユニットは、所望構成物の細胞形質成分(すなわち中間の細胞ユニット)を欠くドメインを定義し維持するために使用される。幾つかの実施形態では、支持物質は任意の形状又は大きさを仮定することができる。
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、組織と器官を作成するためのバイオプリンターである。幾つかの実施形態では、バイオプリンターに付けられたカートリッジは、バイオインク及び/又は支持物質を含む。幾つかの実施形態では、バイオプリンターは、具体的な組織構成物を形成するために、具体的なパターンで、具体的な位置に、バイオインク又は支持物質を堆積させる。幾つかの実施形態では、バイオインクを含むカートリッジは、使い捨てである。幾つかの実施形態では、カートリッジは、コンテンツの押し出し、分注又は沈着の後に、バイオプリンターから放出される。幾つかの実施形態では、新しいカートリッジはバイオプリンターに付けられている。
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正する方法である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示された方法はさらに、レーザーを活性化し少なくとも1つの略安定した及び/又は略定常的なレーザービームを発生させることを含み、ここで前記レーザービームは地面に水平である。図1を参照。
(d)プリンターヘッドをレーザービームの方へ動かし、レーザービームがプリンターヘッドによって遮断されるとすぐにその動きを止めること(ここで、レーザービームが遮断される位置が、第2のy位置である);(e)そして、第1のy位置と第2のy位置の間の中間点を計算すること、を含む。
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正する方法である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載された方法はさらに、レーザーを活性化し少なくとも1つの略安定した及び/又は略定常的なレーザービームを発生させることを含み、ここで前記レーザービームは地面に垂直である。図2を参照。
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、分注のオリフィスを含むプリンターヘッドの位置を較正する方法であって、ここでプリンターヘッドはバイオプリンターに付けられており、該方法は少なくとも1つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで、軸はX軸、Y軸及びZ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも2つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、X軸、Y軸及びZ軸から選択される。幾つかの実施形態では、その方法は少なくとも3つの軸に沿ってプリンターヘッドの位置を較正することを含み、ここで軸は、X軸、Y軸及びZ軸から選択される。
特定の実施形態で、本明細書に開示されているのは、沈着のオリフィスを含むカートリッジの位置を較正するためのシステムであって、ここでカートリッジは、バイオプリンターに付けられ、前記システムは、少なくとも1つの軸に沿ってカートリッジの位置を較正するための手段を含んでおり、ここで軸は、Y軸、X軸及びZ軸から選択される。
以下の具体的な例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、方法はどうであれ、開示されているものの残りを限定するものとして、解釈されるべきではない。さらなる精錬なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその十分な程度まで利用することができると考えられる。本明細書に引用されるすべての公報は、それらの全体が引用によって本明細書に組み込まれる。これらに対する引用によって、このような情報の利用可能性及び一般的な普及が証明される。
<細胞培養>
平滑筋細胞:主要なヒト大動脈の平滑筋細胞(HASMC)を、37℃及び5%のCO2で、10%のウシ胎児血清(FBS)、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、0.25μg/mlのアムホテリシンB、0.01MのHEPES(すべてInvitrogen Corp.,Carlsbad,CAから)、50mg/Lのプロリン、50mg/Lのグリシン、20mg/Lのアラニン、50mg/Lのアスコルビン酸、及び3μg/LのCuSO4(すべてSigma,St.Louis,MOから)を補った、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)で維持し、増殖させた。継代4と8の間のHASMCのコンフルエント(confluent)な培養物を、すべての研究において使用した。
