JP6325443B2 - 磁化された幹細胞の凝集および分化方法 - Google Patents
磁化された幹細胞の凝集および分化方法Info
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Description
本発明は、細胞療法、再生医学および組織工学の分野に関する。それは、より具体的には、特に代替組織(tissue substitute)の形成に関して、細胞の組織化および有利には細胞の分化を促進する、細胞、典型的には幹細胞の最適な凝集を可能にする方法に関する。この方法は、前処理された幹細胞を磁場に曝露することを含み、分化した細胞を含む細胞凝集体、特に大きな細胞凝集体を得ることを可能にする。驚くべきことに、また現在の実務に反して、この凝集方法は、外因性の3次元細胞接着支持マトリックス(support matrix)および/または増殖因子の非存在下において有利に実行し得る。本発明はまた、かかる方法を用いて得ることができる細胞凝集体、およびインビトロ、エキソビボまたはインビボで対象とする組織構造を得ることを目的とした組織イニシエーター(tissue initiator)としてのその使用に関する。さらに、本発明は、得られる組織構造、および研究または治療における代替組織としてのその使用に関する。本願はまた、インビボで対象とする組織の発生(development)をモニターすることを有利に可能にする方法を提供する。
組織工学において一般的に用いられる細胞凝集方法は、該細胞を遠心することにその本質がある。しかし、かかる方法は、限られた数の細胞(多くておよそ 250,000 個の細胞)を含む小さな凝集体(およそ 1 mm3)の取得を可能にするだけである。遠心する細胞の数を増大させたとしても、凝集体の中心に存在する細胞が(おそらくは栄養および酸素に対する制限されたアクセスが原因で)壊死するため、より体積の大きな凝集体を得ることは現時点では不可能である。
本発明は、細胞、特に幹細胞および/または分化中の細胞(cells undergoing differentiation)もしくは分化の過程にある細胞の凝集方法であって、以下の工程を含む方法に関する:
a) 幹細胞または分化中の細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させる工程であって、該接触が磁化された細胞を得ることを可能にする工程、および
b) 該磁化された細胞を磁場に曝露する工程であって、該曝露が細胞凝集体の形成を可能にする工程。
本願発明の発明者らは、“磁化による細胞凝集”技術を細胞に適用することにより、細胞の分化、特に分化中の細胞および/または幹細胞、典型的には間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹(ES)細胞または再プログラムされた細胞(本発明においても“誘導前駆細胞”の表現によって同定される人工多能性幹細胞または iPSC)の分化を非常に有利に促進することが可能な、細胞凝集方法において細胞の組織化を著しく改善する方法を開発した。この技術は、(i)細胞への磁性粒子の導入(自発的インターナリゼーションによる)、およびその後の(ii)磁化された細胞の外部磁場への曝露を介する、制御された幾何学的形状(geometric shape)を有する細胞凝集体の形成および組織化を含む。この方法の工程(i)は、インビトロまたはエキソビボで行うことができる。工程(ii)は、当業者の好みに応じて、インビトロ、エキソビボまたはインビボで行うことができ、好ましくは意図する細胞凝集体のその後の応用に適した条件下で、例えば、好ましくは細胞が存する分化プロセスの段階および/または細胞が到達することが望まれる細胞分化の段階に適した条件下で行うことができる。かかる方法は、これまでに説明した既存の方法に伴う技術的制約を考慮すると、これまでは予想できなかった臨床的視点(clinical perspective)を提供するものである。
a) 細胞、特に幹細胞または分化中の細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させる工程であって、該接触が磁化された細胞を得ることを可能にする工程、および
b) 該磁化された細胞を磁場、好ましくは集中した(focused)磁場に曝露する工程であって、該曝露が細胞凝集体の形成を可能にする工程。