2%w/vのNovoGel(商標)溶液の調製:1gの低融点NovoGel(商標)を、50mlのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水(DPBS)に溶かした。簡潔に言うと、NovoGel(商標)が完全に溶解するまで、DPBS及びNovoGel(商標)を、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で85℃まで加熱した。NovoGel(商標)溶液を、125℃で25分間、蒸気滅菌によって殺菌した。温度が66.5℃を超えて維持される限り、NovoGel(商標)溶液は、液相にとどまった。この温度未満では、相転移が生じ、NovoGel(商標)溶液の粘度が増加し、NovoGel(商標)が固形ゲルを形成する。
HASMC−HAEC混合細胞シリンダーの作成:混合細胞シリンダーを調製するために、HASMC及びHAECを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞をDPBS(1ml/5cm2の増殖領域)で洗浄した。細胞を、10分間、トリプシン(1ml/15cm2の増殖領域)の存在下でのインキュベーションによって、培養フラスコの表面から分離した。HASMCを0.15%のトリプシンを使用して分離し、一方で、HAECを0.1%のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた(トリプシンの容積に対して2Xの容積)。細胞懸濁液を、6分間200gで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。HASMC及びHAECの適切な容積を混合し、5、7.5、10、12.5、及び15%のHAEC(総細胞集団の%として)を含む、混合した細胞懸濁液を得た。混合した細胞懸濁液を、5分間200gで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、6mlのHASMC培地中に再懸濁し、20mlのガラスバイアルに移動させ、その後、60分間150rpmで、及び37℃及び5%のCO2で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、15mlの遠心分離チューブに移動させ、5分間200gで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、400μlのHASMC培地中に再懸濁し、数回ピペットアップ及びピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確認した。細胞懸濁液を、15mlの遠心チューブの内部に置いた0.5mlのマイクロチューブへ移動させ、その後、4分間2000gで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。50mmの長さの細胞シリンダーを得るために、上清培地を吸収し、細胞を吸収によってキャピラリーチューブ(OD 1.0mm,ID 0.5mm,L 75mm;Drummond Scientific Co.,Broomall,PA)へ移動させた。キャピラリー内部の細胞ペーストを、20分間、37℃及び5%のCO2で、HASMC培地でインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーを供給したプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからNovoGel(商標)のモールド(HASMC培地で覆われた)の溝へと沈着させた。細胞シリンダーを、24時間及び48時間、37℃及び5%のCO2でインキュベートした。
<細胞培養>
平滑筋細胞:主要なヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC;GIBCO)を、37℃及び5%のCO2で、10%のウシ胎児血清(FBS)、100U/mlのペニシリン、0.1mg/mlのストレプトマイシン、0.25μg/mlのアムホテリシンB、0.01MのHEPES(すべて、Invitrogen Corp.,Carlsbad,CAから)、50mg/Lのプロリン、50mg/Lのグリシン、20mg/Lのアラニン、50mg/Lのアスコルビン酸、及び3μg/LのCuSO4(すべて、Sigma,St.Louis,Mo)で補った、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で維持し、増殖させた。継代4と8の間のHASMCのコンフルエントな培養物を、すべての研究において使用した。
2%及び4%(w/v)のNovoGel(商標)溶液の調製:1g又は2g(それぞれ2%又は4%に関する)の低融点のNovoGel(商標)(Ultrapure LMP)を、50mlのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水(DPBS)に溶かした。簡潔に言うと、DPBS及びNovoGel(商標)を、NovoGel(商標)が完全に溶解するまで、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で85℃まで加熱した。NovoGel(商標)溶液を、125℃で25分間、蒸気滅菌によって殺菌した。温度が66.5℃を超えて維持される限り、NovoGel(商標)溶液は液相にとどまる。この温度未満で相転移が生じ、NovoGel(商標)溶液の粘度が増加し、NovoGel(商標)が固形ゲルを形成する。