実施例 1 - ヒト間葉系幹細胞(hMSC)から軟骨細胞を得るために適用される凝集方法 - 基準条件(reference conditions)
・ 凝集体の形成
用いるヒト間葉系幹細胞(hMSC)は市販のもの(commercial aliquots)である(Lonza)。これらの細胞を、0.1mM の鉄濃度における酸化鉄(磁赤鉄鉱)ナノ粒子の懸濁液と共に 30 分間インキュベートする。ナノ粒子を含有しない培養培地中における終夜の追跡の後、250,000、500,000 または 1,000,000 個の細胞を、磁性針の上に位置するガラス基板(厚さ100μm)上に堆積(deposit)させる。この方法は、球形状の細胞凝集体の形成をもたらす。凝集体の細胞に対して及ぼす磁力は 70 から 400 pN の範囲である。
軟骨組織工学の場合、間葉系幹細胞の凝集体を、インキュベーター(37℃、5% CO2)中において 28 日間、特に増殖因子 TGFβ3 を含む軟骨形成誘導培地中で有利に培養する。この培地を1週間に2回更新する。
軟骨形成培地中における 28 日間の培養の後、軟骨マトリックスの存在を実証するため、凝集体を組織学および定量 PCR によって解析した。このマトリックスは II型コラーゲン線維とプロテオグリカンから構成され、該プロテオグリカンはタンパク質コアとグリコサミノグリカン鎖が結合したものである。軟骨中に豊富に見出されるプロテオグリカンの例は、アグリカン(aggregan)である。
最初に、液体窒素で冷却したイソペンタン浴において OCT(最適切削温度化合物(Optimal Cutting Temperature compound))マトリックス中で凍結させる前に、サンプルをホルマリン中で固定する(4℃における12時間のインキュベーション)。次いで、ミクロトームクライオスタットを用いて 6 μm の切片を切り出し、後前処理されたスライド上に載せる。実際の染色の前に、該切片を再度、周囲温度で 10 分間、1% ホルマリン中で固定し、その後、水道水浴においてリンスする。
- 0.5% トルイジンブルー溶液 (20 ml の 95% エタノールおよび 80 ml の蒸留水中における 500 mg)を用いる 1 から 2 分間のスライドの染色。
- 水道水浴におけるリンス。
- 脱水: 連続する3回の 100% エタノール浴 (2 分; 2 分; 5 分) および連続する3回のトルエン浴 (2 分; 2 分; 5 分)。
- Eukit を用いるスライドのマウント。
- ヘマトキシリン染色
o 蒸留水中に希釈した 0.2×溶液を用いる 3 分間の染色。
o 水道水浴における 2 分間のリンス。
o 酸アルコール(70% エタノール中における 1% 塩酸 HCl)浴における 15 秒間の分別。
- ファストグリーン(Fast Green)染色
o 1:5000 水溶液(200 ml の水における 40 mg)を用いる 3 分間の染色。
o 1% 酢酸浴における迅速リンス。
- サフラニン-O 染色
o 0.1% サフラニン-O 水溶液中における最大 3 分間の染色。
o 95% エタノール浴におけるリンス。
- 脱水: 連続する3回の 100% エタノール浴(2 分; 2 分; 5 分)および連続する3回のトルエン浴(2 分; 2 分; 5 分)。
- Eukit を用いるスライドのマウント。
分化段階の後の細胞に含まれる全 RNA を、Machery-Nagel キットを用い、供給者の指示するプロトコールに従って抽出する。ゲノム DNA の混入を避けるため、得られた RNA を DNAse で処理する。次いで、100 μl につき 1 μg の全 RNA の終濃度で SuperScript II 逆転写酵素(Invitrogen)を用いて相補 DNA (cDNA) を合成する。供給者の指示するプロトコールを参照し、ABIPRISM 7900 装置の配列決定システムおよび SYBR Green 色素(Applied-Biosystems)を用いてリアルタイム定量 PCR を行う。PCR プライマーを、Primer Express プログラム(Applied Biosystems)を用いて構築する。mRNA の転写レベルを、基準遺伝子: RPLP0 (酸性リボソームリンタンパク質(phosphoprotein)P0)の発現レベルに対して標準化する。PCR の終了時に形成される融解曲線によって、転写産物の特異性を確認する。確立された蛍光検出閾値は、閾値サイクル(Ct)を検出することおよび特定の遺伝子の相対的発現を定量することを可能にする。対象とする遺伝子(Rと表す)に対応する mRNA のレベルは、基準遺伝子 RPLP0 のレベルと比較して表される: ΔCt=CtR−CtRPLP0。各々の遺伝子 R について、分化培地を用いずに培養された陰性対照サンプルを参照する。遺伝子 R に対応する mRNA の量は、この陰性対照と比較して表され、2(−ΔΔCt)に等しい(ΔΔCt=ΔCtサンプル−ΔCt陰性対照)。