HASMC−HAEC混合細胞シリンダーの作成:混合細胞シリンダーを調製するために、HASMC及びHAECを個別に集め、その後、前もって決められた割合で混合した。簡潔に言うと、培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞をDPBS(1ml/5cm2の増殖領域)で洗浄した。細胞を、10分間、トリプシン(1ml/15cm2の増殖領域)の存在下で、インキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。HASMCを0.15%のトリプシンを使用して分離し、一方で、HAECを0.1%のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培地をフラスコに加えた(トリプシンの容積に対して2Xの容積)。細胞懸濁液を、6分間200gで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。HASMC及びHAECの適切な容積を混合し、15%のHAEC及び残部85%のHASMC(総細胞集団の割合として)を含む混合した細胞懸濁液を得た。混合した細胞懸濁液を、5分間200gで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、6mlのHASMC培地中で再懸濁し、20mlのガラスバイアルに移動させ、その後、60分間150rpmで、及び37℃及び5%のCO2で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、15mlの遠心分離チューブに移動させ、5分間200gで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、400μlのHASMC培地中で再懸濁し、数回ピペットアップ及びピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確認した。細胞懸濁液を、15mlの遠心分離チューブの内部に置いた0.5mlのマイクロチューブへ移動させ、その後、4分間2000gで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。50mmの長さの細胞シリンダーを得るために、上清培地を吸収し、細胞を吸収によって、キャピラリーチューブ(OD 1.0mm,ID 0.5mm,L 75mm)へ移動させた。キャピラリー内部の細胞ペーストを、20分間、37℃及び5%のCO2で、HASMC培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブからNovoGel(商標)(HASMC培地によって覆われた)のモールドの溝へと沈着させた。細胞シリンダーを、24時間、37℃及び5%のCO2でインキュベートした。
NovoGel(商標)のベースプレートの調製:10mlのあらかじめ暖められた(>40℃)NovoGel(商標)(2%w/v)を、10cmのペトリ皿へ分注することにより、NovoGel(商標)のベースプレートを作成した。分注直後に、ディッシュの全体のベースを包含し、均一の層を形成するように、NovoGel(商標)を平らに広げた。ペトリ皿を、20分間室温でインキュベートし、それによりNovoGel(商標)を完全にゲル化させた。
バイオプリンターをアセンブリした。バイオプリンターは、カートリッジを保持するためのコレット・チャックのグリップ、及びカートリッジのコンテンツを分注するためのピストンを有しているプリンターヘッドを含んでいた。使用されるカートリッジは、長さが75−85mmである、ガラス製のマイクロキャピラリーチューブだった。バイオインク又は支持物質を必要とする度に、新しいキャピラリーチューブを充填した。
X軸での較正:キャピラリーチップを、レーザービームの左(−x)に傾けて、レーザーセンサーの範囲で移動させた。センサーがキャピラリーエッジを検出するまで、キャピラリーを+X方向に移動させ、この位置を記録した。上記の工程を反対側から繰り返した(すなわち、チップをレーザービームの右(+x)に傾け、センサーがキャピラリーエッジを検出するまで、−x方向に移動させる)。両方の工程からの位置を平均し、キャピラリーの中間点を計算した。随意に、上記の工程を、異なるy−位置のために繰り返し、また、計算された中間点を平均した。
Y軸での較正:チップがレーザービームの高さのちょうど下になり、キャピラリーを1つ側面方向に離れる(y−方向)ように、キャピラリーを移動させた。キャピラリーをレーザーに向けてy−方向に移動させた。レーザーセンサーがキャピラリーに反射されるビームを検出したときに、キャピラリーを止め、この位置を記録した。上記の工程を、レーザーの他の側面方向に離れ、(y−方向)に動いたキャピラリーを動かした。上記の工程からの中間点をy−位置として記録した。
キャピラリーから印刷する前に、バイオインク又は支持物質がキャピラリーのまさに先端で印刷し始めるように、キャピラリー内部にバイオインク又は支持物質をプライミングした。較正レーザーを、キャピラリーをプライミングするために使用した。キャピラリーチップを、ちょうどレーザービームの上に移動させ、ビームはY軸にした。キャピラリーチップはレーザービームの上の20−100μmの間にあった。バイオインク又は支持物質がキャピラリーチップから分注し始め、レーザービームを遮断するまで、プリンターヘッド中の分注ピストンが押し下げられた。ピストンを逆方向(20−100μm)に駆動させることにより、分注されたバイオインク又は支持物質を吸引し、キャピラリーチューブに戻した。その後、キャピラリーをプライミングし、分注の準備を行った。
NovoGel(商標)を支持物質として使用した。キャピラリーチューブの外側表面に付着する過剰なNovoGel(商標)を取り除き、過剰なNovoGel(商標)が印刷品質に影響を与えることを回避するために、過剰なNovoGel(商標)を取り除いた。除去する特性をバルクのNovoGel(商標)容器へ統合した。バルクのNovoGel(商標)容器を、隔壁を付けられるように開いた蓋を有する、標準的な医療用バイアルに合わせた。隔壁を、1−2mmの厚いシリコンの中央にある横断線で構成する。隔壁を通してキャピラリーをバルクのNovoGel(商標)容器に浸し、NovoGel(商標)を吸引することによって、キャピラリーが容器から出ると、過剰なNovoGel(商標)をキャピラリーから除去し、バルク容器内に残った。
バイオプリンター及びカートリッジを上記のように組み立てた。バイオプリンターは、バイオプリンターによって生成された構造を受け取るためのペトリ皿を有するステージを有していた。ペトリ皿をNovoGel(商標)でコーティングした。
Claims (11)
- 以下のa)〜f)の手段を含むバイオプリンター。
a)1つ以上のプリンターヘッドであって、それぞれ少なくとも1個のカートリッジと、各カートリッジを受け取り、保持するための手段を含み、各カートリッジ中にはバイオインクを含み、前記バイオインクは生細胞を含む固形又は半固形組成物である、プリンターヘッド;
b)前記プリンターヘッドに設けられた、オリフィスからなるバイオインクを分注するための手段であって、オリフィスを介して選択されたカートリッジ中のバイオインクを圧力の印加によって押し出して分注する、バイオインクを分注するための手段;
c)レーザービーム及びレーザーセンサーを利用して、前記カートリッジ又は前記オリフィスの位置を空間内で決定するための手段;
d)コンピューターモジュールからなる、前記カートリッジ又は前記オリフィスの位置、および前記オリフィスからの前記バイオインクの分注を制御する手段;
e)少なくとも1つの押し出された前記バイオインクからなるコンテンツを受け取るための受け面;
f)前記レーザービーム及び前記レーザーセンサーを利用するレーザー較正により、前記オリフィスをプライミングする手段 - 前記バイオインクを分注するための手段が、ピストン、圧縮ガス、液圧応用機械あるいはそれらの組み合わせを介して圧力を印加する請求項1に記載のバイオプリンター。
- 温度を調節するための手段を更に含む請求項1に記載のバイオプリンター。
- 周囲温度、カートリッジの温度、カートリッジ中のバイオインクの温度、受け面の温度、あるいはそれらの組み合わせを調節するための手段を更に含む請求項3に記載のバイオプリンター。
- 前記温度を調節するための手段が発熱体である請求項4に記載のバイオプリンター。
- 前記温度を調節するための手段が、放射暖房器、対流加熱器、伝導性ヒーター、ファンヒーター、熱交換器あるいはそれらの組み合わせである請求項5に記載のバイオプリンター。
- 前記温度を調節するための手段が冷却体である請求項4に記載のバイオプリンター。
- 前記温度を調節するための手段が、冷媒、冷却液、氷、放射冷却器、対流冷却器、伝導性冷却器、ファン冷却器あるいはそれらの組み合わせである請求項7に記載のバイオプリンター。
- プリンターステージ及び支持物質をさらに含み、
a) プリンターステージ;
b) 受け面;
c) 分注するための手段;
d) バイオインク;及び
e) 支持物質;のうちの1以上に湿潤剤を適用するための手段をさらに含み、
前記湿潤剤は、
前記バイオインク又は前記支持物質が前記バイオプリンターによって分注される前、実質的に分注と同時に、および前記バイオインク又は前記支持物質が前記バイオプリンターによって分注された後、のいずれかから選択される1又は2以上のタイミングで適用される請求項1に記載のバイオプリンター。 - 前記受け面は本質的に水平であるか、あるいは、本質的に滑らかである請求項1に記載のバイオプリンター。
- 前記受け面の微細構成が、1又は2以上の構造体の寸法、形状又は組織若しくは幾何学的形状に適応するか又は影響を及ぼすために設計される請求項1に記載のバイオプリンター。
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