o AGN : 軟骨マトリックスの構成要素であるアグリカンをコードする遺伝子;
Fwd : TCTACCGCTGCGAGGTGAT (配列番号 1)
Rev : TGTAATGGAACACGATGCCTTT (配列番号 2)
o Col2A : 硝子軟骨に存在する II 型コラーゲンのα鎖をコードする遺伝子
Fwd : ACTGGATTGACCCCAACCAA (配列番号 3)
Rev : TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA (配列番号 4)
o Col1A : 線維性軟骨に存在し、分化していない間葉系細胞によって合成される I 型コラーゲンのα鎖をコードする遺伝子
Fwd : GCTACCCAACTTGCCTTCATG (配列番号 5)
Rev : TTCTTGCAGTGGTAGGTGATGTTC (配列番号 6)。
250,000、500,000 または 1,000,000 個の間葉系幹細胞の凝集体は、28 日間の軟骨形成の終了時において、対照、即ち遠心分離(文献における標準的な条件)により形成される 250,000 個の細胞の凝集体に匹敵する、軟骨マトリックスに特徴的な遺伝子(AGN および Col2A/Col1A)の発現を示す。
細胞凝集体のコンパクトさのバリエーションは、実施例 1 において示した標準的条件に関して、凝集体形成の間に細胞に適用される磁力を増大または減少させることによって得られる。この力は、細胞の磁性標識のバリエーションによって、又はより厚いガラス基板上への堆積によって調節される。試験した実験条件を、以下の表に再現する。
凝集体は同じ収縮動態を有する。
実施例 1 について、厚さ 0.5μm の直線または十字の形態に加工(machined)された磁化可能な軟鉄部品の使用によって最初の配置を改変する。用いた実験条件を以下の表に再現する。堆積、凝集、凝集体培養および解析の方法は実施例 1 と同一である。
・ 条件 3.6 は、陰性対照(遠心分離によって限局され、TGFβ3 を含まない軟骨形成培地中で培養された 250,000 個の細胞)と同様のマトリックス遺伝子発現をもたらす。
・ 条件 3.4 は、条件 3.5 よりも軟骨マトリックスの形成に有益である。
・ 条件 3.1、3.2、3.3 および 3.4 は、陽性対照(遠心分離によって限局され、TGFβ3 を含む軟骨形成培地中で培養された 250,000 個の細胞)に匹敵する軟骨マトリックスの合成をもたらす。
実施例 1 に記載した通りに、ヒト間葉系幹細胞の凝集体を磁気凝集によって形成させ、軟骨形成培地中で培養する。
・ 細胞凝集体の形成を誘導する磁石の近接は、これらの凝集体の自発的かつ早期の融合をもたらす。
・ 初期の融合(0日目、1日目、4日目)の場合、均質な単一の凝集体への凝集体の全体融合が観察される。
・ 後期の融合(7日目、10日目、16日目)の場合、密接しているが、その構造が別個の単位の存在によって特徴付けられる集合体への凝集体の融合が観察される。
・ 凝集体を接触させる時点は完全に制御することができる。
・ 後期の融合の場合、最終的な凝集体のサイズはそれを構成する単位のサイズの合計と同等であるが、初期の融合の場合には、凝集体のさらなる緊密化(compaction)が観察される。
・ 条件 4.4 および 4.12 は、豊富な軟骨マトリックスを有する代替組織の形成をもたらす。
・ 条件 4.1、4.2、4.3、4.9、4.10 および 4.11 は、軟骨マトリックスを有する代替組織の形成をもたらす。
・ 全ての条件において、連続する組織が形成される。
・ 条件 4.9、4.10 および 4.11 は、有意差のないII型コラーゲンおよびアグリカン遺伝子の発現レベルをもたらす。
・ 磁気融合(条件 4.9、4.10、4.11)により形成される 106 個の細胞の凝集体のII型コラーゲン発現レベルと、遠心分離により形成される 106 個の細胞の凝集体のII型コラーゲン発現レベルとの比較により、通例の遠心分離手法によって形成される凝集体(880±291)よりも磁気融合によって得られる凝集体(3473±654)の方がこの発現レベルが有意に高いことが示される(統計学的検定: スチューデントの t 検定)。
[Fe]=0.1 mM から [Fe]=2 mM の範囲の濃度の酸化鉄ナノ粒子と共に 30 分間のインキュベーションにより DMEM (必須アミノ酸および多能性を維持するための LIF タンパク質を有する)中で培養されたマウス胚性幹細胞。胚性細胞あたりの細胞取り込みは、細胞あたり 1 pg から 4 pg の範囲の鉄である(下記の曲線を参照されたい)。50,000 から 250,000 個の細胞を、磁気アトラクタ(attractor)から 100 μm にあるガラス基板上に堆積させた。該細胞に適用した磁力は 50 から 200 pN の範囲である。全ての条件において、球形状の密接した凝集体が得られる。
Claims (16)
- インビボで動物に移植することが可能な組織構造の作成方法であって、該作成方法は、外因性の三次元支持マトリックスの非存在下で行われ、幹細胞または分化中の細胞の凝集方法を行うことを含み、該凝集方法は、
a) 幹細胞または分化中の細胞をインビトロまたはエキソビボで磁性粒子と接触させる工程であって、該接触が、表面に磁化された粒子が結合されているか、または磁化された粒子がインターナライズされている磁化された細胞を得ることを可能にする工程、および
b) 該磁化された細胞を磁場に曝露する工程であって、該曝露が細胞凝集体の形成を可能にする工程
を含む、作成方法。 - 幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)、胚性幹細胞(ESC)または誘導前駆細胞である、請求項1に記載の方法。
- 磁場が、集中した磁場である、請求項1または2に記載の方法。
- 磁化された細胞を磁場に曝露する工程 b) が、1種以上の磁石形状への前記細胞の曝露からなる、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 磁化された細胞が磁石形状に曝露され、該形状がスポット、切断された針の先端または末端、直線、十字、星、環、ディスク、円、またはこれらの形状の1つおよび/または他の形状のいくつかから選択されるものである、請求項4に記載の方法。
- 該凝集方法が遠心分離工程を伴わずに行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 該凝集方法が分化因子の非存在下で行われる、請求項6に記載の方法。
- 50万個、百万個または2百万個の幹細胞または分化中の細胞を使用する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記凝集方法の終了時に得られる同一のまたは異なる細胞からなる1種以上の細胞凝集体を培養する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 凝集方法の実行に続く培養工程の初日または最初の 2、3、4、5、6、7 または 8 日の間、増殖因子の非存在下で行われる、請求項9に記載の方法。
- 軟骨構造の作成を可能にするものであり、且つ、凝集工程の間、増殖因子の非存在下で実行される、請求項9に記載の方法。
- 培養工程が1種以上の磁気源を用いて作成される磁場の存在下で行われる、請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- 外因性の三次元支持マトリックスを欠き、(i)表面に磁化された粒子が結合されているか、または磁化された粒子がインターナライズされている分化した磁化された細胞および(ii)前記分化した磁化された細胞により分泌される細胞外マトリックスを含む、代替組織。
- 分化した磁化された細胞が磁性軟骨細胞であり、細胞外マトリックスが軟骨性細胞外マトリックスである、請求項13に記載の代替組織。
- 組織のスティック、パッチ、シートまたは棒の形態であることを特徴とする、請求項13または14に記載の代替組織。
- 画像化によって請求項13〜15のいずれかに記載の代替組織を可視化する方法。
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